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[Gebiet der Technik]
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Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Steuerungsverfahren für lonenaustauschchromatographen sowie einen lonenaustauschchromatographen.
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[Hintergrund der Erfindung]
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Als ein Verfahren zur Analyse von Probenkomponenten in einer Probe ist die lonenaustauschchromatographie bekannt. Bei der lonenaustauschchromatographie handelt es sich um eine Methode zur Trennung und Analyse von Probenkomponenten unterschiedlicher Eigenschaften durch Wechselwirkung mit den Probenkomponenten in zwei Phasen: einer stationären Phase, bestehend aus einem Ionenaustauscher wie einem lonenaustauscherharz, und einer mobilen Phase, die aus einem Puffer oder dergleichen besteht. Bei dem Ionenaustauscher ist die lonenaustauschergruppe chemisch modifiziert, wobei es Kationenaustauscher wie Sulfonsäure oder Carbonsäure und Anionenaustauscher wie quartäres Ammonium oder tertiäres Ammonium gibt.
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Zu den Proben, die in der lonenaustauschchromatographie analysiert werden, gehören beispielsweise die Aminosäuren.
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In der Aminosäuren-Simultananalyse, die eine Vielzahl von verschiedenen Aminosäuren simultan analysiert, lassen sich die zu analysierenden Aminosäuren und aminosäureverwandte Substanzen grob in rund 20 verschiedene Proteinhydrolysat-Aminosäuren und über 40 Aminosäuren bzw. aminosäureverwandte Substanzen aus biologischen Flüssigkeiten untergliedern. Diese zahlreichen Aminosäuren können simultan analysiert werden, indem eine Mehrzahl von Puffern gemischt werden, die Probe, die den gemischten Puffern zugesetzt wird, durch die Trennsäule durchläuft und anschließend die Detektion erfolgt.
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Auf der Grundlage dieser Methode werden bisher durch Innovationen hinsichtlich der Art des Ionenaustauscherharzes zur Packung der Trennsäule, der Pufferzusammensetzung sowie der Flussrate analytische Methoden mit dem Ziel entwickelt, die Trennung zu verbessern und die Analysezeit zu verkürzen. Ein Beispiel davon stellt das Patentdokument 1 dar.
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In dem Patentdokument 1 ist eine Technik beschrieben, welche „bei der Multikomponenten-Simultananalyse von Aminosäuren eine Trennung ermöglicht, die den durch die Eigenschaften des jeweiligen Füllmaterials bedingten Bereich der hohen Trenngüte ausnutzt, indem die Analyse mittels einer Mehrzahl von in Reihe geschalteten Säulen mit Füllmaterialien unterschiedlicher chemischer Eigenschaften erfolgt, womit die Trennleistung gesteigert und die Analyse beschleunigt wird“ (siehe Zusammenfassung).
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[Dokumente des Standes der Technik]
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[Patentdokumente]
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[Patentdokument 1] Patentoffenlegungsschrift
JP2008-249447 -
[Allgemeine Beschreibung der Erfindung]
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[Aufgabe, die der Erfindung zugrunde liegt]
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Bei der Technik gemäß dem Patentdokument 1, mit welcher zwar die Trennleistung gesteigert und die Analyse beschleunigt wird, gab es jedoch noch Raum für weitere Verbesserungen aus dem Gesichtspunkt der kompakteren Gestaltung der Säule sowie der Kosteneinsparung, da eine Mehrzahl von Säulen mit Füllmaterialien unterschiedlicher chemischer Eigenschaften in Reihe geschaltet werden.
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Dabei ist insbesondere bei der Aminosäuren-Simultananalyse die Analysezeit lang, so dass eine weitere Verkürzung der Analysezeit vorteilhaft ist.
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Die vorliegende Offenbarung, die vor dem Hintergrund der oben beschriebenen technischen Aufgabe zustande kam, stellt ein Steuerungsverfahren für lonenaustauschchromatographen sowie einen lonenaustauschchromatographen bereit, der die Steigerung der Trennleistung von Probenkomponenten und die Verkürzung der Analysezeit auch dann in sich vereinen kann, wenn aus dem Gesichtspunkt der kompakteren Gestaltung der Säule sowie der Kosteneinsparung eine einzige Trennsäule eingesetzt wird.
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[Mittel zur Lösung der Aufgabe]
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Der offenbarungsgemäße lonenaustauschchromatograph bzw. dessen Steuerungsverfahren umfasst eine Fördereinheit, welche zwei oder mehr verschiedene Elutionsmittel, umfassend ein erstes Elutionsmittel und ein zweites Elutionsmittel, dessen Förderung später als das erste Elutionsmittel zum Zweck der Trennung einer Probe gestartet wird, in einen Fließweg fördert, eine Probeninjektionseinheit, die stromabwärts von der Fördereinheit vorgesehen ist und die Probe in die Elutionsmittel in dem Fließweg injiziert, eine Trennsäule, die stromabwärts von der Probeninjektionseinheit vorgesehen ist und Probenkomponenten in der Probe trennt, einen Detektor, der die durch die Trennsäule getrennten Probenkomponenten detektiert, und eine Steuerung, die die Fördereinheit zur Förderung der Elutionsmittel mit einem sich gemäß einem vorgegebenen Zeitprogramm verändernden Mischverhältnis der Elutionsmittel steuert, wobei die Steuerung das vorgegebene Zeitprogramm derart ausführt, dass die Förderung des zweiten Elutionsmittels gleichzeitig mit der Injektion der Probe oder vor der Injektion der Probe gestartet wird.
