DE3004356C2

DE3004356C2 - Füllmasse zum Füllen einer Flüssigkeitschromatographiesäule, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Durchführung einer Flüssigkeitschromatographie

Info

Publication number: DE3004356C2
Application number: DE3004356A
Authority: DE
Inventors: Fumio Chofu Tokyo Kodama; Masaaki Kunitachi Tokyo Nakao
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1979-02-07
Filing date: 1980-02-06
Publication date: 1982-04-01
Also published as: JPS55106357A; IT8019759A0; CA1145737A; GB2042557B; IT1150076B; GB2042557A; DE3004356A1; JPS6331737B2; FR2448718B1; FR2448718A1

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Füllmasse zum Füllen einer Flüssigkeitschromatographiesäule und eignet sich zur Durchführung einer Flüssigkeitschromatographie, insbesondere zur Ausführung von klinischen Untersuchungen.

Zur Diagnose von Krankheiten sowie zur Festlegung von Maßnahmen zur Behandlung von Krankheiten ist es wichtig, Informationen über den Krankheitszustand zu erhalten, und zwar durch Analyse der Eigenschaften sowie der Komponenten der physiologischen Proben des Patienten, wie des Plasmas, des Serums, der cerebrospinalen Flüssigkeit des Urins usw.

Bisher wurden derartige Informationen nach verschiedenen chemischen und biochemischen Analysemethoden erhalten. Bei der Untersuchung von Patienten mit mehreren Krankheiten ist es jedoch erforderlich, eine Untersuchungsmethode zur Verfügung zu haben, die einen genauen Aufschluß über die Krankheitszustände gibt.

Insbesondere im Falle von Nierenerkrankungen und Lebererkrankungen besteht infolge der Kompliziertheit des Krankheitszustandes der Bedarf an neuen Indikationsmöglichkeiten. Beispielsweise wurden bisher im Falle von Nierenkrankheiten die Werte untersucht, welche die Nierenfunktionen wiedergeben, wie beispielsweise der Creatiningehalt, der Harnsäuregehalt sowie der Elektrolytgehalt im Blut, der Protein- und Zuckergehalt im Urin sowie der pH des Urin. Im Falle von Leberkrankheiten schenkte man den Werten Beachtung, welche Leberfunktionen wiederspiegeln, beispielsweise den Bioenzymaktivitäten, wie der Glutaminsäure-Oxalessigsäuretransaminase (GOT), d. h. des Enzyms, welches die Reaktion

L-GIutaminsäure + Oxalessigsäure

«-Ketoglutarsäure + L-Asparaginsäure

katalysiert, der Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transaminase (GPT), der Lactase-Dehydrogenase (LDH) und der Leucinaminopeptidase (LAP), ferner den Komponenten des Blutes, wie beispielsweise dem Protein und dem Bilirubin.

Diese Werte spielen wichtige Rollen und werden zur Festlegung der Diagnose sowie des Behandlungsweges verwendet.

In neuerer Zeit ist man auf die Erkenntnis gestoßen, daß eine enge Beziehung besteht zwischen den urämischen Toxinen und dem Krankheitszustand von Nierenkrankheiten. Die vorstehend erwähnten Werte, die nach herkömmlichen Methoden ermittelt werden, vermögen nicht das Vorliegen der vorstehend erwähnten Toxine zu belegen, wobei darüber hinaus bisher keine einfachen Methoden zum Aufsprühen und Bestätigen der Toxine vorhanden waren. Auch im Falle von Leberkrankheiten sind verschiedene Substanzen aufgrund eines abnormalen Stoffwechsels sowie ätiopathogene Substanzen entsprechende Hinweismöglichkeiten, es gibt jedoch keine geeigneten Methoden zum Aufspüren und Bestätigen derartiger Substanzen.

Die derzeit verfügbaren Analysemethoden auf dem Gebiet der Chemie und Biochemie reichen daher immer noch nicht vollständig aus. Daher besteht der Bedarf an der Entwicklung einer geeigneten Methode zum Aufspüren und Bestätigen der vorstehend erwähnten Substanzen, die einen Hinweis auf verschiedene Krankheitszustände geben.

