DE4029557C2 - Verfahren, Gerät und Trennsäule für eine Flüssigkeitschromatographie - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für eine Flüssigkeitschromatographie einer biologischen oder lebenswichtigen Komponente und ein Gerät dafür.

Insbesondere betrifft sie ein Verfahren für eine Flüssigkeitschromatographie von glykolisiertem Hämoglobin und ein Gerät dafür.

Glykolysierte Hämoglobine werden nach Eintritt von Zucker in Erytrozyten durch eine Reaktion des Zuckers in Blut mit Hämoglobin in Abhängigkeit von der Konzentration des Zuckers erzeugt. Man sagt, daß die Konzentration eines stabilen A_1c (s-A_1c) unter den glykosylierten Hämoglobinen die mittlere Zuckerkonzentration für die vorangegangenen 2 bis 3 Monate widerspiegelt. Die Konzentration von s-A_1c wird, verglichen mit dem Blutzuckerspiegel, dem Urinzuckerspiegel und Ähnlichem, stark durch physiologische Faktoren beeinflußt, und daher wird sie für die Diagnose von Diabetes und als ein Anzeichen des Fortschreitens der Genesung eines Diabetikers benutzt.

A_1c wird durch Binden von Glukose an den n-Terminus einer β-Kette von Hämoglobinen gebildet. A_1c besteht aus labilem A_1c (l-A_1c) und stabilem A_1c (s-A_1c).

Hämoglobin ist ein konjugiertes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 64 000, das durch eine Verbindung von Häm (1 Pigment) mit Globin (ein Protein) gebildet wird, und spielt eine wichtige Rolle als Sauerstoffträger in Körpern von Tieren.

Wenn ein Zucker wie Glukose mit Hämoglobin reagiert, wird ein Freisetzen von Sauerstoff schwierig, so daß eine Sauerstoffversorgung zu äußeren Blutgefäßen und Geweben schwierig wird. Zusätzlich ist die Struktur des Reaktionsproduktes festgelegt, was in einer Deformation von Blutgefäßen usw. resultiert.

Als normale menschliche Hämoglobine sind die in Tabelle 1 aufgelisteten bekannt. Das Hämoglobin (Hb) eines gesunden Erwachsenen besteht aus HbA₀, HbA₂ und HbF, und ein durch eine Reaktion mit einem Zucker HbA₀ gebildetes Produkt ist glykosyliertes Hämoglobin (HbA₁). GHb (HbA₁) besteht aus A₁, A_1b, A_1c und Ähnlichem, welche in der Aminosäurestruktur von Hämoglobin und der Art von an Hämoglobin angelagertem Zucker verschieden sind. Von den glykosylierten Hämoglobinen wird A_1c, das durch Binden von Glukose an den N-Terminus einer β-Kette gebildet ist, in den größten Mengen gefunden.

Tabelle 1

Hämoglobin eines gesunden Erwachsenen

A_1c wird nicht-enzymatisch durch zwei Reaktionsschritte erzeugt. Bei der ersten Reaktion wird ein sogenanntes labiles A_1c (l-A_1c) erzeugt, von dem ein Teil durch eine reversible Reaktion zu Glukose und Hämoglobin rückreagiert. Andererseits ist die zweite Reaktion eine irreversible Reaktion und ergibt das stabile A_1c (s-A_1c).

HbA₁, A_1c, s-A_1c und Ähnliches werden als Anzeichen von Diabetes benutzt, aber es ist vorzuziehen, das stabile A_1c (s-A_1c) als genaueres Anzeichen zu messen.

Als Verfahren zum Trennen von glykolisiertem Hämoglobin, Hämoglobin, und Hämoglobinderivaten gibt es viele Verfahren, bei denen sie auf der Grundlage des Unterschieds ihrer elektrischen Eigenschaften getrennt werden. Derartige Verfahren sind elektrophoretische Verfahren, chromatographische Verfahren mit Ionenaustausch, usw. Es gibt auch Verfahren, die auf einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie basieren.

Als Verfahren zum Trennen von s-A_1c von l-A_1c und Messen derselben gibt es zwei Verfahren, d. h. (1) ein Verfahren, bei dem l-A_1c durch eine Vorbehandlung zuvor entfernt wird, und (2) ein Verfahren, bei dem s-A_1c von l-A_1c getrennt und chromatographisch durch Anwendung einer Trennsäule erfaßt wird.

Als Verfahren, bei dem l-A_1c durch eine Vorbehandlung entfernt wird, gibt es Verfahren, bei denen Erytrozyten mit einer physiologischen Salz- oder einer Pufferlösung gezüchtet werden, die Semikarbazid und Anilin enthält (P. A. Svendsen, et al., Diabetologia, 19, 130 (1980); und D. M. Nathan et al., Claim Chem., 28, 512 (1982)). Diese Verfahren erfordern eine schwierige Vorbehandlung oder sind in der Schnelligkeit so schlecht, daß eine Behandlung 30 Minuten bis 4 Stunden erfordert. Kommerziell verfügbare Instrumente (oder Geräte) für ausschließlichen Gebrauch haben einen direkt angeschlossenen und gesteuerten l-A_1c-Entfernungsmechanismus. Es ist berichtet worden, daß die Behandlungszeit durch ein Hinzufügen eines kommerziell verfügbaren l-A_1c-Entfernungsreagenzes zu Blut und durch Erhitzen des resultierenden Gemisches auf 50°C für 1 bis 2 Minuten verringert wird (Takahshi et al., Nippon Rinsho Kensa Jidoka Gakkai Kaisha, 12, 133 (1987)). Eine derartige Hitzebehandlung hat jedoch den Nachteil, daß sie Protein denaturiert, um eine Ablagerung zu verursachen, so daß ein Rohr oder ein Filter verstopft wird.

Andererseits gibt es als Verfahren, bei dem s-A_1c von l-A_1c durch die Verwendung einer Trennsäule getrennt wird, beispielsweise ein Verfahren, das ein Packmaterial verwendet, das aus Siliziumdioxid als Grundmaterial und einer Carboxylgruppe als Ionenaustauschgruppe besteht, und ein Verfahren, das ein Packmaterial verwendet, das aus einem porösen Harz vom Polyvinylalkoholtyp besteht. Kommerziell verfügbare Instrumente zum ausschließlichen Gebrauch erlauben auch eine Trennung von s-A_1c von l-A_1c.

Bei dem Verfahren, das ein Packmaterial verwendet, das aus Siliziumdioxid als Grundmaterial und einer Carbonylgruppe als Ionenaustauschgruppe besteht, ist eine lange Zeit von etwa 20 Minuten für ein Trennen von Hämoglobin in die Komponenten A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀ erforderlich (Jap. Pat. Anm. Kokai (Offenlegungsschrift) Nr. 63-75558).

DE-A1-36 09 021 beschreibt ein für eine Flüssigkeitschromatographie geeignetes Trennmedium, d. h. Packmaterial, das aus einem im wesentlichen nicht-porösen Träger besteht, an dessen Oberfläche polymere Ketten kovalent gebunden sind, wobei jede dieser Ketten mehrere Bindungsketten enthält.

Diese Bindungsstellen können zum Ionenaustausch befähigte funktionelle Gruppen sein. Mit diesem Packmaterial kann zwar ein Hämoglobingemisch aus vier Komponenten getrennt werden, jedoch dauert eine solche Trennung mindestens zehn Minuten.

Bei dem Verfahren, das ein Packmaterial verwendet, das aus einem porösen Harz vom Polyvinylalkoholtyp besteht, ist eine lange Zeit von etwa 60 Minuten zum Trennen von Hämoglobin in die Komponenten A_1a, A_1bb, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀ erforderlich (Hoshino et al., "Collection of the Substances of Lectures to the 31th Japan Liquid Cromatography Society", Nr. 29, 175 (1988)).

Bei einem weiteren Verfahren, das ein Copolymer vom Vinylalkoholtyp als ein Packmaterial verwendet, werden l-A_1c, s-A_1c und HbA₀ in etwa 25 Minuten voneinander getrennt. Dieses Verfahren hat jedoch die Komponenten A_1a, A_1b und HbF nicht erhellt bzw. verarbeitet bzw. getrennt (Jap. Pat. Anm. Kokai (Offenlegungsschrift) Nr. 60-213863).

Einzelheiten derartiger Packmaterialien sind nicht deutlich berichtet worden. Es scheint, daß eine Trennung von Komponenten voneinander nicht fertig ist oder eine lange Zeit erfordert, da die Teilchengröße der Packmaterialien und ihre physikalischen Eigenschaften, wie ein spezifischer Oberflächenbereich, eine Austauschkapazität usw. nicht besonders geeignet gemacht worden sind.

Im Fall eines herkömmlichen Analysators für glykosyliertes Hämoglobin dauert es etwa 3.5 Minuten, um Hämoglobin in 5 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, A_1c und HbA₀ zu trennen, und es dauert 8 Minuten, um Hämoglobin in 6 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀ zu trennen (Takahashi et al., Japan Rinsho Kensa Jidoka Gakkai Kaisha 12, 133 (1987)). Das Hämoglobin aller Menschen wird nicht in 5 oder 6 Komponenten getrennt, da A_1a, A_1b, HbF oder Ähnliches aufgrund ihres geringen Anteils nicht im Blut einiger Menschen nachgewiesen werden und andere Hämoglobinderivate im Blut anderer Menschen enthalten sind. In der vorliegenden Beschreibung werden der Einfachheit halber die Ausdrücke "5-Komponentenanalyse" und "6-Komponentenanalyse" benutzt.

Zum Trennen von Hämoglobin in die obigen 5 Komponenten wird eine Trennsäule (⌀ 4.6 × 35 mm) benutzt, die ein Material vom Siliziumdioxidgeltyp verwendet. Andererseits wird zum Trennen von Hämoglobin in die obengenannten 6 Komponenten eine Trennsäule unterschiedlicher Größe (⌀ 4.6 × 120 mm) benutzt und dasselbe Material verwendet. Sowohl bei der 5-Komponentenanalyse als auch bei der 6-Komponentenanalyse wird die Elution durch ein schrittweises Gradientenverfahren ausgeführt, bei dem 3 Eluenten schrittweise durch eine Trennsäule geführt werden. Die 5-Komponentenanalyse und die 6-Komponentenanalyse unterscheiden sich voneinander in der verwendeten Trennsäule und in den Verbindungen der benutzten Eluenten. Daher können die 5-Komponentenanalyse und die 6-Komponentenanalyse nicht aufeinanderfolgend ausgeführt werden. Wenn beispielsweise die 6-Komponentenanalyse nach der 5-Komponentenanalyse ausgeführt wird, sollten die Säule und die Eluenten ausgetauscht werden, und daher sind aufwendige Handhabungen erforderlich. Darüber hinaus sollte ein Eluent nach dem Säulenaustausch für etwa 10 Minuten durch eine Entlastungssäule geführt werden, um die Säule zu stabilisieren, so daß eine lange Zeit für die Messung erforderlich ist.

Als in eine derartige Säule gepacktes Packmaterial wird für gewöhnlich ein Packmaterial benutzt, das durch Einführen einer Carboxymethylgruppe als Funktionsgruppe in ein Siliziumdioxidgel mit einer Teilchengröße von etwa 5 µm als Grundmaterial erhalten wird.

