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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Durchführen präparativer Chromatographie in
effizienter, wiederholbarer Weise.
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Hintergrund
der Erfindung
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Zu
den zahlreichen vorgeschlagenen und verwendeten präparativen
Chromatographietechniken gehören:
(1) Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HPLC, high performance liquid chromatography) mit Kreislaufrückführung und
(2) simulierte Wanderbettchromatographie (SMB, simulated moving
bed). HPLC mit Kreislaufrückführung ist
zumindest seit 1959 bekannt (R.S. Porter und J.F. Johnson, Nature,
183, 391 (1959)). Bei einer Kreislaufrückführung wird das chromatographische
Profil nach Eluieren aus der Säule
und Hindurchgehen durch den Detektor zur Saugseite der Lösungsmittelpumpe
geleitet. Das Profil wird dann wieder durch die Säule geschickt,
d.h. wird rückgeführt. Diese
Rückführung vergrößert die
Zahl theoretischer Platten, welche für die Trennung verfügbar sind,
weil eine Kreislaufrückführung im
wesentlichen die Verwendung einer längeren Säule simuliert. Somit wird die
Auflösung
nach jedem Durchgang vergrößert. Da
in der Pumpe eine Vermischung auftritt, wird etwas von der Trennung,
welche in der Säule
entstand, zerstört.
Daher ist eine Kreislaufrückführung nur
durchführbar,
wenn die Auflösung,
die jedes Mal gewonnen wird, wenn das Profil durch die Säule hindurchgeht,
größer ist
als der Verlust an Auflösung
aufgrund der Vermischung bei jedem Mal, bei dem das Profil durch
die Pumpe geht. In der Praxis bedeutet dies, daß das Volumen der Säule viel
größer sein muß als das
Volumen der Pumpe. Während
jeglichen Durchgangs, bei dem eine hinreichende Auflösung erzielt
worden ist, werden Fraktionen von den führenden und nachlaufenden Rändern des
chromatographischen Profils gesammelt oder abgeschnitten, wobei
Sammelventile oder ein getrennter Fraktionssammler verwendet wird.
Ein Übersichtsartikel,
welcher die Verwendung einer Kreislaufrückführung bei der Trennung von
Enantiomeren diskutiert, ist jüngst
veröffentlicht
worden (J. Dingenen und J.N. Kinkel, J. Chromatography A, 666, 627 (1994)).
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Die
SMB-Chromatographie ist in den frühen 1960ern durch Mitarbeiter
am UOP erfunden worden (D.B. Broughton, R.W. Neuzil, J.M. Pharis,
C.S. Brearly, Chem. Eng. Progress, 66(9), 70 (1970)). Die SMB-Chromatographie
ist ein kontinuierliches Verfahren, bei dem Ausgangsmaterial kontinuierlich
in das Innere des zirkulierenden SMB-Profils eingespritzt wird;
zwei Produktströme
(Extrakt und Raffinat) werden kontinuierlich gesammelt; und frische
mobile Phase wird ebenfalls kontinuierlich hinzugefügt. Das
gesamte Profil wandert im System. Beispielsweise wird bei einem
SMB-System mit einem 16-Säulenfeld
zu einem bestimmten Zeitpunkt das Ausgangsmaterial zwischen den
Säulen 7 und 8 eingespritzt;
die mobile Phase wird zwischen den Säulen 16 und 1 eingespritzt;
das Raffinat wird zwischen den Säulen 11 und 12 gesammelt
und das Extrakt wird zwischen den Säulen 3 und 4 gesammelt.
Wenn sich das Profil um eine hinreichende Distanz durch das System
bewegt, werden alle Einspritz- und Sammelpunkte simultan um eine
Säulenlänge weitergeschaltet.
Beispielsweise wird der Zufuhrpunkt auf zwischen den Säulen 9 und 10 umgeschaltet;
der mobile Phasenpunkt auf zwischen den Säulen 1 und 2;
der Raffinatpunkt auf zwischen den Säulen 12 und 13 und
der Extraktionspunkt auf zwi schen den Säulen 4 und 5.
Das Umschalten tritt periodisch zu den geeigneten Zeitpunkten auf.
Im Fließgleichgewicht
wird eine Massenbalance aufrechterhalten, bei der die Menge jeder
eingespritzten Komponente gleich der Menge jeder gesammelten Komponente
ist. Im Fließgleichgewicht
verbleibt das chromatographische Profil in Form und Zusammensetzung
konstant. Ein weiteres Charakteristikum der SMB-Chromatographie
ist, dass es vier Flußraten über das
Profil gibt. Es ist auch wichtig herauszustreichen, daß SMB-Chromatographie
wahrhaft kontinuierlich ist: die mobile Phase und die Zufuhrpumpen
hören niemals auf,
Material in das System einzupumpen; die Extrakt- und Raffinatleitungen
hören niemals
auf, gesammeltes gereinigtes Material zu liefern.
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Bei
einer präparativen
HPLC mit Kreislaufrückführung werden
nachfolgende Einspritzungen nur vorgenommen, nachdem alle Komponenten
der Probe gesammelt oder in den Abfall geschickt worden sind. Somit wird
bei üblicher
präparativer
HPLC mit Kreislaufrückführung (oder
jeder anderen Art von Stapelmodus-Chromatographie) frische Probe niemals
in das Innere des chromatographischen Profils eingespritzt.
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Bei
simulierter Wanderbett-SMB-Chromatographie wird eine frische Probe
kontinuierlich in das Innere des umlaufenden chromatographischen
Profils eingespritzt und die zwei Produktströme werden kontinuierlich von
jedem Ende des Profils gesammelt. SMB ist damit ein binärer Trennungsprozeß, weil
nur zwei Fraktionen gesammelt werden. Eine Einspritzung in das Innere
des Profils macht die Trennung inhärent zu einem binären Trennungsprozeß.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Eine
Aufgabe der Erfindung ist es, ökonomische
und effiziente präparative
HPLC-Verfahren bereitzustellen. Die Erfindung ist gerichtet auf
einen präparativen
chromatographischen Umlaufprozeß,
wie in Anspruch 1 definiert.
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Man
kann ein präparatives
chromatographisches Umlaufverfahren unter Verwendung einer einzelnen Säule bereitstellen,
dass im Fließgleichgewicht
umfaßt:
- (a) Etablieren und Aufrechterhalten eines umlaufenden
chromatographischen Profils durch die Säule und durch eine Lösungsmittelpumpe;
- (b) diskontinuierliches und periodisches Einspritzen einer Probe,
welche zumindest zwei Komponenten umfaßt, in das Innere des aufrechterhaltenen
umlaufenden Profils; und
- (c) diskontinuierliches und periodisches Sammeln von zumindest
zwei angereicherten Fraktionen aus dem umlaufenden Profil. Zusätzlich ist
es in einer weiten Ausführungsform üblich, den
Betriebsschritt (d) des Benutzens der Lösungsmittelpumpe zum Pumpen
von Lösungsmittel
als einer mobilen Phase im wesentlichen kontinuierlich in die Säule während eines
einzelnen Umlaufs zu verwenden.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der Erfindung, werden alle Ereignisse in einem Umlauf
nach dem Einleiten des Sammelns der ersten Fraktion in bezug auf
die Zeit der Einleitung des Sammelns der ersten Fraktion referenziert
und die mobile Phasenpumpe kann während des Sammelns der letzten
Fraktion nahe am Ende eines Umlaufs abgeschaltet werden. Dieser
Aspekt der Erfindung führt
zu einer sehr reproduzierbaren durchschnittlichen Zirkulationszeit
für das
chromatographische Profil und damit zu einem Verfahren, das von
Umlauf zu Umlauf sehr reproduzierbar ist. Weiterhin gestattet dieser
Aspekt der Erfindung eine automatische Kompensation von Abweichungen
bei der Umlaufzeit des chromatographischen Profils aufgrund von
geringen Abweichungen bei Faktoren wie etwa Temperatur, mobile Phasenstärke, Pumpgeschwindigkeit,
etc..
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Um
das Verfahren der Erfindung durchzuführen, umfassen Merkmale der
Vorrichtung: eine Lösungsmittelpumpe,
eine Einspritzpumpe, ein Einspritzventil und eine Einspritzschleife,
Sammelventile, ein Rückführventil,
und eine mit einer geeigneten stationären Phase bepackte chromatographische
Säule.
