DE4124058C2 - Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin und Vorrichtung zum Messen desselben - Google Patents
Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin und Vorrichtung zum Messen desselbenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Messen von Hämoglobin
in stabiler Form in Blut und eine Vorrichtung zum Messen desselben.
Nachdem Blutzucker abhängig von seiner Konzentration in die roten Blutzellen
eintritt, wird der Zucker an Hämoglobin gebunden, um Glycohämoglobin zu bilden.
Es wird gezeigt, daß die Konzentration von A1c in stabiler Form (hier im weiteren
als stabil-A1c oder abgekürzt als s-A1c bezeichnet) zwischen verschiedenen Typen
von Glycohämoglobin den durchschnittlichen Blutglukosespiegel der letzten ein bis
drei Monate widerspiegelt.
A1c ist zusammengesetzt aus A1c in stabiler Form (s-A1c) und A1c in labiler Form
(labil-A1c; l-A1c). Von diesen beiden zeigt s-A1c gute Korrelation mit dem Blutglukosespiegel
der letzten ein bis drei Monate. Es wird vorgeschlagen, daß l-A1c
ungefähr 10 bis 15% des gesamten A1c in einem hungrigen gesunden Erwachsenen
ausmacht. Das l-A1c wird gebildet durch reversible Bindung des N-Terminus
der β-Kette von Hämoglobin und einem reduzierenden Terminus von Glukose über
eine Schiffsche Base und wird in einer relativ kurzen Zeit erzeugt und wieder
abgebaut. Im diabetischen Patienten ist der l-A1c-Gehalt deshalb höher als im
gesunden Erwachsenen, manchmal steigt er auf 10 bis 20% des Gesamt-A1c. Er
ist auch nach Mahlzeiten höher als bei Hunger, und wird beachtlich durch den
Zustand, wenn Blut gesammelt wird, beeinflußt.
Oder aber s-A1c wird allmählich aus l-A1c erzeugt, kontinuierlich und irreversibel.
Es wird vorgeschlagen, daß s-A1c sehr gut den Blutglukosespiegel der letzten ein
bis drei Monate widerspiegelt.
Also ist es bevorzugt, daß s-A1c abgetrennt wird und allein vermessen wird. Jedoch
sind die beiden extrem analog in der Struktur, so daß sie sehr schwierig durch
Flüssigchromatographie zu trennen sind.
Das Verfahren zum Messen von nur s-A1c umfaßt zwei Methoden: (1) ein Verfahren
zum Trennen und Messen von s-A1c und l-A1c auf einer Trennsäule durch
Chromatographie und (2) ein Verfahren zum Vorbehandeln und Entfernen von l-
A1c.
Bei dem Verfahren zum Trennen von l-A1c und s-A1c auf einer Trennsäule, wird
eine lange, hoch präparative Trennsäule verwendet, zur Verbesserung der präparativen
Leistung. Das Verfahren hat eine charakteristische Eigenschaft, indem Hämoglobin
kaum denaturiert wird, verglichen mit dem Verfahren zur Entfernung von
l-A1c durch dessen Vorbehandlung (siehe z. B. Gazette of Japanese Patent Laid-open
Nr. 75 558/1988).
Andererseits beinhaltet das Verfahren zur chemischen Entfernung von l-A1c durch
dessen Vorbehandlung, das Verfahren rote Blutzellen in physiologischer Salzlösung
oder einem Puffer, der Semicarbazid und Anilin enthält, zu inkubieren [D. M.
Nathan, Clin. Chem., 27, 1261 (1981); D. M. Nathan et al., Clin. Chem., 28, 512
(1982)]. Dieses Verfahren konzentriert sich auf die Tatsache, daß sich die vorübergehende
Bindung von l-A1c, d. h. die Bindung über eine Schiffsche Base, leicht
löst.
Es ist auch ein Verfahren vorgeschlagen worden, das die Zugabe eines käuflich
erhältlichen Reagenzes zu Blut zwecks Entfernung von l-A1c und anschließende
Erwärmung des Blutes auf ungefähr 50°C für 1 bis 2 Minuten umfaßt, wodurch
l-A1c entfernt wird (siehe z. B. Gazette of Japanese Patent Laid-open Nr.
36 143/1988; Gazette of Japanese Patent Laid-open Nr. 97 857/1989).
Nach den Verfahren des Standes der Technik erfordert jedoch die komplette Trennung
von l-A1c und s-A1c gemäß des Verfahrens der Trennung von l-A1c und s-A1c
auf einer Trennsäule eine analytische Zeit von ungefähr 10 bis 60 Minuten pro
Probe. Deshalb ist es nahezu unmöglich, eine große Anzahl von Proben zu behandeln.
Weil die Säule so lang ist, daß sie eine große Menge Füllmaterial erfordert,
hat das Verfahren Nachteile dahingehend, daß die Säule hohe Kosten verursacht
und die Vorrichtung dafür sperrig ist.
Gemäß des Verfahrens l-A1c durch dessen Vorbehandlung zu entfernen, ist die
Vorbehandlung per se komplex und erfordert 30 Minuten bis 4 Stunden. Das
Verfahren bringt auch ein Problem beim Behandeln vieler Proben mit sich.
Weiter bringt das Verfahren der Hitzebehandlung ein Problem mit sich, daß die
Analyse schließlich in dem Fall unmöglich sein kann, wenn das Protein im Blut
denaturiert ist, was zum Auftreten von Präzipitaten führt, die Leitungen und Filter
verstopfen können.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Messen von
Glycohämoglobin und eine Vorrichtung zum Messen desselben bereitzustellen,
dadurch gekennzeichnet, daß A1c in stabiler Form (s-A1c) von anderen Hämoglobinkomponenten
in kurzer Zeit abgetrennt werden kann und daß das Verstopfen
von Leitungen und Filtern verhindert werden kann. Um die obige Aufgabe zu
lösen, umfaßt das Meßverfahren der vorliegenden Erfindung gleichzeitiges Durchführen
eines Verfahrens zum Trennen von Glycohämoglobin, Hämoglobin und
Hämoglobinderivaten im Blut und eines Verfahrens zum Abbau von Hämoglobin
in labiler Form im Blut in Glukose und Hämoglobin, wodurch die Hämoglobin-
Komponente in labiler Form entfernt wird und Hämoglobin in stabiler Form
mittels Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie gemessen wird.