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[Vorteile der Erfindung]
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Gemäß der vorliegenden Offenbarung kann ein Steuerungsverfahren für lonenaustauschchromatographen bzw. ein lonenaustauschchromatograph bereitgestellt werden, der die Steigerung der Trennleistung von Probenkomponenten und die Verkürzung der Analysezeit auch dann in sich vereinen kann, wenn aus dem Gesichtspunkt der kompakteren Gestaltung der Säule sowie der Kosteneinsparung eine einzige Trennsäule eingesetzt wird.
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Weitere nicht genannte Aufgaben, Gestaltungen und Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Ausführungsformen und Ausführungsbeispiele.
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Figurenliste
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- [1] Schematische Darstellung des Vorrichtungsaufbaus und des Fließwegs eines Aminosäuren-Analysators 100.
- [2] Schematische Darstellung von Zeittabellen auf dem Zeitprogramm, das die Vorgänge des Aminosäuren-Analysators 100 steuert.
- [3] Chromatogramme von Ausführungs- und Vergleichsbeispielen.
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[Ausführungsform der Erfindung]
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Im Folgenden werden Ausführungsformen der Offenbarung beschrieben. Die folgenden Beschreibungen der bevorzugten Ausführungsformen dienen grundsätzlich allein zur beispielhaften Veranschaulichung und beabsichtigen keinerlei Einschränkung der vorliegenden Offenbarung, ihrer Anwendung oder ihrer Verwendung.
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<Ionenaustauschchromatograph>
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Der offenbarungsgemäße lonenaustauschchromatograph kann als Analysator für Proben verwendet werden, die im Allgemeinen durch die lonenaustauschchromatographie analysiert werden können. Der lonenaustauschchromatograph ist insbesondere ein Aminosäuren-Analysator für die Analysen der Aminosäurenzusammensetzung von Proteinen und Peptiden sowie die Analysen von Aminosäuren und deren verwandten Substanzen in Arzneimitteln, biologischen Flüssigkeiten oder drgl. oder ein HPLC-System für die Analysen von Proteinen, Aminen, organischen Säuren oder drgl., vorzugsweise ein Aminosäuren-Analysator.
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Der offenbarungsgemäße lonenaustauschchromatograph analysiert Probenkomponenten durch eine Gradientenelution. Dabei wird vorliegend der Begriff „Gradient“ als ein Stufengradient, Kurvengradient und Lineargradient umfassender Begriff verwendet.
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Der offenbarungsgemäße lonenaustauschchromatograph umfasst als seine erforderlichen Elemente eine Fördereinheit, eine Probeninjektionseinheit, eine Trenneinheit, einen Detektor und eine Steuerung. Der lonenaustauschchromatograph kann zusätzlich zu diesen Elementen weitere fakultative Elemente umfassen. Insbesondere kann er aus dem Gesichtspunkt der Erleichterung der Detektion von Probenkomponenten Reagenzien für Vorsäulenderivatisierung oder Nachsäulenderivatisierung und Vorrichtungen wie Pumpen, Mischer, Reaktionssäulen o. Ä. umfassen.
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Die Fördereinheit fördert zwei oder mehr verschiedene Elutionsmittel, umfassend ein erstes Elutionsmittel und ein zweites Elutionsmittel, dessen Förderung dem ersten Elutionsmittel folgend gestartet wird, in einen Fließweg. Dabei kann die Fördereinheit derart gestaltet sein, dass sie zusätzlich zu den Elutionsmitteln ein Säulenspülmittel, ein nicht zur Trennung der Probe dienendes Einstellungsmittel oder drgl. fördern kann.
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Die Elutionsmittel sind Puffer wie z. B. Natriumcitratpuffer, Lithiumcitratpuffer o. Ä., die während der nachstehend beschriebenen Schritte der Vorinjektionsförderung und der Trennung in die Trennsäule eingebracht werden. Für die Elutionsmittel, das Säulenspülmittel und das Einstellungsmittel können jeweils die entsprechenden Mittel verwendet werden, die im Allgemeinen in der lonenaustauschchromatographie eingesetzt werden.
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Dabei stellt das erste Elutionsmittel unter den zwei oder mehr verschiedenen Elutionsmitteln das Elutionsmittel dar, das an erster Stelle in die Trennsäule eingeführt wird, wobei es zumindest in dem Schritt der Vorinjektionsförderung in die Trennsäule eingeführt wird. Dementsprechend hat das erste Elutionsmittel neben seiner Funktion als ein zur Trennung von Probenkomponenten beitragendes Elutionsmittel die Funktion der Stabilisierung der Trennsäule. Das zweite Elutionsmittel hingegen, bei dem die zur Trennung von Probenkomponenten beitragende Funktion gegenüber dem ersten Elutionsmittel überwiegt, muss keine Funktion der Stabilisierung der Trennsäule aufweisen.