Jegliche Art präparativer
chromatographischer Säule
kann verwendet werden. Ein Detektor kann verwendet werden, obwohl ein
Detektor nicht essentiell für
die Leistung der Erfindung ist. Vermittels der bevorzugten Verwendung
des Detektors wird das gesamte Verfahren sichtbar und intuitiv,
was eine Methodenentwicklung sehr erleichtert. Noch wichtiger ist,
dass der Detektor die Verwendung von Software beim Einleiten aller
Sammel- und Steuerereignisse gestattet, wie etwa das Sammeln von
Fraktionen, das Einspritzen einer frischen Probe, die Pumpensteuerung,
etc. gestattet. Durch Messen von Parametern wie der steigenden und
fallenden Flanke, der charakteristischen Absorption, der Funktionen
der Absorptionen, der charakteristischen optischen Aktivität, des refraktiven
Index, des pH, etc. bestimmt eine solche Software den korrekten
Punkt auf dem chromatographischen Profil, um ein gegebenes Ereignis
einzuleiten.
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Die
Software gestattet auch, daß Sammel-
und Steuerereignisse zeitbestimmte Ereignisse sind. Es wird bevorzugt,
daß einige,
falls nicht sogar alle, Steuerereignisse einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf, Ventilschaltung, Ein- und Ausschalten von Pumpen und Einstellen
von Pumpenflußraten
von der Software einzig auf Zeit-Basis eingeleitet werden. Andererseits
wird es, wenn kein Detektor verwendet wird, bevorzugt, daß das Fortschreiten
und der Erfolg der Trennung durch periodisches und/oder Online-Probennehmen
von Fraktionen, gefolgt von einer Analyse der Fraktionen durch analytische
Instrumente, die nicht mit dem präparativen chromatographischen
Verfahren assoziiert sind, bestimmt wird.
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Zum
Erzielen bester Ergebnisse sollte das Verfahren der vorliegenden
Erfindung durch die Verwendung eines konventionellen Computers und
von Steuersoftware automatisiert werden. Obwohl nicht empfohlen,
ist es möglich,
das Verfahren manuell zu betreiben.
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Das
Verfahren kann verwendet werden, um jede Art von chromatographischer
Trennung durchzuführen,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf, normale phasenchromatographische Trennungen, umkehrphasenchromatographische
Trennungen, chirale chromatographische Trennungen, Ionenaustausch-chromatographische
Trennungen, affinitätschromatographische
Trennungen, und Größenausschluß-chromatographische
Trennungen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in jedem
Maßstab
ausgeführt
werden, sowohl größer als
auch kleiner als derjenige der Beispiele, die später präsentiert werden.
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Vergleich
mit Systemen des Stands der Technik
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Bei
der vorliegenden Erfindung werden Proben periodisch und diskontinuierlich
in das Innere des umlaufenden chromatographischen Profils eingespritzt.
Es ist dahingehend zur SMB ähnlich,
daß eine
Probe in das Innere des Profils eingespritzt wird. Es unterscheidet
sich von der SMB darin, daß das
Verfahren nicht kontinuierlich ist. Wie bei der SMB werden Fraktionen
an beiden Enden des Profils gesammelt. Es ist damit im wesentlichen
eine binäre
Trennungstechnik. Obwohl leicht mehr als zwei Fraktionen gesammelt
werden können,
ist das Verfahren immer noch binär,
weil die Fraktionen nur von den vorderen und hinteren Teilen des
Profils genommen werden.
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Die
Vorteile des Einspritzen in das Innere des Profils im Vergleich
zur konventionellen und Kreislaufrückführungschromatographie sind
die folgenden:
- • nur ein kleines Maß an Auflösung der
Spitzen ist notwendig. Somit können
relativ preisgünstige
stationäre Phasen
zum Beladen der Säulen
verwendet werden.
- • Weil
keine hohe Auflösung
nötig ist,
können
hohe Fließraten
verwendet werden. Dies verbessert die Produktivität signifikant.
- • Weil
keine hohe Auflösung
benötigt
wird, können
starke mobile Phasen verwendet werden. Die steigert die Produktivität signifikant.
- • Weil
man in das Innere des Profils einspritzt, treten Injektionen häufiger auf.
Dies steigert die Produktivität signifikant.
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Der
Stand der Technik enthält
drei Patente, welche relevant sind:
US
4,267,054 ,
US 4,379,751 ,
und
US 4,970,002 . Obwohl
die Verfahren in diesen Patenten Kreislaufrückführung und Intra-Profileinspritzung
von Proben zeigen, erfordern sie zwei Säulen oder eine sehr komplizierte
Säule,
die eigentlich ein Zweisäulensystem
ist. Die vorliegende Erfindung verwendet nur eine einzelne präparative
HPLC-Säule.
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Auch
im Stand der Technik ist ein Artikel von M. Bailly und D. Tondeur
(Chem. Eng. Sci. 37(8), 1199–1212,
1982), in dem ein Rückführchromatographieverfahren
beschrieben wird, an dem ein gründliches Mischen
des gesamten rückgeführten chromatographi schen
Profils mit einer frischen Probe und eine Re-Injektion beteiligt
sind. Beim von Bailly und Tondeur beschriebenen Verfahren wird die
Auflösung,
die sich im chromatographischen Profil als Ergebnis seines Durchgangs
durch die Säule
entwickelt hat, durch Vermischen des gesamten Profils mit der frischen
Probe vor der Re-Injektion zerstört.
Die vorliegende Erfindung verwendet ein präzises Einspritzen frische Probe
an einer präzisen
Stelle in das bewahrte umlaufende chromatographische Profil. Es
tritt keine signifikante Vermischung zwischen der frischen Probe
und dem umlaufenden chromatographischen Profil vor oder während des
Einspritzprozesses auf. Die vorliegende Erfindung ist daher ein überlegener
Prozeß dahingehend,
daß die
im chromatographischen Profil entstandene Auflösung als Ergebnis ihres Durchgangs
durch die Säule
nicht vor dem Einspritzen durch Vermischen mit Probe zerstört wird.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Für ein besseres
Verständnis
der vorliegenden Erfindung werden eine detaillierte Beschreibung
des Verfahrens der chromatographischen Trennung von Fluidmischungen
in Fraktionen und Beispiele, welche die chromatographischen Ausführungsformen
illustrieren, unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen gegeben, in
denen:
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1 ein
schematisches Flußdiagramm
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist;
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2 ein
schematisches Flußdiagramm
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist, die sich von 1 im Plazieren
des Einspritzventils und der Einspritzschleife unterscheidet;
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3 das
Chromatogramm des Umlaufs 41 von Beispiel 1 ist;
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4 die überlagerten
Chromatogramme der Umläufe 3, 4, 7, 10 und 41 von
Beispiel 1 ist;
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5 die überlagerten
Chromatogramme der Umläufe 18 bis 23 von
Beispiel 1 ist;
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6 die überlagerten
Chromatogramme der Umläufe 24 bis 29 von
Beispiel 1 ist;
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7 die überlagerten
Chromatogramme der Umläufe 30 bis 35 von
Beispiel 1 ist;
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8 die überlagerten
Chromatogramme der Umläufe 36 bis 41 von
Beispiel 1 ist;
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9 die
analytischen Ergebnisse von Fraktion 1 von Beispiel 1 zeigt;
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10 die
analytischen Ergebnisse von Fraktion 2 von Beispiel 1 zeigt;
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11 das
Chromatogramm von Umlauf 13 von Beispiel 2 ist;
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12 die überlagerten
Chromatogramme der Umläufe 3 bis 7 von
Beispiel 2 ist;
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13 die überlagerten
Chromatogramme der Umläufe 8 bis 13 von
Beispiel 2 ist.
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Detaillierte
Beschreibung der Zeichnungen
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Unter
Bezugnahme auf die 1 und 2 sind die
Komponenten der Erfindung durch die folgenden Zahlen identifiziert:
- • 1 ist
der Lösungsmittelbehälter. Die
Lösungsmittelpumpe 2 zieht
nach Bedarf frische mobile Phase aus dem Lösungsmittelbehälter 1,
wann immer die Sammelventile 7 bis 10 oder das
Ablaßventil 11 offen
sind.
- • 2 ist
die Lösungsmittelpumpe.
Die Pumprate der Lösungsmittelpumpe 2 wird
typischerweise durch die Steuerungssoftware gesteuert, kann aber
auch manuell eingestellt werden.
- • 3 ist
die chromatographische Säule.
Jede Art von typischerweise bei präparativer HPLC verwendeter
Säule kann
verwendet werden.
- • 4 ist
der Detektor. Der Detektor kann ein W-Sicht-, refraktiver Index-,
Leitfähigkeits-
oder jegliche Art von Detektor sein, die typischerweise bei HPLC
verwendet wird. Für
beste Ergebnisse sollte eine Vollflussprobenzelle verwendet werden.
- • 5 ist
der Ventilverteilungsverzweiger, durch welchen ein Ausfluß aus der
Säule 3 und
dem Detektor 4 auf irgendeines der Ventile 6 bis 11 geleitet
wird, von denen nur eines gleichzeitig geöffnet werden kann.
- • 6 ist
das Rückführventil.
Wenn dieses Ventil offen ist, wird der Ausfluß aus der Säule 3 und dem Detektor 4 auf
die Ansaugseite der Lösungsmittelpumpe 2 geleitet.
