JP2020056748A - 負ピークの影響を受けないピーク検出手法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、検出の目的となる正方向に生じるピークの近傍に負方向のピークが存在するクロマトグラムにおいて、負方向のピークの影響なく、目的とする正方向のピークを検出する方法を提供するものである。【解決手段】クロマトグラムのピーク処理方法であって、目的ピークの前方に出現する負方向のピークにより、前記目的ピークのピークスタートの出力値がピークエンドの出力値よりも任意の閾値を超えて小さい前記目的ピークに対して、前記目的ピークのピークスタート時間に１．０を超える係数を乗じた時間から前記目的ピークのピークトップ時間に１．０未満の係数を乗じた時間までの間で、出力変化量が最小となる時間を真のピークスタート時間とし、前記目的ピークのピークスタート時間を真のピークスタート時間からとすることを特徴とする前記方法。【選択図】 なし

Description

本発明は、クロマトグラムにおいて、前後に負方向のピークが出現する場合の、目的とする正方向のピークを検出する方法に関する。

クロマトグラフィーは複数成分を含む試料を分析カラムで分離検出し、成分の定量や定性を行う方法である。一般的には、各成分ピークの溶出時間から定性を行い、検出器の出力度合により定量を行う。定量分析を行うためには、ピークのベースラインを決定し、ピークの面積または高さをクロマトグラムから算出する必要がある。ベースラインの決定は、操作者の判断により手作業で指定する方法のほか、クロマトグラムの時間当たりの出力変化量を基準として、予め指定された閾値をピーク検出条件として参照することによりピークスタート点、またはピークエンド点を自動で決定する方法などが用いられる（図１（ａ）参照）。たとえば、出力変化量が単調増加でピーク検出条件Ａ（０＜Ａ）を超過したときにピークスタートと判定し、出力変化量が単調増加でピーク検出条件Ｂ（Ｂ＜０）を超過したときにピークエンドと判定するなどの方法がある。

しかしながら、定量を目的とする正方向のピークの前後に負方向のピークが出現する場合、前述の方法では正しくピーク検出できない場合がある（図１（ｂ）参照）。この場合、図１（ａ）と同じベースライン決定条件を用いているためにクロマトグラムの時間当たりの出力変化量を示すグラフにおいて、不適切な点がピークスタート点として指定されてしまうため、操作者が手作業でベースラインを指定し直す、指定した時間帯のピーク検出を禁止する、指定した時間をピークスタート点に指定するなどの特殊なピーク検出条件の設定が必要であった。

本発明は、検出の目的となる正方向に生じるピークの近傍に負方向のピークが存在するクロマトグラムにおいて、負方向のピークの影響なく、目的とする正方向のピークを検出する方法を提供するものである。

本発明に係るクロマトグラムのピーク処理方法において、
目的ピークの前方に出現する負方向のピークにより、前記目的ピークのピークスタートの出力値がピークエンドの出力値よりも任意の閾値を超えて小さい前記目的ピークに対して、前記目的ピークのピークスタート時間に１．０を超える係数を乗じた時間から前記目的ピークのピークトップ時間に１．０未満の係数を乗じた時間までの間で、出力変化量が最小となる時間を真のピークスタート時間とし、前記目的ピークのピークスタート時間を真のピークスタート時間からとする。
また、本発明に係るクロマトグラムのピーク処理方法の一態様においては、目的ピークの後方に出現する負方向のピークにより、前記目的ピークのピークエンドの出力値がピークスタートの出力値よりも任意の閾値を超えて小さい前記目的ピークに対して、前記目的ピークのピークトップ時間に１．０を超える係数を乗じた時間から前記目的ピークのピークエンド時間に１．０未満の係数を乗じた時間までの間で、出力変化量が最大となる時間を真のピークエンド時間とし、前記目的ピークのピークエンド時間を真のピークエンド時間までとする。

本発明により、検出の目的となる正方向に生じるピークの近傍に負方向のピークが存在するクロマトグラムにおいて、負方向のピークの影響なく、目的とする正方向のピークのベースラインを決定することが可能となった。

（ａ）負方向のピークが存在しないクロマトグラムにおいて、従来法を用いてピーク検出を行った結果である。（ｂ）負方向のピークが存在するクロマトグラムにおいて、従来法を用いてピーク検出を行った結果である。 負方向のピークの存在の有無による、ピークスタートとピークエンドの出力差の違いを示した図である。（ａ）負方向のピークが無い場合 、（ｂ）前方に負方向のピークが有る場合、（ｃ）後方に負方向のピークが有る場合を示す。 ピークスタート異常があるクロマトグラムについて本発明を実施した一例である。 ピークエンド異常があるクロマトグラムについて本発明を実施した一例である。 実施例１で用いたイオンクロマトグラフシステムの構成図である。 試料１について本発明を実施して、ピークスタート異常を修正したことを示した図である。 試料２について本発明を実施して、ピークスタート異常を修正したことを示した図である。 実施例２で用いたサイズ排除クロマトグラフシステムの構成図である。 試料３について本発明を実施して、ピークスタート異常を修正したことを示した図である。