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Die Salzkonzentration des ersten Elutionsmittels ist vorzugsweise niedriger als die Salzkonzentration des zweiten Elutionsmittels. Dadurch kann die Trennsäule effektiv stabilisiert werden. So lässt sich die Trennleistung von Probenkomponenten durch die restlichen Elutionsmittel, einschließlich des zweiten Elutionsmittels, steigern. Dabei bedeutet vorliegend „Salzkonzentration“ die Konzentration der im Elutionsmittel enthaltenen Kationen bzw. Anionen. Konkret ist die Salzkonzentration des ersten Elutionsmittels bevorzugt 0,05N oder größer und kleiner als 0,2N, noch bevorzugter 0,12N oder größer und 0,19N oder kleiner. Die Salzkonzentration des zweiten Elutionsmittels ist bevorzugt größer als 0,16N und kleiner als 1,2N, noch bevorzugter 0,2N oder größer und 1N oder kleiner.
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Dabei liegt die Differenz zwischen dem pH-Wert des ersten Elutionsmittels und dem pH-Wert des zweiten Elutionsmittels bevorzugt innerhalb von 0,5, noch bevorzugter innerhalb von 0,3. Handelt es sich bei der nachstehend beschrieben stationären Phase der Trennsäule um ein Kationenaustauscherharz, ist der pH-Wert des ersten Elutionsmittels noch bevorzugter höher als der pH-Wert des zweiten Elutionsmittels. Dadurch kann die Trennsäule effektiv stabilisiert werden. So lässt sich die Trennleistung von Probenkomponenten durch die restlichen Elutionsmittel, einschließlich des zweiten Elutionsmittels, steigern.
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Handelt es sich dabei bei der nachstehend beschrieben stationären Phase der Trennsäule um einen Kationenaustauscher, liegt der pH-Wert des ersten bzw. zweiten Elutionsmittels vorzugsweise in einem Bereich um 3, insbesondere 2,5 oder höher und 3,5 oder niedriger. Wenn in dieser Konstellation die Elutionsmittel drei oder mehr verschiedene Elutionsmittel umfassen, ist der pH-Wert des dritten Elutionsmittels, dessen Förderung dem zweiten Elutionsmittel folgend gestartet wird, vorzugsweise höher als der pH-Wert des ersten bzw. zweiten Elutionsmittels.
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Die Fördereinheit im Einzelnen ist beispielsweise aus Behältern, welche jeweils eine Flüssigkeit wie Elutionsmittel, Säulenspülmittel, Einstellungsmittel oder drgl. speichern, Elektromagnetventilen, welche die Förderung der jeweiligen Flüssigkeit aus dem Behälter in den Fließweg starten/beenden bzw. die Flussrate der jeweiligen Flüssigkeit regeln, und Pumpen gestaltet, welche die Flussrate der jeweiligen Flüssigkeit regulieren. Das Elektromagnetventil kann in dem für den jeweiligen Behälter vorgesehenen Fließweg für den jeweiligen Behälter vorgesehen sein. Die Pumpe kann stromabwärts von dem Elektromagnetventil in dem Fließweg vorgesehen sein. So können sich beispielsweise die für den jeweiligen Behälter vorgesehenen Fließwege stromabwärts von dem Elektromagnetventil zu einem Fließweg vereinigen, in dem eine Pumpe vorgesehen ist (Niederdruck-Gradientenelution). Alternativ kann die Pumpe in einer Mehrzahl, jeweils in dem für den jeweiligen Behälter vorgesehenen Fließweg für den jeweiligen Behälter, vorgesehen sein (Hochdruck-Gradientenelution).
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Die Probeninjektionseinheit, die stromabwärts von der Fördereinheit vorgesehen ist, stellt ein Mittel zum Injizieren der Probe in die Elutionsmittel in dem Fließweg dar. Die Probeninjektionseinheit, die sowohl ein manueller Injektor als auch ein automatischer Autosampler sein kann, ist aus dem Gesichtspunkt der präzisen Steuerung des Injektionszeitpunkts und -volumens der Probe vorzugsweise ein Autosampler.
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Die Trenneinheit, die stromabwärts von der Probeninjektionseinheit vorgesehen ist, umfasst eine Trennsäule zur Trennung von Probenkomponenten in der Probe. Die Trenneinheit kann neben der Trennsäule ein Mittel zum Regulieren der Temperatur der Trennsäule umfassen. Für die Trennsäule, die keiner besonderen Einschränkungen unterliegt, können die Säulen verwendet werden, die im Allgemeinen in der lonenaustauschchromatographie eingesetzt werden. Die stationäre Phase der Trennsäule, die sowohl ein Kationenaustauscher wie ein Kationenaustauscherharz als auch ein Anionenaustauscher wie ein Anionenaustauscherharz sein kann, ist vorzugsweise ein Kationenaustauscher, insbesondere ein Kationenaustauscherharz.
