DE2620314A1

DE2620314A1 - Verfahren und vorrichtung zur chromatographie in fluessiger phase unter erhoehtem druck

Info

Publication number: DE2620314A1
Application number: DE19762620314
Authority: DE
Inventors: Kazunori Fujita; Ikuo Shimokobe; Seiji Takeuchi
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1975-05-09
Filing date: 1976-05-07
Publication date: 1976-11-11
Also published as: DE2620314C2; US4073725A

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Chromatographie in flüssiger Phase unter erhöhtem Druck

Die Erfindung betrifft ein Verfahren der im Oberbegriff des Patentanspruchs 1 genannten Art sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur schnellen Trennung eines Substanzgemisches unter Verwendung einer mit einem Ionenaustauscherharz gefüllten Säule und eines unter erhöhtem Druck arbeitenden analytischen Systems.

Trennsäulen zur chromatographischen Trennung flüssiger Phasen sind gebräuchlicherweise mit Austauscherharzen gefüllt. Beim Eluieren und Entwickeln einer Probe in einer solchen Säule werden die Probe und eine Laufmittellösung am Kopf der Säule aufgegeben. Auch die Säulenregenerierlösung wird am Kopf der Säule aufgegeben. Diese Verfahren arbeiten langsam. So sind die schnellsten im Handel erhältlichen in flüssiger arbeitenden Chromatographen in der Lage, zwanzig Aminosäuren als Proteinbestandteile in 70 min zu trennen. Mit verbesserten Versuchsgeräten konnte die Anmelderin diese Trennung im Verlauf von 40 min erzielen. Solche Hochgeschwindigkeitsmessungen sind jedoch nur mit sehr feinkörnigen Säulenbe-

609846/0806

-2- 26203

Schickungen oder mit Säulen durchführbar, die einai nur sehr kleinen lichten Durchmesser haben. Dies hat dazu geführt, die chromatographische Flüssigkeitstrennung unter Drücken im Bereich von einigen 10 bis zu einigen 100 bar durchzuführen. Durch die hohen Drücke treten neue Probleme auf.

Die Problematik ist im folgenden anhand der chromatographischen Trennung von Aminosäuren zu analytischen Zwecken in flüssiger Phase erläutert. Wenn die Trennung und Bestimmung von zwanzig Aminosäuren als Proteinbestandteile innerhalb von 40 min durchgeführt werden sollen, muss der Druck am Eingang der Trennsäule mindestens 50 bar betragen. Die Säule muss zur Analyse von Aminosäuren mit etwa 8 bis 18 % raumvernetzten Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren beschickt sein. Bereits bei einem Druck von über etwa 40 bar am Eingang der Säule tritt jedoch bereits eine ausgesprochen grosse Kontraktion des Trennharzes auf. Dies führt zu einer Verschlechterung der Trennwirkung für die Komponenten der Probe. Dieser Effekt zeigt sich beispielsweise in folgendem Versuch deutlich:

Eine Trennsäule wird mit 10 % raumvernetztem, stark saurem Kationenaustauscherharz gefüllt. Die Temperatur der Trennsäule wird auf 60 ⁰C eingestellt. Der Anfangsdruck zu Beginn der Trennung am Eingang der Säule wird auf etwa 55 bar eingestellt. Die Eluierlösung und die Regenerierlösung werden kontinuierlich ausschliesslich am Kopf der Säule aufgegeben. 4 h nach dem Erreichen der Trennbedingungen wird der Druck am Eingang der Säule erneut gemessen. Er liegt um 7 bis 10 bar über dem Anfangsdruck. Die Qualität der Trennung der zwanzig Aminosäuren wird an der Trennung von Threonin und Serin bewertet, deren Trennmaxima dicht beieinander liegen. Berechnet wird für diese beiden Aminosäuren die prozentuale Trennung als Verhältnis der Abstände der einzelnen Konzentrationsmaxima zum Fuss der Säule.Unmittelbar nach Erreichen der Trennbedingungen beträgt dieses Trennverhältnis 78 % (A) .

609846/0806

während es 4 h nach dem Erreichen der Trennbedingungen bereits nur noch 64 % beträgt (B). Die Trennungskoeffizienten, also das Verhältnis der Retentionsζeiten, von Threonin und Serin werden gemessen. Es werden 1,10 für (A) und 1,09 für (B) gefunden. Zur Erhöhung des Trennkoeffizienten von 1,09 auf 1,10 muss die Länge der Säule um 20 % vergrössert werden.

