JPH071275B2 - 糖化ヘモグロビン測定用溶血試液 - Google Patents
糖化ヘモグロビン測定用溶血試液Info
- Publication number
- JPH071275B2 JPH071275B2 JP30378287A JP30378287A JPH071275B2 JP H071275 B2 JPH071275 B2 JP H071275B2 JP 30378287 A JP30378287 A JP 30378287A JP 30378287 A JP30378287 A JP 30378287A JP H071275 B2 JPH071275 B2 JP H071275B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hba
- hemolytic
- blood
- reagent
- hemoglobin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液中の糖化ヘモグロビン（ヘモグロビン
A1）、特にヘモグロビンA1cの測定において用いられる
糖化ヘモグロビン測定用溶血試液に関する。
A1）、特にヘモグロビンA1cの測定において用いられる
糖化ヘモグロビン測定用溶血試液に関する。
（従来の技術） 糖尿病の指標のひとつとして血液中の糖化ヘモグロビン
（ヘモグロビンA1）、特にヘモグロビンA1cが知られ、
その測定が行われている。血液中のヘモグロビンA1を測
定するときには、該ヘモグロビンA1は赤血球中に存在す
るため、通常、血液をあらかじめ溶血剤で溶血させたも
のを試料として、その測定が行われている。ヘモグロビ
ンA1cは、下記式に示されるように、ヘモグロビン（以
下、ヘモグロビンをHbで示す）のβ鎖Ｎ末端に存在する
バリンのアミノ基にグルコース１分子が非酵素的に結合
した複合体である。Hbの上記アミノ基にグルコースが結
合すると、まず、下記式に示すようなシッフ塩基である
不安定型ヘモグロビンA1c（Ｉ）が形成される 上記式（１）において、β−Ａ−NH2はHbを示し、その
なかのNH2は、該Hbのβ鎖Ｎ末端のバリンのアミノ基を
示す。
（ヘモグロビンA1）、特にヘモグロビンA1cが知られ、
その測定が行われている。血液中のヘモグロビンA1を測
定するときには、該ヘモグロビンA1は赤血球中に存在す
るため、通常、血液をあらかじめ溶血剤で溶血させたも
のを試料として、その測定が行われている。ヘモグロビ
ンA1cは、下記式に示されるように、ヘモグロビン（以
下、ヘモグロビンをHbで示す）のβ鎖Ｎ末端に存在する
バリンのアミノ基にグルコース１分子が非酵素的に結合
した複合体である。Hbの上記アミノ基にグルコースが結
合すると、まず、下記式に示すようなシッフ塩基である
不安定型ヘモグロビンA1c（Ｉ）が形成される 上記式（１）において、β−Ａ−NH2はHbを示し、その
なかのNH2は、該Hbのβ鎖Ｎ末端のバリンのアミノ基を
示す。
この不安定型HbA1c（Ｉ）の生成反応は可逆反応であ
り、グルコース濃度に応じて平衡が不安定型HbA1c
（Ｉ）の生成方向もしくは解離方向に傾く。（Ｉ）は、
さらにアマドリ転位を経て、不可逆的に安定型HbA1c（I
I）に変化する。
り、グルコース濃度に応じて平衡が不安定型HbA1c
（Ｉ）の生成方向もしくは解離方向に傾く。（Ｉ）は、
さらにアマドリ転位を経て、不可逆的に安定型HbA1c（I
I）に変化する。
HbA1cは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによりH
bを各Hb成分に分離し、そのODを測定することにより定
量され得るが、上記安定型HbA1c（Ｓ−HbA1c）および不
安定型HbA1c（Ｌ−HbA1c）を分離して測定することがで
きない。そのためHbA1cを安定した値で得られない。な
ぜなら、Ｌ−HbA1cは、グルコース（つまり血糖）量に
より、その量が変化し、該血糖値は、食事や運動により
急激かつ大幅に変化するためである。
bを各Hb成分に分離し、そのODを測定することにより定
量され得るが、上記安定型HbA1c（Ｓ−HbA1c）および不
安定型HbA1c（Ｌ−HbA1c）を分離して測定することがで
きない。そのためHbA1cを安定した値で得られない。な
ぜなら、Ｌ−HbA1cは、グルコース（つまり血糖）量に
より、その量が変化し、該血糖値は、食事や運動により
急激かつ大幅に変化するためである。
上記欠点を解消するため、血液検体からＬ−HbA1cを除
去し、Ｓ−HbA1cのみを測定する試みがなされている。
例えば、David M.Nathanら、Clinical Chemistry,28512
〜515（1982）には、セミカルバジドおよびアニリンを
Ｌ−HbA1cの除去剤として用い、pH5.0,38℃にて30分間
血液検体を処理することが開示されている。セミカルバ
ジドは、グルコースを捕捉し、かつ求核試薬として作用
し、Hbのアミノ基と競合する。アニリンは触媒として作
用する。その結果、Ｌ−HbA1cは実質的に除去される。
しかし、Ｌ−HbA1cの除去反応が酸性側（pH 5.0）に
て、かつ比較的高温（38℃）および長時間（30分）でな
されるため、Hbの変性（例えば脱ヘム）が生じる。例え
ば、イオン交換クロマトグラフィーによる溶出パターン
を観察すると、脱ヘムによる退色に起因するピーク強度
の低下やHbA1aとHbA1bとに起因するピークの増大が観察
される。
去し、Ｓ−HbA1cのみを測定する試みがなされている。
例えば、David M.Nathanら、Clinical Chemistry,28512
〜515（1982）には、セミカルバジドおよびアニリンを
Ｌ−HbA1cの除去剤として用い、pH5.0,38℃にて30分間
血液検体を処理することが開示されている。セミカルバ
ジドは、グルコースを捕捉し、かつ求核試薬として作用
し、Hbのアミノ基と競合する。アニリンは触媒として作
用する。その結果、Ｌ−HbA1cは実質的に除去される。
しかし、Ｌ−HbA1cの除去反応が酸性側（pH 5.0）に
て、かつ比較的高温（38℃）および長時間（30分）でな
されるため、Hbの変性（例えば脱ヘム）が生じる。例え
ば、イオン交換クロマトグラフィーによる溶出パターン
を観察すると、脱ヘムによる退色に起因するピーク強度
の低下やHbA1aとHbA1bとに起因するピークの増大が観察
される。
特開昭58−210024号公報には、ジヒドロキシボリル化合
物（ホウ酸化合物）がＬ−HbA1cの除去剤として界磁さ
れている。このジヒドロキシボリル化合物はグルコース
のOH基をエステル化するためグルコースが系内から除去
され、その結果、Ｌ−HbA1cの解離が進行する。しか
し、Ｌ−HbA1cを除去するためには、高濃度のジヒドロ
キシボリル化合物を必要とする。例えば、溶血させた血
液を含む試料液中で約0.1〜1.0Mの割合で含有されるこ
とが必要である。このように高濃度のジヒドロキシボリ
ル化合物が含有されると、イオン交換クロマトグラフィ
ーにかける場合にそのイオン強度が通常の場合とは異な
り、その結果、分離条件が変わり、測定が困難となった
り測定条件の補正が必要となる。さらに、最適pHが約4.