Eine Trennsäule, die durch Packen eines Packmaterials mit einer Teilchengröße von etwa 5 µm in eine Säule mit ⌀ 4.6 × 35 mm hergestellt ist, erlaubt eine Trennung der obigen 5 Komponenten. Eine Trennsäule mit dieser Größe (Länge) hat jedoch keine ausreichende Fähigkeit, 6 Komponenten zu trennen, und eine Trennsäule mit einem Innendurchmesser von 4.6 und einer Länge von 120 mm sollte für diese Trennung benutzt werden.

Die chromatographische Leistung (Auflösung Rs) wird im Verhältnis zu der Quadratwurzel der Säulenlänge verbessert (der Wert der Auflösung Rs wird erhöht). Daher ist die chromatographische Leistung um so höher, je größer die Säulenlänge ist, aber um so länger ist die für eine Analyse erforderliche Zeit. Zusätzlich resultiert die Erhöhung der Säulenlänge in einem größeren Druckabfall und beeinflußt die Lebensdauer der Säule, die Lebensdauer einer Pumpendichtung, usw.

Wie oben beschrieben ist, erfordert bei den herkömmlichen Verfahren eine Trennung von Hämoglobin in 6 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀ eine lange Zeit von 8 bis 60 Minuten. Die herkömmlichen Verfahren sind daher bezüglich der Analysenzeit nachteilig.

Die herkömmlichen Verfahren machen es nicht möglich, zwei Komponentenanalysen, d. h. eine 5-Komponentenanalyse (Trennung von Hämoglobin in A_1a, A_1b, HbF, A_1c und A₀) und eine 6-Komponentenanalyse (eine Trennung von Hämoglobin in A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀), unter Verwendung einer einzigen Trennsäule auszuführen. D. h., daß sie es nicht ermöglichen, die 5-Komponentenanalyse und die 6-Komponentenanalyse aufeinanderfolgend auszuführen und sind nachteilig bezüglich der Einfachheit der Bedienung und der Geschwindigkeit.

Bei dem zuvor genannten Stand der Technik gibt es das Problem, daß es eine lange Zeit dauert, ein stabiles A_1c (s-A_1c) von anderen Hb-Komponenten (A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, HbA₀, usw.) zu trennen und dieselben zu messen.

Weitere Probleme sind: Hämoglobin kann nicht in 5 Komponenten A_1a, A_1b HbF, A_1c und HbA₀, und in 6 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀ unter Verwendung einer einzigen Trennsäule und von Eluenten mit der gleichen einzigen Zusammensetzung aufgetrennt werden, und Trennsäule und Eluenten sollten ausgetauscht werden, so daß aufwendige Handhabungen erforderlich sind. Der Austausch der Trennsäule und der Eluenten erfordert eine lange Zeit. Verfahren und Geräte nach dem Stand der Technik sind nicht wirtschaftlich.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Gerät mit einer Trennsäule sowie ein Verfahren unter Verwendung eines Packmaterials bereitzustellen, das es ermöglicht, A_1c oder labiles A_1c und stabiles A_1c von Bluthämoglobinen bei hoher Trennfähigkeit in möglichst kurzer Zeit zu trennen und labiles A_1c und stabiles A_1c oder A_1c schnell und quantitativ zu bestimmen.

Eine weitere Aufgabe ist es, eine Trennsäule, die mit einem Packmaterial gepackt ist, welches eine aufeinanderfolgende 5-Komponentenanalyse und 6-Komponentenanalyse des Hämoglobins ohne Austausch der Trennsäule und der Eluenten erlaubt, zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgaben werden gelöst durch den Gegenstand der Ansprüche 1, 4 und 9.

Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Das Gerät für eine Flüssigkeitschromatographie für die Bestimmung von glykosyliertem Hämoglobin A_1c 4, welches leicht in Glukose und Hämoglobin umgewandelt wird, und glykosyliertem Hämoglobin A_1c 5, welches nicht leicht in Glukose und Hämoglobin umgewandelt wird,
oder die Trennung von glykosyliertem Hämoglobin A_1c 9, welches die zuvor genannten beiden glykosylierten Hämoglobine umfaßt, von Bluthämoglobinen, und die Bestimmung von A_1c 9, weist auf
einen oder mehrere Eluenten 11, 12, 13;
eine Trennsäule 25, die mit einem Packmaterial gepackt ist;
einen automatischen Probennehmer 14 zum Abtasten einer oder mehrerer Probe(n) und Überführen derselben zu der Trennsäule 25;
eine intelligente Pumpe 16 zum Durchführen des oder der Eluenten 11, 12, 13 durch die Trennsäule 25;
und einen Detektor 27 zum Erfassen der Absorptionen von Eluaten von der Trennsäule 25;
und ist dadurch gekennzeichnet, daß das Packmaterial im wesentlichen aus einer porösen Substanz mit darin eingebauten Carboxylalkylgruppen zusammengesetzt ist und aus der Klasse bestehend aus Methacrylatpolymeren, Vinylalkoholpolymeren, Styrol-Divinyl-Benzol-Polymeren und Siliziumdioxidgelen ausgewählt ist, wobei das Packmaterial eine mittlere Teilchengröße in trockenem Zustand von 4 µm oder weniger, einen spezifischen Oberflächenbereich in trockenem Zustand von 10 bis 100 m²/g und eine Austauschkapazität, basierend auf einer trockenen Basis, von 0.1 bis 1 mäq hat.

Der spezifische Oberflächenbereich des Packmaterials im trockenen Zustand beträgt 10 bis 100 m²/g, und die Austauschkapazität des Packmaterials pro Gramm, die auf einer trockenen Basis basiert, beträgt 0.1 bis 1 mäq.

Die funktionelle Gruppe ist eine Carboxalkylgruppe. Zusätzlich werden eine oder mehrere Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 5.0 bis 7.0 als Eluenten benutzt.

Darüber hinaus ist ein flüssigchromatographisches System aufgebaut, das es möglich macht, verschiedene Analysen (z. B. eine 5-Komponentenanalyse und eine 6-Komponentenanalyse) aufeinanderfolgend auszuführen.

Eine Erläuterung der vorliegenden Erfindung wird mit der nachfolgenden Beschreibung im Zusammenhang mit der Zeichnung gegeben.

Fig. 1 ist ein beim Beispiel 1 erhaltenes Chromatogramm.

Fig. 2 ist ein beim Vergleichsbeispiel 1 erhaltenes Chromatogramm.

Fig. 3 ist ein beim Vergleichsbeispiel 2 erhaltenes Chromatogramm.

Fig. 4 ist ein beim Beispiel 2 erhaltenes Chromatogramm.

Fig. 5 ist ein beim Beispiel 3 erhaltenes Chromatogramm.

Fig. 6 ist ein beim Beispiel 4 erhaltenes Chromatogramm.

Fig. 7 ist eine Kurve, die die Korrelation zwischen (l-A_1c + s-A_1c)-Werten, die durch das Verfahren des Beispiels 2 gemessen sind, und A_1c-Werten, die durch das Verfahren des Beispiels 3 gemessen sind, zeigt.

Fig. 8 und 9 zeigen ein Ausführungsbeispiel des Analysegeräts dieser Erfindung.

Fig. 10 bis 12 sind Flußdiagramme von Beispielen dieser Erfindung.

Fig. 13 zeigt Bedingungen eines Glukosetoleranz-Screenings.

Fig. 14 und 15 sind Flußdiagramme von Beispielen dieser Erfindung.

Fig. 16 zeigt ein beim Vergleichsbeispiel 4 erhaltenes Chromatogramm.

Fig. 17 ist eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Flußrate des Eluenten und HETP zeigt.

Fig. 18 ist eine Kurve, die die Beziehung zwischen einem spezifischen Oberflächenbereich und einer Austauschkapazität zeigt.

Fig. 19 ist eine Kurve, die die Beziehung zwischen einem spezifischen Oberflächenbereich und HETP zeigt.

Fig. 20 ist eine Kurve, die die Beziehung zwischen einer Austauschkapazität und HETP zeigt.

Die chromatographischen Leistungen einer Trennsäule können durch Einstellen der mittleren Teilchengröße eines Packmaterials in einem trockenen Zustand auf eine Größe von 4 µm oder weniger verbessert werden, und es kann eine Säule verwendet werden, die kürzer ist. Deshalb kann die Analysenzeit durch Verbessern der chromatographischen Leistungen verringert werden.

Packmaterialien werden in anorganische polymere Packmaterialien und organische polymere Packmaterialien klassifiziert, und zwar entsprechend den Startmaterialien. Als anorganische polymere Packmaterialien werden jene weitverbreitet benutzt, die Siliziumdioxidgel als Grundmaterial aufweisen.

Bei einer Verringerung des Teilchendurchmessers ist das Siliziumdioxidgel aufgrund seiner Eigenschaften widerstandsfähig. Andererseits wird in dem Fall von organischen polymeren Packmaterialien das Packmaterial durch Druck verformt, wenn der Druckabfall einer Säule durch Verringern eines Teilchendurchmessers erhöht wird, so daß die chromatographischen Leistungen verschlechtert werden. Die Verschlechterung der chromatographischen Leistungen ergibt sich beispielsweise aus einer Änderung des Packzustandes des Packmaterials in der Säule, die durch die Deformation des Packmaterials durch Druck verursacht ist.

Wenn physikalische Eigenschaften, wie spezifischer Oberflächenbereich und Teilchengröße eines Packmaterials bestimmt sind, wird der Druckabfall einer Säule in einem zu dem Quadrat des Teilchendurchmessers inversen Verhältnis erhöht. Daher ist es besondere in dem Fall von organischen polymeren Packmaterialien notwendig, den Druckwiderstand, d. h. die mechanische Stärke, des Packmaterials selbst zu verbessern, und den Druckabfall einer Säule zu verringern (nämlich die Permeabilität zu erhöhen).

Bei der vorliegenden Erfindung ist ein Packmaterial zum Analysieren von glykosyliertem Hämoglobin vorgeschlagen worden, das ausgezeichnet in bezug auf chromatographische Leistung, Druckwiderstand (mechanische Stärke) und Permeabilität ist, und es sind Teilchendurchmesser des Packmaterials für eine Hochleistungs-Trennsäule und dessen physikalische Eigenschaften, wie spezifischer Oberflächenbereich, Art einer funktionellen Gruppe, Menge an geänderten funktionellen Gruppen (d. h. die Austauschkapazität), usw. geklärt worden.

Die Trennsäule, die bei dem analytischen Verfahren und dem Gerät der vorliegenden Erfindung benutzt wird, ist gegenüber herkömmlichen Säulen beispielsweise in bezug auf Auflösung, Druckwiderstand, Permeabilität besser, da sie ein Packmaterial benutzt, dessen physikalische Eigenschaften sehr geeignet gemacht worden sind. Aufgrund dieser besseren Auflösung kann eine kürzere Säule benutzt werden, und die Analysenzeit kann verringert werden. Zusätzlich können die oben erwähnten 5-Komponentenanalyse und die 6-Komponentenanalyse unter Benutzung einer einzigen Säule ausgeführt werden, und zwar durch Verändern der Zusammensetzung(en) des (der) Eluenten oder der Elutionsbedingungen (die Art(en)) des (der) Eluenten muß (müssen) nicht geändert werden). Darüber hinaus kann die Trennsäule aufgrund der Überlegenheit bei der Pemeabilität und dem Druckwiderstand stabil für eine lange Zeitdauer benutzt werden.