In diesem Zusammenhang hat die Flüssigkeitschromatographie als Analysemethode, die auf Prinzipien von chemischen und biochemischen Analysemethoden basiert, in neuerer Zeit an Aufmerksamkeit gewonnen. Sogar thermisch und chemisch instabile Substanzen lassen sich durch die Flüssigkeitschromatographie ohne Denaturierung aufspüren, ferner kan man mehere Komponenten unter Einsatz einer relativ kleinen Probemenge bestimmen. Daher wird die Flüssigkeitschromatographie auf dem Gebiet der Medizin in breitem Umfange eingesetzt Um jedoch die Flüssigkeitschromatographie auf diesem Gebiet voll einsetzen zu können, sind noch einige Probleme zu lösen, welche im Zusammnenhang mit der Auswahl des Filmmaterials, der Einstellung der Trennungsbedingungen zur Durchführung der Chromatographie sowie den erforderlichen Vorbehandlungen stehen.

Beispielsweise versuchten Chang et al. (T. M. S. Chang et al., »Trans. Amer. Artif. Int. Organs«, Band XX, Seite

364 [1974]) die vorstehend erwähnten Toxine, die in dem Blut von Patienten auftreten, weiche an einer Nierenkrankheit leiden, dadurch aufzuspüren, daß sie die Flüssigkeitschromatographie unter Einsatz von Säulen anwendeten, die mit porösen Kügelchen aus vernetzten! Dextran gefüllt waren.

Dabei wurde gefunden, daß im Serum von Patienten, die an Nierenkrankheiten leiden, im Unterschied von einem normalen Serum einige Substanzen auftreten, welche spezifische Peaks in den Chromatogramm, das bei der Flüssigkeitschromatographie erhallen worden ist, ergaben, woraus geschlossen wurde, daß diesen Peaks einige schädliche Substanzen zuzuordnen sind.

Die Methode von Chang et al. ist insofern jedoch noch mit Nachteilen behaftet, als die erhaltenen spezifischen Peaks sehr breit sind, wobei ihre Methode außerdem den Einsatz einer relativen großen Menge der Serumprobe von 2 bis 3 ml und darüber erfordert, wobei die Behandlung einer Probe 4 bis 7 Stunden dauert.

Daher ist diese Methode als klinische Untersuchungsmethode nicht zufriedenstellend.

Die Methode von Fürst (P. Fürst, »Clinical Nephorlogy«. Band 5 [4], Seite 198 [1976]) besteht darin, Serumproben mit einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie zu untersuchen. Diese Methode verkürzt die Analysezeit, ist jedoch mit dem Nachteil behaftet, daß viele Peaks in dem Chromatogramm auftreten, sie sich überlappen, so daß es schwierig ist, eine jede Komponente abzutrennen und zu identifizieren. Darüber hinaus ist keine dieser Methoden bei einer Anwendung auf eine klinische Untersuchung in der Lage, durch eine Analyse von Bioproben eine Kenntnis über die Beziehung zwischen dem Fortschreiten des Krankheitszustandes und dem Auftreten der Peaks in dem Chromatogramm zu geben, obwohl es möglich ist, einige spezifische Peaks in dem Chromatogramm einer Probe zu erhalten, die einem Patienten mit einer Leberkrankheit oder Nierenkrankheit entnommen worden ist. Daher haben die Methoden von Chang und Fürst keinen Eingang in die Praxis gefunden.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein Mittel zur wirksamen und genauen Durchführung einer klinischen Untersuchung von physiologischen Proben aus Patienten, die insbesondere von Nierenkrankheiten usw. befallen worden sind, zu schaffen.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung durch eine Füllmasse zum Füllen einer Flüssigkeitschromatographiesäule geschaffen, welche gekennzeichnet ist durch ein kugelähnliches hydroxymethyliertes Copolymeres aus Styrol und Divinylbenzol, wobei an dem kugelähnlichen hydroxymethylierten Copolymeren ein Serumprotein adsorbiert ist und daran anhaftet.

Vorzugsweise besteht dabei das Serumprotein aus Albumin, Globulin oder aus einer Mischung davon.