Das Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin im Blut durch Hochleistungschromatographie
gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt Durchleiten von Elutionsmitteln
durch eine Trennsäule, die mit einem Füllmaterial gepackt ist, das aus
einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen
und Dihydroxyboronylgruppen besteht, wodurch Hämoglobin in labiler Form im
Blut abgebaut und entfernt wird, und umfaßt anschließendes Messen von Glycohämoglobin
in stabiler Form im Blut.
Das Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin im Blut durch Hochleistungschromatographie
gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt Durchleiten von Elutionsmitteln
durch eine Trennsäule, wobei ein Füllmaterial, bestehend aus einer
anorganischen oder organischen prorösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und ein
Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz
mit Dihydroxyboronylgruppen miteinander vermischt werden, wodurch Hämoglobin
in labiler Form im Blut abgebaut und entfernt wird, und umfaßt anschließendes
Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form im Blut.
Das Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin im Blut durch Hochleistungschromatographie
gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt Durchleiten von Elutionsmitteln
durch einen Typ von Füllmaterialien, wobei jedes aus einer anorganischen
oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen besteht und
folgendes Durchleiten der Elutionsmittel durch einen anderen Typ von Füllmaterialien,
wobei jedes aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit
Dihydroxyboronylgruppen besteht, oder Durchleiten der Elutionsmittel in einer
Elutions-Folge, die gegensätzlich zu der vorher genannten Folge ist, wodurch
Hämoglobin in labiler Form im Blut abgebaut und entfernt wird, und umfaßt
anschließendes Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form im Blut.
Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin
in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie, die umfaßt: eine
Trennsäule zum Trennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum
Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum
Einleiten von Elutionsmitteln in die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren
von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei
die Trennsäule mit der Funktion zum gleichzeitigen Ausführen des Verfahrens zur
Trennung von Glycohämoglobin, Hämoglobin und Hämoglobin-Derivaten und des
Verfahrens zum Abbau von Hämoglobin in labiler Form im Blut in Glukose und
Hämoglobin und zur Entfernung des Hämoglobins in labiler Form ausgestattet ist.
Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin
in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie, die umfaßt: eine
Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum
Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum
Einleiten von Elutionsmitteln in die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren
von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei
die Trennsäule mit einem Füllmaterial gepackt ist, das aus einer anorganischen
oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen
besteht.
Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin
in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie, die umfaßt: eine
Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum
Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum
Einleiten von Elutionsmitteln in die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren
von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei
die Trennsäule mit einem Füllmaterial gepackt ist, das durch Mischen eines
Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz
mit Carboxyalkylgruppen und eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen
oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, hergestellt ist.
Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin
in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie, die umfaßt: eine
Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum
Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum
Einleiten von Elutionsmitteln in die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren
von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat der Trennsäule, wobei ein
Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz
mit Carboxyalkylgruppen und ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen
oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, getrennt in zwei
Schichten in die Trennsäule gepackt sind.
Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin
in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie, die umfaßt: eine
Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum
Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum
Einleiten von Elutionsmitteln in die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren
von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei
die Trennsäule in zwei Teile in Fließrichtung der Elutionsmittel getrennt ist; ein
Teil ist mit einem Füllmaterial gepackt, das aus einer anorganischen oder organischen
porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen besteht und der andere Teil ist
mit einem Füllmaterial gepackt, das aus einer anorganischen oder organischen
porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen besteht.
Weiter ist die Trennsäule der vorliegenden Erfindung mit einem Füllmaterial
gepackt, das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit
Carboxyalkyl- und Dihydroxyboronylgruppen besteht.
Weiterhin ist die Trennsäule der vorliegenden Erfindung mit einem Füllmaterial
gepackt, das durch Mischen eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen
oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und eines Füllmaterials,
bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit
Dihydroxyboronylgruppen, hergestellt ist.
Weiter wird die Trennsäule der vorliegenden Erfindung durch Packen eines Füllmaterials,
bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz
mit Carboxyalkylgruppen und eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen
oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, getrennt in zwei
Schichten in Fließrichtung der Elutionsmittel, hergestellt.
Fig. 1 zeigt das in Beispiel 1 erhaltene Chromatogramm;
Fig. 2 zeigt das in Vergleichsbeispiel 1
erhaltene Chromatogramm;
Fig. 3 zeigt das in Beispiel 2 erhaltene
Chromatogramm;
Fig. 4 zeigt das in Vergleichsbeispiel 2 erhaltene Chromatogramm;
Fig. 5 ist eine Figur, die die Korrelation zwischen den Leveln von A1c in
stabiler Form (s-A1c), gemessen durch das Verfahren von Beispiel 2 und den
Leveln von s-A1c, gemessen durch das Verfahren von Vergleichsbeispiel 1 darstellt;
Fig. 6 ist ein Ausführungsbeispiel der analytischen Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung;
Fig. 7 ist eine Konstruktions-Figur von elementaren Teilen der Trenn-
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung; und
Fig. 8 ist eine Konstruktions-Figur
von elementaren Teilen der Trenn-Vorrichtung von Vergleichsbeispiel 3.
Durch Verwendung einer Trennsäule, die mit einem Füllmaterial mit Carboxyalkylgruppen
und Dihydroxyboronylgruppen gepackt ist, als Trennsäule für die Analyse
von Glycohämoglobin, kann der Abbau von l-A1c und die Trennung in die individuellen
Komponenten von Hämoglobin (Hb) gleichzeitig ausgeführt werden.
Im Fall, daß Glycohämoglobin (GHb) in seine Komponenten durch Hochleistungs-
Flüssig-Chromatographie (HPLC) getrennt wird, wird als Füllmaterial, ein Kationenaustauscherharz
mit geringer Azidität, verwendet, wobei Carboxymethylgruppen in
ein hydrophiles Substrat, wie Silicagel, Methacrylatgel, Vinylalkoholgel oder ähnlichem,
eingeführt werden. Durch die Ionenaustauscher-Chromatographie wird Hb
durch Ausnutzung der unterschiedlichen isoelektrischen Punkte in seine individuellen
Komponenten getrennt. Als andere Möglichkeit wird ein Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen
in der Affinitäts-Chromatographie verwendet. Wenn ein
Elutionsmittel durch eine Säule geleitet wird, die mit einem Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen
gepackt ist, wird l-A1c in HbA₀ und Glukose abgebaut. Weil
l-A1c durch Bindung des N-Terminus der β-Kette von Hb mit dem reduzierenden
Terminus von Glukose hergestellt ist, wie es in Formel 1 gezeigt ist, ist es extrem
instabil. Aus diesem Grund wandert das Gleichgewicht in die rechte Richtung und
l-A1c wird in HbA₀ abgebaut.