Das Rückführventil 6 ist
geöffnet,
wenn das gesamte oder Teil des chromatographischen Profils durch
die Säule 3 rückgeführt werden
soll. Das Rückführventil 6 wird
typischerweise durch die Steuerungssoftware gesteuert.
- • 7, 8, 9 und 10 sind
Fraktionssammelventile. Eines dieser Ventile wird geöffnet, wenn
gewünscht
wird, eine Fraktion zu sammeln. Diese Ventile werden typischerweise
durch die Steuerungssoftware gesteuert.
- • 11 ist
das Ablassventil. Dieses Ventil wird geöffnet, wenn gewünscht wird,
den Ausfluß aus
der Säule 3 und
dem Detektor 4 in den Abfall zu schicken. Dieses Ventil
wird typischerweise durch die Steuerungssoftware gesteuert.
- • Die
Komponenten 12 bis 16 bilden das Probeneinspritzventilsystem.
– 12 ist
das 6-Wege-Einspritzventil.
– 13 ist die Einspritzschleife.
– 14 ist
der Ablaßdurchgang
des Einspritzventils 12.
– 15 ist der Probenbehälter.
– 16 ist
die Probeneinspritzpumpe.
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Betrieb der
Erfindung
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Das
Folgende ist eine Beschreibung des Betriebs der in 1 gezeigten
bevorzugten Ausführungsform:
Am
Anfang des Laufs wird die Einspritzschleife 13 mit Probe
gefüllt.
Um dies zu erreichen, wird das Einspritzventil 12 in der
durch den gestrichelten Flusspfad angezeigten Ladeposition plaziert
und die Einspritzpumpe 16 wird eingeschaltet. Die Probe
wird somit aus dem Probenbehälter 15 gesaugt
und in die Einspritzschleife 13 gepumpt. Wenn die Einspritzschleife 13 gefüllt ist,
wird die Einspritzpumpe 16 abgeschaltet. Überschußprobe geht
durch den Ablaßdurchgang 14 in
den Abfall. Während
dieses anfänglichen
Füllens
der Einspritzschleife 13 zieht die Lösungsmittelpumpe 2 mobile
Phase aus dem mobilen Phasenbehälter 1.
Der Ausfluß aus
der Säule 3 und
dem Detektor 4 folgt dem gestrichelten Flusspfad durch
das Einspritzventil 12 und geht durch Ventil 11 in
den Abfall.
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Das
anfängliche
Einspritzen von Probe wird wie folgt durchgeführt. Gleichzeitig wird das
Einspritzventil 12 in der Einspritzposition plaziert, die
durch den Flusspfad der durchgezogenen Linie angezeigt ist, das
Rückführventil 6 geöffnet und
das Ablassventil 11 geschlossen. Die Lösungsmittelpumpe 2 veranlaßt die mobile Phase,
im Uhrzeigersinn im System zirkuliert zu werden, wie in 1 dargestellt.
Die Probe in der Einspritzschleife 13 wird daher durch
das Rückführventil 6,
durch die Lösungsmittelpumpe 2 und
auf die Säule 3 geführt. Wenn
die gesamte ursprünglich
in der Einspritzschleife 13 befindliche Probe auf die Säule 3 gepumpt worden
ist, ist die anfängliche
Einspritzung abgeschlossen.
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Nun
beginnt die repetitive Phase des Verfahrens. Die folgende Abfolge
von Ereignissen tritt bei jedem Umlauf auf:
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Ereignis 1-1:
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Wenn
das gesamte chromatographische Profil auf der Säule 3 ist, d.h. nachdem
das gesamte Profil auf die Säule 3 geleitet
worden ist und bevor irgend etwas von dem Profil aus der Säule 3 eluiert,
wird das Einspritzventil 12 zur Ladeposition umgeschaltet,
die durch den gestrichelten Flusspfad angezeigt ist; das Ablassventil 11 wird
geöffnet
und jedes der Ventile 6 bis 10, das geöffnet worden
sein könnte,
wird geschlossen. Der Ausfluß aus
der Säule 3 und
dem Detektor 4 folgt dem gestrichelten Flusspfad durch
das Einspritzventil 12 und geht durch Ventil 11 in
den Abfall. Dieser Abfallsammelschritt verhindert, daß irgendwelche
Umlaufverunreinigungen zukünftige
Fraktionen kontaminieren. Während
dieses Ereignisses wird die Lösungsmittelpumpe 2 angeschaltet
und zieht frische mobile Phase aus dem Lösungsmitteltank 1,
um die durch das Ablassventil 11 verlorene mobile Phase
auszugleichen.
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Ereignis 1-2:
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Zur
geeigneten Zeit wird die Einspritzschleife 13 mit Probe
gefüllt,
wie oben beschrieben, indem die Probeneinspritzpumpe 16 für den notwendigen
Zeitraum eingeschaltet wird. Während
dieses Ereignisses geht der Ausfluß aus der Säule 3 und dem Detektor 4 durch
das Ablassventil 11 in den Abfall. Dieser Abfallsammelschritt
verhindert, daß irgendwelche
umlaufenden Verunreinigungen zukünftige
Fraktionen kontaminieren. Während
dieses Ereignisses wird frische mobile Phase aus dem Lösungsmitteltank 1 von
Lösungsmittelpumpe 2 angesaugt,
um die durch das Ablassventil 11 verlorene mobile Phase
auszugleichen.
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Ereignis 1-3:
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Wenn
das chromatographische Profil aus der Säule 3 eluiert, detektiert
der Detektor 4 den führende Rand
des Profils. Eines der Sammelventile 7 bis 10 wird
geöffnet,
um eine Fraktion aus dem führenden
Rand des Profils, die als Fraktion 1 definiert wird, zu
sammeln. Als Beispiel und um eine klare Beschreibung des Verfahrens
zu geben, wird das Ventil 7 als das Sammelventil für Fraktion 1 bezeichnet.
Gleichzeitig mit dem Öffnen des
Ventils 7 zum Sammeln der Fraktion 1 wird das
Ablassventil 11 geschlossen. Während des Sammelns von Fraktion 1 wird
frische mobile Pha se aus dem Lösungsmitteltank 1 von
der Lösungsmittelpumpe 2 angesaugt, um
die während
des Sammelns von Fraktion 1 verlorene mobile Phase auszugleichen.
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Ereignis 1-4:
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Zur
geeigneten Zeit schließt
das Ventil 7 und öffnet
das Rückführventil 6.
Dies beendet das Sammeln von Fraktion 1 und leitet den
Rest des chromatographischen Profils durch die Lösungsmittelpumpe 2 und
auf die Säule 3.
Es wird keine mobile Phase aus dem Lösungsmitteltank 1 von
der Lösungsmittelpumpe 2 angesaugt,
wenn das Rückführventil 6 geöffnet ist,
weil keine mobile Phase durch irgendeines der geschlossenen Ventile 7 bis 11 verloren
geht.
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Ereignis 1-5:
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Zur
geeigneten Zeit, wenn der zentrale Teil des chromatographischen
Profils aus der Säule 3 eluiert, wird
das Einspritzventil 12 auf die durch den Flusspfad der
durchgezogenen Linie angezeigte Einspritzposition geschaltet. Ausfluß aus der
Säule 3 und
dem Detektor 4 wird durch die Einspritzschleife 13 umgeleitet.
Somit wird eine frische Probe am geeigneten Punkt im Profil in das
Innere des chromatographischen Profils eingespritzt. Das Profil
schreitet durch das Rückführventil 6,
durch die Lösungsmittelpumpe 2,
und auf die Säule 3 fort.
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Ereignis 1-6:
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Mit
Fortsetzen der Eluierung des chromatographischen Profils aus der
Säule 3 und
dem Detektor 4 und zur geeigneten Zeit wird eines der Sammelventile 7 bis 10 geöffnet, um
eine Fraktion aus dem nachlaufenden Rand des Profils, definiert
als Fraktion 2, zu sammeln. Beispielhaft und um eine klare
Beschreibung des Verfahrens zu geben, wird Ventil 9 als
das Sammelventil für
Fraktion 2 bezeichnet. Während des Sammelns von Fraktion 2 wird
frische mobile Phase aus dem Lösungsmitteltank 1 von
der Lösungsmittelpumpe 2 angesaugt,
um die während
des Sammelns von Fraktion 2 verlorene mobile Phase auszugleichen.
Das chromatographische Profil, das in den Ereignissen 1-4 und 1-5
auf die Säule
rückgeführt wurde,
wandert weiterhin unter dem Einfluß der Lösungsmittelpumpe 2 die
Säule hinunter.
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Ereignis 1-7:
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Zur
geeigneten Zeit schließt
Ventil 9 und ein anderes der Ventile 7 bis 11 öffnet sich.
Beispielhaft und um eine klare Beschreibung des Verfahrens zu geben,
wird Ventil 10 als das Sammelventil für dieses Ereignis bezeichnet.