Bei der Durchführung einer Flüssigkeitschromatographie unter Einsatz einer erfindungsgemäßen Füllmasse ist es möglich, die Peaks in den jeweiligen Chromatogrammen zu trennen und aufzuspüren, die eine Beziehung zu dem Fortschreiten des Krankheitszustandes der vorstehend erwähnten Krankheiten haben, wobei ein Arbeiten innerhalb einer kurzen Zeitspanne möglich ist und nur kleine Probemengen erforderlich sind.

Insbesondere eignet sich die erfindungsgemäße Füllmasse zur Durchführung einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatogiraphie.

In den Rahmen der Erfindung fällt ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Füllmassen. Dieses Verfahren besteht darin, daß die Adsorption oder das Anhaften des Serumproteins in der Weise bewirkt wird, daß man eine Lösung des Serumproteins durch eint Chromatographiesäule schickt, die mit einem kugelähnlichen hydroxymethylierten Copolymeren aus Styrol und Divinylbenzol gefüllt ist, wobei gegebenenfalls die Lösung des Serumproteins in der Weise hergestellt wird, daß man Serumprotein in einem Lösungsmittel,

ίο ausgewählt aus Wasser, einer Pufferlösung, einer Pufferlösung mit einem zugesetzten Salz oder einer Pufferlösung mit einem zugesetzten organichen Lösungsmittel, auflöst. Dabei wird das Serumprotein vorzugsweise in einer Lösung verwendet, deren Konzentration zwischen 0,2 und 5 Gew.-% schwankt.

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt

F i g. 1 Chromatogramme von Serumproben, die nach der in Beispiel 1 beschriebenen Hochgescbwindigkeitsflüssigkeitschromatographie erhalten worden sind, wobei a) das Chromatogramm eines normalen Serums und b) das Chromatogramm eines Serums eines Patienten ist, der en einem Nierenversagen leidet,

F i g. 2 ebenfalls Chromatogramm von Serumproben, die durch Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie gemäß Beispiel 3 erhalten worden sind, wobei a) das Chromatogramm eines normalen Serums und b) das Chromatogramm eines Serums eines Patienten isi. der an einer Leberkrankheit leidet, während c) das

so Chromatogramm des gleichen Patienten nach der Genesung von der Leberkrankheit ist.

In der erwähnten Chromatogrammen ist auf der Ordinate die Absorption der Lösung, die in den Beispielen näher angegeben ist, bei 254 nm aufgetragen, wobei die Absorption der Lösung in einer Beziehung zu der Konzentration der Komponenten in der Lösung steht. Auf den Abszissen ist die Eluierungszeit oder Retentionszeit in Minuten aufgetragen. In den Fig. 1 und 2 geben die Werte 1 bis 9 bzw. a) bis e) oder a) bis g) die Peaks an, die den aus den viele Komponenten enthaltenden Proben isolierten Komponenten entsprechen.

Die erfindungsgemäße Füllmasse kann wie folgt hergestellt werden:

(a) Herstellung der kugelähnlichen Substanz aus

einem hydroxymethylierten Copolymeren

aus Styrol und Divinylbenzo!

Beispielsweise wird eine monomere Mischung aus Styrol und Divinylbenzol in Suspension in einem Nichtlösungsmittel, beispielsweise Wasser sowie in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators zur Gewinnung eines kugelähnlichen Copolymeren aus Styrol und Divinylbenzol polymerisiert. Indem man das kugelähnliche Copolymere in Reaktion mit Formaldehyd bringt, wird ein hydroxymethyliertes Copolymeres aus Styrol und Divinylbenzol erhalten. Die bisher im Handel erhältlichen kugelähniiehen Copolymeren aus Styrol und Divinylbenzol, die in Hochgeschwindigkeitschromatographiesäulen als Füllstoff eingesetzt wurden, körn.en zur Durchführung der folgenden Stufe ebenfalls eingesetzt werden.