5〜6.5、好ましくは5.0〜6.0であるため、Hbの変性が生
じるおそれがある。
物（ホウ酸化合物）がＬ−HbA1cの除去剤として界磁さ
れている。このジヒドロキシボリル化合物はグルコース
のOH基をエステル化するためグルコースが系内から除去
され、その結果、Ｌ−HbA1cの解離が進行する。しか
し、Ｌ−HbA1cを除去するためには、高濃度のジヒドロ
キシボリル化合物を必要とする。例えば、溶血させた血
液を含む試料液中で約0.1〜1.0Mの割合で含有されるこ
とが必要である。このように高濃度のジヒドロキシボリ
ル化合物が含有されると、イオン交換クロマトグラフィ
ーにかける場合にそのイオン強度が通常の場合とは異な
り、その結果、分離条件が変わり、測定が困難となった
り測定条件の補正が必要となる。さらに、最適pHが約4.
5〜6.5、好ましくは5.0〜6.0であるため、Hbの変性が生
じるおそれがある。
Ｌ−HbA1cのその他の除去方法としては、血液検体を希
釈してグルコース濃度を下げ、Ｌ−HbA1cの解離を促進
させる方法が知られている。これを実施するには、例え
ば、赤血球を大過剰の生理食塩水でインキュベートした
り、溶血物を透析する方法が採用される。しかし、これ
らの方法はいずれも長時間を必要とするため、臨床検査
のための方法としては適切ではない。
釈してグルコース濃度を下げ、Ｌ−HbA1cの解離を促進
させる方法が知られている。これを実施するには、例え
ば、赤血球を大過剰の生理食塩水でインキュベートした
り、溶血物を透析する方法が採用される。しかし、これ
らの方法はいずれも長時間を必要とするため、臨床検査
のための方法としては適切ではない。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり、その目
的とするところは、血液検体中の安定型ヘモグロビンA1
cのみを、精度良く簡便に、かつヘモグロビンを変性さ
せることなく測定することの出来る、不安定型ヘモグロ
ビンA1cの除去もしくは解離作用と共に、赤血球の溶血
作用を有する溶血試液を提供することにある。
的とするところは、血液検体中の安定型ヘモグロビンA1
cのみを、精度良く簡便に、かつヘモグロビンを変性さ
せることなく測定することの出来る、不安定型ヘモグロ
ビンA1cの除去もしくは解離作用と共に、赤血球の溶血
作用を有する溶血試液を提供することにある。
（問題点を解決するための手段および作用） 本発明の糖化ヘモグロビン測定用溶血試液は、血液中の
ヘモグロビンA1の測定に用いられ、該溶血試液がイリン
酸縮合体および／またはリン酸縮合体の塩からなり、不
安定型ヘモグロビンA1cをヘモグロビンとグルコースと
に解離しうる不安定型糖化ヘモグロビン解離剤とロ溶血
剤とを主成分としており、そのことにより上記目的が達
成される。
ヘモグロビンA1の測定に用いられ、該溶血試液がイリン
酸縮合体および／またはリン酸縮合体の塩からなり、不
安定型ヘモグロビンA1cをヘモグロビンとグルコースと
に解離しうる不安定型糖化ヘモグロビン解離剤とロ溶血
剤とを主成分としており、そのことにより上記目的が達
成される。
本発明の溶血試液に含有されるリン酸縮合体としては、
(HPO3)n（ｎは２以上の整数）で表わされるメタリン
酸、２原子以上のリンを含みＰ−Ｏ−Ｐ結合を有するポ
リリン酸およびそれらの類似体がある。メタリン酸とし
ては、トリメタリン酸（III）、テトラメタリン酸（I
V）などが、ポリリン酸としては、ピロリン酸（Ｖ）、
テトラポリリン酸（VI）などがある。
(HPO3)n（ｎは２以上の整数）で表わされるメタリン
酸、２原子以上のリンを含みＰ−Ｏ−Ｐ結合を有するポ
リリン酸およびそれらの類似体がある。メタリン酸とし
ては、トリメタリン酸（III）、テトラメタリン酸（I
V）などが、ポリリン酸としては、ピロリン酸（Ｖ）、
テトラポリリン酸（VI）などがある。
これらに関連する類似体としては、上記化合物が側鎖を
有する化合物やさらに複雑に縮合している化合物が挙げ
られる。例えば、下記（VII）、（VIII）および（IX）
の化合物が挙げられる。
有する化合物やさらに複雑に縮合している化合物が挙げ
られる。例えば、下記（VII）、（VIII）および（IX）
の化合物が挙げられる。
上記化合物の他、水に溶解させるとこれらのリン酸縮合
体を生成する化合物も包含される。例えば、５酸化リン
も本発明に使用され得る。５酸化リンは、水に溶解する
と加水分解によりウルトラポリリン酸（IX）、テトラメ
タリン酸（IV）、テトラポリリン酸（VI）などに変化す
る。しかし加水分解最終産物であるモノオルソリン酸
（H3PO4）にはその効果が認められない。
体を生成する化合物も包含される。例えば、５酸化リン
も本発明に使用され得る。５酸化リンは、水に溶解する