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Der Detektor, der stromabwärts von der Trennsäule vorgesehen ist, stellt eine Vorrichtung dar, die zum Detektieren der durch die Trennsäule getrennten Probenkomponenten dient. Für den Detektor, der keiner besonderen Einschränkungen unterliegt, können die Detektoren wie z. B. Leitfähigkeitsdetektor, UV/Vis-Detektor, Fluoreszenzdetektor und elektrochemischer Detektor verwendet werden, die im Allgemeinen in der lonenaustauschchromatographie eingesetzt werden.
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Die Steuerung, die zumindest mit den Elektromagnetventilen und Pumpen der Fördereinheit, mit der Probeninjektionseinheit falls Autosampler und, wenn vorhanden, mit den Mitteln zum Regulieren der Temperatur der Behälter u. a. bei der Fördereinheit sowie der Trennsäulen elektrisch oder online verbunden ist, sendet Steuersignale an diese, um ihre Funktionen zu steuern. Die Steuerung, die zudem mit dem Detektor elektrisch oder online verbunden ist, ruft die Detektionsergebnisse von dem Detektor ab, um sie in Form von Chromatogrammen und Daten auszugeben. Die Steuerung ist beispielsweise eine auf bekannten Mikrocomputern basierende Vorrichtung und umfasst eine Eingabeeinheit zur Eingabe von Informationen von außen, ein Speicherelement zur Speicherung von Informationen, eine arithmetisch-logische Einheit zur Durchführung verschiedener Rechenoperationen auf der Grundlage verschiedener Informationen und eine Ausgabeeinheit zur Ausgabe von Informationen wie eine Anzeige.
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In dem Speicherelement der Steuerung ist ein Zeitprogramm zur Durchführung des nachstehend beschrieben Analyseprozesses gespeichert. Die Steuerung steuert die Fördereinheit zur Förderung der Elutionsmittel mit einem sich gemäß einem in dem Zeitprogramm enthaltenden vorgegebenen Gradientenelutionszeitprogramm verändernden Mischverhältnis der zwei oder mehr verschiedenen Elutionsmittel.
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<Analyseprozess des Ionenaustauschchromatographen>
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Der Analyseprozess des lonenaustauschchromatographen, umfassend einen Schritt der Probeninjektion, einen Schritt der Trennung, einen Schritt der Spülung, einen fakultativen Schritt der Einstellung und einen Schritt der Vorinjektionsförderung, wird mit diesen Schritten, die zusammen als eine Methode zählen, für eine vom Benutzer festgelegte Anzahl wiederholt.
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Der Schritt der Probeninjektion ist ein Schritt, bei dem die Probe durch die Probeninjektionseinheit in den Fließweg injiziert wird. Das Zeitprogramm kann, ohne es aber darauf beschränken zu wollen, mit dem entsprechenden Schritt der Probeninjektion als Zeitpunkt Null erstellt werden.
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Der Schritt der Trennung ist ein Schritt, bei dem nach dem Schritt der Probeninjektion Probenkomponenten der Probe in der Trennsäule getrennt werden. Zumindest in dem Schritt der Trennung werden die Elutionsmittel gemäß dem Gradientenelutionszeitprogramm in dem Zeitprogramm gefördert.
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Sobald der Schritt der Trennung abgeschlossen ist, muss der Zustand der Trennsäule für die nächste Methode in den Zustand vor der Probeninjektion, d.h. in den Ausgangszustand zurückgeführt und stabilisiert werden. Der Schritt der Spülung nach dem Schritt der Trennung, der fakultative Schritt der Einstellung und der Schritt der Vorinjektionsförderung sind für diesen Zweck vorgesehen.
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Zunächst wird in dem Schritt der Spülung ein Säulenspülmittel gefördert, um die Trennsäule zu spülen.
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Sodann wird in dem Schritt der Vorinjektionsförderung vor dem Schritt der Probeninjektion der nächsten Methode zumindest das erste Elutionsmittel gefördert, um die Trennsäule zu stabilisieren.
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Dabei kann ein Schritt der Einstellung nach dem Schritt der Spülung und vor dem Schritt der Vorinjektionsförderung vorgesehen sein. In dem Schritt der Einstellung wird ein nicht zur Trennung der Probe dienendes Einstellungsmittel gefördert. Damit kann die Trennsäule zügig in den Ausgangszustand zurückgeführt werden. Für das Einstellungsmittel kann beispielsweise eine wässrige Lösung mit einer niedrigen Salzkonzentration, bei einem Kationenaustauscher als der stationären Phase der Trennsäule eine wässrige Lösung mit einem niedrigen pH-Wert, bei einem Anionenaustauscherharz als der stationären Phase der Trennsäule eine wässrige Lösung mit einem hohen pH-Wert oder Reinwasser verwendet werden.