Es ist bekannt, dass zur quantitativen chromatographischen Bestimmung einer Komponente eines Gemisches die Fläche des Konzentrationsmaximums ausgemeseen wird. Um diese Bestimmung mit ausreichender Genauigkeit durchführen zu können, muss die prozentuale Trennung zumindest 70 % betragen. Im Fall (B) des vorstehend beschriebenen Versuches kann also eine zur quantitativen Bestimmung notwendige Trennung nicht mehr erreicht werden. Sowohl die Druckzunahme am Säuleneingang im Verlauf der Trennung als auch der Abfall der prozentualen Trennung beim kontinuierlichen Betrieb der Säule sind auf die Kontraktion oder Kompression des Harzes .sowie auf eine Veränderung der Kenndaten des Harzes zurückzuführen, die ebenfalls auf die Kompression des Harzes zurückzuführen sind. In der Wirkung entspricht diese Kenndatenveränderung des Austauscherharzes einer Erhöhung des Vernetzungsgrades.

Aus der US-PS 3 220 164 ist ein Chromatograph bekannt, bei dem mehrere Trennsäulen in Reihe hintereinander geschaltet sind. Diese Schaltung dient der Trennung eines Stoffgemisches in einzelne Komponenten. Das Stoffgemisch wird kontinuierlich und wiederholt über zumindest zwei Säulen geführt. Die Säulen werden dann nacheinander und einzeln während der Rezirkulation gewaschen. Im Zusammenhang mit dieser Mehrsäulenchromatographen bleiben jedoch die Probleme der Verminderung des prozentualen Trennungsgrades und einer Abnahme der Reproduzierbarkeit der Trennung unter hohen Drücken am Eingang der Trennsäule, insbesondere unter Drücken im Bereich

609848/0808

"⁴~ 26203U

von 40 bis 50 bar und darüber, ausser Betracht/

Ein Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Flüssigkeitschromatographie unter hohem Druck, bei denen selbst bei langem Dauerbetrieb keine Verminderung der Reproduzierbarkeit auftritt.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Flüssigkeitschromatographie, die auch einen kontinuierlichen Dauerbetrieb dann noch einwandfrei zulässt, wenn das analytische System des Chromatographen unter einem Druck von über 40 bar gehalten wird.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Flüssigkeitschromatographie, die eine rasche und vollständige Austragung der während der Trennung in die Säule gelangten Verunreinigungen gewährleistet.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Rückstellung von Ionenaustauscherharzen in den Ursprungszustand, nachdem diese Harze durch den hohen Druck in der Trennsäule verformt worden sind.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Flüssigkeitschromatographie zur parallelen Durchführung der Trennung eines Stoffgemisches und der Regenerierung der Säule, also eines Verfahrens und einer Vorrichtung mit verringertem Zeitverlust bei kontinuierlicher Messung.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist schliesslich die Schaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur Unterdrückung einer Kenndatendrift unter hohem Druck komprimierter Austauscherharze durch kurzfristiges Quellen.

609846/0808

-s- 26203U

Der Erfindung liegt angesichts des Standes der Technik also die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Flüssigkextschromatographie zu schaffen/die ohne eine Kenndatendrift/ insbesondere ohne eine Verschlechterung der Trennungsgrades, auch bei Drücken über 40 bar langfristig im kontinuierlichen Dauerbetrieb betrieben werden kann, wobei vor allem die Regenerationszeiten als Leerlaufzeiten ausgeschaltet und die nachteiligen Druckeinflüsse auf das Austauscherharz behoben werden.

Zur Lösung dieser Aufgabe wird ein Verfahren der eingangs genannten Art vorgeschlagen, das erfindungsgemäss die im Anspruch 1 genannten Merkmale aufweist.

Zusammengefasst schafft die Erfindung also ein Verfahren, bei dem ein zu trennendes und zu analysierendes Stoffgemisch über eine Aufgabevorrichtung am Kopf einer Trennsäule aufgegeben wird. Das aufgegebene Gemisch wird in der Trennsäule in die einzelnen Komponenten aufgetrennt. Die Säule ist mit Austauscherharzen gefüllt, die unter Einwirkung äusserer Drücke verformbar sind. Eine Natriumionen enthaltende Elutionslösung wird am Kopf der Säule über eine Beschickungspumpe unter einem Druck von mindestens 40 bar aufgegeben. Die am Fuss der Säule auslaufenden Komponenten werden über einen Fühler registriert. Nachdem die einzelnen Komponenten die Säule verlassen haben, wird am Fuss der Säule eine Lithiumionen enthaltende Regenerierungslosung aufgegeben, die am Kopf der Säule ausgetragen wird. Durch den Durchlauf der Regenerierungslosung durch das Austauscherharz der Säule wird diese für die nächste Trennung aufbereitet. Anschliessend wird dann das nächstfolgende zu trennende Substanzgemisch am Fuss der Säule aufgegeben und werden die einzelnen getrennten Komponenten am Kopf der Säule abgezogen.

Das Wesen der Erfindung beruht also auf der ausgewählten Kom-

609846/0806

26203U

bination von Gegenionen, die in einer Elutionslösung und in einer Säulenregenerierungslösung enthalten sind. Ionen, die die gleiche elektrische Ladung wie die Gegenionen in der Elutionslösung aufweisen, jedoch eine höhere Hydratationszahl (Hydratationskoordinationszahl) haben, sind also wesentlicher Bestandteil der Regenerierungslösung.