と加水分解によりウルトラポリリン酸（IX）、テトラメ
タリン酸（IV）、テトラポリリン酸（VI）などに変化す
る。しかし加水分解最終産物であるモノオルソリン酸
（H3PO4）にはその効果が認められない。
上記リン酸縮合体の縮合度はＬ−HbA1cの除去効果から
みて２〜６が最も好ましい。しかし、より重合度の高い
化合物でも水溶液中において加水分解によりP2〜P6のリ
ン酸縮合体を生成するので使用が可能である。
みて２〜６が最も好ましい。しかし、より重合度の高い
化合物でも水溶液中において加水分解によりP2〜P6のリ
ン酸縮合体を生成するので使用が可能である。
これらのリン酸縮合体は、その塩であっても同等の効果
が得られる。塩の種類は特に限定されないが、例えばア
ルカリ金属やアルカリ土類金属の塩が挙げられ、Na塩、
Ｋ塩などが好適である。
が得られる。塩の種類は特に限定されないが、例えばア
ルカリ金属やアルカリ土類金属の塩が挙げられ、Na塩、
Ｋ塩などが好適である。
本発明の溶血試液中のリン酸縮合体および／またはリン
酸縮合体の塩の血液に対する使用量は、用いられる化合
物の種類や溶血時の条件（温度、インキユベーシヨン時
間、pHなど）によって異なるが、通常、血液（全血）1m
lあたり１〜6000mgの割合である。例えば、血液検体３
μｌを450μｌの溶血試液にて溶血させた試料溶液中に
ピロリン酸であれば約0.1〜4.0W/V％、（W/V％は、単位
容量あたりの重量割合を表わすものとする）好ましくは
0.5〜2.0W/V％の割合で、テトラポリリン酸であれば、
約0.001〜1.0W/V％、好ましくは0.01〜0.2W/V％の割合
となるように添加される。過少であるとＬ−HbA1Cの解
離・除去効果が得られず、過剰であるとクロマトグラフ
イー分離時における分離が困難となる。
酸縮合体の塩の血液に対する使用量は、用いられる化合
物の種類や溶血時の条件（温度、インキユベーシヨン時
間、pHなど）によって異なるが、通常、血液（全血）1m
lあたり１〜6000mgの割合である。例えば、血液検体３
μｌを450μｌの溶血試液にて溶血させた試料溶液中に
ピロリン酸であれば約0.1〜4.0W/V％、（W/V％は、単位
容量あたりの重量割合を表わすものとする）好ましくは
0.5〜2.0W/V％の割合で、テトラポリリン酸であれば、
約0.001〜1.0W/V％、好ましくは0.01〜0.2W/V％の割合
となるように添加される。過少であるとＬ−HbA1Cの解
離・除去効果が得られず、過剰であるとクロマトグラフ
イー分離時における分離が困難となる。
本発明の溶血試液中の溶血剤としては、界面活性剤が好
適に用いられる。例えば、高級脂肪族アルコール、アル
キルアリールポリエーテルアルコール、スルホネート化
合物のポリオキシエチレンエーテル、サルフエート化合
物のポリオキシエチレンエーテル、ソルビット脂肪酸エ
ステルのポリオキシエチレン付加体などがある。溶血剤
の使用量は、その種類などによっても異なるが、通常、
血液1mlあたり10〜2000mgである。例えば、溶血剤を0.0
1〜２容量％の割合で含有する溶血試液を血液1mlあたり
２〜400mlの割合で添加してインキュベートすることに
より溶血させることができる。溶血剤が過剰であるとク
ロマトグラフィーによるHbの分離が困難となる。
適に用いられる。例えば、高級脂肪族アルコール、アル
キルアリールポリエーテルアルコール、スルホネート化
合物のポリオキシエチレンエーテル、サルフエート化合
物のポリオキシエチレンエーテル、ソルビット脂肪酸エ
ステルのポリオキシエチレン付加体などがある。溶血剤
の使用量は、その種類などによっても異なるが、通常、
血液1mlあたり10〜2000mgである。例えば、溶血剤を0.0
1〜２容量％の割合で含有する溶血試液を血液1mlあたり
２〜400mlの割合で添加してインキュベートすることに
より溶血させることができる。溶血剤が過剰であるとク
ロマトグラフィーによるHbの分離が困難となる。
また、本発明の溶血試液を長期間貯蔵する場合には、防
腐剤、例えばアジ化ナトリウムなどを0.005〜0.1W/V％
程度含有させると良い。
腐剤、例えばアジ化ナトリウムなどを0.005〜0.1W/V％
程度含有させると良い。
本発明の溶血試液を用いて糖化Hbの測定をクロマトグラ
フィーにかけて行うには、まず、血液検体を溶血試液で
処理して溶血させ、Hbを含む試料を調製する。この操作
中に血液検体中のＬ−HbA1Cも、溶血試液中の解離剤の
作用によりHbとグルコースとに解離される。血液検体と
溶血試液との接触時のpHは酸性側であるほどＬ−HbA1C
の解離速度は上昇するが、pHが低すぎるとHbの変性が生
じる。さらに、極端に高いか低いpH条件下ではクロマト
グラフィーによるHbの分離が困難になる。従って、通