Daher erlaubt das Verfahren und das Gerät zum Analysieren von glykosyliertem Hämoglobin dieser Erfindung, die eine derartige Trennsäule verwendet, eine schnelle, stabile und leichte (einfache) Analyse des glykosylierten Hämoglobins.

Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung erklärt.

Als bei dieser Erfindung verwendete Trennsäule können Säulen verwendet werden, die mit einem Packmaterial einer anorganischen oder organischen Substanz bepackt sind, und die mit einer funktionellen Gruppe verändert werden, die in einem trockenen Zustand eine mittlere Teilchengröße von 4 µm oder weniger, einen spezifischen Oberflächenbereich von 10 bis 100 m²/g und eine Austauschkapazität von 0.1 bis 1 mäq/g aufweisen. Als bei dieser Erfindung verwendete Trennsäule können verschiedene verwendet werden, obwohl Säulen vorzuziehen sind, die mit einem Packmaterial gepackt sind, das mit mindestens einer Carboxylalkylgruppe verändert ist, und Säulen noch mehr vorzuziehen sind, die mit Packmaterial bepackt sind, das mit mindestens einer Carboxymethylgruppe verändert ist. Ein Verfahren zum Einführen einer Carboxylalkylgruppe in eine anorganische und eine organische Substanz ist ein herkömmliches Verfahren (japanische Offenlegungsschrift Nr. 59-3 23 102).

Als Packmaterial wird ein Material benutzt, das eine anorganische oder eine organische Substanz als ein Grundmaterial aufweist. Als Substanz kann eine Substanz benutzt werden, die im allgemeinen zum Analysieren von glykosyliertem Hämoglobin, usw. durch eine Flüssigkeitschromatographie benutzt wird. Die organische Substanz enthält beispielsweise Methacrylatpolymere, Vinylalkoholpolymere und Styrol- Divinyl-Benzol-Polymere.

Bezüglich der Teilchengröße des Packmaterials wurde ein Erreichen einer erwünschten Teilchengröße durch Aufnehmen eines Rasterelektronenmikrobildes der anorganischen oder der organischen Substanz oder durch Messung der Teilchengröße durch das Coulter-Counter-Verfahren bestätigt. Der spezifische Oberflächenbereich des Packmaterials wurde mit Hilfe des BET-Verfahrens gemessen. Die Austauschkapazität des Packmaterials wurde mit einem herkömmlichen Verfahren gemessen.

Als eine bei dieser Erfindung verwendete Säule wird vorzugsweise eine zylindrische Säule mit einem Innendurchmesser von 1 bis 8 mm und einer Länge von 20 cm oder weniger verwendet, woei vorzugsweise eine zylindrische Säule mit einem Innendurchmesser von 1 bis 6 mm und einer Länge von 2 bis 10 cm verwendet wird.

Als Verfahren zum Packen des Packmaterials in die Säule kann irgendein herkömmliches Verfahren verwendet werden, solange es ein einheitliches Packen und eine Steuerung der Packrate erlaubt. Die Steuerung der Packrate wird beispielsweise durch Erhöhen der Durchflußrate eines Lösungsmittels im Laufe der Zeit durchgeführt, das während des Packens zugeführt wird, und zwar von der Flußrate zu Beginn des Packens an.

Eine Flüssigkeitschromatographie wird durch Absorbieren von glykosyliertem Hämoglobin, Hämoglobin und/oder Derivaten davon in der Trennsäule und durch darauffolgendes Hindurchführen eines oder mehrerer Eluenten, um glykosyliertes Hämoglobin usw. zu trennen, durchgeführt.

Als Eluent (Eluenten) kann irgendein Eluent benutzt werden, der für gewöhnlich zum Analysieren von glykolisiertem Hämoglobin durch eine Flüssigkeitschromatographie benutzt wird, solange dieser oder diese eine Pufferlösung (Pufferlösungen) mit einem pH-Wert von 5.0 bis 7.0 ist (sind). Es können beispielsweise Pufferlösungen benutzt werden, die Natriumazetat, Natriumphosphat, Kaliumphosphat enthalten, und Lösungen, die Salze wie Natriumchlorid, Natriumsulfat enthalten. Harnstoff oder Guanidin können dem hinzugefügt werden. Zusätzlich können organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Acetonitril, Ethanol, Methanol, Mercaptoethanol damit gemischt werden.

Die Zusammensetzung(en) des (der) Eluenten, z. B. die Konzentrationen eines Puffers, eines Salzes, eines Harnstoffs, eines organischen Lösungsmittels, usw. und der pH-Wert müssen beim Analysieren von glykosyliertem Hämoglobin, Hämoglobin oder Ähnlichem durch eine Flüssigkeitschromatographie nicht konstant sein. Beispielsweise können sie in der Art eines kontinuierlichen Gradienten oder eines schrittweisen Gradienten variiert werden. Die Durchflußrate der durchgeführten Eluenten muß auch nicht konstant sein und kann kontinuierlich oder schrittweise mit der Zeit variiert werden.

Glykosyliertes Hämoglobin, Hämoglobin und Hämoglobinderivate in einem Eluat, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Trennsäule getrennt worden sind, können durch Messen sichtbaren Lichts mit einer Wellenlänge von 415 nm nachgewiesen werden. Daher können ihre Trennung und ihre längenmäßige Bestimmung leicht durchgeführt werden.

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele erläutert.

Beispiel 1 und Vergleichsbeispiele 1 und 2

Beim Beispiel 1 wurde ein Packmaterial benutzt, das durch Einführen von Carboxymethylgruppen als funktionelle Gruppen in ein Methacrylatpolymer als Grundmaterial erhalten wird.

Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse einer Messung der physikalischen Eigenschaften und den Druckabfall des Packmaterials des Beispiels 1.

Das beim Beispiel 1 benutzte Packmaterial hatte eine Teilchengröße von 3.5 ± 0.5 µm, einen spezifischen Oberflächenbereich von 20 m²/g und eine Austauschkapazität von 0.28 mäq/g.

Ein im Vergleichsbeispiel 1 benutztes Packmaterial wurde synthetisiert, um im wesentlichen denselben spezifischen Oberflächenbereich und dieselbe Austauschkapazität wie im Beispiel 1 und eine mittlere Teilchengröße von 5 µm zu haben.

Das im Vergleichsbeispiel 2 verwendete Packmaterial ist keine poröse Substanz, hat keine physikalisch ausgebildeten Poren (nämlich keine Makropore), und hat einen kleinen spezifischen Oberflächenbereich. Dessen Teilchengröße betrug 3.5 ± 0.5 µm, was der Größe im Beispiel 1 entspricht. Dessen spezifischer Oberflächenbereich betrug 5 m²/g und war damit kleiner als der spezifische Oberflächenbereich des im Beispiel 1 benutzten Packmaterials. Beim Vergleichsbeispiel 2 wurden Carboxymethylgruppen in derselben Art wie beim Beispiel 1 eingeführt. Da das im Vergleichsbeispiel 2 verwendete Packmaterial keine Makroporen und einen kleinen spezifischen Oberflächenbereich hatte, betrug seine Austauschkapazität 0.01 mäq/g; die Anzahl der geänderten Carboxymethylgruppen war nämlich klein.

Jedes der obigen drei Packmaterialien wurde in eine Säule gepackt, wodurch Trennsäulen erhalten wurden. Die Packmaterialien des Beispiels 1 und des Vergleichsbeispiels 1 wurden einzeln in eine Säule aus rostfreiem Stahl mit einem Innendurchmesser von 4.6 mm und einer Länge von 35 mm gepackt. Andererseits wurde das Packmaterial des Vergleichsbeispiels 2 in eine größere Säule mit einem Innendurchmesser von 7.5 mm und einer Länge von 75 mm gepackt, da dessen spezifischer Oberflächenbereich und seine Austauschkapazität klein waren, so daß dessen Kontaktbereich mit einer Probe klein war.

Alle Packungen wurden mittels des Aufschlämmungsverfahrens durchgeführt. Als Lösungsmittel bei der Aufschlämmung und als Lösungsmittel zum Packen wurde ein 80 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6.20) benutzt. Das Lösungsmittel zum Packen wurde bei einem Packdruck von 15 MPa (150 kg/cm²) wähend einer Stunde zugeführt.

Als Probe wurde frisches Blut eines normalen Erwachsenen, das nach einem Hinzufügen von Natriummethylendiamintetraazetat als Antigerinnungsmittel gesammelt worden war, benutzt. Das frische Blut wurde mit einem kommerziell verfügbarem Hämmolysin 200fach verdünnt. 20 ml der so erhaltenen Hämolysatlösung wurden als Meßprobe benutzt.

Als Eluenten wurden Lösungen benutzt, die durch Auflösen von Monokaliumphosphat (KH₂PO₄) und Dikaliumphosphat (K₂HPO₄) in entsalztem Wasser in folgenden Konzentrationen vorbereitet worden waren:

Lösung a:
33 mM KH₂PO₄
7 mM K₂HPO₄
pH-Wert 6.2

Lösung b:
160 mM KH₂PO₄
40 mM K₂HPO₄
pH-Wert 6.1

Es wurde eine experimentelle Anordnung benutzt, die aus den folgenden Bestandteilen zusammengesetzt war:
einer Pumpe: intelligente Pumpe vom Typ L 6200, hergestellt von Hitachi Ltd.; einem Injektor: der Injektor hat eine Kapazität von 20 µl; einem Detektor: UV- VIS-Detektors vom Typ L 4200, hergestellt von Hitachi Ltd.; und einem Datenprozessor: Datenprozessor vom Typ L 2500, hergestellt von Hitachi Ltd.

Eine Analyse wurde bei einer Säulentemperatur von 25°C und einer Meßwellenlänge von 415 nm ausgeführt. Eine Trennung von Komponenten wurde durch das folgende lineare Gradientenverfahren durchgeführt:

Lösung a/Lösung b = 100/0 pro Volumen
→ Lösung a/Lösung b = 60/40 pro Volumen
10 min
Durchflußrate der Eluenten: 1.0 ml/min

Die Tabelle 2 zeigt gemessene Werte des Druckabfalls ΔP der Säule des Beispiels 1 und der Vergleichsbeispiele 1 und 2. Diese Werte wurden erhalten, wenn die erste Lösung (Lösung a/Lösung b = 100/0) bei einer Durchflußrate von 1.0 ml/min durchgeführt wurde.

In dem Vergleichsbeispiel 1 war die Teilchengröße des Packmaterials 5 µm groß, so daß der Wert von ΔP etwa halb so groß wie die Werte war, die in dem Beispiel 1 und dem Vergleichsbeispiel 2 erhalten wurden. Aus dem Beispiel 1 und dem Vergleichsbeispiel 2 ist ersichtlich, daß, wenn die Teilchengröße bestimmt war, das Packmaterial mit einer kleineren Austauschkapazität dazu neigte, einen kleineren ΔP-Wert zu haben (Beispiel 1: Austauschkapazität 0.28 mäq/g, ΔP 4.5 MPa (45 kg/cm²); Beispiel 2: Austauschkapazität 0.01 mäq/g, ΔP 4.0 MPa (40 kg/cm²).