Wie in der Formel 2 gezeigt ist, wird Glycohämoglobin, indem ein Zucker, wie z. B.
Glukose, an Hb gebunden ist, von Nicht-Glycohämoglobin (Hb) durch Affinitätschromatographie
getrennt, im allgemeinen durch Ausnützung der spezifischen
Reaktion der Dihydroxyboronylgruppen, die in eine feste Phase mit einer 1,2-Cis-
Diolgruppe eingeführt ist. Diese Reaktion läuft bei pH 8 oder mehr ab.
Weil das Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen für den Zweck l-A1c in Glukose
und Hb abzubauen, verwendet wird und nicht für die Trennung von Glycohämoglobin
und Nicht-Glycohämoglobin, ist pH 8 oder weniger bevorzugt, insbesondere
ist pH 7 oder weniger bevorzugt.
Bei pH 8 oder mehr wird Glycohämoglobin spezifisch an die Dihydroxyboronylgruppen
gebunden und an das Füllmaterial adsorbiert.
Die isoelektrischen Punkte von Hb und GHb liegen von 6,90 bis 6,95. Wenn Hb
und GHb voneinander durch Ionenaustauscher-Chromatographie unter Verwendung
eines schwach-aziden Kationenaustauscherharzes (mit eingeführten Carboxyalkylgruppen)
getrennt werden, sollte ein Elutionsmittel mit einem geringeren pH als die
individuellen isoelektrischen Punkte von Hb und GHb verwendet werden. Demgemäß
gibt es keine Chance, daß Glycohämoglobin an die Dihydroxyboronylgruppen
gebunden werden kann.
Unter Verwendung des Füllmaterials mit Carboxyalkyl- und Dihydroxyboronylgruppen,
wie es beschrieben worden ist, kann s-A1c abgetrennt und vermessen
werden, ohne Beeinflussung durch l-A1c, das infolge physiologischer Faktoren und
Nahrung variabel ist.
Als Trennsäule kann eine Säule verwendet werden, die mit einem Füllmaterial mit
Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen gepackt ist.
Andererseits wird nach Entfernung von l-A1c auf einer Säule, die mit einem Füllmaterial
mit Dihydroxyboronylgruppen gepackt ist, Hb in seine individuellen Komponenten
auf einer Trennsäule, die mit einem Füllmaterial mit Carboxyalkylgruppen
gepackt ist, getrennt.
Im Gegensatz dazu, kann, nachdem Hb in seine individuellen Komponenten auf
einer Trennsäule, die mit einem Füllmaterial mit Carboxyalkylgruppen gepackt ist,
getrennt ist, l-A1c auf einer Säule, die mit einem Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen
gepackt ist, entfernt werden.
Weiter kann eine Säule verwendet werden, wobei ein Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen
und ein Füllmaterial mit Carboxylalkylgruppen miteinander vermischt
werden und gepackt werden, oder sie werden aufeinanderfolgend in Schichten
gepackt.
Nach dem vorliegenden Verfahren können die Elutionsmittel, die üblicherweise für
Ionenaustauscher-Chromatographie verwendet worden sind, verwendet werden wie
sie sind. Also ist die Prüfung der Elutionsbedingungen nicht speziell erforderlich.
Weil die Entfernung von l-A1c wegen der Vorbehandlung nicht notwendig ist, ist
das analytische Verfahren einfach und die Zeit für die Analyse ist verkürzt, weil
die Vorbehandlung nicht erforderlich ist. Der Abbau und die Degeneration von Hb
und GHb findet nicht statt, ausgenommen von l-A1c.
So kann dem Trennverfahren von Glycohämoglobin unter Verwendung solch einer
Trennsäule gemäß der vorliegenden Erfindung folgend, A1c in stabiler Form (s-A1c)
im Blut schnell analysiert werden, stabil mit guter Reproduzierbarkeit und einfach
ohne Einfluß von A1c in labiler Form (l-A1c), dessen Spiegel abhängig von physiologischen
Faktoren variiert.
Die Beispiele der vorliegenden Erfindung werden nun mit den nachfolgenden
Zeichnungen erklärt.
Als Füllmaterial der vorliegenden Erfindung kann eines verwendet werden, wobei
Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen in ein Partikel eingeführt
werden. Als Trennsäule kann eine Säule verwendet werden, die gleichzeitig mit
einem Füllmaterial, in das Carboxyalkylgruppen eingeführt worden sind und mit
einem Füllmaterial, in das Dihydroxyboronylgruppen eingeführt worden sind, gepackt
ist. Weiterhin kann als Säule eine Säule verwendet werden, die getrennt mit einem
Füllmaterial, in das Carboxyalkylgruppen eingeführt worden sind und mit einem
Füllmaterial, in das Dihydroxyboronylgruppen eingeführt worden sind, gepackt ist.
Als Matrix (Substrat) zum Einführen von Carboxyalkylgruppen und/oder Dihydroxyboronylgruppen
können solche Matrizen verwendet werden, die üblicherweise für
Flüssigchromatographie verwendet worden sind. Jedoch sind solche mit intensiver
mechanischer Stabilität, geringer nicht-spezifischer Proteinabsorption (nicht zu
intensive Hydrophilie) und chemischer Stabilität bevorzugt. Als die solche Erfordernisse
befriedigende Matrix können hydrophile, organische, poröse Substanzen (vernetztes
Polymer) einschließlich Methacrylatgel und Vinylalkoholgel verwendet
werden. Wenn ein Puffer von pH 7 oder weniger als Elutionsmittel verwendet
wird, können anorganische poröse Substanzen, wie z. B. Silicagel, benutzt werden.
Das Verfahren zum Einführen von Dihydroxyboronylgruppen in solche oben beschriebenen
Matrices wird in den folgenden Verfahren veranschaulicht. Solche
Matrices haben mit Epihalohydrin, Bis-Epoxid und ähnlichem reagiert, gefolgt durch
die Reaktion mit meta-Aminophenyl-Boroniger Säure, wodurch die Einführung von
Dihydroxyboronylgruppen in die Matrices erreicht wird. Durch Einführen von
Carboxyalkylgruppen in die Hydroxylgruppe einer Matrix durch bekannte Methoden
und anschließendes Überführen der Carboxyalkylgruppe in das Azid, das dann mit
meta-Aminophenyl-Boroniger Säure reagiert, wird die Einführung von Dihydroxyboronylgruppen
in die Matrix erreicht. Durch Reaktion von Bromcyan mit der
Hydroxylgruppe einer Matrix, gefolgt von der Reaktion mit einem Oligopeptid und
der Reaktion von meta-Aminophenyl-Boroniger Säure in Anwesenheit von Carbodiimid
wird die Einführung von Dihydroxyboronylgruppen in die Matrix erreicht.