Dieses Ereignis tritt auf, nachdem der Großteil des nachlaufenden Rands
als Fraktion 2 gesammelt worden ist; das heißt, dieses
Ereignis tritt am "Schwanz" des Profils auf,
wenn das Profil gemäß Messung durch
den Detektor 4 fast bis auf die Basislinie zurückgekehrt
ist. Somit kann man sich dieses Ereignis als die Sammlung einer
sehr verdünnten
Fraktion oder einer Abfallfraktion denken, die in beiden Fällen als
Fraktion 3 bezeichnet wird. Dieses Sammelereignis setzt
sich fort, bis der gesamte "Schwanz" des Profils gesammelt
ist. Das chromatographische Profil, das in Ereignissen 1-4 und 1-5
auf die Säule 3 rück geführt wurde,
wandert weiter unter dem Einfluß der
Lösungsmittelpumpe 2 die
Säule hinunter.
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Ereignis 1-8: (Optional).
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Ereignis
1-8 stellt in einer neuen Weise extrem reproduzierbare Umläufe auf
einer Zeitbasis zur Verfügung.
Die Lösungsmittelpumpe 2 wird
einige Zeit nach Einleitung des Ereignisses 1-7 abgeschaltet. Das
Ereignis 1-8 wird nur genutzt, falls die Ereignisse 1-4 bis 1-7
im Bezug auf die Zeit zu Ereignis 1-3 referenziert werden. In solch
einem Fall tritt Ereignis 4 zu einem vorbestimmten Zeitraum
nach Einleitung von Ereignis 1-3 auf, Ereignis 5 tritt
zu einem vorbestimmten Zeitraum nach Einleitung von Ereignis 1-3
auf, etc.. Auch Ereignis 1-8 wird im bezug auf die Zeit zum Ereignis
1-3 referenziert, d.h. Ereignis 1-8 tritt zu einem vorgegebenen
Zeitraum nach Einleitung von Ereignis 1-3 auf. Nach der Einleitung
von Ereignis 1-8 bleibt die Lösungsmittelpumpe 2 bis
zum Ende des Umlaufs abgeschaltet. Falls Ereignis 1-8 nicht benutzt
werden sollte und falls eine Umlaufzeit gewählt werden sollte, die etwas
länger
als die wahre Zirkulationszeit des chromatographischen Profils ist, würde sich
das Profil bei jedem Umlauf zu immer früheren Zeiten verschieben und
schließlich
würde der
führende
Rand des Profils vor dem Beginn des Umlaufs auftreten.
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Umgekehrt
würde,
falls eine Umlaufzeit gewählt
würde,
die etwas kürzer
als die wahre Zirkulationszeit des chromatographischen Profils ist,
sich das Profil zu immer späteren
Zeiten bei je dem Umlauf verschieben und schließlich würde der nachlaufende Rand des
Profils in den nächsten
Umlauf übertragen
werden. Um Ereignis 1-8 zu verwenden, wird eine Umlaufzeit gewählt, die
etwas länger
als die wahre Zirkulationszeit des Profils ist. Das Profil tendiert
dann dazu, sich zu früheren
Zeiten zu verschieben. Jedoch wird dies die Lösungsmittelpumpe 2 veranlassen,
für eine
längere
Zeit aus zu sein, womit die Durchschnittsgeschwindigkeit des umlaufenden
Profils vermindert wird. Falls sich das Profil zu sehr verlangsamt,
wird das Profil dazu tendieren, sich zu längeren Zeiten zu verschieben.
Dies wird die Lösungsmittelpumpe 2 dazu
veranlassen, für
eine kürzere Zeit
aus zu sein, womit die Durchschnittsgeschwindigkeit des umlaufenden
Profils vergrößert wird.
Somit wird die Zirkulationszeit des Profils dazu gezwungen, ein
wenig um die gewählte
Umlaufzeit zu oszillieren. Dies führt zu einer sehr reproduzierbaren
Durchschnittszirkulationszeit für
das chromatographische Profil und damit zu einem Verfahren, das
von Umlauf zu Umlauf sehr reproduzierbar ist. Diese Technik gestattet
eine automatische Kompensation von Abweichungen der Durchschnittszirkulationszeit
des chromatographischen Profils aufgrund von geringen Abweichungen
in Faktoren wie etwa Temperatur, mobiler Phasenstärke, Pumpgeschwindigkeit,
etc.. Falls das Ereignis 1-8 nicht benutzt wird, werden die Absolutzeiten
jedes Steuer- und Sammelereignis in die Steuerungssoftware eingegeben.
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Der
Umlauf endet entweder mit dem Ende von Ereignis 1-7 oder 1-8 und
die Sequenz von Ereignissen beginnt wieder mit Ereignis 1-1. Das
Verfahren wird viele Male wiederholt. Schließlich entwickelt sich ein Massengleichgewicht;
d.h. die Menge jeder der in den Fraktionen gesammelten Komponenten
ist gleich der Menge jeder eingespritzten Komponente. Das Chromatogramm
hat dann die Anmutung eines Fließgleichgewichtprozesses; d.h.
die Form der chromatographischen Kurve, wie vom Detektor gemessen,
ist für
jeden Umlauf praktisch identisch. Dieser Zustand könnte als
ein periodisches Fließgleichgewicht
akkurat dahingehend beschrieben werden, dass sich das Profil in
seiner Größe expandiert
und kontrahiert, während
es im Kreislauf wandert, abhängig
davon, ob Probe eingespritzt wird, Fraktionen gesammelt werden,
oder ob das Profil einfach die Säule
herunter wandert und den Trennungsprozess durchläuft. Aus Gründen der Kürze wird im folgenden dieser Zustand
als ein Fließgleichgewicht
bezeichnet. Wenn einmal der Prozeß Fließgleichgewichtszustand erreicht hat,
kann der Prozeß so
viele Male wiederholt werden, wie nötig um die gewünschte Probenmenge
zu trennen.
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Das
Folgende ist eine Beschreibung des Betriebs der bevorzugten, in 2 gezeigten
Ausführungsform:
Am
Anfang des Laufs wird die Einspritzschleife 13 mit Probe
gefüllt.
Um dies zu erreichen, wird das Einspritzventil 12 in der
durch den gestrichelten Flusspfad angezeigten Ladeposition plaziert
und die Einspritzpumpe 16 wird eingeschaltet. Damit wird
Probe aus dem Probentank 15 gesaugt und in die Einspritzschleife 13 gepumpt.
Wenn die Einspritzschleife 13 gefüllt ist, wird die Einspritzpumpe 16 abgeschaltet.
Jegliche Überschussprobe
geht durch den Ablassdurchgang 14 in den Abfall. Während dieses
anfänglichen
Füllens
der Einspritzschleife 13 zieht die Lösungsmittelpumpe 2 mobile
Phase aus dem mobilen Phasentank 1 und pumpt sie durch den
gestrichelten Flusspfad des Einspritzventils 12 und auf
die Säule 3.
Der Ausfluß aus
der Säule 3 und
dem Detektor 4 geht durch das Ventil 11 in den
Abfall.
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Das
anfängliche
Einspritzen von Probe wird wie folgt erreicht. Das Einspritzventil 12 wird
in der durch den Flußpfad
durchgezogener Linie angezeigten Einspritzposition plaziert. Die
Lösungsmittelpumpe 2 pumpt mobile
Phase durch die Einspritzschleife 13 und auf die Säule 3.
Die Probe in der Einspritzschleife 13 wird daher auf die
Säule 3 geleitet.
Wenn die gesamte ursprünglich
in der Einspritzschleife 13 befindliche Probe auf die Säule 3 gepumpt
worden ist, ist das anfängliche
Einspritzen abgeschlossen.
-
Nunmehr
beginnt die repetitive Phase des Verfahrens. Die folgende Abfolge
von Ereignissen tritt bei jedem Umlauf auf:
-
Ereignis 2-1:
-
Wenn
das gesamte chromatographische Profil auf der Säule 3 ist, d.h. nachdem
das gesamte Profil auf die Säule 3 geleitet
worden ist und bevor irgend etwas von dem Profil aus der Säule 3 eluiert,
wird das Einspritzventil 12 zur Ladeposition umgeschaltet,
die durch den gestrichelten Flusspfad angezeigt ist; das Ablassventil 11 wird
geöffnet
und jedes der Ventile 6 bis 10, das geöffnet worden
sein könnte,
wird geschlossen. Mobile Phase wird von der Lösungsmittelpumpe 2 aus
dem Lösungsmittelbehälter 1 durch
den gestrichelten Flusspfad eds Einspritzventils 12 und
auf die Säule 3 gepumpt.
Der Ausfluß aus
der Säule 3 und
dem Detektor 4 geht durch Ventil 11 in den Abfall.