Nach einer Weiterbildung der Erfindung wird die Trennsäule vorzugsweise mit einem Ionenaustauscherharz gefüllt, das unter Druck verformbar ist, und wird der Säule eine EIutionslösung unter einem Druck von mindestens 40 bar zugeführt. Die Elutionslösung und die Regenerierungslösung werden auf die Säule gegeben, jedoch im Gegensatz zum Stand der Technik in der Weise, dass in einem kontinuierlichen Betrieb die Elutionslösung und die Regenerierungslösung mit periodisch alternierenden Aufgabe- und Strömungsrichtungen auf die Säule gegeben werden. Der im Anfangszyklus eingangsseitig liegende Eingang der Säule ist beim nächstfolgenden Zyklus der ausgangsseitige Ablaufstutzen der Säule. Die während des einen Zyklus den hohen eingangsseitigen Drücken ausgesetzten Austauscherharze sind also während des nächsten Arbeitszyklus mit entgegengesetzter Strömungsrichtung entspannt, wodurch ihre Quellung ermöglicht und gefördert wird.

Die Erfindung ist im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 in graphischer Darstellung den

Verteilungskoeffizienten und den eingangsseitigen Druck der Säule als Funktion der Säulenhöhe;

Fig. 2 ein schematisches Blockschaltbild

eines Ausführungsbeispiels der Erfindung;

609846/0806

_₇_ 26203U

Fig. 3 ein nach dem Verfahren der Erfindung

aufgenommenes Chromatogramm und

Fig. 4 ein schematisches Blockschaltbild

eines zweiten Ausführungsbeispiels der Erfindung.

Bevor im folgenden die Erfindung näher beschrieben ist, seien zunächst Versuchsergebnisse erläutert, die dem besseren Verständnis der Erfindung dienen. Die Versuche dienen dem Nachweis der Zustandsänderung der Austauscherkenndaten, wenn sowohl die Elutionslösung als auch die Regenerierungslösung stets von der gleichen Seite her auf die Trennsäule gegeben werden.

Die Elutionslösung ist eine Monochloressigsäurepufferlösung vom pH 3,0, die 1,0 m Natriumionen (Na ) und 0,145 m Zink-

2+
ionen (Zn ) enthält. Zunächst wird die Elutionslösung auf die Trennsäule gegeben. Dabei wird die Zxnkionenkonzentratxon der Elutionslösung mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz in der Säule ins Gleichgewicht gebracht. Der Anfangsdruck am Säuleneingang wird auf 30 bar eingestellt. Das Harz w-rd 4 h unter zunehmendem Druck gehalten. Das mit Zinkionen beladene Harz wird in einem oberen Teil, einem Mittelteil und einem Fussteil in drei voneinander getrennten Schichten aus der Säule genommen. In der Tabelle 1 sind die Volumina des abgesetzten Harzes der einzelnen Schichten gezeigt. Ausserdem ist die je 1 ml Harz adsorbierte Zinkionenmenge dargestellt.

Tabelle 1

Lage des Harzes Volumen des sedi- Je 1 ml Harz adsorin der Säule mentierten Harzes bierte Menge Zink- __ ionen .

obere Schicht 12,2 7,93

mittlere Schicht 11,1 8,72

untere Schicht 13,3 8,91

609846/0806

26203U

Die in der Tabelle 1 wiedergegebenen Daten zeigen, dass selbst bei einem Anfangsdruck von 30 bar in der oberen Schicht weniger Zinkionen als in der mittleren Schicht und in dieser weniger als in der unteren Schicht adsorbiert sind. Diese Adsorptionsverteilung entspricht der Druckverteilung. Je höher der Druck, desto geringer die Menge der adsorbierten Zinkionen. Bei höheren Eingangsdrücken ist dieser Effekt stärker ausgeprägt.

In der Fig. 1 ist der Verteilungskoeffizient als Funktion der Säulenhöhe graphisch dargestellt. Ausserdem ist auf der Grundlage der in Tabelle 1 gezeigten Daten der Eingangsdruck an der Säule als Funktion der Säulenhöhe dargestellt. In diesem Fall ist der Verteilungskoeffizient das Verhältnis der Menge an Metallionen in der Harzschicht zur Menge der gleichen Metallionen in der Elutionslösung. Im Idealfall soll der Verteilungskoeffizient unabhängig von der Säulenhöhe sein. Die Ergebnisse zeigen jedoch, dass der Verteilungskoeffizient mit zunehmender Säulenhöhe abnimmt. Gleichzeitig und gleichbedeutend nimmt also der Verteilungskoeffizient mit zunehmendem Druck am Säuleneingang ab.