Das Verfahren zum Einführen von Carboxyalkylgruppen in die Matrices schließt ein
Verfahren ein, bei dem eine halogenierte Essigsäure einschließlich Monochloressigsäure
und Monobromessigsäure mit der Hydroxylgruppe der Matrices reagiert.
Vorzugsweise beträgt die Menge der einzuführenden Carboxyalkylgruppen 0,1 bis
1 meq (milli-Äquivalent) pro g×Trockengewicht eines Füllmaterials. Vorzugsweise
beträgt die Menge der einzuführenden Dihydroxyboronylgruppe 0,1 bis 1 meq
(milli-Äquivalent) pro g×Trockengewicht eines Füllmaterials.
Die Menge der Dihydroxyboronylgruppen kann gemessen und bestimmt werden, z. B.,
durch Alkalititration unter der Bedingung, daß ein Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen
und Sorbitol in einer wäßrigen Lösung anwesend sein können
[Japanese Chemical Society "New Experimental Chemistry Series (Shin-Jikken
Kagaku Koza) (Analytical Chemistry I)", (1976), Maruzen, Seite 77]. Die Menge
von Borsäure, die durch Wasserstoffperoxidbehandlung eines Füllmaterials mit
Dihydroxyboronylgruppen frei wird, kann durch die oben beschriebene Titration
bestimmt werden. Die Menge an Borsäure kann durch Atomabsorptions- und
Emissions-Spektral-Analyse bestimmt werden. Die Menge der Carboxyalkylgruppen
kann durch ein üblicherweise bekanntes und allgemein verwendetes Verfahren der
Messung der Austauschkapazität der Carboxylgruppe bestimmt werden.
Als Füllmittel mit Carboxyalkylgruppen können verschiedene Füllmaterialien
verwendet werden, einschließlich solche, die Carboxymethylgruppen, Carboxyethylgruppen
oder ähnliches haben. Insbesondere kann ein Füllmaterial mit Carboxymethylgruppen
verwendet werden kann.
Die Form des gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Füllmaterials
schließt verschiedene Formen ein, z. B. kugelförmige Formen und gequetschte
Formen, aber kugelförmige sind mehr bevorzugt, um eine höhere Temperatur zu
erreichen. Der Partikel-Durchmesser ist 1 bis 200 µm, bevorzugt 1 bis 20 µm, und
insbesondere bevorzugt 1 bis 10 µm.
Die Säule der vorliegenden Erfindung hat wunschgemäß eine zylindrische Form mit
einem Innen-Durchmesser von 1 bis 10 mm und eine Länge von 20 cm oder
weniger, vorzugsweise eine zylindrische Form mit einem Innendurchmesser von 1
bis 6 mm und eine Länge von 1 bis 10 cm.
Als Verfahren zum Packen eines Füllmaterials in eine Säule kann jedes üblicherweise
bekannte Verfahren verwendet werden, solange es das Packen in einheitlichem
Zustand gewährleistet und die Füll-Rate kontrolliert werden kann. Die Füll-
Rate kann durch die Kontrolle des Drucks und der Packungs-Zeit reguliert werden.
Das Elutionsmittel kann ein Elutionsmittel sein, das gewöhnlich für die Analyse
von Glycohämoglobin bei der Flüssig-Chromatographie verwendet wird, vorausgesetzt,
daß das Elutionsmittel ein Puffer mit pH 5,0 bis 7,0 ist. Dort werden z. B.
Puffer einschließlich Natriumacetat, Natriumphosphat, Kaliumphosphat o. ä. oder
Lösungen, die Salze wie Natriumchlorid, Natriumsulfat o. ä. enthalten, verwendet.
Harnstoff und Guanidin können ebenso hinzugesetzt werden. Organische Lösungsmittel,
wie Acetonitril, Ethanol, Methanol, Mercaptoethanol o. ä. können hinzugemischt
werden.
Die Konzentration und der pH einer Elutionsmittel-Zusammensetzung einschließlich
Puffer, Salze, Harnstoff, organische Lösungsmittel o. ä. sind nicht notwendigerweise
konstant für die Analyse von Hämoglobin, Glycohämoglobin und Hämoglobin-
Derivaten. Sie können einem Wechsel unterworfen werden, z. B. durch das kontinuierliche
Gradienten-Verfahren oder das schrittweise Gradienten-Verfahren. Der
Fluß eines zu übertragenden Elutionsmittels fließt nicht notwendigerweise konstant
und kann kontinuierlich oder in schrittweiser Art gemäß dem Zeitverlauf modifiziert
werden.
Glycohämoglobin, Hämoglobin und Hämoglobin-Derivate, die von dem Eluat mittels
der Trennsäule der vorliegenden Erfindung getrennt werden, können basierend auf
der Messung von sichtbarem Licht bei einer Wellenlänge von 415 nm detektiert
werden. Wenn der pH und die Konzentration eines Elutionsmittels einem Wechsel
unterworfen werden, induziert der Wechsel des Brechungsindexes eine Absorption.
Deshalb kann sichtbares Licht bei einer Wellenlänge von 690 nm, bei dem die
Absorption von Glycohämoglobin, Hämoglobin u. ä. nicht stattfindet, für die
Referenz-Messung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen erklärt.
Dort wurde ein Füllmaterial verwendet, wobei Carboxymethylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen
als funktionelle Gruppen in ein Methacrylatpolymer als Matrix
eingeführt wurden.
Tabelle 1 zeigt die Meßergebnisse der physikalischen Werte und des Druckverlustes
des Füllmaterials in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1. Das Füllmaterial
von Beispiel 1 ist hergestellt durch Einführen von Dihydroxyboronylgruppen in das
Füllmaterial mit Carboxymethylgruppen von Vergleichsbeispiel 1. Beispiel 1 ist
nahezu gleich zu Vergleichsbeispiel 1 bezüglich Partikel-Durchmesser, spezifischer
Oberfläche und der Menge an Carboxymethylgruppen. Sogar, wenn Dihydroxyboronylgruppen
eingeführt worden sind, ändern sich der Partikel-Durchmesser, die
spezifische Oberfläche und die Menge an Carboxymethylgruppen nicht sehr viel.