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<Steuerungsverfahren für lonenaustauschchromatographen>
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Der offenbarungsgemäße lonenaustauschchromatograph ist durch die folgenden Merkmale gekennzeichnet:
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Die Steuerung führt das Zeitprogramm derart aus, dass die Förderung des zweiten Elutionsmittels gleichzeitig mit der Injektion der Probe oder vor der Injektion der Probe gestartet wird.
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In dieser Ausführungsform umfasst das Zeitprogramm eine Zeittabelle für jeden der Schritte der Probeninjektion, der Trennung, der Spülung, der fakultativen Einstellung und der Vorinjektionsförderung. Zudem umfasst das Zeitprogramm ein Gradientenelutionszeitprogramm zur Steuerung der Fördereinheit zur Förderung der Elutionsmittel mit einem sich verändernden Mischverhältnis der Elutionsmittel.
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Beispielsweise kann das Gradientenelutionszeitprogramm derart gestaltet sein, dass an erster Stelle die Förderung des ersten Elutionsmittels gestartet wird und an zweiter Stelle die Förderung des zweiten Elutionsmittels gestartet wird.
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In diesem Fall kann die Steuerung das Gradientenelutionszeitprogramm vor der Injektion der Probe, vorzugsweise in dem Schritt der Vorinjektionsförderung, derart ausführen, dass die Förderung des zweiten Elutionsmittels gleichzeitig mit der Injektion der Probe oder vor der Injektion der Probe gestartet wird.
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Gemäß dieser Gestaltung, in der die Ausführung des Gradientenelutionszeitprogramms noch vor dem Schritt der Probeninjektion vorweg gestartet wird, kann die Analysezeit verkürzt werden.
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Außerdem kann gemäß dieser Gestaltung wie im Folgenden beschrieben die Trennleistung der Trennsäule gesteigert werden.
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Wenn das Elektromagnetventil geöffnet und die Förderung des Elutionsmittels aus dem Behälter, der das entsprechende Elutionsmittel speichert, gestartet wird, ergibt sich eine Zeitverzögerung, die dem Volumen des Fließwegs von dem Behälter bis zur Trennsäule entspricht, bis das entsprechende Elutionsmittel die Trennsäule erreicht. Ebenfalls ergibt sich bei der Injektion der Probe durch die Probeninjektionseinheit eine Zeitverzögerung, die dem Volumen des Fließwegs von der Probeninjektionseinheit zur Trennsäule entspricht, bis die Probe die Trennsäule erreicht. Somit entsteht eine Differenz zwischen dem Zeitpunkt, in dem die Probe in die Trennsäule gelangt, und dem Zeitpunkt, in dem das jeweilige Elutionsmittel in die Trennsäule gelangt.
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Wenn die Förderung des zweiten Elutionsmittels gestartet wird, kommt es in dem Fließweg zwischen der Verzweigung, an der sich die Fließwege für die Behälter des ersten bzw. zweiten Elutionsmittel vereinigen, und der Trennsäule letztlich dazu, dass ein Teil des ersten Elutionsmittels durch das zweite Elutionsmittel verdrängt wird. Infolgedessen wird, abhängig von dem Zeitpunkt des Startens der Förderung der zweiten Elutionsmittels, die Probe in das erste Elutionsmittel, das Flüssigkeitsgemisch des ersten und zweiten Elutionsmittels oder das zweite Elutionsmittel injiziert.
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Wenn die Probe in das Flüssigkeitsgemisch des ersten und zweiten Elutionsmittels oder das zweite Elutionsmittel injiziert wird, erreicht das zweite Elutionsmittel die Trennsäule gleichzeitig mit der Probe oder bereits vor der Probe. Dementsprechend beginnt zeitgleich mit dem Gelangen der Probe in die Trennsäule die Elution der Probenkomponenten durch die mobile Phase, in der teilweise oder vollständige Verdrängung durch das zweite Elutionsmittel erfolgt ist, womit die Trennleistung von Probenkomponenten gesteigert werden kann.
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Auch wenn die Probe in das erste Elutionsmittel injiziert wird, dauert es gegenüber dem Stand der Technik weniger Zeit nach dem Gelangen der Probe in die Trennsäule, bis das zweite Elutionsmittel die Trennsäule erreicht, da die Förderung des zweiten Elutionsmittels gleichzeitig mit oder vor der Injektion der Probe gestartet ist. Dementsprechend beginnt nach dem Gelangen der Probe in die Trennsäule zügig die Elution der Probenkomponenten durch die mobile Phase, in der teilweise oder vollständige Verdrängung durch das zweite Elutionsmittel erfolgt ist, womit die Trennleistung von Probenkomponenten gesteigert werden kann.
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Folglich sind gemäß der vorliegenden Offenbarung die Steigerung der Trennleistung von Probenkomponenten und die Verkürzung der Analysezeit vereinbar. Überdies kann ein Beitrag zur kompakteren Gestaltung der Säule und Kosteneinsparung geleistet werden, da eine einzige Säule verwendet wird.
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Dabei kann das Gradientenelutionszeitprogramm beispielsweise auch derart gestaltet sein, dass an erster Stelle die Förderung des zweiten Elutionsmittels gestartet wird und danach die Förderung eines weiteren Elutionsmittels - z. B. des dritten Elutionsmittels bei drei oder mehr verschiedenen Elutionsmitteln - gestartet wird.