本発明における「目的ピーク」とは、クロマトグラムについて時間当たりの出力変化量（以下、単に「出力変化量」と言う場合がある。）を取得し、出力変化量と、予め指定された閾値をピーク検出条件として参照し、ピークスタート点とピークエンド点を決定することによりピーク検出を行った際の特定のピークを指す。クロマトグラムの出力変化量は、連続データであればクロマトグラムの時間微分により取得し、離散データであればクロマトグラムの時間差分により取得することができる。また、前後数点の出力を基にある時間の変化量の指標を求めてもよく、出力変化量を求める手法に特に制限は無い。クロマトグラム中のノイズにより、出力変化量が大きく変動する場合は、出力変化量に対してローパスフィルタ等のフィルターを掛けたり、移動平均を取得したりするなどのノイズ成分を低減する手段を併用しても良い。

本発明における「負方向のピーク」とは、溶出成分により検出器の出力信号が低下することにより発生するクロマトグラムの変動であり、凹状のピークを指す。

負方向のピークの影響がない正方向のピークの場合、ピークスタート点とピークエンド点の出力差は、ベースラインのドリフトにより発生する信号差程度に小さい（図２ａ）。一方、負方向のピークが前方にある正方向のピークは、ピークスタートの出力値がピークエンドの出力値よりも、ベースラインのドリフトにより発生する信号差よりも大きい値で小さくなる（図２ｂ）。また、負方向のピークが後方にある正方向のピークは、ピークエンドの出力値がピークスタートの出力値よりも、ベースラインのドリフトにより発生する信号差よりも大きい値で小さくなる（図２ｃ）。したがって、本発明における「任意の閾値」とは、ベースラインドリフトの影響を無視できる程度の値を設定すべきであり、操作者が変更可能であることが望ましい。

目的ピークの前方に出現する負方向のピークにより、前記目的ピークのピークスタートの出力値がピークエンドの出力値よりも任意の閾値を超えて小さい場合、前記目的ピークのピークスタート時間に１．０を超える係数を乗じた時間から前記目的ピークのピークトップ時間に１．０未満の係数を乗じた時間までの間で、出力変化量が最小となる時間を探索する。例として、３．２００分に出現する負方向のピークと、５．０００分に出現する正方向のピーク（目的ピーク）が存在するクロマトグラムにて、ピークスタート時間に１．１００を乗じ、ピークトップ時間に０．９５０を乗じた場合を図３（ａ）に示す。この場合、探索範囲は３．５２０分から４．７５０分となる。この探索範囲内で出力変化量が最小となる時間は、４．４５０分であることが図３（ｂ）から分かる。したがって、目的ピークの「真のピークスタート時間」は、４．４５０分となる。真のピークスタート時間からピークエンド時間までが、目的ピークの取るべきベースラインであることが図３（ｃ）より明らかである。なお、出力変化量が最小となる時間が複数ある場合は、最も遅い時間を真のピークスタート時間とすることが好ましい。

また、目的ピークの後方に出現する負方向のピークにより、前記目的ピークのピークエンドの出力値がピークスタートの出力値よりも任意の閾値を超えて小さい場合、前記目的ピークのピークトップ時間に１．０を超える係数を乗じた時間から前記目的ピークのピークエンド時間に１．０未満の係数を乗じた時間までの間で、出力変化量が最大となる時間を探索する。例として、５．０００分に出現する正方向のピーク（目的ピーク）と、６．５００分に出現する負方向のピークが存在するクロマトグラムにて、ピークトップ時間に１．０５０を乗じ、ピークエンド時間に０．９５０を乗じた場合を図４（ａ）に示す。この場合、探索範囲は５．２５０分から６．１７５分となる。この探索範囲内で出力変化量が最大となる時間は、５．８００分であることが図４（ｂ）から分かる。したがって、目的ピークの「真のピークエンド時間」は、５．８００分となる。ピークスタート時間から真のピークエンド時間までが、目的ピークの取るべきベースラインであることが図４（ｃ）より明らかである。なお、出力変化量が最大となる時間が複数ある場合は、最も早い時間を真のピークエンド時間とすることが好ましい。