Diese zwei Füllmaterialien werden getrennt in eine Säule aus rostfreiem Stahl mit
einem Innen-Durchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 80 mm als Trennsäule
gepackt. Das Packen wurde nach der Aufschlämmungsmethode durchgeführt. 80 mM
Kaliumphosphat mit einem pH 6,2 wurde als Aufschlämmungs-Lösungsmittel
und Pack-Lösungsmittel verwendet. Das Pack-Lösungsmittel wurde bei einem Pack-
Druck von 150 kg/cm² für eine Stunde eluiert.
Als eine Probe wurde frisch gesammeltes Blut von gesunden Erwachsenen, nach
Zugabe von Natriumethylendiamintetraacetat als Anti-Koagulanz, verwendet. Ein
käuflich erhältliches hämolytisches Agenz wurde zu dem frischen Blut für eine 200fache
Verdünnung hinzugegeben und die erhaltene hämolytische Lösung wurde als
Probe verwendet.
Als Elutionsmittel wurden Monokaliumphosphat (KH₂PO₄) und Dikaliumphosphat
(K₂HPO₄) verwendet, nachdem sie vorbereitend in deionisiertem Wasser gelöst
worden waren, so daß sie auf ihre Konzentrationen wie folgt eingestellt worden
sind.
A Lösung:
33 mM KH₂PO₄
7 mM K₂HPO₄
pH 6,2
33 mM KH₂PO₄
7 mM K₂HPO₄
pH 6,2
B Lösung:
66 mM KH₂PO₄
14 mM K₂HPO₄
pH 6,2
66 mM KH₂PO₄
14 mM K₂HPO₄
pH 6,2
C Lösung:
160 mM KH₂PO₄
40 mM K₂HPO₄
pH 6,1
160 mM KH₂PO₄
40 mM K₂HPO₄
pH 6,1
Als experimentelle Systeme wurden individuell eine intelligente Pumpe von Hitachi
vom Typ L-6200, eine Einspritz-Vorrichtung mit 10 µl Kapazität, ein Detektor von
Hitachi vom Typ L-4200 UV-VIS, ein Datenprozessor von Hitachi vom Typ D-2500
verwendet.
Die Detektion wurde durchgeführt bei einer Säulentemperatur von 25°C und einer
Nachweiswellenlänge von 415 nm. Die Trennung von individuellen Komponenten
war gemäß der schrittweisen Gradienten-Methode, wie im folgenden gezeigt wird:
Erste Lösung:
A Lösung 0-0,4 min
A Lösung 0-0,4 min
Zweite Lösung:
A Lösung/B Lösung=50/50 0,5-3,0 min
A Lösung/B Lösung=50/50 0,5-3,0 min
Dritte Lösung:
C Lösung 3,1-3,8 min
C Lösung 3,1-3,8 min
Vierte Lösung:
A Lösung 3,9-7,0 min
A Lösung 3,9-7,0 min
Fluß des Eltionsmittels: 1,2 ml/min
Injektions-Volumen der Probe: 10 µl
Injektions-Volumen der Probe: 10 µl
Unter den hier oben beschriebenen analytischen Bedingungen sind in Fig. 1 bzw.
2 das Chromatogramm, das auf der Trennsäule von Beispiel 1 erhalten worden ist,
und das Chromatogramm, das auf der Trennsäule von Vergleichsbeispiel 1 erhalten
worden ist, gezeigt.
In den Fig. 1 und 2 stellt Peak 1 A1a; Peak 2 A1b; Peak 3 HbF; Peak 4 A1c in
stabiler Form (s-A1c); Peak 5 HbAc; Peak 6 A1c in labiler Form (l-A1c) dar.
Die individuellen Peaks wurden wie folgt identifiziert: Verschiedene Typen von
Glycohämoglobin können durch Inkubation von Blut mit Zuckerderivaten erzeugt
werden und die Bestätigung der dann verstärkten Peaks erlaubt die Identifizierung
der individuellen Peaks.
Peak 1 (A1c) wurde durch Hinzufügen von Fructose-1,6-Diphosphat und Glukose-6-
Phosphat identifiziert, während Peak 2 (A1a) durch Hinzufügen von Brenztraubensäure
identifiziert wurde. Es wird angenommen, daß Peak 6 l-A1c ist, weil Peak
6 deutlich verstärkt war, wenn eine Probe hergestellt und vermessen worden ist,
nachdem Glukose zum Blut für die Inkubation hinzugefügt worden ist und weil
sich Peak 6 verkleinerte, wenn eine Probe hergestellt und vermessen worden ist,
nachdem Glukose zu dem Blut für die Inkubation hinzugefügt worden ist und das
Blut dann in physiologischer Salzlösung bei 45°C für 4 Stunden inkubiert worden
war. Andererseits kann Peak 4 als s-A1c betrachtet werden, weil Peak 4 sich nicht
vergrößerte oder verkleinerte, sogar nach Hinzufügen von Glukose oder der
Inkubation in physiologischer Salzlösung. Es wird angenommen, daß Peak 3 HbF
ist, weil dieser Peak das gleiche Erscheinungsbild zeigte, wie das der Hauptkomponenten
von Nabelblut.
Im Fall von Vergleichsbeispiel 1 in Fig. 2, taucht Peak 6, der l-A1c darstellt, auf.
Im Gegensatz dazu, ist, im Fall der Verwendung der Trennsäule von Beispiel 1,
l-A1c komplett entfernt, wie in Fig. 1 zu sehen ist. Die Retentionszeiten der
individuellen Komponenten, d. h. A1a, A1b, HbF, s-A1c und HbA₀ sind nahezu
gleich auf den Trennsäulen von Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1. Die Druckverluste
der Säulen bei einem Elutionsmittel-Fluß von 0,2 ml/min waren fast gleich,
nämlich 98 kg/cm² in Beispiel 1 und 95 kg/cm² in Vergleichsbeispiel 1.
Gemäß dem vorliegenden Beispiel kann die Entfernung (Abbau) von Hb und die
Trennung davon in die individuellen Komponenten gleichzeitig ausgeführt werden,
wie es oben beschrieben worden ist, so daß es möglich ist, die Behandlungszeit
zum Entfernen von l-A1c zu verkürzen, welche eine Zeit von 15 min bis 4 Stunden
nach Stand der Technik betrug. Weil l-A1c kontinuierlich innerhalb des Systems
entfernt werden kann, sind solche komplexen Verfahren, wie sie üblicherweise
ausgeführt worden sind, nicht mehr erforderlich. Weil die für den Abbau von l-A1c
benötigte Zeit kurz ist, kann ein genau gemessener Wert von s-A1c erreicht
werden, ohne die Degeneration oder den Abbau von GHb und Hb, die im
Verfahren zur Entfernung von l-A1c enthalten sind.