Dieser Abfallsammelschritt ver hindert, daß jegliche umlaufenden Verunreinigungen
zukünftige
Fraktionen kontaminieren.
-
Ereignis 2-2:
-
Zur
geeigneten Zeit wird die Einspritzschleife 13 mit Probe
gefüllt,
wie oben beschrieben, indem die Probeneinspritzpumpe 16 für den benötigten Zeitraum
eingeschaltet wird. während
dieses Ereignisses geht der Ausfluß aus der Säule 3 und dem Detektor 4 durch
das Ablassventil 11 in den Abfall. Dieser Abfallsammelschritt
verhindert, daß irgendwelche
umlaufenden Verunreinigungen zukünftige
Fraktionen kontaminieren. Während
dieses Ereignisses wird frische mobile Phase aus dem Lösungsmitteltank 1 von
der Lösungsmittelpumpe 2 angesaugt,
um die durch das Ablassventil 11 verlorene mobile Phase
auszugleichen.
-
Ereignis 2-3:
-
Wenn
das chromatographische Profil aus der Säule 3 eluiert, detektiert
der Detektor 4 den führenden Rand
des Profils. Eines der Sammelventile 7 bis 10 wird
geöffnet,
um eine Fraktion aus dem führenden
Rand des Profils, die als Fraktion 1 definiert wird, zu
sammeln. Als Beispiel und um eine klare Beschreibung des Verfahrens
zu geben, wird das Ventil 7 als das Sammelventil für Fraktion 1 bezeichnet.
Gleichzeitig mit dem Öffnen des
Ventils 7, um die Fraktion 1 zu sammeln, wird
das Ablassventil 11 geschlossen. Während des Sammelns von Fraktion 1 wird
frische mobile Phase aus dem Lösungsmitteltank 1 durch
die Lösungsmittelpumpe 2 angesaugt,
um die während
des Sammelns von Fraktion 1 verlorene mobile Phase auszugleichen.
-
Ereignis 2-4:
-
Zur
geeigneten Zeit schließt
sich das Ventil 7 und öffnet
sich das Rückführventil 6.
Dies beendet das Sammeln von Fraktion 1 und leitet den
Rest des chromatographischen Profils durch die Lösungsmittelpumpe 2,
durch den gestrichelten Flusspfad des Einspritzventils 12 und
auf die Säule 3.
Es wird keine mobile Phase aus dem Lösungsmitteltank 1 durch
Lösungsmittelpumpe 2 gesaugt,
wenn das Rückführventil 6 geöffnet ist, weil
keine mobile Phase durch irgendeines der geschlossenen Ventile 7 bis 11 verloren
geht.
-
Ereignis 2-5:
-
Zur
geeigneten Zeit, wenn der zentrale Teil des chromatographischen
Profils aus der Säule 3 eluiert und
durch das Rückführventil 6 und
durch die Lösungsmittelpumpe 2 geführt wird,
wird das Einspritzventil 12 auf die durch den Flusspfad
durchgezogener Linie angezeigte Einspritzposition geschaltet. Ausfluß aus der
Lösungsmittelpumpe 2 wird
durch die Einspritzschleife 13 abgeleitet. Somit wird eine
frische Probe in das Innere des chromatographischen Profils zum
geeigneten Punkt im Profil eingespritzt. Das Profil schreitet durch
das Rückführventil 6,
durch die Lösungsmittelpumpe 2,
und auf die Säule 3 fort.
-
Ereignis 2-6:
-
Mit
Fortsetzen der Eluierung des chromatographischen Profils aus der
Säule 3 und
dem Detektor 4 und zur geeigneten Zeit wird eines der Sammelventile 7 bis 10 geöffnet, um
eine Fraktion aus dem nachlaufenden Rand des Profils, definiert
als Fraktion 2, zu sammeln. Beispielhaft und um eine klare
Beschreibung des Verfahrens zu geben, wird Ventil 9 als
das Sammelventil für
Fraktion 2 bezeichnet. Während des Sammelns von Fraktion 2 wird
frische mobile Phase aus dem Lösungsmitteltank 1 von
der Lösungsmittelpumpe 2 angesaugt,
um die während
des Sammelns von Fraktion 2 verlorene mobile Phase auszugleichen.
Das chromatographische Profil, das in den Ereignissen 2-4 und 2-5
auf die Säule
rückgeführt wurde,
wandert weiterhin unter dem Einfluß der Lösungsmittelpumpe 2 die
Säule hinunter.
-
Ereignis 2-7:
-
Zur
geeigneten Zeit schließt
Ventil 9 und ein anderes der Ventile 7 bis 11 öffnet sich.
Beispielhaft und um eine klare Beschreibung des Verfahrens zu geben,
wird Ventil 10 als das Sammelventil für dieses Ereignis bezeichnet.
Dieses Ereignis tritt auf, nachdem der Großteil des nachlaufenden Rands
als Fraktion 2 gesammelt worden ist; das heißt, dieses
Ereignis tritt am "Schwanz" des Profils auf,
wenn das Profil gemäß Messung durch
den Detektor 4 fast bis auf die Basislinie zurückgekehrt
ist. Somit kann man sich dieses Ereignis als die Sammlung einer
sehr verdünnten
Fraktion oder einer Abfallfraktion denken, die in beiden Fällen als
Fraktion 3 bezeichnet wird. Dieses Sammelereignis setzt
sich fort, bis der gesamte "Schwanz" des Profils gesammelt
ist. Das chromatographische Profil, das in Ereignissen 2-4 und 2-5
auf die Säule 3 rückgeführt wurde,
wandert weiter unter dem Einfluß der
Lösungsmittelpumpe 2 die
Säule hinunter.
-
Ereignis 2-8:
-
Wie
zuvor für
Ereignis 1-8 erläutert,
stellt Ereignis 2-8 in einer neuen Weise extrem reproduzierbare Umläufe auf
einer Zeitbasis zur Verfügung.
Die Lösungsmittelpumpe 2 wird
einige Zeit nach Einleitung des Ereignisses 2-7 abgeschaltet. Das
Ereignis 2-8 wird nur benutzt, falls die Ereignisse 2-4 bis 2-7
im Bezug auf die Zeit zu Ereignis 2-3 referenziert werden. In solch
einem Fall tritt Ereignis 2-4 zu einem vorbestimmten Zeitraum nach
Einleitung von Ereignis 2-3 auf, Ereignis 2-5 tritt zu einem vorbestimmten
Zeitraum nach Einleitung von Ereignis 2-3 auf, etc.. Ereignis 2-8
wird auch im bezug auf die Zeit zum Ereignis 2-3 referenziert, d.h.
Ereignis 2-8 tritt zu einem vorgegebenen Zeitraum nach Einleitung
von Ereignis 2-3 auf. Nach der Einleitung von Ereignis 2-8 bleibt
die Lösungsmittelpumpe 2 bis
zum Ende des Umlaufs abgeschaltet. Der Mechanismus und die Vorteile,
die oben für
Ereignis 1-8 beschreiben worden sind, gelten auch für Ereignis
2-8.
-
Der
Umlauf endet entweder mit dem Ende von Ereignis 2-7 oder 2-8 und
die Sequenz von Ereignissen beginnt wieder mit Ereignis 2-1. Das
Verfahren wird viele Male wiederholt. Schließlich entwickelt sich ein Massengleichgewicht;
d.h. die Menge jeder der in den Fraktionen gesammelten Komponenten
ist gleich der Menge jeder eingespritzten Komponente. Das Chromatogramm
hat dann die Anmutung eines Fließgleichgewichtprozesses; d.h.
die Form der chromatographischen Kurve, wie vom Detektor gemessen,
ist für
jeden Umlauf praktisch identisch. Wie oben angezeigt, könnte dieser
Zustand als ein periodisches Fließgleichgewicht akkurat dahingehend
beschrieben werden, dass sich das Profil in seiner Größe expandiert
und kontrahiert, während
es im Kreislauf wandert, abhängig
davon, ob Probe eingespritzt wird, Fraktionen gesammelt werden,
oder ob das Profil einfach die Säule
herunter wandert und den Trennungsprozess durchläuft, und wird nachfolgend als
ein Fließgleichgewichtszustand
bezeichnet. Wenn einmal der Prozess Fließgleichgewichtszustand erreicht
hat, kann der Prozess so viele Male wiederholt werden, wie nötig um die
gewünschte
Probenmenge zu trennen.
-
In
der vorliegenden Erfindung tritt alles Umschalten sequentiell auf,
nicht simultan, wie in der SMB. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung
ist daher nicht kontinuierlich, sondern eher diskontinuierlich und
repetitiv. Im Fließgleichgewichtszustand
ist die Zeit zwischen demselben Ereignis in aufeinanderfolgenden
Umläufen
konstant und wird die Umlaufzeit genannt. Man nehme beispielsweise
an, daß die
Umlaufzeit sechs Minuten beträgt.