Die Fig. 1 bis 3 zeigen unter den obigen Analysebedingungen jeweils die bei dem Beispiel 1 und den Vergleichsbeispielen 1 und 2 erhaltenen Chromatogramme.

In der Fig. 1 ergibt sich Peak 1 aufgrund von A_1a, Peak 2 aufgrund von A_1b, Peak 3 aufgrund von HbF, Peak 4 aufgrund des labilen A_1c (l-A_1c), Peak 5 aufgrund des stabilen A_1c (s-A_1c), und Peak 6 aufgrund von HbA₀.

Die einzelnen Peaks wurden wie folgt identifiziert: da es bekannt ist, daß verschiedene glykosylierte Hämoglobine durch Inkubieren von Blut mit Zuckerderivaten erzeugt werden können, können die einzelnen Peaks durch Bestätigen der Existenz der Peaks identifziert werden, die bezüglich der Intensität durch die Inkubation mit Zuckerderivaten erhöht sind. Eine Identifizierung als A_1a (Peak 1) wurde durch Zugabe von jeweils Fructose-1,6-Diphosphat (F-1,6-DP) und Glukose-6- Phosphat (G-6-P) durchgeführt und eine Identifizierung als A_1b (Peak 2) wurde durch Zugabe von Brenztraubensäure durchgeführt. Wenn Glukose zu Blut hinzugefügt wurde, gefolgt durch eine Inkubation, und darauffolgend eine Probe für eine Messung vorbereitet und dieser ausgesetzt wurde, wurde die Intensität des Peaks 4 erhöht. Wenn eine Messung nach einer Inkubation in einer physiologischen Kochsalzlösung ausgeführt wurde, wurde die Intensität des Peaks 4 erniedrigt, aber der Peak 5 wurde nicht geändert. Aufgrund dieser Tatsachen wurde der Peak 4 als ein Peak identifiziert, der zu l-A_1c gehört, und der Peak 5 als ein Peak, der zu s-A_1c gehört. Der Peak 3 wurde als ein Peak identifiziert, der zu HbF gehört, da er dasselbe Verhalten wie jenes einen Peaks zeigte, der zu dem Hauptbestandteil von Nabelblut gehört (er wurde an derselben Stelle eluiert wie in dem letzten Fall).

In der Fig. 2 (Vergleichsbeispiel 1) zeigt Peak 7 die Anwesenheit von (A_1a + A_1b) an, Peak 8 die Anwesenheit von (HbF + A_1c), und Peak 5 die Anwesenheit von HbA₀. Die einzelnen Peaks wurden auf dieselbe Art identifiziert wie bei dem Beispiel 1.

Bei dem Vergleichsbeispiel 1 ist die mittlere Teilchengröße des benutzten Packmaterials 5 µm groß, so daß die Trennung von Hämoglobinkomponenten verglichen mit dem Beispiel 1 weniger ausreichend war. D. h., die Säule des Vergleichsbeispiels 1 ließ keine Trennung von A_1c von HbF zu. Zusätzlich wurden A_1a und A_1b an derselben Stelle eluiert und konnten daher nicht voneinander getrennt werden.

In der Fig. 3 (Vergleichsbeispiel 2) gehört Peak 1 zu A_1a, Peak 2 zu A_1b, Peak 8 zu (HbF + A_1c), und Peak 6 zu HbA₀. Die einzelnen Peaks wurden auf dieselbe Art wie in dem Beispiel 1 identifiziert.

Bei dem Vergleichsbeispiel 2, bei dem keine makroporöse Substanz benutzt wurde, war die Größe der verwendeten Säule ⌀ 7.5 · 75 mm, was größer war, als jene der im Beispiel 1 benutzten Säule (5.7-faches des Volumens der letzteren und 2.1-faches der Länge der letzteren). Im allgemeinen kann eine Trennung durch die Verwendung einer langen Säule verbessert werden. Bei dem Vergleichsbeispiel 2 konnte A_1c trotz der Verwendung einer relativ großen Säule nicht von HbF getrennt werden. Darüber hinaus war die Trennung zwischen A_1c (Peak 8) und HbA₀ im Vergleichsbeispiel 2 weniger ausreichend als die Trennung zwischen s- A_1c (Peak 5) und HbA₀ (Peak 6) im Beispiel 1.

Wie oben beschrieben ist, waren die Peaks in den Vergleichsbeispielen 1 und 2 (Fig. 2 und 3) breiter als die Peaks im Beispiel 1 (Fig. 1). In den Vergleichsbeispielen 1 und 2 war die Trennung der Komponenten des Hämoglobins nicht ausreichend.

Deshalb beträgt die mittlere Teilchengröße des Packmaterials im trockenen Zustand vorzugsweise 4 µm oder weniger. Sie beträgt insbesondere 1 bis 4 µm und beträgt von dem Gesichtspunkt der leichteren Herstellung aus besonders vorteilhaft 2 bis 4 µm.

Beispiel 2

Es wurde ein Packmaterial benutzt, das durch Modifizieren eines Methacrylatpolymeren als Grundmaterial mit Carboxymethylgruppen als funktionelle Gruppen erhalten wird. Das Packmaterial des in Tabelle 2 aufgeführten Beispiels 1 wurde darüber hinaus in Klassen eingeteilt, um ein Packmaterial mit einer mittleren Teilchengröße von 3.2 µm zu erhalten. Dieses Packmaterial hatte eine Teilchengröße von 3.2 ± 0.4 µm, einen spezifischen Oberflächenbereich von 21 m²/g und eine Austauschkapazität von 0.28 mäq/g.

Das Packmaterial wurde nach der Klassifizierung in eine Säule aus rostfreiem Stahl mit einem Innendurchmesser von 4.6 mm und einer Länge von 35 mm gepackt, und die mit dem Packmaterial bepackte Säule wurde als Trennsäule benutzt. Das Packen wurde durch das Aufschlämmungsverfahren durchgeführt. Als Lösungsmittel beim Aufschlämmen und als Lösungsmittel zum Packen wurde ein 80 mM-Kaliumphosphat-Puffer (pH-Wert 6.20) benutzt. Das Lösungsmittel zum Packen wurde bei einem Packdruck von 15 MPa (150 kg/cm²) während einer Stunde zugeführt.

Unter Verwendung der oben genannten Trennsäule wurde glykosyliertes Hämoglobin und Hämoglobin durch eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie analysiert.

Als Probe wurde frisches Blut eines normalen Erwachsenen, das nach Zugabe von Natriumethylendiamintetraacetat als Antigerinnungsmittel gesammelt worden war, benutzt. Das Blut wurde mit einem kommerziell verfügbaren Hämolysin 200-fach verdünnt. 20 µl der so erhaltenen Hämolysatlösung wurden als Probe zur Messung benutzt.

Als Eluenten wurden Lösungen benutzt, die durch Auflösen von Monokaliumphosphat (KH₂PO₄) und die Dikaliumphosphat (K₂HPO₄) in entsalztem Wasser bei folgenden Konzentrationen vorbereitet wurden:

Lösung A:
33 mM KH₂PO₄
7 mM K₂HPO₄
pH-Wert 6.2

Lösung B:
66 mM KH₂PO₄
14 mM K₂HPO₄
pH-Wert 6.2

Lösung C:
160 mM KH₂PO₄
40 mM K₂HPO₄
pH-Wert 6.2

Es wurde eine experimentelle Anordnung benutzt, die aus folgenden Bestandteilen zusammengesetzt ist: einer Pumpe: intelligente Pumpe vom Typ L-6200, hergestellt von Hitachi Ltd.; einem Injektor: Injektor mit einer Kapazität von 20 µl; einem Detektor: UV-VIS-Detektor vom Typ L-4200m, hergestellt von Hitachi Ltd.; und einem Datenprozessor vom Typ L-2500, hergestellt von Hitachi Ltd.

Eine Analyse wurde bei einer Säulentemperatur von 25°C und einer Nachweiswellenlänge von 415 nm ausgeführt. Eine Trennung der Komponenten wurde durch das folgende schrittweise Gradientenverfahren durchgeführt:

1. Lösung: Lösung A
0 bis 0.2 min
2. Lösung: Lösung A/Lösung B = 50/50	0.3 bis 1.5 min
3. Lösung: Lösung C	1.6 bis 1.9 min
4. Lösung: Lösung A	2.0 bis 3.0 min

Durchflußrate der Eluenten: 1.2 ml/min
Druckverlust ΔP: 6.5 MPa (65 kg/cm²)

Die Fig. 4 zeigt ein unter den obigen Analysebedingungen erhaltenes Chromatogramm.

Peak 1 ist auf A_1a zurückzuführen, Peak 2 auf A_1b, Peak 3 auf HbF, Peak 4 auf ein labiles A_1c (l-A_1c), Peak 5 auf ein stabiles A_1c (s-A_1c) und Peak 6 auf HbA₀. Die einzelnen Peaks wurden durch das Verfahren, das im Beispiel 1 beschrieben ist, identifiziert.

Auf diese Weise konnte Hämoglobin in dem Blut schnell und befriedigend in 6 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀ getrennt werden.

Beispiel 3

Glykolisiertes Hämoglobin und Hämoglobin wurden unter Verwendung der gleichen Trennsäule und des gleichen Geräts wie im Beispiel 2 gemessen. Es wurde die gleiche Probe wie in Beispiel 1 benutzt. Eine Trennung der Komponenten wurde durch das folgende schrittweise Gradientenverfahren durchgeführt. Die benutzten Komponenten waren dieselben wie im Beispiel 1, und nur das Gradientenprogramm unterschied sich von dem im Beispiel 1 benutzten.

1. Lösung: Lösung A
0 bis 0.1 min
2. Lösung: Lösung B	0.2 bis 1.0 min
3. Lösung: Lösung C	1.1 bis 1.3 min
1. Lösung: Lösung A	1.4 bis 2.5 min

Durchflußrate der Eluenten: 1.2 ml/min
Druckverlust der Säule: 6.5 MPa (65 kg/cm²)

Andere Meßbedingungen stimmten mit denen des Beispiels 1 überein.

Die Fig. 5 zeigt ein unter den obigen Analysebedingungen erhaltenes Chromatogramm.

Peak 1 ist zurückzuführen auf A_1a, Peak 2 auf A_1b, Peak 3 auf HbF, Peak 9 auf A_1c (l-A_1c + s-A_1c) und Peak 6 auf HbA₀.

Die einzelnen Peaks wurden durch das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren identifiziert.

Wenn das Verfahren des vorliegenden Beispiels angewandt wird, werden l-A_1c und s-A_1c nicht chromatographisch voneinander getrennt und werden als einzelner Peak erfaßt, der auf A_1c zurückzuführen ist. Die Analysezeit ist jedoch noch kürzer als jene im Beispiel 2. In der Tat benutzen viele Institutionen das Ergebnis einer derartigen 5-Komponentenanalyse als einen Index für eine Untersuchung und als ein Mittel für Diabetes.

Auf diese Weise wurde festgestellt, daß das Verfahren des vorliegenden Beispiels eine schnelle und befriedigende Trennung von Hämoglobin im Blut in 5 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, A_1c und HbA₀ erlaubt.