Die Erfindung baut auf der Anwendung des hygroskopischen Verhaltens des Ionenaustauscherharzes auf. Ausserdem werden die unterschiedlichen Hydrationsgrade der verschiedenen Ionen ausgenutzt. Bekanntlich liegen Ionen in Lösung nicht isoliert, sondern solvatisiert, in Wasser also hydratisiert, vor. Die Anzahl der Wassermoleküle in der Hydrationshülle, also die Koordinationszahl der Wassermoleküle, ist eine Funktion der Ionen. Es ist bekannt, dass die Durchmesser der hydratisierten Ionen um so grosser sind, je kleiner der Durchmesser des nicht hydratisierten Ions wird. Die fixierten oder Gegenionen liegen also im Austauscherharz im hydratisierten Zustand vor. Der Wassergehalt und das Volumen des Wasseis im Harz hängen also wesentlich von der Art der Ionen ab.

609846/0806

28203

In der Tabelle 2 sind die spezifischen Volumina der Harzsalze im trockenen Zustand und in Wasser zusammengestellt.

Tabelle 2

T	Volumen in Wasser (ml/g) Trockenvolumen (ml/g)	HR	" LiR	" NaR	NH^R	KR
l_t52h 0,696	1,503 0,702	I,lfl8 0,730	1,^09 0,792	1,357 0,763

In der Tabelle 2 bedeuten HR das Harz in der Wasserstoffform, LiR in der Lithiumform, NaR in der Natriumform, NH-R in der Ammoniumform und KR in der Kaliumform. Das Volumen der Harze in Wasser in ihren Salzformen nimmt in der folgenden Reihenfolge zu: K < NH. < Na <. Li < H. Der Wassergehalt des Harzes ist durch die Ordnung K = NH₄-¹C Na <£ Li < H.

Die Hydratationszahlen der einzelnen Ionen betragen 0,6 für K, 0,2 für NH₄, 2,0 für Na, 3,4 für Li und 3,9 für H. Harzsalze, deren Ionen die höheren Hydratationszahlen haben, besitzen auch einen grösseren Wassergehalt.

Wenn in der Elutionslösung Natriumionen als Gegenionen enthalten sind, können die Harze durch Verwendung einer wässrigen Lithiumhydrxodlösung rasch aufgequollen werden, da die in solchen Lösungen enthaltenen Lithiumionen eine grössere Hydrationszahl als die Natriumionen, die in der Regerenierungslösung verwendet werden, besitzen. Nach Abschluss einer Analyse, bei der Natriumionen als Gegenionen in der Elutionslösung verwendet werden, und Verwendung einer wässrigen Lithiumhydroxidlösung als Regenerierungslösung kann

809846/0806

26203U

die Höhe der Harzschicht innerhalb von 18 min auf den ursprünglichen Wert regeneriert werden. Vorzugsweise sind sowohl die Gegenionen als auch die Ionen in der Regenerierungslösung Alkalimetallionen.

Wenn K als Gegenion in der Elutionslösung verwendet wird, müssen Na oder Li oder sowohl Na als auch Li in der Regenerationslösung vorliegen. Als Gegenionen braucht nicht nur eine Ionenart verwendet zu werden, sondern können auch mehrere Ionenarten gemeinsam verwendet werden, beispielsweise sowohl Na als auch K in Kombination miteinander. In gleicher Weise brauchen auch die Alkalimetallionen in der Regenerationslösung nicht nur von einer Art Alkalimetallionen zu sein.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist im folgenden in Verbindung mit der Fig. 2 näher beschrieben.

Eine Trennsäule 62 ist mit stark saurem Kationenaustauscher beschickt, beispielsweise mit einem Styrol-Divinylbenzol-Copolymer mit einem Vernetzungsgrad von 6 bis 16 %. Der Teilchendurchmesser des Copolymers liegt im Bereich von 5 bis 8 μ. Der lichte Durchmesser der Trennsäule 62 beträgt 7 mm. Die Höhe der Harzschicht ist 135 mm. Vorrichtungen 64 und zur Aufgabe des zu trennenden Gemisches liegen zu beiden Seiten der Säule. Die Aufgabevorrichtungen 64 und 66 sind beide auf einen Umschalter 56 geschaltet. Ein Elutionslösungsbehälter 50 enthält eine Elutionslösung, die eine Zitronensäurepufferlösung mit einem pH von 3,25 enthält. Die Elutionslösung enthält weiterhin 0,20 m Natriumionen als Gegenionen.