Die Teilchengröße des kugelähnlichen Copolymeren sowie sein Hydroxymethylierungsgrad werden je nach dem Zweck der Flüssigkeitschromatographie ausgewählt, gewöhnlich beträgt jedoch der Durchmesser 5 bis

50 Mikron und der Hydroxymethylierungsgrad 0,05 bis 0,5.

(h) Adsorption oder Anhaften des Serumproteins

an das kugelähnliche oxymethylierte Copolymere

aus Styrol und Divinylbenzol

Ein Serumprotein, beispielsweise Albumin oder Globulin, das aus einer Vielzahl von Säugetieren erhältlich ist, beispielsweise aus Menschen, Rindern, Pferden, Hunden oder Schafen, wird in einem Lösungsmittel aufgelöst, worauf die Lösung in Kontakt mit dem vorstehend erwähnten kugelähnlichen hydroxymethylierten Copolymeren unter Rühren gebracht wird. Dann wird das System in die Flüssigkeit und in den Feststoff aufgetrennt, wobei man ein hydroxymeihyiiertes Copolymeres aus Styrol und Benzol erhält, an dem Serumprotein adsorbiert ist oder anhaftet. Das vorstehend erwähnte Kontaktierungsverfahren wird durch Eintauchen des vorstehend erwähnten hydroxymethylierten kugelähnlichen Copolymeren in die Lösung aus Serumprotein durchgeführt oder durch Durchschicken der Lösung des Serumproteins durch eine Säule, die mit dem kugelähnlichen hydroxymethylierten Copolymeren gefüllt ist, ausgeführt. Zusätzlich wird die Absorption oder das Anhaften automatisch in der Weise zu Ende gebracht, daß man die vorstehend erwähnten zwei Substanzen in Kontakt miteinander bringt, und zwar infolge des Adsorptionsvermögens des hydroxymethylierten Copolymeren für das Serumprotein.

Die vorstehend erwähnte Lösung aus Serumprotein, die zur Durchführung der Adsorption oder des Anhaftens verwendet wird, wird erha'ten durch Auflösen des Proteins in Wasser, einer Pufferlösung oder einer Pufferlösung, die ein Salz, wie Natriumperchlorat, enthält. Man kann auch ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Propanol oder Dioxan verwenden. In den Fällen, in denen die Konzentration des Serumproteins in der vorstehend erwähnten Lösung hoch ist, wird die Absorption oder das Anhaften des Serumproteins an das hydroxymethylierte Copolymere innerhalb einer kurzen Zeitspanne beendet, wobei jedoch der Zustand der Adsorption oder des Anhaftens nicht gleichmäßig ist. In den Fällen, in denen die vorstehend erwähnte Konzentration gering ist, dauert es lange bis zur Beendigung der Adsorption oder des Anhaftens. Unter derartigen Umständen beträgt die Konzentration des Serumproteins in der vorstehend erwähnten Lösung vorzugsweise 0,2 bis 5 Gew.-%.

Wie vorstehend erwähnt, wird dann, nachdem das Scrurnprcteär; zum Adsorbieren oder Anhaften an dem kugelähnlichen hydroxymethylierten Copolymeren aus Styrol und Divinylbenzol gebracht worden ist, die Füllmasse gemäß vorliegender Erfindung durch gründliches Waschen des auf diese Weise behandelten Copolymeren erhalten. Um die Füllmasse zur Durchführung einer Flüssigkeitschromatographie einzusetzen, wird sie in eine Säule eingefüllt, die für eine chromatographische Analyse verwendet wird. Da die Koagulierungsneigung durch die Adsorption des Serumproteins zwischen den Teilchen erhöht worden ist, hat sich ein gleichmäßiges Einfüllen der Füllmasse in die Säule als schwierig erwiesen. Deshalb sollte beim Einfüllen besondere Sorgfalt angewendet werden. Um die beim Füllen der Säule mit der Füllmasse gemäß vorliegender Erfindung auftretende Schwierigkeiten zu vermeiden, ist es zweckmäßig, wenn das hydroxymethylierte Copolymere in die Säule eingefüllt wird, nachdem noch kein Serumprotein adsorbiert worden ist. Nach dem Einsetzen der gefüllten Säule in eine herkömmliche Vorrichtung zur Durchführung einer Flüssigkeitschromatographie wird dann die Lösung des Serumproteins durch die Säule geschickt. Nach der vorstehend beschriebenen Methode dauert die Zeit zum Adsorbieren oder zum Anhaften des Serumproteins an dem kugelähnlichen hydroxymethylierten Copolymeren etui was langer, während andererseits die vorbereitenden Maßnahmen für die Analyse vereinfacht werden.