Beispiel 4

Glykosyliertes Hämoglobin, Hämoglobin und Hämoglobinderivate wurden unter Verwendung der gleichen Trennsäule und des gleichen Geräts wie im Beispiel 1 analysiert. Es wurde die gleiche Probe wie im Beispiel 1 benutzt. Eine Trennung der Komponenten wurde durch das unten beschriebene lineare Gradientenverfahren durchgeführt. Die Lösung A und Die Lösung C des Beispiels 2 wurden als Eluenten benutzt.

Lösung A/Lösung B = 100/0 pro Volumen
→ Lösung A/ Lösung B = 50/50 pro Volumen
8 min
Durchflußrate der Eluenten: 1.0 ml/min
Druckverlust der Säule ΔP = 0.5 MPa (5.5 kg/cm²)

Die anderen Meßbedingungen waren dieselben wie im Beispiel 2.

Die Fig. 6 zeigt ein unter den obigen Analysebedingungen erhaltenes Chromatogramm.

Peak 1 ist zurückzuführen auf A_1a, Peak 3 auf HbF, Peak 4 auf l-A_1c, Peak 5 auf s-A_1c und Peak 6 auf HbA₀.

Die einzelnen Peaks wurden durch das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren identifiziert.

Es wird angenommen, daß andere Peaks als die obigen Peaks auf die unten beschriebenen Substanzen zurückzuführen sind.

Ein Peak, der zurückzuführen ist auf ein Hämoglobin mit damit verbundenem (oder umgesetztem) Arzneimittel, erscheint in der Nähe eines Peaks, der auf A_1b (Peak 2 in Fig. 6) zurückzuführen ist, und ein Peak, der auf Hämoglobin mit damit verbundenem Aspirin und Vitamin B₆ zurückzuführen ist, erscheint in der Nähe der Peaks, die auf A_1c (Peak 4 und Peak 5 in Fig. 6) zurückzuführen sind. Peaks, die auf Zersetzungsprodukte des Hämoglobins zurückzuführen sind, erscheinen zwischen Peaks, die auf A_1c (Peak 4 und Peak 5 in Fig. 6) zurückzuführen sind, und einem Peak, der auf HbA₀ (Peak 6 in Fig. 6) zurückzuführen ist. Peaks, die auf normale Hämoglobine wie Hämoglobin S und Hämoglobin C zurückzuführen sind, erscheinen nach einem Peak, der auf HbA₀ (Peak 6 in Fig. 6) zurückzuführen ist.

So erlaubt das Verfahren des vorliegenden Beispiels eine feinere Trennung von Hämoglobin im Blut. Es erlaubt daher eine genauere Messung von s-A_1c. Außerdem ermöglicht es, eine Information zu erhalten, die ein Hämoglobin, glykosyliertes Hämoglobin, Hämoglobinderivate und normales Hämoglobin betrifft.

Die zum Erhalten eines solchen ausführlichen Chromatogramms erforderliche Zeit betrug bisher etwa 1 Stunde (Hoshino et al. "Collection of the Substances of Lectures to the 31th Japan Liquid Chromatographie Society" Nr. 20 (1988)). Das Verfahren des vorliegenden Beispiels macht es möglich, eine Analyse in 7 Minuten auszuführen, was ein Achtel oder weniger lang ist wie zuvor, und zwar durch Entwickeln eines Packmaterials für eine Trennsäule, usw.

Eine genauere Analyse kann dadurch ausgeführt werden, daß der Gradient weicher gemacht wird, obwohl die Analysezeit länger wird.

Wie oben beschrieben ist, macht es die Säule der vorliegenden Erfindung möglich, die in den Beispielen 2 bis 4 (Fig. 4 bis 6) beschriebene Analyse durch die Verwendung der gleichen Trennsäule und der gleichen Eluenten nur durch Verändern des Gradientenprogramms auszuführen.

Wenn eine Vielzahl von Gradientenprogrammen vorher eingegeben worden sind, kann daher die 6-Komponentenanalyse, die 5-Komponentenanalyse und eine Viel- Komponenten-(mehr als 6 Komponenten)-Analyse (genaue Analyse), wie sie in den Beispielen 2 bis 4 (Fig. 4 bis 6) beschrieben sind, aufeinanderfolgend durch Wählen eines Programms für eine gewünschte Messung durch das Betätigen eines Schalters ausgeführt werden.

So können die 5-Komponenten-, Viel-Komponentenanalysen usw. ohne Austauschen der Trennsäule und der Eluenten ausgeführt werden, so daß die Unbequemlichkeiten eines Austauschs der Trennsäule und der Eluenten nicht erforderlich sind. Da die Analysen unter Verwendung von nur einer Trennsäule ausgeführt werden können, können außerdem die Kosten verringert werden.

Ein Vergleich wurde zwischen Werten, die durch das analytische Verfahren des Beispiels 2 gemessen sind, und Werten, die durch das analytische Verfahren des Beispiels 3 gemessen sind, durchgeführt.

Als Proben wurden Lösungen benutzt, die vorbereitet wurden durch Verdünnen von frischem Blut normaler Erwachsener und Diabetiker, das ein zugefügtes Antigerinnungsmittel enthielt, mit Hämolysin.

Die Fig. 7 zeigt Meßergebnisse, die für 60 Fälle erhalten wurden. In der Fig. 7 bezieht sich die Abszissenachse auf die Summe der l-A_1c-Konzentration (%) und der s-A_1c-Konzentration (%), die durch das im Beispiel 2 beschriebene Verfahren gemessen wurden, und die Ordinatenachse bezieht sich auf die A_1c-Konzentration (%), die durch das im Beispiel 3 beschriebene Verfahren gemessen wurde.

Der Korrelationskoeffizient zwischen den durch das Verfahren des Beispiels 2 gemessenen Werten und den durch das Verfahren des Beispiels 3 gemessenen Werten war 0.994. Wenn der durch das Verfahren des Beispiels 2 gemessene Wert als X genommen wurde und der durch das Verfahren des Beispiels 3 gemessene Wert als Y genommen wurde, wurde die Korrelation durch die Formel dargestellt: Y = 1.034X - 0.310. Somit gab es eine sehr gute Korrelation zwischen den durch die zwei Verfahren erhaltenen Werten.

Es ist ersichtlich, daß die Verfahren der Beispiele somit eine hochpräzise Analyse von Hämoglobin im Blut erlauben. Das bedeutet, das gesehen werden kann, daß sie eine hochpräzise Messung erlauben, auch wenn die Anzahl der zu messenden Komponenten erhöht ist, wie in dem Fall der 6-Komponentenanalyse.

Beispiel 5

Die Fig. 8 zeigt den Aufbau des Hauptsystems des Geräts dieser Erfindung und die Fig. 9 den detaillierten Aufbau des Geräts.

Als Probe wurde frisches Blut benutzt, das nach Hinzufügen von Natriumethylendiamintetraacetat als Antigerinnungsmittel gesammelt wurde. Das Blut wurde mit kommerziell verfügbarem Hämolysin 200-fach verdünnt und in die Probenteller 19 des automatischen Probenehmers 14 eingesetzt, die in den Fig. 8 und 9 gezeigt sind. Eine Trennsäule 25 wurde benutzt, die die gleiche war, wie die im Beispiel 2 benutzte Trennsäule.

Die Säule hatte einen Innendurchmesser von 4.6 mm und eine Länge von 35 mm. Die Temperatur eines konstanten Temperaturbades für die Säule (ein Ofen) 26 wurde auf 30°C eingestellt. Als Eluenten wurden eine Lösung A11, eine Lösung B12 und eine Lösung C13 benutzt, die im Beispiel 2 beschrieben wurden. In den Fig. 8 und 9 bezeichnen die Pfeile mit durchgezogener Linie den Fluß der Flüssigkeiten, wie der Probe und der Reagenzien, und die Pfeile mit gestrichelten Linien den Signalfluß.

Im Fall der 5-Komponentenanalyse (eine Trennung von Hämoglobin in 5 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, A_1c und A₀) wurden die Komponenten durch Anwenden des folgenden schrittweisen Gradienten getrennt:

Lösung A:
0 bis 0.1 min
Lösung B:	0.2 bis 1.0 min
Lösung C:	1.1 bis 1.3 min
Lösung A:	1.4 bis 2.5 min

Durchflußrate der Eluenten: 1.2 ml/min

Die in die Probenteller 19 eingesetzte Probe wurde in ein 6-Wegeventil 23 über eine Saugdüse 20 und ein Probenübertragungsrohr 21 mittels einer Spritze 18 eingeführt, danach über ein Filter 24 geführt und dann in die Trennsäule 25 eingeführt. Eine Probenschleife ist mit 22 bezeichnet. Eine Waschlösung 30 wurde über ein 3-Wegeventil 17 zugeführt. Die Lösung A11, die Lösung B12 und die Lösung C13 wurden der Trennsäule 25 über ein 3-Wegesolenoidventil 15 mittels einer Lösungsübertragungspumpe (intelligente Pumpe) 16 zugeführt. Die Absorbtion des Eluats von der Trennsäule 25 wurde mittels eines Detektors 27 bei Wellenlängen von 415 nm und 690 nm (zum Messen der Hintergrundsabsorption) gemessen.

Wie in der Fig. 5 gezeigt ist, konnte Hämoglobin unter den obigen Gradientenbedingungen Hämoglobin in 5 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, A_1c und HbA₀ in einem 2.5-Minutenzyklus getrennt werden. Auf der Basis des so erhaltenen Chromatogramms wurde der Anteil (prozentualer Gehalt) (%) von A_1c an dem gesammelten Hämoglobins mittels eines Datenprozessors 28 berechnet.

Im Fall der 6-Komponentenanalyse (Trennung von Hämoglobin in 6 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀) wurde Hämoglobin unter Verwendung des folgenden schrittweisen Gradienten analysiert:

Lösung A:
0 bis 0.2 min
Lösung A/Lösung B = 50/50:	0.3 bis 1.5 min
Lösung C:	1.6 bis 1.9 min
Lösung A:	2.0 bis 3.5 min

Durchflußrate der Eluenten: 1.2 ml/min

Wenn es unter den obigen Gradientenbedingungen analysiert wurde, konnte Hämoglobin in einem 3.5-Minuten-Zyklus in 6 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s- A_1c und HbA₀ getrennt werden, wie es in Fig. 4 gezeigt ist. Auf der Grundlage des so erhaltenen Chromatogramms wurde der Anteil (prozentualer Gehalt) (%) von s-A_1c an dem gesamten Hämoglobin mittels des Datenprozessors 28 berechnet.

Ein Betriebsteil 29 steuert den automatischen Probenehmer 14, die Lösungsübertragungspumpe (intelligente Pumpe) 16 und das 3-Wegesolenoidventil 15 auf der Grundlage des Ausgangs des Datenprozessors.

Zusätzlich wurde eine Viel-Komponenten-(mehr als 6 Komponenten)-Analyse durch das folgende lineare Gradientenverfahren ausgeführt:

Lösung A/Lösung C = 100/0 pro Volumen
→ Lösung A/ Lösung B = 50/50 pro Volumen
8 min
Durchflußrate der Eluenten: 1.0 ml/min

Nach der Analyse wurde die Lösung A mit einer Durchflußrate von 1.0 ml/min von 8.1 bis 10.0 Minuten geführt, um die Säule in ihren Anfangszustand zurückbringen.