In einem Behälter 60 für die Regenerierungslösung ist eine wässrige Lxthiumhydroxidlösung als Regenerxerungslosung vorrätig gehalten. Der Behälter 50 für die Elutionslösung und der Behälter 60 für die Regenerxerungslosung sind beide auf ein Ventil 52 geschaltet. Zwischen dem Umschaltventil 52 und

609846/080$

26203U

dem Umschaltventil 56 ist eine Aufgabepumpe 54 eingeschaltet. Die Ventile 52 und 54 sind gegeneinander verriegelt. Sie werden zeitlich und funktionell von einem Stellglied 80 gestellt. Ein Behälter 70 für Reagenzlösungen enthält eine Ninhydrinlösung als Färbungsmittel. Der Behälter 70 ist mit einer Mischstation 74 verbunden, und zwar über eine Förderpumpe 72. Ein Reaktor 76 speichert für eine vorgegebene Verweilzeit bei einer vorgegebenen Temperatur ein Lösungsgemisch und ist zu diesem Zweck als längere, in einen Thermostaten eintauchende Rohrleitung ausgebildet. Ein Fühler 78 ist als Durchflussphotometer ausgebildet. Mit dem Ventil 56 ist auch eine Austragsleitung 68 verbunden.

Die Trennsäule 62 wird über einen Wassermantel auf einer konstanten Temperatur von 60 ⁰C gehalten. In der Praxis weist der Chromatograph mehr als nur einen Behälter 50 für die Elutionslösung auf. Aus Gründen der Deutlichkeit ist in den Figuren jedoch lediglich einer dieser Behälter dargestellt. Der Volumenstrom der Elutionslösung ist auf 1,2 ml/min eingestellt. 30 min nach Anstellen des Chromatographen beträgt der Druck am Säuleneingang 55 bar. Der Reaktor 76 wird auf 100 ⁰C gehalten.

Unter Steuerung durch das Stellglied 80 werden die Antriebe der Stellventile 52 und 56 betätigt. Elutionslösung vom Behälter 50 läuft über die Leitung 82 und die Aufgabevorrichtung 64 auf die Säule 62. In der Aufgabevorrichtung wird das Aminosäuregemisch injiziert. Es wird von der Elutionslösung auf die Säule 62 mitgenommen und dort entwickelt. Das aus der Säule 62 ablaufende Gemisch gelangt über die Leitung 84 und das Stellventil 56 auf die Mischstufe 74. In der Mischstufe 74 wird das Eluat mit dem Färbungsmittel· vermischt, das über die Förderpumpe 72 zugeführt wird. Die Amxnosäurekomponenten des Flüssigkextsgemischs werden während des Durchlaufs durch den Reaktor 76 ausreichend an-

•'609846/0806

26203U

gefärbt und in dieser angefärbten Form im Detektor 78 durch optische Absorption vermessen. Die Messung erfolgt vorzugsweise bei Wellenlängen von 440 mm und 570 mm. Die optischen Absorptionsänderungen werden in elektrische Signale umgewandelt und als Chromatogramm auf einem Schreiber aufgezeichnet. Der Gehalt der einzelnen Aminosäurekomponenten bestimmt sich aus der Lage der Maxima der einzelnen Komponenten und der Fläche unter diesen Maxima.

Anschliessend werden die Stellventile 52 und 56 so umgestellt, dass der Behälter 60 mit der Regenerierungslösung mit der Pumpe 54 verbunden ist, die dann ihrerseits mit der Leitung 84 verbunden ist. Dabei ist die Leitung 82 mit der Austragsleitung 68 verbunden. Die Regenerierungslösung wird über die Leitung 84 auf die Säule 62 gegeben und über die Leitung 82 und die Leitung 68 ausgetragen. Der bei der vorhergehenden Aufgabe der Elutionslösung als Eingang dienende Anschluss der Säule ist jetzt bei der Aufgabe der Regenerierungslösung der Ausgangsanschluss. Das unter dem erhöhten Druck des vorhergehenden Arbeitstaktes komprimierte Harz liegt nun entspannt vor und quillt. Bei mit Harz beschickten Säulen tritt in der Säule stets ein Druckgefälle auf, wobei der eingangsseitig an der Säule herrschende Druck der grösste Druck ist. Dagegen liegt am Ausgang einer harzbeschickten Säule praktisch stets Atmosphärendruck vor. Wenn beim kontinuierlichen Betrieb Eingang und Ausgang periodisch vertauscht werden, kann die Druckbelastung der Säule verteilt und gemittelt werden.

Wenn dann die Stellventile 52 und 56 wieder umgestellt werden, wird die Elutionslösung auf die Trennsäule 62 über die Rohrleitung 84 gegeben. Die die Säule 62 verlassende Elutionslösung wird über die Leitung 82, das Stellventil 56, die Mischstufe 74, den Reaktor 76 und den Detektor 78 ausgetragen, wobei die Elutionslösung und die Harzschicht ins Gleichgewicht

609846/0806

26203H

gebracht werden.

Anschliessend wird ein zweites Substanζgemisch über die Aufgabevorrichtung 66 auf die Säule gegeben. Die Elutionslösung wird der Säule über die Zuleitung 84 aufgegeben. Nach der zweiten Trennung werden die Stellventile 52 und 56 erneut umgeschaltet und die Regenerierungslösung der Säule 62 über die Zuleitung 82 zugeführt. Bei der dritten Trennung wird das Substanzgemisch wieder über die Aufgabevorrichtung 64 zugeführt.