Gemäß dem vorliegenden Beispiel wird in Fig. 1 von Beispiel 1 beobachtet, daß
die individuellen Hb-Komponenten ganz auf der Trennsäule von Beispiel 1 getrennt
werden. Folglich kann die analytische Zeit weiter verkürzt werden durch die
Verwendung einer kürzeren Säule und die Vergrößerung des Elutionsmittel-Volumens.
Betreffend Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2 zeigt Tabelle 2 die physikalischen
Werte und den Druckverlust der Füllmaterialien. Die Trennsäulen von Beispiel 2
und Vergleichsbeispiel 2 werden hergestellt durch Packen der Füllmaterialien von
Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 in kürzere Säulen (Durchmesser: 4,6×35 mm).
Das Pack-Verfahren war dasselbe wie in Beispiel 1.
Unter Verwendung der Trennsäulen von Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2 wurden
Glycohämoglobin und Hämoglobin gemessen. Das gleiche System wie in Beispiel 1
wurde verwendet. Die gleiche Probe wie in Beispiel 1 wurde nochmals verwendet.
Die Trennung der individuellen Komponenten war gemäß des schrittweisen
Gradienten-Verfahrens wie hier nachfolgend gezeigt. Die Zusammensetzungen der
Eluentionsmittel-Lösungen A, B und C sind dieselben wie in Beispiel 1, aber das
Gradienten-Programm und der Fluß der Elutionsmittel sind verschieden von denen
in Beispiel 1.
Erste Lösung:
A Lösung 0-0,2 min
A Lösung 0-0,2 min
Zweite Lösung:
B Lösung 0,3-1,5 min
B Lösung 0,3-1,5 min
Dritte Lösung:
C Lösung 1,6-1,9 min
C Lösung 1,6-1,9 min
Vierte Lösung:
A Lösung 2,0-3,5 min
A Lösung 2,0-3,5 min
Fluß des Elutionsmittels: 1,4 ml/min
Unter den hier oben beschriebenen analytischen Bedingungen sind das auf der
Trennsäule von Beispiel 2 erhaltene Chromatogramm und das auf der Trennsäule
von Vergleichsbeispiel 2 erhaltene Chromatogramm in den Fig. 3 bzw. 4 gezeigt.
Die Druckverluste der Säulen bei einem Elutionsmittel-Fluß von 1,4 ml/min, in
Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2, waren 48 kg/cm² bzw. 47 kg/cm².
In Fig. 3 stellt Peak 1 A1a; Peak 2 A1b; Peak 3 HbF; Peak 4 s-A1c; Peak 5
HbA₀ dar. In Fig. 4 stellt Peak 1 A1a; Peak 2 A1b; Peak 3 HbF; Peak 7 {(l-A1c)
+(s-A1c)}; Peak 5 HbA₀ dar.
In den Fig. 3 und 4 sind die Retentionszeiten der individuellen Komponenten
nahezu gleich. Die Retentionszeit von Peak 4 (s-A1c) in Fig. 3 ist gleich zu der
Retentionszeit von Peak 7 {(l-A1c)+(s-A1c)}. Die Peak-Fläche von Peak 7 ist
ungefähr 10% größer als die Peak-Fläche von Peak 4. Die Retentionszeit von Peak
7 in Fig. 4 ist identisch mit der Retentionszeit von Peak 4 in Fig. 3. Jedoch wird
angenommen, weil Peak 7 l-A1c enthält, daß die Peak-Fläche für diesen Teil
größer ist.
Die Chromatogramme von 60 Proben wurden durch die Verfahren von Beispiel 2
und Vergleichsbeispiel 2 analysiert. Die Fläche von Peak 4 (s-A1c) wurde mit der
Fläche von Peak 7 {(l-A1c)+(s-A1c)} verglichen. Die Fläche von Peak 7 war im
Mittel 6,8% größer (Bereich zwischen 3 und 12%) als die von Peak 4. Der Wert
von Glycohämoglobin bei Hunger wurde gemessen und es ist erwägt worden, daß
der Anteil von l-A1c sofort nach der Mahlzeit größer wird.
In Beispiel 2 (Fig. 3) wird l-A1c innerhalb der Trennsäule abgebaut, so daß 5
Komponenten von A1a, A1b, HbF, s-A1c und HbA₀ in nur 3,5 Minuten voneinander
getrennt werden können. So kann s-A1c gemessen werden. Im Fall, daß l-A1c
und s-A1c, wie in Vergleichsbeispiel 1 (Fig. 2), voneinander durch Chromatographie
getrennt worden sind, sollte notwendigerweise eine längere Säule verwendet werden,
verglichen mit der Säule von Beispiel 2, falls identische Füllmaterialien verwendet
werden, was in einer längeren Analysezeit für diesen Teil resultiert. Wie es in Fig. 2
erscheint, ist die für die Messung einer Probe erforderliche Zeit sieben Minuten,
was die einfache Zeit von Beispiel 2 (Fig. 3) bedeutet.
Gemäß dem vorliegenden Beispiel, wie es oben beschrieben worden ist, kann s-A1c
in einer kürzeren Zeit gemessen werden, verglichen mit der chromatographischen
Methode zur Trennung von s-A1c von l-A1c. Weil die Menge von zu packenden
Füllmaterialien geringer ist, wenn die Länge der Säulen kürzer wird, kosten die
Säulen weniger. Weiterhin wird die Menge eines zu verwendenden Elutionsmittels
geringer, was eine Verringerung der laufenden Kosten bedeutet.
Es wurde ein Vergleich zwischen den gemessenen Werten von Beispiel 2 und den
gemessenen Werten von Vergleichsbeispiel 1 durchgeführt.
Als Proben wurde Anti-Koagulenz-enthaltendes frisches Blut von gesunden Erwachsenen
oder von diabetischen Patienten, welches vorläufig mit einem hämolytischen
Agenz verdünnt worden war, verwendet. Die Ergebnisse von 60 vermessenen
Proben sind in Fig. 5 gezeigt. Die Abszisse der Figur stellt die s-A1c-Konzentration
(in %), gemessen durch das Verfahren von Beispiel 2, dar, während die Ordinate
s-A1c, gemessen nach der Methode von Vergleichsbeispiel 1, darstellt.