Die Analyse unter den obigen Gradientenbedingungen ergaben das in Fig. 6 gezeigte Chromatogramm.

Beispiel 6

Die Fig. 10 zeigt ein Beispiel eines Flußdiagramms einer Analyse von glycosyliertem Hämoglobin. Es wurde das im Beispiel 5 beschriebene Gerät benutzt. Auf die Programme des im Beispiel 5 beschriebenen Gradienten wird wie folgt Bezug genommen: Auf das Gradientenprogramm zum Ausführen der 5-Komponentenanalyse wird als Programm Bezug genommen, auf das Gradientenprogramm zum Ausführen der 6-Komponentenanalyse als Programm und auf das Gradientenprogramm zum Ausführen einer Viel-Komponentenanalyse als Programm .

Zuerst wird eine 5-Komponentenanalyse durch Anwenden des Programms ausgeführt. Wie in Fig. 5 gezeigt ist, erlaubt das Programm ein Trennen von Hämoglobin in A_1a, A_1b, HbF, A_1c und HbA₀ in einem 2.5-Minuten-Zyklus. Auf der Grundlage des so erhaltenen Chromatogramms wird der prozentuale Gehalt der Komponenten berechnet. In dem Fall einer Probe, bei der der prozentuale Gehalt (%) von A_1c weniger als ein bestimmter Wert (B₁) ist, wird die Analyse beendet. Andererseits wird nur eine Probe, bei der der prozentuale Gehalt (%) von A_1c den bestimmten Wert (B₁) überschreitet, der 6-Komponentenanalyse ausgesetzt.

Signale, die die Nummern von Proben anzeigen, die die 6-Komponentenanalyse erfordern, werden vom Betriebsteil 29 zum automatischen Probenehmer 14 übertragen.

Zur selben Zeit werden die Signale vom Betriebsteil 29 zum 3-Wegespenolidventil 15 und zur intelligenten Pumpe 16 übertragen, in der die Durchflußrate und Ähnliches durch einen Befehl gesteuert werden können, wodurch das Programm 2 für die 6-Komponentenanalyse ausgeführt wird. In diesem Fall ist es notwendig, das Mischungsverhältnis der Eluenten, ihre Schaltzeiten, ihre Durchflußrate usw. zu ändern. Der B₁-Wert kann unter Verwendung von + SD (: mittlerer Wert, SD: Standardabweichung), + 2 SD, usw. frei bestimmt werden.

Benutzt man das Programm kann Hämoglobin in 6 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀ in einem 3.5-Minuten-Zyklus getrennt werden.

Es ist bekannt, daß A_1c nicht-enzymatisch durch zwei Reaktionsschritte erzeugt wird. Zuerst werden Glucose und Hämoglobin miteinander über eine Aldiminbindung verbunden, um l-A_1c zu bilden. Als nächstes wird die Aldiminbindung durch eine Amadori-Umlagerung schrittweise in eine Ketoaminverbindung umgewandelt, was in einer irreversiblen Bildung von s-A_1c resultiert. Die Bildungsrate von l-A_1c ist etwa 60-mal so schnell wie die Bildungsrate von s-A_1c, und ein großer Anteil von l-A_1c dissoziiert in Glucose und Hämoglobin. Die Menge von s-A_1c wird nicht durch physiologische Faktoren wie Speisen geändert, aber die Menge von l-A_1c wird durch Speisen oder Ähnliches schnell erhöht. Deshalb erlaubt eine Messung von s-A_1c in bezug auf Diabetes eine genauere Trennung als eine Messung von A_1c.

Bei dem Verfahren des vorliegenden Beispiels wird die 5-Komponentenanalyse für alle Proben ausgeführt, und der prozentuelle Gehalt von A_1c wird in jeder Probe berechnet. Aus dem so erhaltenen A_1c-Wert wird in dem Betriebsteil 29 beurteilt, ob die 6-Komponentenanalyse notwendig ist oder nicht (ob A_1c größer ist als B₁ oder nicht), und nur Proben, die der Ungleichung A_1c < B₁ genügen, werden der 6-Komponentenanalyse ausgesetzt.

Bei dem Verfahren ist es möglich, alle Probensätze in dem automatischen Probenehmer 14 der 5-Komponentenanalyse auszusetzen, und darauf Proben unter ihnen der 6-Komponentenanalyse in einem Zug auszusetzen, die der Ungleichung A_1c < B₁ genügen. Es ist auch möglich, die 5-Komponentenanalyse bei jeder Probe zu wiederholen, gefolgt von der 6-Komponentenanalyse, die ausgeführt wird, wenn die Probe der Ungleichung A_1c < B₁ genügt.

Beispiel 7

Die Fig. 11 zeigt ein Beispiel eines Flußdiagramms der Analyse des glycosylierten Hämoglobins. Es wird dasselbe Gerät benutzt wie beim Beispiel 5.

Zuerst wird die 5-Komponentenanalyse ausgeführt und der prozentuale Gehalt von A_1c wird berechnet. Danach wird beurteilt, ob A_1c größer ist als B₁ oder nicht und nur Proben werden der 6-Komponentenanalyse ausgesetzt, die der Ungleichung A_1c < B₁ genügen, und danach wird der prozentuelle Gehalt von s-A_1c berechnet. Ob s-A_1c größer ist als B₂ oder nicht wird gleich beurteilt, und nur Proben, die der Ungleichung s-A_1c < B₂ genügen, werden der Viel-Komponenten-(mehr als 6 Komponenten)-Analyse ausgesetzt.

Ob Proben der Ungleichung A_1c < B₁ der Ungleichung s-A_1c < B₂ genügen, wird in dem Betriebsteil 29 beurteilt, und Signale, die die Anzahl der Proben anzeigen, die dieser Bedingung genügen, werden zu dem automatischen Probenehmer übertragen. Ein Signal zum Ausführen des Gradientenprogramms oder wird zu dem 3-Wegesolenoidventil 15 und der intelligenten Pumpe 16 übertragen, um das Mischungsverhältnis der Eluenten, ihre Durchflußraten, ihre Schaltzeiten usw. zu ändern.

Die Viel-Komponentenanalyse kann sofort nach der 5-Komponentenanalyse ausgeführt werden.

Beispiel 8

Die Fig. 12 zeigt ein Flußdiagramm einer Analyse von glycosyliertem Hämoglobin.

Bei dem vorliegenden Beispiel wird aus dem gemessenen Wert von glycosyliertem Hämoglobin und einer Glucosekonzentration beurteilt, ob eine genauere Untersuchung notwendig ist oder nicht.

Japan Comprehensive Health Screening Medical Society hat seine unten beschriebene Empfehlung abgegeben. Eine Überprüfung der Glucoseverträglichkeit wird durch eine Kombination von einem festen Blutzuckerspiegel (FPG) und A_1c durchgeführt, und Personen, die sich einer Prüfung unterzogen haben und den Bestimmungen genügen, die unten beschrieben sind, werden beurteilt, Personen zu sein, die eine nähere Untersuchung erforderlich machen, und werden einem 75-g-Glucoseverträglichkeitstest (75 g GTT) ausgesetzt.

Bedingungen:
(1) FPG: 140 mg/dl oder mehr
(2) A_1c: + 2 SD oder mehr
(3) FPG: 110 - 140 mg/dl
   A_1c: + 1 SD oder mehr

Die Fig. 13 zeigt die Beziehung zwischen FPG und A_1c bei einer Überprüfung einer Glucoseverträglichkeit. Personen, die sich einer Überprüfung unterzogen haben und den Werten entsprechen, die an den Stellen in dem schattierten Bereich aufgetragen sind, erfordern eine genauere Untersuchung.

Zuerst wird die 5-Komponentenanalyse ausgeführt und der prozentuelle Gehalt von A_1c wird berechnet. Es wird beurteilt, ob der prozentuelle Gehalt von A_1c mehr ist als B₁ oder nicht. Z. B. können + SD, + 2 SD, oder Ähnliches als B₁ verwendet werden. Nur wenn der prozentuelle Gehalt von A_1c größer ist als B₁, wird der Wert von A_1c gehalten, und der berechnete Wert der Glucose-(FPG)- Konzentration und der prozentuelle Gehalt von A_1c werden in der in der Fig. 13 gezeigten Kurve aufgetragen, wodurch beurteilt wird, ob eine genauere Untersuchung nötig ist oder nicht. Das Auftragen in der Kurve kann in einem Betriebsteil durchgeführt werden.

Die Fig. 14 zeigt ein Flußdiagramm zum Beurteilen, ob eine genauere Untersuchung des prozentuellen Gehalts von s-A_1c und dem festen Blutzuckerspiegel (FPG) notwendig ist oder nicht.

Beispiel 9

Die Fig. 15 zeigt ein Beispiel eines Flußdiagramms einer Analyse von glycosyliertem Hämoglobin.

Zuerst wird die 5-Komponentenanalyse unter Verwendung des im Beispiel 5 beschriebenen Systems ausgeführt und der prozentuelle Gehalt von A_1a, A_1b, HbF, A_1c und HbA₀ werden berechnet. Als nächstes wird beurteilt, ob der prozentuelle Gehalt einer bestimmten Komponente unter A_1a, A_1b, HbF, A_1c und HbA₀ größer ist als ein bestimmter Wert (wenn er größer ist als ein bestimmter Wert, besteht eine Möglichkeit eines abnormalen Musters). Die Viel-Komponentenanalyse wird nur ausgeführt, wenn der prozentuelle Gehalt einer bestimmten Komponente (die geeignet in Abhängigkeit von dem Zweck einer Untersuchung bestimmt sein kann) unter Fraktionen, die durch Fraktionierung von Hämoglobin erhalten werden, größer ist als ein bestimmter Wert, und es wird geprüft, ob ein abnormales Hämoglobinmuster gebildet wird oder nicht.

Wie oben beschrieben ist, macht es das Verfahren des vorliegenden Beispiels möglich, eine 5-Komponentenanalyse, eine 6-Komponentenanalyse, eine Viel-Komponenten- (mehr als 6 Komponenten)-Analyse etc. aufeinanderfolgend unter Verwendung der gleichen Säule und der gleichen Eluenten nur durch Ändern des Gradientenprogramms auszuführen. Es erlaubt daher eine Verringerung der Zeit, die für eine Analyse erforderlich ist. Es kann automatisiert werden. Es ist bequem, da die Säule und das Eluent nicht ausgetauscht werden müssen.

Zusätzlich wird von dem gemessenen Wert (prozentueller Gehalt) einer Komponente A_1c oder s-A_1c, die durch ein Fraktionieren von Hämoglobin erhalten wurde, beurteilt, ob eine genauere Analyse ausgeführt wird oder nicht, und die genauere Analyse wird ausgeführt, wenn sie nötig ist, wodurch genauere gemessene Werte erhalten werden können. Es gibt beispielsweise folgende Abläufe: 5-Komponentenanalyse → 6-Komponentenanalyse; 6-Komponentenanalyse → Viel-Komponentenanalyse; 5-Komponentenanalyse → Viel-Komponentenanalyse; usw.

Durch Einschlagen eines solchen Kurses kann eine genauere Untersuchung und eine Behandlung von Diabetes durchgeführt werden.