Während der Trennung werden die in den Proben enthaltenen Verunreinigungen im Bereich der Eingangsseite der Säule, bezogen auf die Durchsatzrichtung zurückgehalten. Da aber nach jedem Arbeitstakt die Regenerierungslösung im Gegenstrom durch die Säule geführt wird, können die während der vorausgegangenen Elutionsstufe aufgefangenen Verunreinigungen rasch, einfach und sicher von der Säule genommen werden. Dagegen werden Verunreinigungen erfahrungsgemäss nicht vollständig von der Säule genommen, wenn die Elutionslösung und die Regenerierungslösung stets in einer Richtung durch die Säule geführt werden.

In der Fig. 3 ist ein in der vorstehend beschriebenen Weise aufgenommenes Chromatogramm dargestellt. Die Maxima sind wie folgt zuzuordnen; Cysteinsulfonsäure (15) , Asparaginsäure (16), Threonin (17), Serin (18), Glutaminsäure (19), Glycin (20) und Alanin (21). Das in der Fig. 3 gezeigte Chromatogramm ist 10 h nach Beginn des kontinuierlichen Betriebes aufgenommen. Die prozentuale Trennung von Threonin (17) und Serin (18) beträgt,78 %. Der gleiche Wert wird unmittelbar nach Beginn des kontinuierlichen Betriebes gefunden. An der Einlaßseite der Säule wird konstant ein Druck von etwa 55 bar während des gesamten kontinuierlichen Betriebes gemessen. Erfindungsgemäss wird das Quellen des Harzes durch die Alkalimetallionen in der Regenerierungslösung gefördert.

609846/0806

-14- 26203U

Jede aufgrund der Kompression des Harzes auftretende Drift des prozentualen Trennungsgrades wird dadurch vollkommen wieder aufgehoben, so dass die Messungen mit ausgezeichneter Reproduzierbarkeit durchführbar sind.

In der Fig. 4 ist das Blockschaltbild eines weiteren Ausführungsbeispiels der Erfindung gezeigt. In den Behältern 1, und 3 sind drei verschiedene Elutionslösungen mit verschiedenen Metallionenkonzentrationen und pH-Werten gespeichert. Jede dieser drei Elutionslösungen enthält Natriumionen als Gegenionen. In einem Behälter 5 ist als Regenerierungslösung eine wässrige Lithiumhydroxidlösung gespeichert. In einem Behälter 6 ist eine Ninhydrinlösung als Färbereagenzlösung für Aminosäuren gespeichert. Die Stellventile 25,26, 27, 32, 34, 42 und 44 werden von einem in der Figur nicht dargestellten Steuergerät gesteuert. Das Stellen dieser Ventile erfolgt nach einem vorgegebenen Programm. Die Säulen 30 und 40 sind mit Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren beschickt.

Die beiden Trennsäulen 30 und 40 sind parallel geschaltet. Sie sind mit Filtern 33 bzw. 43 an beiden Anschlüssen ausgerüstet. Die Aufgäbevorrichtungen 31 und 41 für die Proben sind an jeweils einer Seite der Säule vorgesehen. Die Anordnung und Ausbildung der Mischstufe 14 zum Mischen des Färbungsmittels, das über eine Förderpumpe 12 aus dem Vorratsbehälter 6 zugeführt wird, mit der von der Säule ablaufenden Flüssigkeit, der Reaktor 7 zur Anfärbung der Aminosäuren, der Detektor 8 und die übrigen Elemente sind in gleicher Weise ausgebildet, wie im Zusammenhang mit dem in Fig. 2 gezeigten Ausführungsbeispiel beschrieben.

Die jeweils benötigte Elutionslösung wird durch das Stellventil 25 gewählt. Selbst während der Trennung kann von einer auf die andere Elutionslösung umgeschaltet werden. Die Elutionslösung läuft über die Stellventile 26 und 32 über eine Förderpumpe 10 auf die Trennsäule 30. In der Säule wird die Elutionslösung mit der Harzbeschickung ins

609846/080 6

26203U

Gleichgewicht gesetzt. Die Probe wird über die Probeaufgabevorrichtung 31 auf die Säule 30 gegeben und dort getrennt. Die die getrennten Komponenten enthaltende Elutions~ lösung läuft über ein Sechswegestellventil 34 und über einen Kanal 38 auf einen Mischer 14, in dem sie mit der als Färbungsreagenz verwendeten Ninhydrinlösung vermischt wird. Die Anfärbung wird im Reaktor 7 zuende geführt. Die Veränderung der optischen Absorption der gefärbten Komponenten wird im Detektor 8 gemessen, der vorzugsweise als Durchflussphotometer ausgebildet ist. Die Messung erfolgt bei 440 und 570 nm. Das Eluat wird schliesslich über den Auslass 13 aus dem Chromatographen ausgetragen. Die Änderungen der optischen Absorption werden in elektrische Signale umgewandelt und auf einem Schreiber 9 als Chromatogramm aufgezeichnet. Im Verlauf der Trennung wird das Stellventil umgeschaltet.