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In diesem Fall kann die Steuerung das Gradientenelutionszeitprogramm gleichzeitig mit oder vor der Injektion der Probe derart ausführen, dass die Förderung des zweiten Elutionsmittels gleichzeitig mit der Injektion der Probe oder vor der Injektion der Probe gestartet wird. Dadurch sind die Steigerung der Trennleistung von Probenkomponenten und die Verkürzung der Analysezeit vereinbar.
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Dabei kann bei Verwendung von drei oder mehr verschiedenen Elutionsmitteln das Starten der Förderung des dritten Elutionsmittels, dessen Förderung dem zweiten Elutionsmittel folgend gestartet wird, vor dem Schritt der Probeninjektion oder gleichzeitig mit der Probeninjektion erfolgen. Vorzugsweise erfolgt das Starten der Förderung des dritten Elutionsmittels erst nach dem Schritt der Probeninjektion. Damit lässt sich eine hohe Trennleistung von Probenkomponenten durch die Elutionsmittel gewährleisten, deren Förderung nach dem zweiten Elutionsmittel gestartet wird.
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[Ausführungsbeispiele]
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Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ein Aminosäuren-Analysator 100 (lonenaustauschchromatograph) sowie sein Steuerungsverfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Offenbarung beschrieben.
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Dabei entsprechen die Bezeichnungen bzw. Buchstabencodes der zu analysierenden Aminosäuren in der nachfolgenden Beschreibung den Angaben gemäß Tabelle 1.
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[Tabelle 1]
| Buchstabencode | Aminosäure |
| Asp | Asparaginsäure |
| Thr | Threonin |
| Ser | Serin |
| Glu | Glutaminsäure |
| Pro | Prolin |
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1 zeigt eine schematische Darstellung des Vorrichtungsaufbaus und des Fließwegs eines Aminosäuren-Analysators 100 gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Offenbarung.
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In dem Aminosäuren-Analysator 100 können ein erstes Elutionsmittel 1 bis ein viertes Elutionsmittel 4, destilliertes Wasser 5 und ein Säulenregeneriermittel 6 installiert sein. Daraus wird eine Flüssigkeit durch Elektromagnetventile 7A bis 7F ausgewählt und durch eine Elutionsmittelpumpe 9 gefördert. Das Elutionsmittel wird über eine Ammoniakfiltersäule 11 in eine Trennsäule 13 eingeführt. Stromabwärts von der Ammoniakfiltersäule 11 und stromaufwärts von der Trennsäule 13 ist ein Autosampler 12 (Probeninjektionseinheit) vorgesehen, wobei eine Aminosäurenprobe durch den Autosampler 12 in das Elutionsmittel in dem Fließweg injiziert wird. Die injizierte Aminosäurenprobe erreicht zusammen mit dem Elutionsmittel die Trennsäule 13 und wird in der Trennsäule 13 getrennt.
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Der Aminosäuren-Analysator 100 umfasst ferner ein Ninhydrin-Reagens 8 und eine Ninhydrin-Pumpe 10 zur Förderung des Ninhydrin-Reagens 8. Die jeweilige in der Trennsäule 13 getrennte Aminosäurekomponente vermischt sich mit dem durch die Ninhydrin-Pumpe 10 geförderten Ninhydrin-Reagens 8 in einem Mischer 14 und reagiert in einer beheizten Reaktionssäule 15.
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Die durch die Reaktion gefärbte Aminosäure (Ruhemanns Purpur) wird fortlaufend durch einen Detektor 16 detektiert und durch eine Datenverarbeitungsvorrichtung 17 (Steuerung) in Form von Chromatogrammen und Daten ausgegeben, aufgezeichnet und gespeichert.
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Die Datenverarbeitungsvorrichtung 17 steuert die Elektromagnetventile 7A bis 7D für die Behälter der Elutionsmittel, das Elektroventil 7E für den Behälter des destillierten Wassers, das Elektroventil 7F für den Behälter des Säulenregeneriermittels, die Elutionsmittelpumpe 9, die Ninhydrin-Pumpe 10, den Autosampler 12 und Mittel zum Regulieren der Temperatur (nicht dargestellt) u. a. der Behälter der Flüssigkeiten sowie der Trennsäule 13 und der Reaktionssäule 15. Diese Steuerung wird im Wesentlichen durch ein Programm ausgeführt, das in einem Speicherelement (nicht dargestellt) der Datenverarbeitungsvorrichtung 17 gespeichert ist.
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Für das erste Elutionsmittel 1 bis das vierte Elutionsmittel 4 sowie das Säulenregeneriermittel 6 wurden die Natriumcitratpuffer gemäß Tabelle 2 verwendet. Dabei ist in Tabelle 2 die Salzkonzentration mit der Na-Konzentration angegeben.