Vergleichsbeispiel 3

Es wurde ein Packmaterial benutzt, das durch Modifizieren eines Methacrylatpolymeren als Grundmaterial mit Carboxymethylgruppen als funktionelle Gruppen erhalten worden war.

Es wurden die physikalischen Eigenschaften des Packmaterials gemessen, was folgendes ergab: Eine Teilchengröße von 8.0 ± 1.6 µm, ein spezifischer Oberflächenbereich von 25 m²/g und einer Austauschkapazität von 0.30 mäq/g.

Das Packmaterial wurde in einer Säule aus rostfreiem Stahl mit einem Innendurchmesser von 4.6 mm und einer Länge von 120 mm gepackt. Das Packen wurde mittels des Aufschlämmungsverfahrens durchgeführt. Als Lösungsmittel bei der Aufschlämmung und als Lösungsmittel zum Packen wurde ein 80 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6.20) benutzt, und das Lösungsmittel zum Packen wurde bei einem Packdruck von 10 MPa (100 kg/cm²) für eine Stunde angelegt.

Es wurde die gleiche Probe und die gleiche experimentelle Anordnung wie bei Beispiel 1 benutzt.

Als Eluenten wurden Lösungen benutzt, die durch Auflösen von Mononatriumphosphat (NaH₂PO₄ · 2H₂O) und/oder von Natriumchlorid (NaCl) in entsalztem Wasser zu den unten beschriebenen Konzentrationen hergestellt worden waren. Die pH-Werte der Lösungen wurden mit HCl eingestellt.

Lösung α: 30 mM NaH₂PO₄ · 2 H₂O (pH-Wert 5.5)
Lösung β: 30 mM NaH₂PO₄ · 2 H₂O + 300 mM NaCl (pH-Wert 5.5)

Eine Trennung der Komponenten wurde durch das folgende lineare Gradientenverfahren durchgeführt:

Lösung α/Lösung β = 100/0 pro Volumen
→ Lösung α/Lösung β = 70/30 pro Volumen
10 min
Durchflußrate der Eluenten: 1.0 ml/min

Die Fig. 16 zeigt ein durch die Verwendung des Packmaterials des Beispiels 4 unter den obigen Analysebedingungen erhaltenes Chromatogramm.

In der Fig. 16 ist Peak 1 auf A_1a zurückzuführen, Peak 2 auf A_1b, Peak 3 auf HbF, Peak 4 auf ein labiles A_1c (l-A_1c), Peak 5 auf das stabile A_1c (s-A_1c) und Peak 6 auf HbA₀.

Wenn das Packmaterial mit einer Teilchengröße von 8 µm benutzt wurde, dauerte es etwa 50 Minuten, Hämoglobin in die 6 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s- A_1c und HbA₀ zu trennen. Daher ist bei dem Vergleichsbeispiel 3 die Meßzeit viel länger als bei den Beispielen dieser Erfindung und eine große Anzahl von Proben konnte nicht in einer kurzen Zeit geprüft werden.

Beispiele 10 bis 12 und Vergleichsbeispiele 3 und 4

Packmaterialien wurden synthetisiert, um den gleichen spezifischen Oberflächenbereich und die gleiche Austauschkapazität zu haben wie jene des im Vergleichsbeispiel 3 beschriebenen Packmaterials (Teilchengröße: 8.0 ± 1.6 µm, spezifischer Oberflächenbereich: 25 m²/g, Austauschkapazität 0.30 mäq/g) und eine Teilchengröße von ungefähr 5 µm, 4 µm, 3.5 µm oder 3 µm. Die Fig. 3 zeigt die Ergebnisse des Messens physikalischer Eigenschaften dieser Packmaterialien. Aus den gemessenen Werten der Teilchengröße, des spezifischen Oberflächenbereichs und der Austauschkapazität können die Packmaterialien der Vergleichsbeispiele 3 und 4 und der Beispiele 10 bis 12 als Packmaterialien mit im wesentlichen dem gleichen spezifischen Oberflächenbereich und der gleichen Austauschkapazität und verschiedenen Teilchengrößen betrachtet werden.

Jedes der Packmaterialien des Vergleichsbeispiels 4 und der Beispiele 10 bis 12 wurde in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 4.6 mm und einer Länge von 35 mm gepackt, und die so behandelten Säulen wurden als Trennsäulen benutzt. Das Packmaterial des Vergleichsbeispiels 3 wurde in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 4.6 mm und einer Länge von 120 mm gepackt, wie es oben beschrieben ist. Das Packen der Packmaterialien des Vergleichsbeispiels 4 und der Beispiele 10 bis 12 in die jeweiligen Säulen wurde auf die gleiche Art wie bei dem Vergleichsbeispiel 3 durchgeführt.

Es wurde die gleiche experimentelle Anordnung wie bei dem Beispiel 1 benutzt. Standard-Hämoglobin wurde als Probe benutzt. Als Eluent wurde eine Lösung benutzt, die durch Mischen von Mononatriumphosphat (NaH₂PO₄ · 2 H₂O) und Natriumchlorid (NaCl) vorbereitet wurde, um ihre Konzentrationen auf die nachfolgend angegebenen Konzentrationen einzustellen.

Tabelle 3

30 mM NaH₂PO₄ · 2 H₂O
100 mM NaCl
pH-Wert 5.5

HETP (Höhenäquivalent zu einer theoretischen Platte) wurde bei verschiedenen Durchflußraten des obigen Eluenten gemessen.

Die Fig. 17 zeigt die Beziehung zwischen HETP und der Durchflußrate des Eluenten in jeder der Säulen, die jeweils mit den Packmaterialien der Vergleichsbeispiele 3 und 4 und der Beispiele 10 bis 12 gepackt sind.

Je kleiner die Teilchengröße des Packmaterials ist, desto kleiner ist das Minimum von HETP und desto kleiner ist die Anstiegsrate in HETP bei einem Ansteigen der Durchflußrate des Eluenten.

HETP ist ein Ausdruck für die chromatographische Effizient (chromtographische Leistung oder Auflösung) in einer Flüssigkeitschromatographie. Je kleiner der Wert von HETP ist, desto schärfer ist ein Peak, der erhalten werden kann.

In Fig. 17 kann in dem Bereich unterhalb der geraden Linie (gestrichelte Linie), die den Punkt (B), bei dem die Durchflußrate die gleiche ist wie jene, die dem Minimum (A) von HETP in dem Vergleichsbeispiel 4 entspricht, und der Wert von HETP ein Fünftel des Minimums (A) ist, mit dem Punkt (C) verbindet, bei dem der Wert von HETP der gleiche ist wie das Minimum (A) von HETP in dem Vergleichsbeispiel 4, und die Durchflußrate das 5-fache jener ist, die dem Minimum (A) entspricht, die Analysezeit auf ein Fünftel oder weniger verringert werden, während die in Fig. 16 gezeigte Auflösung beibehalten wird. Zusätzlich kann die Analysenzeit weiterhin durch Wählen geeigneter Elutionsbedingungen verringert werden (z. B. durch Anwenden eines schrittweisen Gradientenverfahrens).

In dem Bereich über der gestrichelten Linie in Fig. 17 ist die Auflösung nicht ausreichend, und A_1c kann nicht in l-A_1c und s-A_1c getrennt werden, während die Analysenzeit auf ein Fünftel verringert wird. Daher sollte eine längere Säule zum Trennen von A_1c in l-A_1c und s-A_1c benutzt werden. Mit einem Anwachsen der Länge einer Säule wird die Analysenzeit anwachsen.

In der Fig. 17 ist die Linie des Vergleichsbeispiels 5 (ein Packmaterial mit einer Teilchengröße von etwa 5 µm) über der gestrichelten Linie in einem herkömmlichen Durchflußratenbereich von 1.0-1.5 ml/min. Je höher die Durchflußrate ist, umso höher ist der der Säule zugefügte Druck und desto kürzer ist die Lebenszeit des Packmaterials.

In der Fig. 17 ist in dem Fall der Beispiele 10, 11 und 12 (Packmaterialien mit jeweiligen Teilchengrößen von ungefähr 4 µm, 3.5 µm und 3.0 µm) der Wert von HETP bei einer Durchflußrate von 1.0 ml/min unter der gestrichelten Linie und eine Analyse für 6 Komponenten A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀, kann ohne Verringern der Lebensdauer der Packmaterialien ausgeführt werden, während die Analysenzeit auf ein Fünftel verringert wird.

Beispiele 11, 13 und 14 und Vergleichsbeispiele 5 und 6

Die Beziehung zwischen dem spezifischen Oberflächenbereich eines Packmaterials und seiner Austauschkapazität oder HETP wird nachstehend beschrieben.

Grundmaterialien, die aus einem Methacrylatpolymergel bestehen, wurden synthetisiert, um eine mittlere Teilchengröße von 3.5 µm und verschiedene spezifische Oberflächenbereiche zu haben. Carboxymethylgruppen wurden unter den gleichen Bedingungen zu den Grundmaterialien kombiniert. Derart erhaltene physikalische Eigenschaften der Packmaterialien wurden durch Messen ihrer Teilchengröße, ihres spezifischen Oberflächenbereiches (nach dem Einführen der funktionellen Gruppe) und ihrer Austauschkapazität geprüft. Die Fig. 4 zeigt die Ergebnisse einer Messung der physikalischen Eigenschaften der Packmaterialien. Die Fig. 18 zeigt die Beziehung zwischen dem spezifischen Oberflächenbereich (nach der Änderung mit der funktionellen Gruppe) und der Austauschkapazität. Aus Fig. 18 kann gesehen werden, daß ein Packmaterial mit dem größeren spezifischen Oberflächenbereich dazu neigt, die größere Austauschkapazität zu haben.

Tabelle 4

Jedes der Packmaterialien wurde in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 4.6 mm und einer Länge von 35 mm gepackt, und die so behandelten Säulen wurden als Trennsäulen benutzt. Das Packen wurde auf dieselbe Art wie bei dem Vergleichsbeispiel 4 durchgeführt. HETP jeder Trennsäule wurde bei verschiedenen Durchflußraten des Eluenten wie in Fig. 17 (Beispiele 10 bis 12 und Vergleichsbeispiele 3 und 4) gemessen. Die Fig. 19 zeigt die Beziehung zwischen dem Wert von HETP bei einer Durchflußrate eines Eluenten von 1.0 ml/min und dem spezifischen Oberflächenbereich des Packmaterials. In dem Vergleichsbeispiel 5 (das Packmaterial hat einen spezifischen Oberflächenbereich von 4 m²/g) waren der Wert von HETP und die Peakbreite groß. Es wird vermutet, daß der Grund dafür ist, daß das Packmaterial keinen ausreichenden Bereich für einen Kontakt mit einer Probe hatte, so daß die Probe sich keiner schnellen Austauschreaktion mit der Probe unterzog. Auch in dem Vergleichsbeispiel 6 (ein Packmaterial hat einen spezifischen Oberflächenbereich von 180 m²/g) wurde ein erhöhter HETP- Wert erhalten. Im allgemeinen neigt ein Packmaterial mit kleinerer Porengröße dazu, den größeren spezifischen Oberflächenbereich zu haben. Es kann vermutet werden, daß die Porengröße in dem Vergleichsbeispiel 6 klein war, so daß eine Probe nicht in und aus den Poren gelangen konnte, was verbreiterte Peaks zur Folge hat. Angesichts des vorangehenden ist der spezifische Oberflächenbereich des Packmaterials vorzugsweise 10 bis 100 m²/g.