In einem bestimmten Umlauf, wie Umlauf 30, wird das Einspritzventil 12 zur
durch den gestrichelten Flußpfad
in 1 angezeigte Ladeposition geschaltet. Sechs Minuten
später
wird das Einspritzventil wieder zur Ladeposition geschaltet; sechs
Minuten später
wird es wieder zur Ladeposition geschaltet, usw. Gleichermaßen wird
sich zu einem späteren
Zeitpunkt im Umlauf 30 das Sammelventil 7 öffnen, um
Fraktion 1 zu sammeln; sechs Minuten später wird sich das Sammelventil 7 wieder öffnen, um
Fraktion 1 zu sammeln, usw.. Dies passiert für alle Ereignisse
in jedem Umlauf. Sie alle treten wieder und wieder auf, wobei der
Abstand zwischen demselben Auftreten gleich der Umlaufzeit ist.
-
Die
vorliegende Erfindung ist ein repetitives Verfahren, das schließlich für Stunden
oder Tage laufen kann. Es ist daher wünschenswert, daß es mittels
Computersteuerung automatisiert werden kann. Ohne weitere Ausführungen
wird geglaubt, daß ein Fachmann
unter Verwendung der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung
in ihrem vollen Umfang ausnutzen kann. Die bevorzugten spezifischen
Ausführungsformen
und Beispiele sind daher nur als lediglich illustrativ aufzufassen
und nicht als den Rest der Beschreibung in irgendeiner Weise beschränkend.
-
In
den folgenden Beispielen werden Temperaturen unkorrigiert in °C angegeben
und wenn nicht anders angegeben, sind alle Teile und Prozente in
Gewicht.
-
Es
wurde die TurboPrep®-Steuerungssoftware, proprietäre Software
der EM Industries, Inc., bei allen in den nachfolgenden Beispielen
diskutierten Läufen
verwendet. Die Software lief auf einem 486er Computer der Dell Computer
Corporation. Die Schnittstelle zwischen Computer und Ausrüstung war
von Opto 22. In den nachfolgenden Beispielen war die Lösungsmittelpumpe 2 eine
präparative
HPLC-Pumpe ST 140 von EM Industries, Inc., Hawthorne, New York.
Die Fließrate
der Lösungsmittelpumpe
wurde mit der Steuerungssoftware eingestellt. Die Einspritzpumpe 16 war
eine Eldex Modell B-100-5-4 Meßpumpe.
Die Fließrate
für diese
Pumpe wurde mit einem Mikrometer manuell eingestellt. Die Eldex-Pumpe
wurde über
die Steuerungssoftware an- und ausgeschaltet.
-
Das
Einspritzventil 12 und sein luftbetriebenes Betätigungselement
wurden von Rheodyne erhalten. Das Rückführventil 6, das Ablassventil 11 und
die Sammelventile 7 bis 10 wurden von Mace erhalten.
Alle Ventile waren luftbetätigt
und wurden über
die Steuerungssoftware gesteuert.
-
Der
Detektor 4 wurde von Knauer erhalten. Es war ein UV HPLC-Detektor variabler
Wellenlänge,
der mit einer Hochdruckflußzelle
ausgestattet war.
-
Die
Säule 3 hatte
die folgenden Abmessungen: 2,5 cm Innendurchmesser × 25 cm
lang. Die Säule wurde
von Modcol (St. Louis, MO) mit Lichrospher C18, 12 μm Partikelgröße, 100 Å Porendurchmesser,
beladen. Lichrospher C18 ist eine Silica-basierte gebundene Phase der Merck KGaA
aus Darmstadt, Deutschland.
-
Es
wurden die folgenden experimentellen Bedingungen verwendet. Die
mobile Phase war Methanol:Wasser 90:10 Volumenteile. Sowohl das
Methanol als auch das Wasser waren von HPLC-Grad und wurden von
EM Science, Gibbstown, New Jersey erhalten. Die nominale Fließrate für die Lösungsmittelpumpe 2 war
2 mL/min.
-
Die,
die Trennung durchlaufende Mischung war eine Lösung von Methyl- und Propyl-p-Hydroxybenzoaten.
Die Methyl- und Propyl-p-Hydroxybenzoate
wurden von Aldrich erhalten. Die Probenlösung wurde durch Auflösen von
30 mg/mL sowohl von Methyl- als auch Propyl-p-Hydroxybenzoat in
Methanol:Wasser 80:20 Volumenteilen hergestellt. Das Methyl-p-Hydroxybenzoat
wird weniger zurückgehalten
und eluiert zuerst; das Propyl-p-Hydroxybenzoat eluierte als zweites.
-
Beispiele
-
Beispiel 1
-
Dieses
Beispiel, ein Lauf von 42 Umläufen,
verwendete die in 1 dargestellte bevorzugte Ausführungsform.
Die Umlaufzeit wurde auf 6,1 Min. eingestellt. Die anderen Betriebsbedingun gen
sind die im vorigen Abschnitt gegebenen. Die nominale Fließrate der
Eldex-Einspritzpumpe 16 wurde auf 20 ml/Min. eingestellt. Jede
Einspritzung trat 0,25 Minuten lang auf, was ein Einspritzvolumen
von 5,0 ml ergab. Somit wurden jedes Mal je 150 mg Methyl- und Propyl-p-Hydroxybenozoat
eingespritzt.
-
Ereignis
1-3, die Einleitung des Sammelns von Fraktion 1, wurde
durch Detektion der steigenden Flanke des chromatographischen Profils
ausgelöst.
Genauer gesagt wurde Ventil 7 geöffnet und Ventil 11 geschlossen,
wenn eine steigende Flanke gleich 20% des maximalen Detektorsignal
pro Sekunde von der Software detektiert wurde. Die Ereignisse 1-4
bis 1-8 wurden jedes zu gesetzten Zeiten nach der Einleitung von
Ereignis 1-3 ausgelöst. 3 zeigt
das Chromatogramm eines typischen Fließgleichgewichtsumlaufs, in
diesem Fall Umlauf 41. Die acht oben diskutierten Ereignisse
sind in 3 wie folgt bezeichnet:
- • E1
zeigt Ereignis 1-1 an: Das Einspritzventil 12 wurde in
Ladeposition plaziert, was durch den durchgezogenen Flusspfad in 1 angezeigt
ist. Das Ablassventil 11 wurde geöffnet. Dieses Ereignis trat
bei 0,0 Minuten im Umlauf auf.
- • E2-a
zeigt den Beginn von Ereignis 1-2: die Einspritzpumpe 16 wurde
eingeschaltet, um die Einspritzschleife 13 zu füllen. Dieses
Ereignis trat bei 0,10 Minuten im Umlauf auf.
- • E2-b
zeigt das Ende von Ereignis 1-2: die Einspritzpumpe 16 wurde
abgeschaltet, wenn die Einspritzschleife 13 gefüllt worden
war. Dieses Ereignis trat bei 0,35 Minuten im Umlauf auf.
- • E3
zeit Ereignis 1-3 an: Ventil 7 wurde geöffnet, um
das Sammeln von Fraktion 1, Methyl-p-Hydroxybenzoat, zu
beginnen. Dieses Ereignis trat auf, wenn eine steigende Flanke gleich
20% des maximalen Detektorsignals pro Sekunde von der Software detektiert
wurde. Wie in Tabelle 1 gezeigt, trat dieses Ereignis bei etwa 27
Sekunden oder bei etwa 0,45 Minuten im Umlauf auf.
- • E4
zeigt Ereignis 1-4 an: Ventil 7 wurde geschlossen, um das
Sammeln von Fraktion 1 zu beenden. Das Rückführventil 6 wurde
geöffnet,
um es dem unaufgelösten
chromatographischen Profil zu gestatten, auf Säule 3 über die
Lösungsmittelpumpe 3 rückgeführt zu werden.
Dieses Ereignis trat 0,6 Minuten nach Einleitung von Ereignis 1-3
oder bei etwa 1,05 Minuten im Umlauf auf.
- • E5
zeigt Ereignis 1-5 an: Das Einspritzventil 12 wurde auf
die Einspritzposition geschaltet, die durch den Flusspfad durchgezogener
Linie in 1 angezeigt ist. Das Innere
des chromatographischen Profils wurde damit abgeleitet, um durch
die Einspritzschleife 13 zu wandern. Dieses führte dazu,
dass 5,0 ml frischer Probe, 150 mg Methyl-p-Hydroxybenzoat und 150 mg Propyl-p-Hydroxybenzoat
in das Innere des chromatographischen Profils eingespritzt wurden.
Dieses Ereignis trat 0,90 Minuten nach Einleitung von Ereignis 1-3
oder bei etwa 1,35 Minuten im Umlauf auf.