Der Korrelations-Koeffizient, γ, zwischen dem Verfahren von Beispiel 2 und dem
von Vergleichsbeispiel 1, war 0,992. Die Korrelations-Formel wird durch Y=
1,03X-0,31 dargestellt, wobei die durch das Verfahren von Beispiel 2 erhaltene
s-A1c-Konzentration durch X dargestellt ist und die durch das Verfahren von
Vergleichsbeispiel 1 erhaltene s-A1c-Konzentration durch Y dargestellt ist. So wurde
eine extrem gute Korrelation zwischen den beiden Verfahren erhalten.
Wie es oben beschrieben ist, kann das Verfahren von Beispiel 2 als ein Verfahren
betrachtet werden, das in der Lage ist, A1c in stabiler Form (s-A1c) in Blut schnell
und mit guter Reproduzierbarkeit zu analysieren.
Fig. 6 stellt ein Beispiel für ein Trennsystem für Glycohämoglobin in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung dar.
Als Proben wurde frisch gesammeltes Blut, nach Zusatz von Natriumethylendiamintetraacetat
als Anti-Koagulanz, verwendet. Das Blut wurde 200fach mit einem
käuflich erhältlichen hämolytischen Agenz verdünnt und das verdünnte Blut wurde
auf einen Probentisch 19 einer selbstabtastenden Einrichtung 20 gestellt.
Als Trennsäule 23 wurde die gleiche verwendet wie sie im Vergleichsbeispiel 2
verwendet wurde. Die Säule hatte einen Innen-Durchmesser von 4,6 mm und eine
Länge von 35 mm. Als Füllmaterial wurde eines verwendet, bei dem Carboxymethylgruppen
in ein Methacrylatgel mit einem Partikel-Durchmesser von 4,5 µm
eingeführt worden waren. In einer Vorbehandlungssäule 22, die eine Säule zum
Entfernen von l-A1c darstellt, wurde ein Füllmaterial mit einem Partikel-Durchmesser
von 8 µm verwendet, wobei Dihydroxyboronylgruppen in ein Methacrylatgel
eingeführt worden waren. Die Vorbehandlungssäule hatte einen Innen-Durchmesser
von 4,6 mm und eine Länge von 10 mm. Im Fall, daß die Säule, die in Beispiel
2 verwendet wurde und bei der Carboxymethylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen
in ein Methacrylatgel eingeführt wurden und bei der die Partikelgröße 4,5 µm ist,
verwendet werden soll, wird die Entfernung von l-A1c und die Trennung von Hb
in seine individuellen Komponenten in einer einzigen Säule ausgeführt, so daß die
Vorbehandlungssäule 22 nicht notwendig ist. Die Temperatur des Säulen-Thermostates
24 war auf 30°C voreingestellt. Als Elutionsmittel wurden eine erste Lösung
8, eine zweite Lösung 9 und eine dritte Lösung 10 verwendet, wie es in Beispiel
2 gezeigt ist.
In Fig. 6 stellt der durchgezogene Pfeil den Fluß von flüssigen Proben oder
Elutionsmittel dar, während der gestrichelte Pfeil den Fluß von Signalen darstellt.
Die Trennung von individuellen Komponenten wurde im schrittweisen Gradienten-
Verfahren wie folgend ausgeführt:
Erste Lösung:
A-Lösung 0-0,2 min
A-Lösung 0-0,2 min
Zweite Lösung:
B-Lösung 0,3-1,5 min
B-Lösung 0,3-1,5 min
Dritte Lösung:
C-Lösung 1,6-1,9 min
C-Lösung 1,6-1,9 min
Vierte Lösung:
A-Lösung 2,0-3,5 min
A-Lösung 2,0-3,5 min
Fluß des Elutionsmittels: 1,4 ml/min.
Die auf den Probentisch 19 gestellte Probe wird über den Ansaugstutzen 18 und
die Probenübertragungsleitung 27 in die Probenschleife 16 mittels einer Spritze 14
übertragen und wird dann gemessen. Die Waschlösung 11 wird über einen Drei-
Wege-Hahn 15 zugeführt. Durch Umlegen des Sechs-Wege-Hahns 17 wird die in
der Probenschleife 16 gemessene Probe durch einen Filter 21 geführt und in die
Vorbehandlungssäule 22 überführt und wird dann kontinuierlich in die Trennsäule
23 übergeleitet.
Nach Durchgang durch eine elektrische Drei-Wege-Pumpe 12 mittels einer Übertragungspumpe
13 und nach Übertragen über einen Filter 21 in die Vorbehandlungssäule
22 werden die Elutionsmittel Erste Lösung 8, Zweite Lösung 9, Dritte
Lösung 10 in die Trennsäule 23 eingeleitet. Durch ein UV-VIS-Detektor 25 wird
die Absorption des Eluats von der Trennsäule 23 bei einer Wellenlänge von 415 nm
gemessen; die Absorption bei einer Wellenlänge von 690 nm wurde als Referenz
gemessen.
Unter den Gradienten-Bedingungen kann das in Fig. 3 gezeigte Chromatogramm
erhalten werden. Es kann, wie in Fig. 3 gezeigt, Hämoglobin in A1a, A1b, HbF, s-
A1c und HbA₀ bei einem Zyklus von nur 3,5 Minuten getrennt werden. Das
Verhältnis von s-A1c (in Prozent) zu Gesamt-Hb wurde basierend auf den Chromatogrammen
mittels eines Daten-Prozessors 26 (Datenprozessierungseinheit) bestimmt.
Weil die Entfernung von l-A1c kontinuierlich innerhalb des Systems gemäß der
vorliegenden Erfindung ausgeführt werden kann, kann eine Automatisierung eines
solchen Prozesses leicht erreicht werden. Wenn l-A1c automatisch entfernt werden
kann, ist die Meß-Genauigkeit gut. Mit anderen Worten: die Reproduzierbarkeit
der gemessenen Werte ist gut. Weiterhin ist das Verfahren einfach.