係数については、１．０を超える又は１．０未満であれば制限はないが、分離モードや検出対象となるピーク形状などにより決定するものであり、操作者が変更可能であることが望ましい。基本的には、ピーク形状がシャープな場合は、許容範囲を狭く、ピーク形状がブロードな場合は、許容範囲を広くすることが好適である。

さらに、本発明は、クロマトグラム上の各ピークについて、ピークスタートの出力値とピークエンドの出力値の差分を算出し、ピークスタートの出力値がピークエンドの出力値よりも任意の閾値を超えて小さいピークと、ピークエンドの出力値がピークスタートの出力値よりも任意の閾値を超えて小さいピークとを検出し、これらのピークに対して上述の方法でピーク処理するという態様を包含している。

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。

（実施例１）
本発明の方法を、図５に示すイオンクロマトグラフシステムを用いて実施した。システムは、移動相および移動相ボトル１、移動相脱気装置２、移動相送液ポンプ３、試料注入部４、カラムオーブン５、サプレッサー６、電気伝導度検出器７、廃液ボトル８、および制御データ処理プログラム９などにより構成される。分析カラム１０としてはＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＩＣ−Ａｎｉｏｎ ＨＳ、ガードカラム１１としては、ＴＳＫｇｅｌ ｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｎ ＳｕｐｅｒＩＣ−Ａ ＨＳを使用、サプレッサーに用いるサプレッサーゲルはＴＳＫｇｅｌ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ＩＣ−Ａを使用、また制御データ処理プログラム９はＩＣ−２０１０ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを使用した（いずれも東ソー株式会社製）。
イオンクロマトグラフでは、通常移動相としてイオンが含まれる溶液を使用するが、試料中の水成分は分離カラムにて保持されないため、イオン成分が出現するよりも先に水成分に由来する負方向のピークが出現する。本実施例では、本システムにて下記試料を分析して得られたクロマトグラムに対して、水成分に由来する負方向のピークの直後に出現するピークスタート異常となるフッ化物イオンについて、本開発手法を用いて負方向のピークの影響を受けないピーク検出が可能か検証した。
試料１：富士フイルム和光純薬株式会社製 陰イオン混合標準液１を超純水で１０倍希釈したもの
試料２：富士フイルム和光純薬株式会社製 陰イオン混合標準液１を超純水で１２８０倍希釈したもの
試料注入量：３０μＬ
カラムオーブン温度：４０℃
移動相流量：１．５ｍＬ／ｍｉｎ
移動相組成：７．５ｍｍｏｌ／Ｌ 炭酸水素ナトリウム ＋ ０．８ｍｍｏｌ／Ｌ 炭酸ナトリウム
サンプリングピッチ：５０ｍｓ
従来法にてフッ化物のピーク検出を行い、ベースラインを指定した結果を図６（ａ）、７（ａ）に示す。なお、ピーク検出に関しては表１に示す条件で実施した。

まず、ピーク検出が完了したクロマトグラムについて閾値を０．０５０μＳに設定し、負方向のピークの影響を受けているピークがあるかを確認した。試料１では１．３４４μＳの差が、試料２では１．５２５μＳの差があり、ピークスタート異常となっていることがわかった。
次に、ピークスタート時間に１．０３０、ピークトップ時間に０．９７０を係数として乗じ、出力変化量が最小となる時間を探索した。試料１では、ピークスタート時間が０．９４８分、ピークトップ時間が１．７５２分となったことから、探索範囲は０．９７６分〜１．６９９分とし、１．５９０分で出力変化量が最小となることがわかった。試料２では、ピークスタート時間が０．９５０分、ピークトップ時間が１．７５０分となったことから、探索範囲は０．９７９〜１．６９８分とし、１．６２１分で出力変化量が最小となることがわかった。
次に、出力変化量が探索範囲内で最小となった時間をピークスタート時間とすることでピークスタート異常を修正した。直前の負方向のピークによりベースラインが異常となったフッ化物イオンピークについて、本発明を実施することにより、正しくピークスタートを修正することができ、正しいベースラインを操作者の判断を必要とせずに取得可能であることが確認できた。また、本発明は濃度が１００倍以上異なるサンプルに対しても共通の設定値で負方向のピークの影響を受けないピーク検出が可能であることがわかった。