Bei der Behandlung für die Adsorption oder das Anhaften des Serumproteins an das kugelähnliche hydroxymelhylierte Copolymere wird die Temperatur

ι-, auf einem Wert gehalten, bei dem keine Denaturierung des Serumproteins erfolgt, d. h. bei einer Temperatur von 5 bis 70 und vorzugsweise 20 bis 40⁰C.

Der pH der Lösung des Serumproteins kann in einem Bereich liegen, in welchem keine Denaturierung und

2(i Koagulierung des Serumproteins erfolgt. Der Bereich liegt gewöhnlich zwischen 5 und 9. wobei es zweckmäßig ist, den isoelektrischen Punkt des Serumproteins zu vermeiden. Ferner erleichtert bei der Herstellung der Lösung des Serumproteins der Einsatz einer Pufferlösung mit dem gleichen pH-Wert wie der pH-Wert der sich bewegenden Phase, die für die Flüssigkeitschromatographie unter Einsatz der Säule durchgeführt wird, die mit der erfindungsgemäße Füllmasse gefüllt ist, die Aufrechterhaltung des stetigen

jo Zustandes der Lösung des Serumproteins während der Durchführung der Untersuchung.

Daher wird die Absorption oder as Anhaften des Serumproteins an das kugelähnliche hydroxymethylierte Copolymere vorzugsweise soweit wie möglich unter

υ den gleichen Bedingungen wie zum Zeitpunkt der Untersuchung im Hinblick auf die Stabilität der erfindungsgemäßen Füllmasse durchgeführt.

Die Menge des an dem erfindungsgemäßen kugelähnlichen hydroxymethylierten Copolymeren anhaftenden

4(i oder adsorbierten Serumproteins schwankt etwas in Abhängigkeit von der Art des kugelähnlichen hydroxymethylierten Copolymeren sowie von dem Serumprotein, das zur Durchführung der Flüssigkeitschromatographie eingesetzt wird, gewöhnlich liegt jedoch die

A=, Menge zwischen 0,1 und 1 Gew.-°/o des Trockenmaterials und vorzugsweise zwischen 0,2 und 0,5 Gew.-% des Trockenmaterials.

Eine mit der erfindungsgemäßen Füllmasse gefüllte Säule kann zur Untersuchung von verschiedenen physiologischen Proben nach dem Einbauen der Säule in eine herkömmliche Vorrichtung zur Durchführung der

in eine andere Vorrichtung mit der gleichen Funktion verwendet werden. Eine derartige Vorrichtung vermag die Komponenten der Probe als Peaks abzutrennen und aufzuspüren, die eine Beziehung zu dem Fortschreiten des Krankheitszustandes haben. Von den physiologischen untersuchbaren Proben seien Blutkomponenten, wie Serum und Plasma, die cerebrospinale Flüssigkeit, die Lymphflüssigkeit, die Ascitesflüssigkeit, der Urin usw. erwähnt

Anschließend kann eine Untersuchungsmethode unter Einsatz der erfindungsgemäßen Filmmasse, insbesondere eine Untersuchung von physiologischen Proben durch Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie, unter den nachfolgenden Bedingungen durchgerührt werden, wobei die nachfolgenden Ausführungen jedoch nur eine beispielhafte Ausführungsform

10

20

betreffen, durch welche die Erfindung nicht beschränkt werden soll.

Als sich bewegende Phase, die in der mit der erfindungsgemäßen Füllmasse gefüllte Säule verwendet wird, kommen Wasser, eine Pufferlösung oder eine Pufferlösung in Frage, die eine Salzkomponente enthält, wie Natriumperchlorat. Ferner kann man ein organisches Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropylalkohol, Dioxan usw. vorzugsweise einsetzen. Ein als sich bewegende Phase besonders geeignetes Material ist ein Phosphatpuffer. Bei Verwendung eines Phosphatpuffers als sich bewegende Phase werden extrem fein getrennte Peaks in dem Chromatogramm erhalten.