常、血液検体を溶血試液で処理した後のpHが4.6〜7.0、
好ましくは5.3〜6.3となるように調整される。
フィーにかけて行うには、まず、血液検体を溶血試液で
処理して溶血させ、Hbを含む試料を調製する。この操作
中に血液検体中のＬ−HbA1Cも、溶血試液中の解離剤の
作用によりHbとグルコースとに解離される。血液検体と
溶血試液との接触時のpHは酸性側であるほどＬ−HbA1C
の解離速度は上昇するが、pHが低すぎるとHbの変性が生
じる。さらに、極端に高いか低いpH条件下ではクロマト
グラフィーによるHbの分離が困難になる。従って、通
常、血液検体を溶血試液で処理した後のpHが4.6〜7.0、
好ましくは5.3〜6.3となるように調整される。
例えば、該溶血試液を0.001〜0.01Mリン酸緩衝液にて構
成し、適当なpH域に調整しておくのが良い。血液検体と
溶血試液との接触時間は解離剤の種類や濃度、pH条件な
どにより異なるが、通常、室温においては10分以上、好
ましくは10〜30分である。温度を上げることによる接触
時間の短縮も可能であり、例えば37℃にて約３〜７分、
50℃にて約１〜３分間インキュベートすることもでき
る。このように処理された試料は、イオン交換クロマト
グラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー）にか
けられ、Hbの各成分が分離されて溶出され、測定され
る。
成し、適当なpH域に調整しておくのが良い。血液検体と
溶血試液との接触時間は解離剤の種類や濃度、pH条件な
どにより異なるが、通常、室温においては10分以上、好
ましくは10〜30分である。温度を上げることによる接触
時間の短縮も可能であり、例えば37℃にて約３〜７分、
50℃にて約１〜３分間インキュベートすることもでき
る。このように処理された試料は、イオン交換クロマト
グラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー）にか
けられ、Hbの各成分が分離されて溶出され、測定され
る。
このようなリン酸縮合体および／またはリン酸縮合体塩
によるＬ−HbA1Cの解離除去作用は、Hb上の2,3−DPGポ
ケットの性質に起因すると考えられる。2,3−DPGポケッ
トに関しては、Beneschら、（Biochem.Biophys.Res.Com
mun.,26,162,1967）；（Chanutinら、（Arch.Biochem.B
iophys.,121:96,1967）などにより詳しく報告されてい
る。この2,3−DPGポケットはHbのβ鎖のヒスチジン、リ
ジンなどの塩基性アミノ酸残基、およびHbA1CのHbβ鎖
のＮ末端バリンによって形成されており、カチオン性を
帯びていることが知られている。本発明に用いられるリ
ン酸縮合体およびリン酸縮合体の塩はアニオン性を有し
かつその分子形状も適切であるため上記2,3−DPGポケッ
トに対して強力な親和性を有する。そのため、グルコー
スと競合してHbのβ鎖末端に結合する。その結果、Ｌ−
HbA1Cの解離が促進される。
によるＬ−HbA1Cの解離除去作用は、Hb上の2,3−DPGポ
ケットの性質に起因すると考えられる。2,3−DPGポケッ
トに関しては、Beneschら、（Biochem.Biophys.Res.Com
mun.,26,162,1967）；（Chanutinら、（Arch.Biochem.B
iophys.,121:96,1967）などにより詳しく報告されてい
る。この2,3−DPGポケットはHbのβ鎖のヒスチジン、リ
ジンなどの塩基性アミノ酸残基、およびHbA1CのHbβ鎖
のＮ末端バリンによって形成されており、カチオン性を
帯びていることが知られている。本発明に用いられるリ
ン酸縮合体およびリン酸縮合体の塩はアニオン性を有し
かつその分子形状も適切であるため上記2,3−DPGポケッ
トに対して強力な親和性を有する。そのため、グルコー
スと競合してHbのβ鎖末端に結合する。その結果、Ｌ−
HbA1Cの解離が促進される。
このようにしてリン酸縮合体および／またはリン酸縮合
体塩のＬ−HbA1Cの解離作用によりＬ−HbA1Cが血液検体
中から除去され、Ｓ−HbA1Cのみが試料中に残留する。
この溶血試液は、Hbのイオン交換クロマトグラフィーに
よる溶出パターンに影響を与えない。そのため上記Ｓ−
HbA1Cは、従来と同様の方法でイオン交換クロマトグラ
フィーにより分離され、精度よく測定される。
体塩のＬ−HbA1Cの解離作用によりＬ−HbA1Cが血液検体
中から除去され、Ｓ−HbA1Cのみが試料中に残留する。
この溶血試液は、Hbのイオン交換クロマトグラフィーに
よる溶出パターンに影響を与えない。そのため上記Ｓ−
HbA1Cは、従来と同様の方法でイオン交換クロマトグラ