Während der.Trennung in der Trennsäule 30 wird die Trennsäule 40 zur Durchführung einer nächsten Trennung vorbereitet. Zu diesem Zweck wird die Regenerierlösung vom Vorratsbehälter über ein Stellventil 27, ein Sechswegestellventil 44 und eine Förderpumpe 11 auf den Fuss der Säule 40 aufgegeben. Die Regenerierlösung läuft durch die Säule 40 und wird schliesslich über das Stellventil 42 und die Ablaufleitung aus dem Chromatographen ausgetragen. Nachdem die Regenerierlösung die Säule 40 vom Fuss zum Kopf entsprechend der vorgegebenen Regenarierzeit durchlaufen hat, wird das Stellventil 27 umgestellt und wird die Eluierlösung über die Leitung 37 am Fuss der Säule 40 aifgegeben. Dabei werden das Harz in der Trennsäule 40 und die Elutionslösung ins Gleichgewicht gebracht. Die Elutionslösung wird über ein Stellventil 42 und die Ablaufleitung 28 aus dem Chromatographen ausgetragen.

Wenn die Trennung der Probe in der Trennsäule 30 abgeschlossen

"609846/0806

- 16 - 26203U

ist, werden die Sechswegestellventil 34 und 44 und die Stellventile 26, 32, 42 und 27 umgeschaltet. Die Elutionslösung wird jetzt über die Förderpumpe 10 und die umgestellten Stellventile 26 und 42 auf den Kopf der Säule 40 gegeben. Über die Probeaufgäbevorrichtung 41 wird auch die Probe auf die Trennsäule 40 gegeben. Die die auf der Trennsäule 40 getrennten Komponenten enthaltende Elutionslösung wird über einen Kanal 48 des Sechswegestellventils und über den Verbindungskanal 49 auf das Sechswegestellventil geleitet. Während der Trennung in der Trennsäule 40 wird Regenerationslösung vom Vorratsbehälter 5 über die Förderpumpe 11 auf den Fuss der Säule 30 gegeben. Die Regenerierungslösung gelangt über die Förderpumpe 11, das Sechswegestellventil, den Verbindungskanal 46, das Sechswegestellventil 34, die Säule 30 und das Stellventil 32 auf die Ablaufleitung Nachdem die Trennsäule 30 für eine bestimmte Zeit mit der Regenerierungslösung behandelt worden ist, wird das Stellventil 27 umgeschaltet und über die Verbindungsleitung 37 Elutionslösung auf den Fuss der Trennsäule 30 gegeben. Auch diese Elutionslösung wird über den Ablauf 28 aus dem Chromatographen genommen. Anschliessend werden die Stellventile im Leitungssystem umgeschaltet, so dass sie den Ausgangszustand annehmen,und wird in dieser Stellung der Ventile die dritte auf den Chromatographen gegebene Probe in der Trennsäule 30 getrennt.

Bei diesem Ausführungsbeispiel der Erfindung werden die Probe und die Arbeitselutionslösung stets am Kopf der Säulen aufgegeben. Die der Einstellung des Gleichgewichtes dienende Elutionslösung und die Regenerierungslösung werden stets am Fuss der Säulen aufgegeben. Die Probentrennung und die Regenerierung der Säule werden parallel zueinander durchgeführt. Der Verlust an zur Verfügung stehender Messzeit ist vernachlässigbar klein. Der vom vorangehenden Arbeitstakt der Säule als Einlass für die Elutionslösung geschaltete Eingang der Trennsäule ist bei der anschliessenden

609846/0806

26203H

Regenerierung im Gegenstrom als Auslass der Säule geschaltet. Auch dadurch wird erreicht, dass das während des Arbeitstaktes am Säuleneingang liegende und unter dem Arbeitsdruck komprimierte Harz während des Regenerierens entspannt wird und mit hohem Wirkungsgrad quellen kann. Durch die Gegenwart und gezielte Auswahl der Alkalimetallionen in der Regenerierungslösung wird das Quellen des Harzes weiter gefördert. Auf diese Weise können auch mit dem in Fig. 4 gezeigten Chromatographen die gleichen Vorteile erzielt werden wie mit dem im -Zusammenhang mit Fig. 2 beschriebenen Chromatographen. Insbesondere ist eine hohe Reprcduzierbarkeit der Trennwerte erhältlich. Die sich eingangsseitig auf der Säule sammelnden Verunreinigungen werden in kürzester Zeit und vollständig durch die Regenerierungslösung von der Säule genommen. Mit dem in Fig. 4 gezeigten Chromatographen kann auch langfristig ein kontinuierlicher Betrieb aufrechterhalten werden, obwohl das analytische System der Anlage unter Überdruck steht. Die Erfindung wird vorzugsweise für Chromatographen mit analytischen Systemen und für ähnliche analytische Systeme verwendet, die mit Eingangsdrücken von 40 bar und darüber arbeiten.