（実施例２）
本発明の方法を、図８に示すサイズ排除クロマトグラフ装置を用いて実施した。クロマトグラフ装置は、移動相および移動相ボトル１、移動相脱気装置２、移動相送液ポンプ３、試料注入部４、カラムオーブン５、示差屈折率検出器１２などにより構成される。制御データ処理プログラム９はＧＰＣ−８０２０ ｍｏｄｅｌＩＩを使用、分析カラム１０としてはＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＭｕｌｔｉｐｏｒｅ ＰＷ−Ｎ（いずれも東ソー株式会社製）を２本直列に接続したものを使用した。
サイズ排除クロマトグラフによって得られたクロマトグラムでは、高分子材料などの分子量分布の後に、試料中の添加物や、試料を溶解させるときに用いる溶媒や、試料に意図せず溶け込んだ空気由来のガスなどにより負方向のピークが出現することがある。本実施例では、本クロマトグラフ装置にて下記試料を分析して得られたクロマトグラムに対して、負方向のピークの直前に出現するポリオキシエチレンラウリルエーテルのピークについて、本発明を用いて負方向のピークの影響を受けないピーク検出が可能か検証した。
試料３：ポリオキシエチレンラウリルエーテル４．０ｇを２００ｍｍｏｌ／Ｌ硝酸ナトリウム＋２０％アセトニトリルの溶液１００ｍＬに溶解したもの
試料注入量：５０μＬ
カラムオーブン温度：４０℃
移動相流量：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
移動相組成：２００ｍｍｏｌ／Ｌ硝酸ナトリウム＋３０％アセトニトリル
サンプリングピッチ：５０ｍｓ
従来法にて試料３を測定し得られたクロマトグラムにてピーク検出を行い、ベースラインを指定した結果を図９（ａ）に示す。ピーク検出に関しては表２に示す条件で実施した。

まず、ピーク検出が完了したクロマトグラムについて閾値を０．１００ｍＶに設定し、負方向のピークの影響を受けているピークがあるかを確認した。５４．８４８ｍＶの差があり、ピークエンド異常となっていることがわかった。
次に、ピークトップ時間に１．０３０、ピークエンド時間に０．９７０を係数として乗じ、出力変化量が最大となる時間を探索した。本クロマトグラムではピークトップ時間が７．８０５分、ピークエンド時間が９．７７０分となったことから、探索範囲は８．０３９分〜９．４７７分とし、９．１７１分で出力変化量が最大となることがわかった。
次に、出力変化量が最大となった時間をピークエンド時間とすることでピークエンド異常を修正した。直後の負方向のピークによりベースラインが異常となったポリオキシエチレンラウリルエーテルのピークについて、本発明を実施することにより、正しくピークエンドを修正することができ、正しいベースラインを操作者の判断を必要とせずに取得可能であることが確認できた。

１．移動相および移動相ボトル
２．移動相脱気装置
３．移動相送液ポンプ
４．試料注入部
５．カラムオーブン
６．サプレッサー
７．電気伝導度検出器
８．廃液タンク
９．データ処理プログラム
１０．分析カラム
１１．ガードカラム
１２．示差屈折率検出器

Claims (4)

1. クロマトグラムのピーク処理方法であって、
   目的ピークの前方に出現する負方向のピークにより、前記目的ピークのピークスタートの出力値がピークエンドの出力値よりも任意の閾値を超えて小さい前記目的ピークに対して、
   前記目的ピークのピークスタート時間に１．０を超える係数を乗じた時間から前記目的ピークのピークトップ時間に１．０未満の係数を乗じた時間までの間で、出力変化量が最小となる時間を真のピークスタート時間とし、
   前記目的ピークのピークスタート時間を真のピークスタート時間からとすることを特徴とする前記方法。
2. クロマトグラムのピーク処理方法であって、
   目的ピークの後方に出現する負方向のピークにより、前記目的ピークのピークエンドの出力値がピークスタートの出力値よりも任意の閾値を超えて小さい前記目的ピークに対して、
   前記目的ピークのピークトップ時間に１．０を超える係数を乗じた時間から前記目的ピークのピークエンド時間に１．０未満の係数を乗じた時間までの間で、出力変化量が最大となる時間を真のピークエンド時間とし、
   前記目的ピークのピークエンド時間を真のピークエンド時間までとすることを行うことを特徴とする前記方法。
3. クロマトグラム上の各ピークについて、ピークスタートの出力値とピークエンドの出力値の差分を算出し、
   ピークスタートの出力値がピークエンドの出力値よりも任意の閾値を超えて小さいピークに対しては請求項１に記載の方法を実施し、ピークエンドの出力値がピークスタートの出力値よりも任意の閾値を超えて小さいピークに対しては請求項２に記載の方法を実施することを特徴とするクロマトグラムの処理方法。
4. 前記閾値又は／及び前記係数を操作者が指定することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。