Die Hauptsystemkonstruktion der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 7
abgebildet, während ein Ausführungsbeispiel der Systemkonstruktion der Vorrichtung
von Vergleichsbeispiel 3 in Fig. 8 abgebildet ist. Wie in Fig. 8 abgebildet
ist, wird die auf den Probentisch 19 der selbstabtastenden Einrichtung vorgegebene
Probe durch die Probenüberführungsleitung 27 in der Probenschleife 16 vermessen
und die Probe wird in den l-A1c-entfernenden Teil 28 durch Umlegen des Sechs-
Wege-Hahnes 17 eingeführt. Das l-A1c im Blut wird entfernt oder reduziert bei
dem l-A1c-entfernenden Teil 28 durch Hitzebehandlung oder ähnliches. Die Probe,
aus der l-A1c entfernt wird, wird in die Trennsäule 23 eingeführt. Andererseits
werden die Elutionsmittel 8 und 9 über den elektromagnetischen Drei-Wege-Hahn
12 in die Trennsäule 23 mittels einer Überführungspumpe 13 eingeleitet. Das Eluat
von der Trennsäule 23 wird durch einen UV-VIS-Detektor 25 detektiert. Wie oben
beschrieben worden ist, ist das in die Trennsäule von Vergleichsbeispiel 3 gepackte
Füllmaterial ein Ionenaustauscherharz, wobei Carboxylgruppen, in z. B. Silikagel
und Methacrylatgel, eingeführt sind. Somit hat es keine Kapazität zur Entfernung
von l-A1c, so daß ein Teil zum Entfernen von l-A1c vor dem Injektionsteil der
Säule plaziert werden sollte. Im Gegenteil hat die Trennsäule der vorliegenden
Erfindung die folgenden zwei Wirkungen, d. h. die Trennung von Hämoglobin und
Glycohämoglobin und das Entfernen von l-A1c. Wie in Fig. 7 gezeigt, ist das
Positionieren eines l-A1c-entfernenden Mechanismus nicht erforderlich. Also ist die
Vorrichtung der vorliegenden Erfindung einfacher in seiner System-Konstruktion und
kann mit kleineren Abmessungen entworfen werden.
Als Trennsäule 23 ist eine der drei nachfolgend beschriebenen Typen eingebaut,
nämlich 1. eine Trennsäule, die mit einem Füllmaterial gepackt ist, das aus einer
anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkyl- und Dihydroxyboronylgruppen
besteht; 2. eine Trennsäule, die mit einem Füllmaterial gepackt ist,
das durch Mischen eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder
organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen, und eines Füllmaterials,
bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen,
hergestellt ist; und 3. eine Trennsäule, wobei ein Füllmaterial,
bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen
und ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder
organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, getrennt in zwei
Schichten in Fließrichtung der Elutionsmittel gepackt werden. Die Füllmaterialien
innerhalb der Trennsäule sind spezifiziert, so daß die spezifische Oberfläche 5 bis
200 m²/g in trockenem Zustand ist, so daß die Menge der Carboxyalkylgruppen 0,1
bis 1 meq pro g×Trockengewicht ist, und so daß die Menge der Dihydroxyboronylgruppen
0,1 bis 1 meq pro g×Trockengewicht ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Entfernung von l-A1c und die Trennung
von Hb in seine individuellen Komponenten auf einer identischen Trennsäule
ausgeführt werden oder kontinuierlich innerhalb des Systems, so daß der für den
Abbau von l-A1c erforderliche Zeitraum, der üblicherweise eine lange Zeit, d. h.
15 Minuten bis vier Stunden erforderte, abgekürzt werden kann.
Weil das komplexe Verfahren der Entfernung von l-A1c nicht notwendigerweise
ausgeführt werden muß, kann das Verfahren auch extrem vereinfacht werden.
Weil der Abbau von l-A1c nicht die Degeneration von GHb und Hb umfaßt, kann
ein genau gemessener Wert von s-A1c ebenso erhalten werden.
Weil l-A1c kontinuierlich innerhalb des Systems entfernt werden kann, kann eine
Automatisierung des Verfahrens einfach realisiert werden, wobei die Präzision in
der Messung und die Reproduzierbarkeit der gemessenen Ergebnisse verbessert
werden kann.
Claims (8)
1. Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form von
verdünnten Blutproben durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie
mittels gleichzeitigen Ausführens eines Verfahrens der Trennung von
Glycohämoglobin, Hämoglobin und Hämoglobinderivaten von der
Blutprobe und eines Verfahrens des Abbaus von Glycohämoglobin in
labiler Form von der Blutprobe, das umfaßt:
- - Injizieren der verdünnten Blutprobe in eine Trennsäule, wobei
die Trennsäule gepackt ist,
- (a) mit einem Füllmaterial, das aus einer anorganischen oder organischen pörosen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen besteht, oder
- (b) mit einem Füllmaterial (b1), das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen besteht, und einem Füllmaterial (b2), das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen besteht,
- - Durchleiten von Elutionsmitteln durch die Trennsäule, und
- - Detektieren der Lichtabsorption des Eluats von der Trennsäule, wobei das Glycohämoglobin in stabiler Form gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zwei Füllmaterialien (b1) und
(b2) vermischt oder getrennt in zwei Schichten in Fließrichtung der
Elutionsmittel in die Trennsäule gepackt sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zwei Füllmaterialien (b1) und
(b2) getrennt je in eine Trennsäule gepackt sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Elutionsmittel
Puffer mit pH 5 bis 6 sind.
5. Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form von
verdünnten Blutproben nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
die umfaßt:
- - eine Trennsäule, wobei die Trennsäule gepackt ist
- (a) mit einem Füllmaterial, das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen besteht, oder
- (b) mit einem Füllmaterial (b1), das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen besteht, und einem Füllmaterial (b2), das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen besteht,
- - eine Einrichtung zum Injizieren der verdünnten Blutprobe in die Trennsäule,
- - eine Einrichtung zum Durchleiten von Elutionsmitteln durch die Trennsäule, und
- - eine Einrichtung zum Detektieren der Lichtabsorption des Eluats von der Trennsäule.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Füllmaterialien (b1) und
(b2) vermischt oder getrennt in zwei Schichten in Fließrichtung der
Elutionsmittel vorliegen.
7. Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Füllmaterialien (b1) und
(b2) getrennt je in einer Trennsäule vorliegen.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei jedes Füllmaterial
eine spezifische Oberfläche von 5 bis 200 m²/g besitzt, die
Menge der Carboxyalkylgruppen pro g × Trockengewicht des Füllmaterials
0,1 bis 1 meq beträgt und die Menge der Dihydroxyboronylgrupen
pro g × Trockengewicht des Füllmaterials 0,1 bis 1 meq
beträgt.
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