フィーにより分離され、精度よく測定される。
（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。
測定方法 以下の実施例においてHbA1の測定は、（株）京都第一科
学製のHi−Auto A1c HA−8120を用い適切条件を選択し
て測定した。このHA−8120はHPLCによるHbA1測定専用装
置であり、陽イオン交換により各Hb成分を４分間で分離
して溶出する。溶出用緩衝液は専用の溶離液（リン酸緩
衝液）が用いられる。この装置を用いたHbの溶出パター
ンは一般に第１図に示される。第１図において、P1およ
びP2はHbA1a+b成分に起因するピークであり、P3およびP
4はＬ−HbA1CおよびＳ−HbA1C成分に起因するピークで
ある。P5は他のヘモグロビン（HbA0）に起因するピーク
である。ここで、HbA1C（Ｓ型とＬ型との合計）は次式
で算出される。
学製のHi−Auto A1c HA−8120を用い適切条件を選択し
て測定した。このHA−8120はHPLCによるHbA1測定専用装
置であり、陽イオン交換により各Hb成分を４分間で分離
して溶出する。溶出用緩衝液は専用の溶離液（リン酸緩
衝液）が用いられる。この装置を用いたHbの溶出パター
ンは一般に第１図に示される。第１図において、P1およ
びP2はHbA1a+b成分に起因するピークであり、P3およびP
4はＬ−HbA1CおよびＳ−HbA1C成分に起因するピークで
ある。P5は他のヘモグロビン（HbA0）に起因するピーク
である。ここで、HbA1C（Ｓ型とＬ型との合計）は次式
で算出される。
本実施例においては同一人（健常人）の血液を使用し、
採血後直ちにヘバリンを添加したものを新鮮血液として
用いた。
採血後直ちにヘバリンを添加したものを新鮮血液として
用いた。
リファレンス値の測定 pH6.3の0.005Mリン酸緩衝液100ml中に溶血剤としてTrit
onX−100（和光純薬製）0.1mlを加えて、解離剤を含有
しない溶血試液を調製した。この溶血試液450μｌに新
鮮血液３μｌを加えて溶血させた後に、上記方法により
HbA1C（Ｌ型およびＳ型を含む）を測定したところ、全H
b中HbA1Cは5.0％の割合で存在することがわかった。こ
の値をブランク値とした。
onX−100（和光純薬製）0.1mlを加えて、解離剤を含有
しない溶血試液を調製した。この溶血試液450μｌに新
鮮血液３μｌを加えて溶血させた後に、上記方法により
HbA1C（Ｌ型およびＳ型を含む）を測定したところ、全H
b中HbA1Cは5.0％の割合で存在することがわかった。こ
の値をブランク値とした。
次に、新鮮血10mlを遠心分離して得た血球約5mlを8/32i
nchセロファンチューブ（和光純薬製）に入れ、生理食
塩水１を用いて各２回、計５時間37℃にてインキュベ
ートした。このようにしてＬ−HbA1Cを解離させた後、
これを約1.5μｌ採取し、上記溶血試液450μｌを用いて
溶血させた。このサンプルについてHbA1Cを同様の方法
で測定したところ4.3％であった。この値は、血液中の
Ｓ−HbA1Cに相当すると考えられる。
nchセロファンチューブ（和光純薬製）に入れ、生理食
塩水１を用いて各２回、計５時間37℃にてインキュベ
ートした。このようにしてＬ−HbA1Cを解離させた後、
これを約1.5μｌ採取し、上記溶血試液450μｌを用いて
溶血させた。このサンプルについてHbA1Cを同様の方法
で測定したところ4.3％であった。この値は、血液中の
Ｓ−HbA1Cに相当すると考えられる。
実施例１ 0.005Mリン酸緩衝液100ml中に溶血剤としてTritonX−10
0（和光純薬製）0.1ml、解離剤としてテトラポリリン酸
（和光純薬製）約0.1gおよび防腐剤としてアジ化ナトリ
ウム0.01gを溶解させ、塩基を加えてpHを6.3に調製し、
溶血試液を得た。この溶血試液450μｌに新鮮血液３μ
ｌを添加し、室温で約10分間放置して溶血ならびにＬ−
HbA1Cの解離を行った。このサンプルのHbA1Cを測定した
ところ4.4％であった。別に、テトラポリリン酸（解離
剤）を加えない溶血試液を調製し、同様の方法でHbA1C
の測定を行った。
0（和光純薬製）0.1ml、解離剤としてテトラポリリン酸
（和光純薬製）約0.1gおよび防腐剤としてアジ化ナトリ
ウム0.01gを溶解させ、塩基を加えてpHを6.3に調製し、
溶血試液を得た。この溶血試液450μｌに新鮮血液３μ
ｌを添加し、室温で約10分間放置して溶血ならびにＬ−
HbA1Cの解離を行った。このサンプルのHbA1Cを測定した
ところ4.4％であった。別に、テトラポリリン酸（解離
剤）を加えない溶血試液を調製し、同様の方法でHbA1C
の測定を行った。
次に、上記溶血試液のそれぞれについてpHを7.0,5.8,5.