Da die erfindungsgemäße Füllmasse das Protein enthält, so daß die Wahrscheinlichkeit besteht, daß sie unerwünschte Umwandlungen während der langen Zeitspanne, während welcher die mit der erfindungsgemäßen Füllmasse gefüllte Säule verwendet wird, erleidet, beispielsweise einen Abbau durch Mikroorganismen, ist es vorzuziehen, in diesen Fällen eine kleine Menge eines antimikrobiellen Mittels, wie Natriumazid usw., der sich bewegenden Phase zuzusetzen.

Die Temperatur, bei welcher die Untersuchung mit einer Flüssigkeitschromatographie unter Einsatz der erfindungsgemäßen Füllmasse durchgeführt wird, liegt zwischen 20 und 4O⁰C. Die Menge der zur Durchführung der Analyse unter Einsatz der vorstehend beschriebenen Vorrichtung erforderlichen Probe beträgt 1 bis 15 Mikroliter.

Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Flüssigkeitschromatographie wird ein Detektor verwendet, der mit einem UV-Spektrometer und einem gewöhnlichen Spektrometer versehen ist, gegebenenfalls können jedoch auch ein Differentialrefraktometer, ein Fluoreszenzspektrometer, ein Infrarotspektrometer, ein Strahlungsdetektor, ein Polarograph oder ein Leitfähigkeitsmesser nach einer entsprechenden sorgfältigen Auswahl verwendet werden.

Um die erhaltenen Werte mengenmäßig auszuwerten, kann die Peakfläche des Chromatogramms dadurch mengenmäßig erfaßt werden, daß eine Datenvorrichtung mit dem vorstehend erwähnten Detektor verbunden wird.

Die Flüssigkeitschromatographie unter Einsatz der erfindungsgemäßen Füllmasse ist nicht nur auf eine klinische Untersuchung anwendbar, sondern beispielsweise auch zum Trennen von Fraktionen nach einem Einfüllen in eine größere Säule.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel i

Nach dem Einfüllen eines hydroxymethylierten kugelähnlichen (Durchmesser 10 bis 15 Mikron) Copolymeren aus Styrol und DivinylbenzoL hergestellt

Tabelle I

Ablaufzeit und relative Peakflächen von normalem Serum sowie von Serum aus einem Patienten mit Nierenversagen bei der Durchführung einer Flüssigkeitschromatographieprobe

nach einem bekannten Verfahren, in eine Säule aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 4 mm und einer Länge von 50 cm, wobei man sich einer üblichen Einfüllmethode bedinet, wird die Säule in einen

Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographen
eingebaut, der mit einem UV-Detektor versehen ist.

In die auf diese Weise eingebaute Säule wird ein Phosphatpuffer mit einem pH von 7,4 mit einer Geschwindigkeit von 1,2 ml/Minute eingefüllt. Nachdem sich der Aufzeichner sowie das Integrationsplanimeter stabilisiert haben, wird eine wäßrige 10%ige Lösung von Menschenserumalbumin in die Säule aus dem Probeneinlaß eingeführt. Nach einem Wiederholen der Einführung der Albuminlösung zur Erzielung der fixierten Anzeigehöhe auf dem Aufzeichnungsgerät oder es fixierten Wertes der Aufzeichnungsfläche auf dem Integrationsplanimeter wird die Behandlung des kugelähnlichen Füllstoffs mit der vorstehend erwähnten Albuminlösung beendet.

Dann wird unter Anwendung des vorstehend erwähnten Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographen, der mit der auf diese Weise hergestellten Säule ausgestattet ist, in welcher das kugelähnliche Füllmaterial menschliches Serumalbumin vollständig adsorbiert hat, die Untersuchung des Serums einer normalen Person und des Serums eines Patienten mit einem chronischen Nierenversagen unter dialytischer Behandlung durchgeführt.