609846/0806

Claims

26203U Patentansprüche

1. Verfahren zur Chromatographie in flüssiger Phase, dadurch gekennzeichnet , dass eine die zu trennenden Komponenten enthaltende Probe auf eine Trennsäule gegeben wird, die mit einem Ionenaustauscherharz beschickt ist, das unter Druckeinwirkung verformbar ist, dass eine Gegenionen enthaltende Elutiohslösung auf die Trennsäule gegeben wird, dass die von der Trennsäule genommenen Komponenten nachgewiesen werden und dass anschliessend eine Regenerierungslösung auf die Trennsäule gegeben wird, die Metallionen der gleichen elektrischen Ladung enthält, wie sie die Gegenionen besitzen, jedoch eine grössere Hydratationszahl als die Gegenionen haben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Strömungsrichtung der auf die Trennsäule gegebenen Elutionslösung der Strömungsrichtung der auf die Trennsäule gegebenen Regenerierungslösung entgegengesetzt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass die Elutionslösung stets von einer Seite her auf die Säule gegeben wird und dass die Regenerierungslösung stets von der entgegengesetzten Seite auf die Säule gegeben wird.

609846/0806

-19- 26203H

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass, nachdem die Regenerierungslösung und die Elutionslösung von einer Seite her auf die Säule gegeben worden sind, die Regenerierungslösung und die Elutionslösung anschliessend vom anderen Ende her auf die Säule gegeben werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch geken nzeichnet, dass die Elutionslösung Natriumionen als Gegenionen und die Regenerierungslösung Lithiumionen enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , dass die Elutionslösung Kaliumionen als Gegenionen und die Regenerierungslösung Natriumionen und bzw. oder Lithiumionen enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , dass das Ionenaustauscherharz ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymer ist.

8. Vorrichtung zur Chromatographie in flüssiger Phase, gekennzeichnet durch eine Trennsäule, die mit unter Druck verformbarem Ionenaustauscherharz beschickt ist, durch Mittel zum Beaufschlagen der Trennsäule mit einer Gegenionen enthaltenden Elutionslösung, durch Mittel zum Erkennen und Registrieren der die Trennsäule

609846/0806

-20- 26203H

verlassenden Komponenten und durch Mittel zur Beaufschlagung der Trennsäule mit einer Regenerxerungslösung in einer Strömungsrichtung, die der Strömungsrichtung der Elutionslösung entgegengesetzt ist, wobei die Regenerxerungslösung Ionen enthält, die die gleiche-elektrische Ladung wie die Gegenionen, jedoch eine grössere Hydratationszahl als diese haben.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch g e k e η η zeichnet , dass die Mittel zur Beschickung der Trennsäule mit der Elutionslösung diese unter einem
Druck von 40 bar oder darüber auf die Säule geben.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 oder 9, g e kennzeichnet durch Mittel zur Schaltung
verschiedener Durchlaufpfade, die periodisch abwechselnd eine Periode der Aufgabe der Regenerxerungslösung und der Elutionslösung auf ein Ende der Trennsäule und
eine Periode der Aufgabe der Regenerxerungslösung und der Elutionslösung auf das entgegengesetzte Ende der
Trennsäule schalten.

11.Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet , dass die Mittel zur Erkennung und Registrierung der getrennten Einzelkomponenten Mittel zur Zufuhr eines Farbreagenzes, Mittel zum Mischen des von der Trennsäule laufenden Eluats mit dem Farb-

609846/0806

-■21- 26203H

reagenz und einen Detektor enthalten.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet , dass die Vorrichtung mindestens zwei Trennsäulen enthält und die Probe in einer der Säulen getrennt wird, während durch eine andere Säule die Regenerierungslösung gegeben wird.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet , dass die Gegenionen und die Metallionen in der Regenerierungslösung Alkalimetallionen sind.

14. Vorrichtung zur Chromatographie in flüssiger Phase, gekennzeichnet durch eine mit Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren beschickte Trennsäule, durch

' Mittel zur Aufgabe der zu trennenden Probe an zumindest einer Seite der Säule, durch Mittel zur Beaufschlagung der Trennsäule mit einer Elutionslösung und einer Regenerierungslösung, durch Mittel zur Steuerung eines Stellventils in der Weise, dass alternierend eine Periode der Beaufschlagung der Trennsäule mit einer Elutionslösung und einer Regenerierungslösung in einer bestimmten Strömungsrichtung und eine Periode der Beaufschlagung der Trennsäule mit der Elutionslösung und der Regenerierungslösung in der entgegengesetzten Strömungsrichtung abgewechselt werden, und durch Mittel zum

609846/0806

Nachweis der die Trennsäule verlassenden Einzelkomponenten .

609846/0808