3,5.0および4.6に設定し、同様にHbA1Cの測定を行っ
た。解離剤を含む溶血試液を用いたときの総Hb中のHbA
1C含有量を第２図に実線（黒プロット）で、そして、解
離剤を含まない溶血試液を用いたときのHbA1C含有量を
実線（白プロット）で示す。さらに、解離剤を含む溶血
試液を用いたときの総Hb量を第２図に一点鎖線（黒プロ
ット）で、そして解離剤を含まない溶血試液を用いたと
きの総Hb量を一点鎖線（白プロット）で示す。総Hb量
は、もとの血液中の総Hb量を100％として換算した。
3,5.0および4.6に設定し、同様にHbA1Cの測定を行っ
た。解離剤を含む溶血試液を用いたときの総Hb中のHbA
1C含有量を第２図に実線（黒プロット）で、そして、解
離剤を含まない溶血試液を用いたときのHbA1C含有量を
実線（白プロット）で示す。さらに、解離剤を含む溶血
試液を用いたときの総Hb量を第２図に一点鎖線（黒プロ
ット）で、そして解離剤を含まない溶血試液を用いたと
きの総Hb量を一点鎖線（白プロット）で示す。総Hb量
は、もとの血液中の総Hb量を100％として換算した。
第２図から、pHが低くなるにつれてHbA1C値が低くな
り、Ｌ−HbA1Cが解離・除去されていることが明らかで
あり、pH7.0〜4.6の範囲内で十分効果のあることが分か
る。しかし、pHが低くなるにつれ脱ヘムによる退色が認
められ、総Hb量が低下するのがわかる。特にテトラポリ
リン酸を含む本発明溶血試液を用いた系においてはこの
傾向が顕著であり、pH4.6における総Hb量はpH6.3の場合
の約75％である。本発明溶血試液を用いて測定する場合
には、pH6.3〜5.3の領域において、Hbが変化することな
くＬ−HbA1Cが解離・除去されることが明らかである。
り、Ｌ−HbA1Cが解離・除去されていることが明らかで
あり、pH7.0〜4.6の範囲内で十分効果のあることが分か
る。しかし、pHが低くなるにつれ脱ヘムによる退色が認
められ、総Hb量が低下するのがわかる。特にテトラポリ
リン酸を含む本発明溶血試液を用いた系においてはこの
傾向が顕著であり、pH4.6における総Hb量はpH6.3の場合
の約75％である。本発明溶血試液を用いて測定する場合
には、pH6.3〜5.3の領域において、Hbが変化することな
くＬ−HbA1Cが解離・除去されることが明らかである。
また、この溶血試液を室温で１ケ月保存したものを使用
して、同様にHbA1Cを測定したところ、製造直後のもの
と実質的に殆ど変わらない測定値を得た。
して、同様にHbA1Cを測定したところ、製造直後のもの
と実質的に殆ど変わらない測定値を得た。
実施例２ 実施例１に準じ、テトラポリリン酸の量をそれぞれ1.0
g,0.2g,0.005g,0.005g,および0.001g含有する溶血試液
（いずれもpH6.0）を調製した。これを用いて実施例１
と同様の方法でHbA1Cの含有量を測定した。その結果を
下表に示す。
g,0.2g,0.005g,0.005g,および0.001g含有する溶血試液
（いずれもpH6.0）を調製した。これを用いて実施例１
と同様の方法でHbA1Cの含有量を測定した。その結果を
下表に示す。
表から、テトラポリリン酸が0.005％程度の低濃度であ
ってもＬ−HbA1Cの除去効果が得られることがわかる。
テトラポリリン酸濃度が1.0％の場合は、クロマトグラ
ムのパターンがブロードに変化するため、濃度をやや低
くすることが望ましい。
ってもＬ−HbA1Cの除去効果が得られることがわかる。
テトラポリリン酸濃度が1.0％の場合は、クロマトグラ
ムのパターンがブロードに変化するため、濃度をやや低
くすることが望ましい。
実施例３ 実施例１に準じ、テトラポリリン酸を約0.1g含有する溶
血試液（pH6.0）を調製した。これを用い、温度条件を3
7℃、50℃および60℃に設定して、それぞれ所定時間イ
ンキュベートした後にHbA1Cの測定を行った。その結果
を第３図に示す。
血試液（pH6.0）を調製した。これを用い、温度条件を3
7℃、50℃および60℃に設定して、それぞれ所定時間イ
ンキュベートした後にHbA1Cの測定を行った。その結果
を第３図に示す。
第３図から反応温度を上げるにつれてより迅速にＬ−Hb
A1Cが除去されることがわかる。しかし、60℃で3.5分間
インキュベートするとHbの変性が認められ、総Hb量が約
90％に低下した。そのため、高温で長時間インキュベー
トすることは好ましくないと考えられる。
A1Cが除去されることがわかる。しかし、60℃で3.5分間
インキュベートするとHbの変性が認められ、総Hb量が約
90％に低下した。そのため、高温で長時間インキュベー
トすることは好ましくないと考えられる。
実施例４ 実施例１に準じ、ピロリン酸ナトリウム（半井化学製）
を約2.0％の割合で含有する溶血試液（pH6.0）、及びウ
ルトラポリリン酸ナトリウム（太平化学製）を約0.1％
の割合で含有する溶血試液（pH6.0）およびヘキサメタ
リン酸ナトリウムを約1.1％の割合で含有する溶血試液
（pH6.0）を調製し室温で７日間保存した。これらを用
いて実施例１と同様の方法でHbA1Cの含有量を測定した
ところ、それぞれ4.5％、4.4％および4.4％であった。
を約2.0％の割合で含有する溶血試液（pH6.0）、及びウ
ルトラポリリン酸ナトリウム（太平化学製）を約0.1％
の割合で含有する溶血試液（pH6.0）およびヘキサメタ
リン酸ナトリウムを約1.1％の割合で含有する溶血試液
（pH6.0）を調製し室温で７日間保存した。これらを用
いて実施例１と同様の方法でHbA1Cの含有量を測定した
ところ、それぞれ4.5％、4.4％および4.4％であった。
比較例１ 実施例１のテトラポリリン酸の代わりにリン酸２水素ナ
トリウム（和光純薬製）を使用し、該リン酸２水素ナト
リウム約2.0％を含有しpHが6.0に調製された溶血試液を
調製した。これを用いて実施例１と同様の方法で、HbA
1Cの含有量の測定を行った。HbA1C値は5.0％であり、Ｌ
−HbA1Cが除去されていないことがわかる。
トリウム（和光純薬製）を使用し、該リン酸２水素ナト
リウム約2.0％を含有しpHが6.0に調製された溶血試液を
調製した。これを用いて実施例１と同様の方法で、HbA
1Cの含有量の測定を行った。HbA1C値は5.0％であり、Ｌ
−HbA1Cが除去されていないことがわかる。
比較例２ 実施例１のテトラポリリン酸の代わりにセミカルバジド
塩酸塩（和光純薬製）0.001M、アニリン（和光純薬製）
0.004Mを含むpH5.3に調製された溶血試液を調製した。
これを用いて新鮮血を溶血させ、その溶血物を60℃にて
２分間インキュベートした。これを測定したところHbA
1C含量は4.6％であった。しかし、分画パターンはかな
りブロードになり、Hbピーク総面積は当初の約70％であ
った。