Als Ergebnis der 30 Minuten dauernden Untersuchungen werden die in F i g. 1 wiedergegebenen Diagramme erhalten, wobei die Peaks a, (b), (c), d, e, (f) und (g) festgestellt werden. Die in Klammern angegebenen Peaks erscheinen nur auf dem Diagramm des Patienten, der an einem chronischen Nierenversagen leidet.

Die gegenseitige Trennung der Peaks, die nur auf dem Diagramm auftreten, das unter Verwendung des Serums des Patienten mit chronischem Nierenversagen aufgenommen worden ist sowie ihre mengenmäßige Erfassung ermöglichen eine bessere Auswertung der klinischen Untersuchung als die Werte, die bei einer herkömmlichen klinischen Untersuchung erhalten werden.

Zu Vergleichszwecken wird die gleiche Hochge-

schwindigkeitsflüssigkeitschromatographiemethode
durchgeführt mit der Ausnahme, daß die Säule mit dem gleichen hydroxymethylierten Copolymeren aus Styrol und Divinylbenzol gefüllt wird, jedoch ohne adsorbiertes oder anhaftendes Serumalbumin, wobei das Serum des Patienten mit chronischem Nierenversagen, der unter Dialysebehandlung steht verwendet wird.

Das Ergebnis zeigt daß (1) der Peak a geringer ist als derjenige der beim Einsatz der erfindungsgemäßen Füllmasse erhalten wird, und (2) daß die Trennung der Peaks b, c, d usw. unzureichend ist

55

35

45

Probe

Relative Peakfläche von abcd

Normales Serum	mit Nieren-	9895	—	—	323	52
Serum des Patienten		8046	130	1293	653	1001
versagen

505 38

ίο

I'M,Η·-.'

Relative Peakllachc von
a h c il

e Γ

Ablaufzeit eines jeden Peaks 4.7 6.9 7.H 8.9 10.6 11.8 25.4

!.Minuten) bis

16.5

Beispiel 2

Unter Einsatz des gleichen Hochgeschwindigkeits-Hüssigkeitschromatographen, der mit einer Säule versehen ist, die mit einer Füllmasse gefüllt ist, welche gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist, wird der Übergang des Krankheitszustandes eines Patienten von einem leichten Nierenversagen über die Behandlung im Krankenhaus bis zur Dialysebehandlung durch chromatographische Untersuchung des Serums des Patienten

2» sowie durch Bestimmung von BUN und Creatinin verfolgt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle 11 hervor. Wie aus der Tabelle ii ersichtlich ist, steigt mit zunehmender Verschlechterung der Werte der herkömmlichen klinischen Untersuchung, wie BUN und Creatinin, in dem Serum die Anzahl der abnormalen Peaks in dem Chromatogramm an, woraus die Nützlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ersichtlich wird.

Tabelle Il

Fortschreiten des Krankheitszustandes eines Patienten mit Niercnversagen und Ergebnisse der Chromatographie des Serums des Patienten

Beobachtung, Tage

Relative Fläche eines jeden Peaks h c d e Γ

Werte der klini- Klinische

sehen Untersuchung Bewertung

BUN Crcatinin
(mg/dl)

48

56
63

70

77

72	—	838	471	—	—	101	7.6	—
57	-	736	446	-	-	101	8.3	-
78	116	434	514	21	116	105	9.2	Verschlimme
								rung
95	214	534	618	70	191	104	9.9	Behandlung im
								Krankenhaus
104	234	770	626	170	168	102	10.8	Vorbereitung für
								die Dialyse
144	243	730	610	191	388	102	10.8	-
151	328	588	589	222	545	103	10.5	_

Beispiel 3

Eine weibliche aseptisch aufgezogene Ratte wird als Modell für eine Lebererkrankung in der Weise vorbereitet daß ihr 1000 mg/kg D-Galactosamin verabreicht wird. Von ihrem Serum wird vor der Verabreichung (normale Stufe) eine Probe entnommen, ferner während des Krankheitszustandes sowie während der Erholungsperiode. Die Serumproben werden mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographen untersucht, der mit einer Säule ausgestattet ist, die mit der erfindungsgemäßen Füllmasse gefüllt ist Das Ergebnis ist das durch F i g. 2 wiedergegebene Diagramm. Die relativen Werte der Peakflächen auf dem Chromatogramm sind in der Tabelle III zusammengefaßt- Getrennt werden biochemische Analysen auf GOT, GPT sowie Bilirubin durchgeführt wobei die Ergebnisse ebenfalls der Tabelle III zu entnehmen sind.