- • E6-p
und E6-t zeigen Ereignis 1-6 an: Das Rückführventil 6 wurde geschlossen
und Ventil 9 wurde geöffnet,
um das Sammeln von Fraktion 2 zu beginnen. E6-t zeigt die
Zeit an, zu der dieses Ereignis auftrat, 3,30 Minuten nach Initiierung
von Ereignis 1-3 oder bei etwa 3,75 Minuten im Umlauf. Weil das
Profil durch die Einspritzschleife 13 wanderte, bevor es
das Sammelventil 9 erreichte, war der Teil des Profils,
der vom Sammelventil 9 gesammelt wurde, der jenige Teil,
der ungefähr
0,25 Minuten früher
durch den Detektor 4 gegangen war (5 ml/[20 ml/Min]). E6-p
zeigt daher den Punkt auf dem Profil an, an dem dieses Ereignis auftrat,
den Teil des Profils, wo das Sammeln von Fraktionen tatsächlich begann.
E6-p trat daher ungefähr 3,05
Minuten nach Einleitung von Ereignis 1-3 oder bei etwa 3,5 Minuten
im Umlauf auf. In den nachfolgenden Chromatogrammen für dieses
Beispiel wird der Anfang von Ereignis 1-6 durch E6-p angezeigt werden.
- • E7-p
und E7-t zeigen Ereignis 1-7 an: Das Sammelventil 9 wurde
geschlossen und das Sammelventil 10 wurde geöffnet, um
das Sammeln von Fraktion 3 zu beginnen. E7-t zeigt den
Zeitpunkt an, an dem dieses Ereignis auftrat, 4,30 Minuten nach
Initiierung von Ereignis 1-3 oder bei etwa 4,75 Minuten im Umlauf.
Weil das Profil durch die Einspritzschleife 13 wanderte,
bevor es das Sammelventil 10 erreichte, war der Teil des Profils,
der vom Sammelventil 10 gesammelt wurde, derjenige Teil,
der ungefähr
0,25 Minuten früher
durch den Detektor 4 hindurch ging (5 ml[20 ml/Min]). E7-p
zeigt daher den Punkt auf dem Profil an, an dem dieses Ereignis
auftrat, dem Teil des Profils, an dem das Sammeln von Fraktion 3 tatsächlich begann.
E6-p trat daher ungefähr
4,05 Minuten nach Einleitung von Ereignis 1-3 oder bei etwa 4,50
Minuten im Umlauf auf. In den nachfolgenden Chromatogrammen für dieses
Beispiel wird der Beginn von Ereignis 1-7 durch E7-p angezeigt.
- • E8
zeigt Ereignis 1-8 an: die Lösungsmittelpumpe
war bis zum Ende des Umlaufs ausgeschaltet. Dieses Ereignis trat
5,50 Minuten nach Einleitung von Ereignis 1-3 oder bei etwa 5,95
Minuten im Umlauf auf. Daher war die Lösungsmittelpumpe ungefähr 0,15
Minuten oder 9,0 Sekunden am Ende jeden Umlaufs abgeschaltet. Dieses
Ergebnis impliziert, daß die
wahre Umlaufzeit, d.h. die Zirkulationszeit des chromatographischen
Profils, ungefähr
5,95 Minuten unter den Temperatur-, Flußraten-, und mobile Phase-Zusammensetzungsbedingungen,
die für
diesen Lauf verwendet wurden, beträgt. Somit wird dieser Lauf
durch direktes Eingeben dieses Werts der Umlaufzeit (5,95 Minuten)
und der absoluten Zeit für
jedes Ereignis wie oben bestimmt (0,0 Minuten für E1, 0,1 Minuten für E2-a,
0,35 Minuten für
E2-b, 0,45 Minuten für
E3, 1,05 Minuten für
E4, 1,35 Minuten für
E5, 3,75 Minuten für
E6-t und 4,75 Minuten für
E7-t) in die Steuerungssoftware dupliziert werden. E8 würde nicht
verwendet worden sein, falls dieser direkte Ansatz verwendet worden
wäre.
-
4 zeigt
die überlagerten
Chromatogramme der Umläufe 3, 4, 7, 10 und 41.
Der führende
Teil des chromatographischen Profils erreichte durch Sammeln von
Fraktion 1 den Fließgleichgewichtszustand
im Umlauf 3. Es wird jedoch geschätzt, daß der Rest des chromatographischen
Profils etwa 18 Umläufe
brauchte, um Fließgleichgewichtszustand
zu erreichen. Das heißt,
daß die
Chromatogramme für
die Umläufe 18 bis 41 praktisch
identisch sind. Dies ist in 5 (Umläufe 18–23), 6 (Umläufe 24–29), 7 (Umläufe 30–35) und 8 (Umläufe 36–41)
illustriert.
-
Fraktion 1 (Methyl-p-Hydroxybenzoat)
und Fraktion 2 (Propyl-p-Hydroxybenzoat) wurden durch analytische
HPLC unter Verwendung einer Hitachi L-6000-Pumpe analysiert. Die
mobile Phase war Methanol:Wasser 60:40 und die Fließrate betrug
2,0 ml/Min. Sowohl das Methanol als auch das Wasser waren von HPLC-Grad
und wurden von EM Science erhalten. Die Säule mit Abmessungen 4 mm ID × 125 mm
wurde mit Lichrospher RP80 (12 μm
Partikelgröße) beladen
und von der Meck KGaA aus Darmstadt, Deutschland er halten. Ein Rheodyne
6-Weg-Ventil (Modell 7000L), ausgestattet mit einer 20 μl-Schleife,
wurde als das Einspritzventil verwendet. Der Detektor war ein UV-Detektor
variabler Wellenlänge
von Knauer. Die Wellenlänge
wurde für
jede Analyse auf 285 nm eingestellt.
-
Die
analytischen Ergebnisse für
Fraktion 1 sind in 9 gezeigt.
Vier Flaschen wurden abwechselnd verwendet, um Fraktion 1 zu
sammeln. Die erste Flasche wurde verwendet, um Fraktion 1 aus
den Umläufen 1–11 zu
sammeln; die zweite Flasche für
Umläufe 12–22;
die dritte Flasche für
Umläufe 23–32 und
die vierte Flasche für
Umläufe 33–42.
Die Reinheit der Fraktion 1, ausgedrückt als Flächen-%, war sehr hoch, und
betrug 99,8% innerhalb des experimentellen Fehlers für alle Umläufe. Jede
Reinheit in 9 ist ein Durchschnitt zumindest
dreier Messungen und jede Unsicherheit wird im 95% Zuverlässigkeitsintervall
ausgedrückt.
-
Die
analytischen Ergebnisse für
Fraktion 2 sind in 10 gezeigt.
Sechs Flaschen wurden abwechselnd verwendet, um Fraktion 2 zu
sammeln. Die erste Flasche wurde verwendet, um Fraktion 2 aus
den Umläufen 1–7 zu
sammeln, die zweite Flasche für
Umläufe 8–14;
die dritte Flasche für
Umläufe 15–21;
die vierte Flasche für
Umläufe 22–28;
die fünfte
Flasche für
Umläufe 29–35;
und die sechste Flasche für
Umläufe 36–42. Die
Reinheit von Fraktion 2, ausgedrückt als Flächen-%, betrug etwa 98,6% für die Umläufe 1–7.
Die Reinheit von Fraktion 2 für alle nachfolgenden Umläufe (Umläufe 8–42)
war größer als
99,6 Flächen-%
innerhalb des experimentellen Fehlers. Somit ist die Fließgleichgewichtsreinheit
(Umläufe 18–42)
von Fraktion 2 sehr hoch, größer als 99,6 Flächen-% innerhalb
des experimentellen Fehlers. Jede Reinheit in 10 ist
der Durchschnitt von zumindest drei Messungen und jede Unsicherheit
ist im 95%-Zuverlässigkeitsintervall
ausgedrückt.
-
Tabelle
1 zeigt die Zeiten für
jeden Umlauf, bei dem Ereignis 1-3, die Einleitung des Sammelns
von Fraktion 1, auftrat. Diese Zeiten sind ein Maß der Reproduzierbarkeit
der Umläufe
auf einer Zeitbasis im Fließgleichgewichtszustand.
Wie gezeigt, ist die Reproduzierbarkeit von Ereignis 1-3 sehr gut.
Da alle Ereignisse nach Ereignis 1-3 zu gegebenen Zeiträumen nach
Ereignis 1-3 auftraten, zeigten alle Ereigniszeiten exzellente Reproduzierbarkeit
von Umlauf zu Umlauf.
-
Tabelle
1: Zeitpunkt der Einleitung von Ereignis 1-3 für jeden Umlauf
-
Beispiel 2
-
Dieses
Beispiel, ein Lauf von 14 Zyklen, verwendete die in 2 dargestellte
bevorzugte Ausführungsform.
Die Umlaufzeit wurde auf 6,0 Min eingestellt. Die nominale Fließrate der
Eldex-Einspritzpumpe 16 wurde auf 20 ml/Min eingestellt.