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[Tabelle 2]
| Natriumcitratpufferzusammensetzung |
| Bezeichnung | 1. Eluent | 2. Eluent | 3. Eluent | 4. Eluent | Säulenregeneriermittel |
| Na- | 0,16 | 0,2 | 0,2 | 1,2 | 0,2 |
| Konzentration [N] | | | | | |
| Natriumcitrat (2H2O) [g] | 6,19 | 7,74 | 13,31 | 26,67 | - |
| Natriumhydroxid [g] | - | - | - | - | 8,00 |
| Natriumchlorid [g] | 5,66 | 7,07 | 3,74 | 54,35 | - |
| Citronensäure (H2O) [g] | 19,80 | 22,00 | 12,80 | 6,10 | - |
| Ethanol [mL] | 130,0 | 20,0 | 4,0 | - | 100,0 |
| Benzylalkohol [mL] | - | - | - | 5,0 | - |
| Thiodiglycol [mL] | 5,0 | 5,0 | 5,0 | - | - |
| 25% BRIJ-35 [mL] | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| Gesamtvolumen [L] | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Caprylsäure [mL] | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| pH (Nennwert) | 3,3 | 3,2 | 4,0 | 4,9 | 13,0 |
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Die Messbedingungen des Aminosäuren-Analysators 100 bei den Ausführungs- und Vergleichsbeispielen sind in Tabelle 3 angegeben. [Tabelle 3]
| Messmethode |
| Trennsäule | #2620M 4,6 mm I.D. x 80 mm |
| Ammoniakfiltersäule | #2650L 4,6 mm I.D. x 60 mm |
| Flussrate Elutionsmittel | 0,22 mL/min |
| Temperatur Trennsäule | 55 °C |
| Reaktionsreagens | Ninhydrin Coloring Solution Kit for HITACHI |
| Flussrate Reaktionsreagens | 0,30 mL/min |
| Reaktionstemperatur | 135 °C |
| Detektionswellenlängen | VIS 440 nm, 570 nm |
| Probeninjektionsvolumen | 20 µL |
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2 zeigt eine schematische Darstellung von Zeittabellen auf dem Zeitprogramm des Aminosäuren-Analysators 100. In 2 stellt (a), (b) bzw. (c) jeweils das Zeitprogramm gemäß dem Vergleichsbeispiel (Stand der Technik), dem Ausführungsbeispiel 1 bzw. dem Ausführungsbeispiel 2 dar.
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[Vergleichsbeispiel]
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In dem Analyseprozess im Stand der Technik ist aus dem Gesichtspunkt der Stabilisierung der Trennsäule 13 vor dem Schritt der Probeninjektion in den Fließweg durch den Autosampler 12 ein Schritt der Vorinjektionsförderung vorgesehen, in dem zumindest das erste Elutionsmittel 1 (Flüssigkeit B1) zu der Trennsäule 13 befördert wird. Und dem Schritt der Vorinjektionsförderung folgt der Schritt der Probeninjektion, bevor es mit dem Schritt der Trennung weitergeht. In dem Schritt der Trennung werden gemäß einem Gradientenelutionszeitprogramm beginnend von dem ersten Elutionsmittel 1 (Flüssigkeit B1) über das zweite Elutionsmittel 2 (Flüssigkeit B2) bis zu dem dritten Elutionsmittels 3 (Flüssigkeit B3) und dem vierten Elutionsmittel 4 (Flüssigkeit B4) mit einem sich verändernden Mischverhältnis zu der Trennsäule 13 befördert.
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So wird im Stand der Technik das Zeitprogramm derart ausgeführt, dass der Startzeitpunkt des Gradientenelutionszeitprogramms mit dem Zeitpunkt der Probeninjektion übereinstimmt.
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[Ausführungsbeispiel 1]
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In dem offenbarungsgemäßen Ausführungsbeispiel 1 wird das Gradientenelutionszeitprogramm bereits in dem Schritt der Vorinjektionsförderung vor dem Schritt der Probeninjektion vorweg gestartet. Mit anderen Worten: Das erste Elutionsmittel 1 (Flüssigkeit B1), dessen Förderung im Stand der Technik durch die Ausführung des Gradientenelutionszeitprogrammes an erster Stelle gestartet wird, ist hierbei zugleich das erste Elutionsmittel 1 (Flüssigkeit B1), das in dem Schritt der Vorinjektionsförderung gefördert wird.
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[Ausführungsbeispiel 2]
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In dem offenbarungsgemäßen Ausführungsbeispiel 2 ist der Startzeitpunkt der Ausführung des Gradientenelutionszeitprogrammes gegenüber dem Ausführungsbeispiel 1 noch weiter vorgezogen, so dass die Förderung des zweiten Elutionsmittels (Flüssigkeit B2) bereits in dem Schritt der Vorinjektionsförderung gestartet wird.
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Gegenüber dem Vergleichsbeispiel (Stand der Technik) ist bei den Ausführungsbeispielen 1 und 2, in denen die Ausführung des Gradientenelutionszeitprogramms vor dem Schritt der Probeninjektion vorweg gestartet wird, die für eine Methode benötigte Analysezeit wie gemäß 2 mit dem Bezugszeichen A dargestellt verkürzt.