Beispiele 11, 15 und 16 und Vergleichsbeispiele 7 und 8

Carboxymethylgruppen wurden mit dem Grundmaterial, das aus einem Methacrylatpolymergel des Beispiels 11 besteht, unter verschiedenen Bedingungen verbunden. Die Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse des Messens physikalischer Eigenschaften der so erhaltenen Packmaterialien.

Tabelle 5

Jedes der Packmaterialien wurde in eine Säule mit einem Innendurchmesser von 4.6 mm und einer Länge von 35 mm gepackt, und die so behandelten Säulen wurden als Trennsäulen benutzt. Das Packen wurde auf die gleiche Art wie bei dem Vergleichsbeispiel 3 durchgeführt. HETP jeder Trennsäule wurde bei verschiedenen Durchflußraten des Eluenten gemessen wie in Fig. 17 (Beispiele 10 bis 12 und Vergleichsbeispiele 3 und 4). Die Fig. 20 zeigt die Beziehung zwischen dem Wert HETP bei der Durchflußrate eines Eluenten von 1.0 ml/min und der Austauschkapazität des Packmaterials. In dem Vergleichsbeispiel 8 (ein Packmaterial hat eine Austauschkapazität von 0.05 mäq/g) wurde ein erhöhter HETP-Wert erhalten. Es wird vermutet, daß der Grund dafür ist, daß die Menge der eingeführten funktionellen Gruppe (Carboxymethylgruppe) zu klein war, so daß eine Probe sich nicht einer schnellen Austauschreaktion mit dem Packmaterial unterzog. Auch in dem Vergleichsbeispiel 7 (ein Packmaterial hat eine Austauschkapazität von 2.0 mäq/g) wurde ein etwas erhöhter HETP-Wert erhalten. Bei Änderung der Salzkonzentration des Eluenten, ist ein Packmaterial mit einer großen Austauschkapazität stärker angeschwollen oder geschrumpft als ein Packmaterial mit einer geringen Austauschkapazität. Eine Verwendung eines Packmaterials mit einer großen Austauschkapazität neigt dazu, einen großen Druckabfall der Säule zur Folge zu haben. Es wird vermutet, daß der erhöhte HETP-Wert auf eine derartige Instabilität des Packmaterials des Vergleichsbeispiels 7 in einem Lösungsmittel (einem Eluenten) und dessen niedrige Permeabilität zurückzuführen ist. Ein Packmaterial mit einer großen Austauschkapazität hat keine ausreichende Lebensdauer, wenn eine Gradientenelution ausgeführt wird. Angesichts dieser Tatsachen beträgt die Austauschkapazität des Packmaterials vorzugsweise 0.1 bis 1 mäq/g.

Wie oben beschrieben ist, erlaubt die vorliegende Erfindung die Herstellung einer Trennsäule mit einer hohen chromatographischen Leistung und ermöglicht daher die Durchführung einer Analyse für s-A_1c, die bislang viel Zeit (8-60 Minuten) erfordert hat, in einer kurzen Zeit (3.5 Minuten).

Die vorliegende Erfindung erlaubt auch ein Herstellen einer Trennsäule mit einer hohen Trennwirkung und einer schnellen Austauschrate der Eluenten und ermöglicht es Analysen wie eine 5-Komponentenanalyse (zu trennende Komponenten: A_1a, A_1b, HbF, A_1c und HbA₀), eine 6-Komponentenanalyse (zu trennende Komponenten: A_1a, A_1b, HbF, l-A_1c, s-A_1c und HbA₀) eine Viel-Komponenten-(mehr als 6 Komponenten)-analyse (genaue Analyse), usw. aufeinanderfolgend durch die gleiche Säule und die gleichen Eluenten nur durch Ändern der Elutionsbedingungen, d. h. des Gradientenprogramms, auszuführen. Gemäß der vorliegende Erfindung kann eine Vielzahl von Analysen aufeinanderfolgend ohne Austauschen von Eluenten oder einer Trennsäule ausgeführt werden, so daß die für die Analysen benötigte Zeit verringert werden kann. Bei der vorliegenden Erfindung ist die Bedienung leicht (die Unbequemlichkeit eines Austausches einer Trennsäule oder von Eluenten und die Unbequemlichkeit eines Durchführens eines Eluenten, bis eine Trennsäule stabil wird, sind nicht nötig).

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Verfahren für eine Flüssigkeitschromatographie geschaffen werden, und auch ein Gerät dafür, das eine Hochgeschwindigkeitsanalyse für Komponenten von Hämoglobin, glycosyliertem Hämoglobin, Hämoglobinderivaten usw. in Blut erlaubt.

Es kann auch ein Verfahren für eine Flüssigkeitschromatographie geschaffen werden, und ein Gerät dafür, das eine hochgenaue Analyse für Komponenten von Hämoglobin, glycosyliertem Hämoglobin, Hämoglobinderivaten usw. in Blut erlaubt.

Zusätzlich kann ein System für eine Flüssigkeitschromatographie geschaffen werden, die es ermöglicht, verschiedene Analysen für Komponenten aufeinanderfolgend automatisch auszuführen.

Claims (10)

1. Gerät für eine Flüssigkeitschromatographie für die Bestimmung von glykosyliertem Hämoglobin A_1c (4), welches leicht in Glukose und Hämoglobin umgewandelt wird, und glykosyliertem Hämoglobin A_1c (5), welches nicht leicht in Glukose und Hämoglobin umgewandelt wird,
oder die Trennung von glykosyliertem Hämoglobin A_1c (9), welches die zuvor genannten beiden glykosylierten Hämoglobine umfaßt, von Bluthämoglobinen, und die Bestimmung von A_1c (9), das aufweist
einen oder mehrere Eluenten (11, 12, 13);
eine Trennsäule (25), die mit einem Packmaterial gepackt ist;
einen automatischen Probennehmer (14) zum Abtasten einer oder mehrerer Probe(n) und Überführen derselben zu der Trennsäule (25);
eine intelligente Pumpe (16) zum Durchführen des oder der Eluenten (11, 12, 13) durch die Trennsäule (25);
und einen Detektor (27) zum Erfassen der Absorptionen von Eluaten von der Trennsäule (25);
dadurch gekennzeichnet, daß das Packmaterial im wesentlichen aus einer porösen Substanz mit darin eingebauten Carboxylalkylgruppen zusammengesetzt ist und aus der Klasse bestehend aus Methacrylatpolymeren, Vinylalkoholpolymeren, Styrol-Divinyl-Benzol-Polymeren und Siliziumdioxidgelen ausgewählt ist, wobei das Packmaterial eine mittlere Teilchengröße in trockenem Zustand von 4 µm oder weniger, einen spezifischen Oberflächenbereich in trockenem Zustand von 10 bis 100 m²/g und eine Austauschkapazität, basierend auf einer trockenen Basis, von 0.1 bis 1 mäq hat.

2. Gerät für eine Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 1, wobei die Carboxylgruppe eine Carboxymethylgruppe ist.

3. Gerät für eine Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Eluent (die Eluenten (11, 12, 13) eine Pufferlösung (Pufferlösungen) mit einem pH-Wert von 5.0 bis 7.0 ist (sind).

4. Verfahren für eine Flüssigkeitschromatographie, die ein Durchführen eines oder mehrerer Eluenten (11, 12, 13) durch eine Trennsäule (25) aufweist, die mit einem Packmaterial gepackt ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Packmaterial im wesentlichen aus einer porösen Substanz mit darin eingebauten Carboxyalkylgruppen zusammengesetzt ist und aus der Klasse bestehend aus Methacrylatpolymeren, Vinylalkoholpolymeren, Styrol-Divinyl-Benzol-Polymeren und Siliziumdioxidgelen ausgewählt ist, wobei das Packmaterial eine mittlere Teilchengröße in trockenem Zustand von 4 µm oder weniger, einen spezifischen Oberflächenbereich in trockenem Zustand von 10 bis 100 m²/g und eine Austauschkapazität, basierend auf einer trockenen Basis, von 0.1 bis 1 mäq hat.

5. Verfahren für eine Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 4, wobei die Carboxyalkylgruppe eine Carboxymethylgruppe ist.

6. Verfahren für eine Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 4 oder 5, wobei der Eluent (die Eluenten) (11, 12, 13) eine Pufferlösung (Pufferlösungen) mit einem pH-Wert von 5.0 bis 7.0 ist (sind).

7. Gerät für eine Flüssigkeitschromatographie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Gerät weiter aufweist:
einen Datenprozessor (28) zum Messen der Anteile der Komponenten, die von Hämoglobinen in der Trennsäule (25) getrennt wurden;
ein Betriebsteil (29) zum Beurteilen, ob der Anteil von glykosyliertem Hämoglobin A_1c (5), wie in Anspruch 1 definiert, oder von glykosyliertem Hämoglobin A_1c (9), wie in Anspruch 1 definiert, auf der Basis der gesamten Hämoglobine, die in dem Datenprozessor (28) gemessen wurden, einen vorbestimmten Wert, insbesondere den Durchschnittswert+SD oder den Durchschnittswert+2 SD, überschreitet, wobei der Begriff "Durchschnittswert" einen Durchschnittswert bezeichnet, der berechnet wurde aus den Werten eines Anteils von A_1c (5) oder A_1c (9), die durch eine Anzahl früherer Messungen erhalten wurden;
eine Einrichtung (14) zum Abtasten einer oder mehrerer Proben auf der Basis von dem Betriebsteil (29) erzeugten Signalen und zum Übertragen der Proben zur Trennsäule (25);
eine intelligente Pumpe (16) zum Verändern der Durchflußrate eines oder mehrerer Eluenten (11, 12, 13) auf der Basis eines von dem Betriebsteil (29) erzeugten Signals;
und ein 3-Wege-Solenoidventil (15) zum Verändern des Mischungsverhältnisses von den Eluenten (11, 12, 13) auf der Basis eines von dem Betriebsteil (29) erzeugten Signals.

8. Gerät für eine Flüssigkeitschromatographie nach Anspruch 7, wobei Analysen, die bezüglich der Anzahl der zu trennenden Komponenten unterschiedlich sind, aufeinanderfolgend ohne einen Austausch der Trennsäule (25) und der Eluenten (11, 12, 13) ausgeführt werden.

9. Trennsäule (25), die mit einem Packmaterial gepackt ist, dadurch gekennzeichnet, daß das Packmaterial im wesentlichen aus einer porösen Substanz mit darin eingebauten Carboxyalkylgruppen zusammengesetzt ist und aus der Klasse bestehend aus Methacrylatpolymeren, Vinylalkoholpolymeren, Styrol-Divinyl-Benzol-Polymeren und Siliziumdioxidgelen ausgewählt ist, wobei das Packmaterial eine mittlere Teilchengröße in trockenem Zustand von 4 µm oder weniger, einen spezifischen Oberflächenbereich in trockenem Zustand von 10 bis 100 m²/g und eine Austauschkapazität, basierend auf einer trockenen Basis, von 0.1 bis 1 mäq hat.

10. Trennsäule nach Anspruch 9, wobei die Carboxyalkylgruppe eine Carboxymethylgruppe ist.