塩酸塩（和光純薬製）0.001M、アニリン（和光純薬製）
0.004Mを含むpH5.3に調製された溶血試液を調製した。
これを用いて新鮮血を溶血させ、その溶血物を60℃にて
２分間インキュベートした。これを測定したところHbA
1C含量は4.6％であった。しかし、分画パターンはかな
りブロードになり、Hbピーク総面積は当初の約70％であ
った。
比較例３ 実施例１のテトラポリリン酸の代わりに、ホウ酸（和光
純薬製）1.0％を含有するpH5.3に調製された溶血試液を
調製した。これを用いて新鮮血を同様に溶血させ溶血物
を50℃にて２分インキュベートした。これを測定したと
ころ、HbA1C含量は4.4％であった。しかし、ホウ酸濃度
を0.1％としpHを6.0に調製して同様の測定を行ったとこ
ろ、HbA1C含量は4.8％となった。このように、ホウ酸が
低濃度である場合には、充分にＬ−HbA1Cを除去するこ
とができない。
純薬製）1.0％を含有するpH5.3に調製された溶血試液を
調製した。これを用いて新鮮血を同様に溶血させ溶血物
を50℃にて２分インキュベートした。これを測定したと
ころ、HbA1C含量は4.4％であった。しかし、ホウ酸濃度
を0.1％としpHを6.0に調製して同様の測定を行ったとこ
ろ、HbA1C含量は4.8％となった。このように、ホウ酸が
低濃度である場合には、充分にＬ−HbA1Cを除去するこ
とができない。
（発明の効果） 本発明の溶血試液は血液中の糖化ヘモグロビンの測定に
用いられるものであり、該溶血試液がイリン酸縮合体お
よび／またはリン酸縮合体の塩からなり、不安定型ヘモ
グロビンA1Cをヘモグロビンとグルコースとに解離しう
る不安定型糖化ヘモグロビン解離剤とロ溶血剤とを主成
分とするものであるので、本発明の溶血試液を用いる
と、赤血球の溶血と同様に、血液中のHbA1CのうちＬ−H
bA1Cが除去され、Ｓ−HbA1Cのみを精度良く簡便にかつ
ヘモグロビンを変性させることなく短時間のうちに測定
することが出来る。Ｓ−HbA1Cは、一時的な血糖の上昇
もしくは降下に左右されずに比較的安定して血液中に存
在するため、この測定値はより信頼度の高い糖尿病の指
標とされ得る。測定系を自動化することにより、さらに
効果的な臨床検査が可能となる。また、本発明の溶血試
液を用いて測定可能な検体としては、人全血ばかりでな
く赤血球試料にも適用できる。さらに、本発明溶血試液
は貯蔵安定性も良好である。
用いられるものであり、該溶血試液がイリン酸縮合体お
よび／またはリン酸縮合体の塩からなり、不安定型ヘモ
グロビンA1Cをヘモグロビンとグルコースとに解離しう
る不安定型糖化ヘモグロビン解離剤とロ溶血剤とを主成
分とするものであるので、本発明の溶血試液を用いる
と、赤血球の溶血と同様に、血液中のHbA1CのうちＬ−H
bA1Cが除去され、Ｓ−HbA1Cのみを精度良く簡便にかつ
ヘモグロビンを変性させることなく短時間のうちに測定
することが出来る。Ｓ−HbA1Cは、一時的な血糖の上昇
もしくは降下に左右されずに比較的安定して血液中に存
在するため、この測定値はより信頼度の高い糖尿病の指
標とされ得る。測定系を自動化することにより、さらに
効果的な臨床検査が可能となる。また、本発明の溶血試
液を用いて測定可能な検体としては、人全血ばかりでな
く赤血球試料にも適用できる。さらに、本発明溶血試液
は貯蔵安定性も良好である。
第１図は血液中のHbをイオン交換クロマトグラフィーに
より分離して測定したときの溶出パターンを示すクロマ
トグラム、第２図は異なるpH値に調整した本発明の溶血
試液において、解離剤を含む場合と含まない場合のそれ
ぞれにつき、血液を処理した後にHbを測定したときの該
pH条件とHbA1C含量との関係、および該pH条件と総Hb量
との関係を示すグラフ、第３図は本発明の溶血試液を用
いて血液中のHbA1Cを測定したときの溶血試液の反応条
件（時間及び温度）とHbA1C含量との関係を示すグラフ
である。
より分離して測定したときの溶出パターンを示すクロマ
トグラム、第２図は異なるpH値に調整した本発明の溶血
試液において、解離剤を含む場合と含まない場合のそれ
ぞれにつき、血液を処理した後にHbを測定したときの該
pH条件とHbA1C含量との関係、および該pH条件と総Hb量
との関係を示すグラフ、第３図は本発明の溶血試液を用
いて血液中のHbA1Cを測定したときの溶血試液の反応条
件（時間及び温度）とHbA1C含量との関係を示すグラフ
である。
Claims (4)
- 【請求項１】血液中の糖化ヘモグロビンの測定に用いら
れる溶血試液であって、該溶血試液がイリン酸縮合体お
よび／またはリン酸縮合体の塩からなり、不安定型ヘモ
グロビンA1cをヘモグロビンとグルコースとに解離しう
る不安定型糖化ヘモグロビン解離剤とロ溶血剤とを主成
分とする糖化ヘモグロビン測定用溶血試液。 - 【請求項２】前記リン酸縮合体が、メタリン酸、ポリリ
ン酸およびそれらの類似体のうちの少なくとも一種以上
である特許請求の範囲第１項記載の溶血試液。 - 【請求項３】該溶血試液のPHが4.6〜7.0である特許請求
の範囲第１項記載の溶血試液。 - 【請求項４】前記溶血剤が界面活性剤である特許請求の
範囲第１項、第２項または第３項記載の溶血試液。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30378287A JPH071275B2 (ja) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | 糖化ヘモグロビン測定用溶血試液 |
| CA000578999A CA1338348C (en) | 1987-11-30 | 1988-09-30 | Eliminating agent for glycosylated hemoglobin |
| EP88730224A EP0319454B1 (en) | 1987-11-30 | 1988-10-01 | An eliminating agent for glycosylated hemoglobin |
| DE3851209T DE3851209T2 (de) | 1987-11-30 | 1988-10-01 | Ausscheidungsmittel für glycosyliertes Hämoglobin. |
| US07/758,383 US5453379A (en) | 1987-11-30 | 1991-09-03 | Eliminating agent for glycosylated hemoglobin and a test method using the same |