Wie aus F i g. 2 und der Tabelle III zu ersehen ist sind die Werte von GOT, GPT und Bilirubin des Serums der bo Ratte, die mit D-Galactosamin behandelt worden ist um ein Modell für eine Leberkrankheit zur Verfugung zu haben, deutlich abnormal nach der Verabreichung im Vergleich zu den Werten vor der Verabreichung sowie nach dem Einsetzen der Erholungsphase. Entsprechend dem Übergang der vorstehend erwähnten Werte zeigt jeder der nach einer mehr als 5 Minuten dauernden Ablaufzeit erhaltenen Peaks eine deutliche Veränderung.

12

Tabelle III

Ergebnis der Chromatographie des Serums einer Ratte als Modell einer Lebererkrankung zusammen mit den Ergebnissen der klinischen Untersuchung

Scruniprobc

Relative Fläche eines jeden Peaks der Nummern

Werte der klinischen
Untersuchung, mg/dl

GOT GPT Bilirubin

In normalem Zustand

34 156 37 37 13 2211 246 128

Im Zustand der Leberkrankheit 35292 41 155 30 202 38 1075 512 795

Im Zustand der Wiederholung 37911 37 122 65 1808 78 - 56 113

Abiaurzeit eines jeden Pe;äks 4.5 6.3 6.8 7.4 8.8 10.6 13.8 15.4 19.1 (min)

100 70 weniger

als 0.3

4560 2260 3.9
540 520 0.5

Aus den Ergebnissen der vorstehenden Untersuchung geht hervor, daß durch Anwendung einer Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographie unter Einsatz der erfindungsgemäßen Füllmasse ein chromatographisches Muster entsprechend dem Übergang des Krankheitszustandes auch im Falle der Leberkrankheit verfügbar ist. Andererseits zeigt die Untersuchung der vorstehend erwähnten Proben des Serums durch die gleiche Chromatographie, wobei unter Einsatz einer Säule gearbeitet wird, die mit dem kugelähnlichen oxymethylierten Copolymeren aus Styroldivinylbenzol gefüllt ist, wobei kein menschliches Serumalbumin adsorbiert ist oder anhaftet, daß ein Chromatogramm erhalten wird, in welchem, wie in dem unteren Teil des Beispiels 1 gezeigt ist, der Peak 1 eine geringere Höhe besitzt und die Trennung der Peaks 2, 3, 4, 7 und 8 unzureichend ist.

llier/u 2 BhUl Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Füllmasse zum Füllen einer Flüssigkeitschromatographiesäule, gekennzeichnet durch ein kugelähnliches hydroxymethyliertes Copolymeres aus Styrol und Divinylbenzol, wobei an dem kugelähnlichen hydroxymethylierten Copolymeren ein Serumprotein adsorbiert ist und daran anhaftet

2. Füllmassen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Serumprotein aus Albumin, Globulin oder einer Mischung davon besteht

3. Verfahren zur Herstellung der Füllmasse nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß die Adsorption oder das Anhaften des Serumproteins in der Weise bewirkt wird, daß man eine Lösung des Serumproteins durch eine Chromatographiesäule schickt, die mit einem kugelähnlichen hydroxyme-

ihylierten Copolymeren aus Styrol und Divinylbenzol gefüllt ist, wobei gegebenenfalls die Lösung des Serumproteins in der Weise hergestellt wird, daß man Serumprotein in einem Lösungsmittel, ausgewählt aus Wasser, einer Pufferlösung, einer Pufferlösung mit einem zugesetzten Salz oder einer Pufferlösung mit einem zugesetzten organischen Lösungsmittel, auflöst

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Serumprotein in einer Lösung verwendet deren Konzentration zwischen 0,2 und 5 Gew.-% schwankt.

5. Verwendung einer Füllmasse gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 zur Durchführung einer Flüssigkeitschromatographie.