Jede Einspritzung trat 0,16 Minuten lang auf, was ein Einspritzvolumen
von 3,2 ml ergab. Somit wurden jedes Mal je 96 mg Methyl- und Propyl-p-Hydroxybenzoat
eingespritzt. Die anderen Betriebsbedingungen sind die in Beispiel
1 gegebenen. Ereignis 2-3, die Einleitung des Sammelns von Fraktion 1,
wurde durch Detektierung der steigenden Flanke des chromatographischen
Profils ausgelöst.
Genauer gesagt, wurde Ventil 7 geöffnet und wurde Ventil 11 geschlossen,
wenn eine steigende Flanke gleich 20% des maximalen Detektorsignals
pro Sekunde von der Software detektiert wurde. Die Ereignisse 2-4
bis 2-8 wurden alle an gegebenen Zeitpunkten nach Einleitung von
Ereignis 2-3 ausgelöst. 11 zeigt
das Chromatogramm für
Umlauf 13. Die acht oben diskutierten Ereignisse sind in 11 wie
folgt bezeichnet:
- • E1 zeigt Ereignis 2-1 an:
Das Einspritzventil 12 wurde in Ladeposition plaziert,
was durch den durchgezogenen Flusspfad in 1 angezeigt
ist. Das Ablassventil 11 wurde geöffnet. Dieses Ereignis trat
bei 0,0 Minuten im Umlauf auf.
- • E2-a
zeigt den Beginn von Ereignis 2-2: die Einspritzpumpe 16 wurde
eingeschaltet, um die Einspritzschleife 13 zu füllen. Dieses
Ereignis trat bei 0,10 Minuten im Umlauf auf.
- • E2-b
zeigt das Ende von Ereignis 2-2: die Einspritzpumpe 16 wurde
abgeschaltet, wenn die Einspritzschleife 13 gefüllt worden
war. Dieses Ereignis trat bei 0,26 Minuten im Umlauf auf.
- • E3
zeit Ereignis 2-3 an: Ventil 7 wurde geöffnet, um das Sammeln von Fraktion 1,
Methyl-p-Hydroxybenzoat, zu beginnen. Dieses Ereignis trat auf,
wenn eine steigende Flanke gleich 20% des maximalen Detektorsignals
pro Sekunde von der Software detektiert wurde. Wie in Tabelle 2
gezeigt, trat dieses Ereignis bei etwa 62 Sekunden oder bei etwa
1,03 Minuten im Umlauf auf.
- • E4
zeigt Ereignis 2-4 an: Ventil 7 wurde geschlossen, um das
Sammeln von Fraktion 1 zu beenden. Das Rückführventil 6 wurde
geöffnet,
um es dem unaufgelösten
chromatographischen Profil zu gestatten, auf Säule 3 über die
Lösungsmittelpumpe 3 rückgeführt zu werden.
Dieses Ereignis trat 0,4 Minuten nach Einleitung von Ereignis 2-3
oder bei etwa 1,43 Minuten im Umlauf auf.
- • E5-p
du E5-t zeigen Ereignis 2-5 an: Das Einspritzventil 12 wurde
auf die Einspritzposition geschaltet, die durch den Flusspfad durchgezogener
Linie in 1 angezeigt ist. Das Innere
des chromatographischen Profils wurde damit abgeleitet, um durch
die Einspritzschleife 13 zu wandern. Dieses führte dazu,
dass 3,2 ml frischer Probe, 96 mg Methyl-p-Hydroxybenzoat und 96
mg Propyl-p-Hydroxybenzoat
in das Innere des chromatographischen Profils eingespritzt wurden.
E5-t zeigt den Zeitpunkt an, zu dem dieses Ereignis auftrat, 1,04
Minuten nach Einleitung von Ereignis 2-3 oder bei etwa 2,07 Minuten
im Umlauf. Weil das Profil durch die Lösungsmittelpumpe 2 (ungefähres Volumen
= 7 ml) wanderte, bevor es die Einspritzschleife 13 erreichte,
ging der Punkt auf dem Profil, an welchem die Probe tatsächlich eingespritzt
wurde, 0,35 Minuten früher
(7 ml/[20 ml/Min]) durch den Detektor durch. E5-p zeigt daher den
Punkt auf dem Profil an, wo das Einspritzen von frischer Probe tatsächlich auftrat.
E5-p trat daher ungefähr
0,69 Minuten nach Einleitung von Ereignis 2-3 oder bei etwa 1,72
Minuten im Umlauf auf. In den nachfolgenden Chromatogrammen für dieses
Beispiel wird der Beginn von Ereignis 2-6 durch E5-p angezeigt.
- • E6
zeigt Ereignis 2-6 an: Das Rückführventil 6 wurde
geschlossen und Ventil 9 wurde geöffnet, um das Sammeln von Fraktion 2 zu
beginnen. Dieses Ereignis trat 2,55 Minuten nach Einleitung von
Ereignis 2, 3 oder bei etwa 3,58 Minuten im Umlauf
auf.
- • E7
zeigt Ereignis 2-7 an: Das Sammelventil 9 wurde geschlossen
und das Sammelventil 10 wurde geöffnet, um das Sammeln von Fraktion 3 zu
beginnen. Dieses Ereignis trat 3,55 Minuten nach Initiierung von Ereignis
2-3 oder bei etwa 4,58 Minuten im Umlauf auf.
- • E8
zeigt Ereignis 2-8 an: die Lösungsmittelpumpe
war bis zum Ende des Umlaufs ausgeschaltet. Dieses Ereignis trat
4,67 Minuten nach Einleitung von Ereignis 2-3 oder bei etwa 5,70
Minuten im Umlauf auf. Daher war die Lösungsmittelpumpe ungefähr 0,30
Minuten oder 18,0 Sekunden am Ende jeden Umlaufs abgeschaltet. Dieses
Ergebnis impliziert, dass die wahre Umlaufzeit, d.h. die Zirkulationszeit
des chromatographischen Profils, ungefähr 5,70 Minuten unter den Temperatur-,
Flußraten-,
und mobile Phase-Zusammensetzungsbedingungen, die für diesen
Lauf verwendet wurden, beträgt.
Somit wird dieser Lauf durch direktes Eingeben dieses Werts der
Umlaufzeit (5,70 Minuten) und der absoluten Zeit für jedes
Ereignis wie oben bestimmt (0,0 Minuten für E1, 0,10 Minuten für E2-a,
0,26 Minuten für
E2-b, 1,03 Minuten für
E3, 1,43 Minuten für
E4, 2,07 Minuten für
E5-t, 3,58 Minuten
für E6
und 4,58 Minuten für
E7) in die Steuerungssoftware dupliziert werden. E8 würde nicht
verwendet worden sein, falls dieser direkte Ansatz verwendet worden
wäre.
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12 zeigt
die überlagerten
Chromatogramme der Umläufe 3–7 und 13 zeigt
die überlagerten Chromatogramme
der Umläufe 8–13.
Der führende
Teil des chromatographischen Profils erreichte durch Sammeln von
Fraktion 1 den Fließgleichgewichtszustand
im Umlauf 4. Die zweite Hälfte des Profils scheint nicht den
Fließgleichgewichtszustand
im Umlauf 14 erreicht zu haben. Anscheinend, wie bei Beispiel
1, wären
mehrere weitere Umläufe
notwendig gewesen, um den Gleichgewichtsfließzustand zu etablieren.
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Tabelle
2 zeigt die Zeiten für
jeden Umlauf, bei dem Ereignis 2-3, die Einleitung des Sammelns
von Fraktion 1, auftrat. Diese Zeiten sind ein Maß der Reproduzierbarkeit
der Umläufe
auf einer Zeitbasis. Wie gezeigt, ist die Reproduzierbarkeit von
Ereignis 2-3 sehr gut. Da alle Ereignisse nach Ereignis 2-3 zu gegebenen Zeiträumen nach
Ereignis 2-3 auftraten, zeigten alle Ereigniszeiten exzellente Reproduzierbarkeit
von Umlauf zu Umlauf.
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Tabelle
2: Zeit der Einleitung von Ereignis 2-3 für jeden Umlauf
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Die
vorstehenden Beispiele können
mit ähnlichem
Erfolg wiederholt werden, indem die generisch oder spezifisch beschriebenen
Reaktanten und/oder Betriebsbedingungen dieser Erfindung gegen die
in den vorstehenden Beispielen ersetzt werden.
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Ohne
weitere Ausführung
wird angenommen, daß ein
Fachmann unter Verwendung der vorstehenden Beschreibung die vorliegende
Erfindung in ihrem vollen Umfang verwenden kann. Die vorstehenden
bevorzugten spezifischen Ausführungsformen
sind daher als lediglich illustrativ und nicht als für den Rest
der Beschreibung in irgendeiner Weise beschränkend anzusehen.