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Dabei zeigt 3 Chromatogramme gemäß dem Vergleichsbeispiel (Stand der Technik) und den Ausführungsbeispielen 1 und 2.
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Im Vergleich zu dem Chromatogramm (a) gemäß dem Vergleichsbeispiel (Stand der Technik) in der oberen Zeile in 3 ist die Elutionszeit von Asp (Asparaginsäure) in den Chromatogrammen (b) und (c) gemäß den Ausführungsbeispielen 1 und 2 in der mittleren bzw. unteren Zeile weiter vorgezogen. Zudem liegen in dem Vergleichsbeispiel (Stand der Technik) die Peaks von Glu/Pro (Glutaminsäure/Prolin) nah aneinander, während in den Ausführungsbeispielen 1 und 2 die beiden Peaks immer weiter auseinander gehen, womit ersichtlich ist, dass die Glu/Pro-Auflösung erhöht ist. Folglich ist es ersichtlich, dass die Trennleistung von Probenkomponenten in den Ausführungsbeispielen 1 und 2 gegenüber dem Vergleichsbeispiel (Stand der Technik) gesteigert ist.
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Des Weiteren führt bei einer Aminosäurenanalyse, die noch mehr Aminosäurekomponenten umfasst, eine Verkürzung der Elutionszeit für Asp (Asparaginsäure) - die als Erstes eluierende Komponente - zu einer Verkürzung der gesamten Analysezeit. Gegenüber dem Vergleichsbeispiel (Stand der Technik) ist bei den Ausführungsbeispielen 1 und 2 wie vorstehend ausgeführt die Elutionszeit für Asp (Asparaginsäure) verkürzt. Dementsprechend kann die Analysezeit bei einer Aminosäurenanalyse, die noch mehr Aminosäurekomponenten umfasst, auch unter diesem Gesichtspunkt noch weiter verkürzt werden.
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Aus dem Vorstehenden ergibt sich, dass gemäß der vorliegenden Offenbarung die Steigerung der Trennleistung von Probenkomponenten und die Verkürzung der Analysezeit vereinbar sind. Überdies kann ein Beitrag zur kompakteren Gestaltung der Säule und Kosteneinsparung geleistet werden, da eine einzige Säule verwendet wird.
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[Ausführungsbeispiel 3]
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Unter dem Gesichtspunkt der Verkürzung der Analysezeit ist ferner ein Verfahren denkbar, anstelle eines zur Trennung dienenden Elutionsmittels ein eigens dafür vorgesehenes Einstellungsmittel einzusetzen, um die Säule zügig in ihren Ausgangszustand vor der Probeninjektion zu überführen.
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Im Gegensatz zu einem Elutionsmittel dient das Einstellungsmittel nicht zur Trennung von Probenkomponenten. Für das Einstellungsmittel kann eine wässrige Lösung mit einer niedrigen Salzkonzentration und/oder mit einem niedrigen pH-Wert oder Reinwasser wie z. B. destilliertes Wasser verwendet werden. In diesem Fall wird beispielsweise nach dem Schritt der Spülung und vor dem Schritt der Vorinjektionsförderung destilliertes Wasser 5 in die Trennsäule eingebracht.
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Die vorliegende Offenbarung ist im Übrigen nicht auf die oben beschriebenen Ausführungsbeispiele beschränkt und umfasst diverse Varianten. So sind in den oben beschriebenen Ausführungsbeispielen die Einzelheiten zur besseren Veranschaulichung der vorliegenden Offenbarung beschrieben, obwohl sich daraus keine Beschränkung dahingehend ergibt, dass alle beschriebenen Elemente zwingend vorhanden sein müssten. Überdies kann ein Element der Gestaltung eines bestimmten Ausführungsbeispiels durch ein Element aus einem anderen Ausführungsbeispiel ersetzt, oder der Gestaltung eines bestimmten Ausführungsbeispiels ein Element aus einem anderen Ausführungsbeispiel hinzugefügt werden. Schließlich ist bei einem Teil der Gestaltung des jeweiligen Ausführungsbeispiels Hinzufügen eines anderen Elements/Entfernen/Ersetzen möglich.
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Bezugszeichenliste
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- 1, B1
- erstes Elutionsmittel
- 2, B2
- zweites Elutionsmittel
- 3, B3
- drittes Elutionsmittel
- 4, B4
- viertes Elutionsmittel
- 5
- destilliertes Wasser (Einstellungsmittel)
- 6, B6
- Säulenregeneriermittel (Säulenspülmittel)
- 7A, 7B, 7C, 7D, 7E, 7F
- Elektromagnetventile (Fördereinheit)
- 8
- Ninhydrin-Reagens
- 9
- Elutionsmittelpumpe (Fördereinheit)
- 10
- Ninhydrin-Pumpe
- 11
- Ammoniakfiltersäule
- 12
- Autosampler (Probeninjektionseinheit)
- 13
- Trennsäule
- 14
- Mischer
- 15
- Reaktionssäule
- 16
- Detektor
- 17
- Datenverarbeitungsvorrichtung (Steuerung)
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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