| US08/056,989 US5292663A (en) | 1987-11-30 | 1993-05-03 | Method of treating blood containing labile glycosylated hemoglobin A1C |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30378287A JPH071275B2 (ja) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | 糖化ヘモグロビン測定用溶血試液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01143957A JPH01143957A (ja) | 1989-06-06 |
| JPH071275B2 true JPH071275B2 (ja) | 1995-01-11 |
Family
ID=17925221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30378287A Expired - Fee Related JPH071275B2 (ja) | 1987-11-30 | 1987-11-30 | 糖化ヘモグロビン測定用溶血試液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH071275B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2782470B2 (ja) * | 1990-07-20 | 1998-07-30 | 株式会社日立製作所 | グリコヘモグロビンの分離方法および分離装置並びに分離カラム |
| JP2010107436A (ja) * | 2008-10-31 | 2010-05-13 | Tosoh Corp | 溶血水溶液及びそれを用いたヘモグロビン類の分離方法 |
-
1987
- 1987-11-30 JP JP30378287A patent/JPH071275B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01143957A (ja) | 1989-06-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Stibler et al. | Abnormal microheterogeneity of transferrin in serum and cerebrospinal fluid in alcoholism | |
| EP0202543B1 (en) | Method of inhibiting glycolysis in blood samples | |
| US7541190B2 (en) | Method of measurement of cellular hemoglobin | |
| Bernard et al. | Effect of renal insufficiency on the concentration of free retinol-binding protein in urine and serum | |
| US8546144B2 (en) | Method of preparing controls for glycated hemoglobin S-A1c derived from healthy blood cells | |
| JPS634145B2 (ja) | ||
| EP2562539B1 (en) | Method of analyzing hemoglobins | |
| EP0064758B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung des Gehalts an glykosiliertem Hämoglobin bei der Langzeitkontrolle des Blutzuckerspiegels | |
| US5292663A (en) | Method of treating blood containing labile glycosylated hemoglobin A1C | |
| US20120122073A1 (en) | Cis di-ahl modified controls for glycated hemoglobin s-a1c derived from healthy blood cells | |
| DE3311458C2 (de) | Verfahren zur Herstellung einer glukosefreien Hämoglobinkontrolle | |
| JPH076990B2 (ja) | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤 | |
| JPH071275B2 (ja) | 糖化ヘモグロビン測定用溶血試液 | |
| JP2506870B2 (ja) | 糖化ヘモグロビン測定用溶離液 | |
| JPH076989B2 (ja) | 糖化ヘモグロビンの測定法 | |
| Boulet et al. | Examination of the mineral composition of the micelle of milk by gel filtration | |
| JPH071277B2 (ja) | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤 | |
| EP0319454B1 (en) | An eliminating agent for glycosylated hemoglobin | |
| JPH06331629A (ja) | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤およびこれを用いた糖化ヘモグロビンの測定法 | |
| CA1150604A (en) | Albumin reagent | |
| WO2011096420A1 (ja) | ヘモグロビンｓの分析方法、ヘモグロビンａ２の分析方法、及び、ヘモグロビンａ０の分析方法 | |
| CN115372486A (zh) | 糖化血红蛋白检测试剂盒及其应用 | |
| JPH0434364A (ja) | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤 | |
| JPH08136539A (ja) | 安定型糖化ヘモグロビン測定方法 | |
| van der Giesen et al. | Consequences of the N B transition of albumin for the binding of warfarin in human serum |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |