DE4124058A1

DE4124058A1 - Verfahren zum messen von glycohaemoglobin und vorrichtung zum messen desselben

Info

Publication number: DE4124058A1
Application number: DE4124058A
Authority: DE
Inventors: Masako Mizuno; Kenji Tochigi; Yutaka Misawa
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1990-07-20
Filing date: 1991-07-19
Publication date: 1992-01-23
Anticipated expiration: 2011-07-20
Also published as: US5348649A; JP2782470B2; DE4124058C2; JPH0477500A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Messen von Hämoglobin in stabiler Form in Blut und eine Vorrichtung zum Messen desselben.

Nachdem Blutzucker abhängig von seiner Konzentration in die roten Blutzellen eintritt, wird der Zucker an Hämoglobin gebunden, um Glycohämoglobin zu bilden. Es wird gezeigt, daß die Konzentration von A1c in stabiler Form (hier im weiteren als stabil-A_1c oder abgekürzt als s-A_1c bezeichnet) zwischen verschiedenen Typen von Glycohämoglobin den durchschnittlichen Blutglukosespiegel der letzten ein bis drei Monate widerspiegelt.

A_1c ist zusammengesetzt aus A_1c in stabiler Form (s-A_1c) und A_1c in labiler Form (labil-A_1c; l-A_1c). Von diesen beiden zeigt s-A_1c gute Korrelation mit dem Blutglukosespiegel der letzten ein bis drei Monate. Es wird vorgeschlagen, daß l-A_1c ungefähr 10 bis 15% des gesamten A_1c in einem hungrigen gesunden Erwachsenen ausmacht. Das l-A_1c wird gebildet durch reversible Bindung des N-Terminus der β-Kette von Hämoglobin und einem reduzierenden Terminus von Glukose über eine Schiffsche Base und wird in einer relativ kurzen Zeit erzeugt und wieder abgebaut. Im diabetischen Patienten ist der l-A_1c-Gehalt deshalb höher als im gesunden Erwachsenen, manchmal steigt er auf 10 bis 20% des Gesamt-A_1c. Er ist auch nach Mahlzeiten höher als bei Hunger, und wird beachtlich durch den Zustand, wenn Blut gesammelt wird, beeinflußt.

Oder aber s-A_1c wird allmählich aus l-A_1c erzeugt, kontinuierlich und irreversibel. Es wird vorgeschlagen, daß s-A_1c sehr gut den Blutglukosespiegel der letzten ein bis drei Monate widerspiegelt.

Also ist es bevorzugt, daß s-A_1c abgetrennt wird und allein vermessen wird. Jedoch sind die beiden extrem analog in der Struktur, so daß sie sehr schwierig durch Flüssigchromatographie zu trennen sind.

Das Verfahren zum Messen von nur s-A_1c umfaßt zwei Methoden: (1) ein Verfahren zum Trennen und Messen von s-A_1c und l-A_1c auf einer Trennsäule durch Chromatographie und (2) ein Verfahren zum Vorbehandeln und Entfernen von l- A_1c.

Bei dem Verfahren zum Trennen von l-A_1c und s-A_1c auf einer Trennsäule, wird eine lange, hoch präparative Trennsäule verwendet, zur Verbesserung der präparativen Leistung. Das Verfahren hat eine charakteristische Eigenschaft, indem Hämoglobin kaum denaturiert wird, verglichen mit dem Verfahren zur Entfernung von l-A_1c durch dessen Vorbehandlung (siehe z. B. Gazette of Japanese Patent Laidopen Nr. 75 558/1988).

Andererseits beinhaltet das Verfahren zur chemischen Entfernung von l-A_1c durch dessen Vorbehandlung, das Verfahren rote Blutzellen in physiologischer Salzlösung oder einem Puffer, der Semicarbazid und Anilin enthält, zu inkubieren [D. M. Nathan, Clin. Chem., 27, 1261 (1981); D. M. Nathan et al., Clin. Chem., 28, 512 (1982)]. Dieses Verfahren konzentriert sich auf die Tatsache, daß sich die vorübergehende Bindung von l-A_1c, d. h. die Bindung über eine Schiffsche Base, leicht löst.

Es ist auch ein Verfahren vorgeschlagen worden, das die Zugabe eines käuflich erhältlichen Reagenzes zu Blut zwecks Entfernung von l-A_1c und anschließende Erwärmung des Blutes auf ungefähr 50°C für 1 bis 2 Minuten umfaßt, wodurch l-A_1c entfernt wird (siehe z. B. Gazette of Japanese Patent Laid-opfen Nr. 36 143/1988; Gazette of Japanese Patent Laid-open Nr. 97 857/1989).

Nach den Verfahren des Standes der Technik erfordert jedoch die komplette Trennung von l-A_1c und s-A_1c gemäß des Verfahrens der Trennung von l-A_1c und s-A_1c auf einer Trennsäule eine analytische Zeit von ungefähr 10 bis 60 Minuten pro Probe. Deshalb ist es nahezu unmöglich, eine große Anzahl von Proben zu behandeln. Weil die Säule so lang ist, daß sie eine große Menge Füllmaterial erfordert, hat das Verfahren Nachteile dahingehend, daß die Säule hohe Kosten verursacht und die Vorrichtung dafür sperrig ist.

Gemäß des Verfahrens l-A_1c durch dessen Vorbehandlung zu entfernen, ist die Vorbehandlung per se komplex und erfordert 30 Minuten bis 4 Stunden. Das Verfahren bringt auch ein Problem beim Behandeln vieler Proben mit sich.

Weiter bringt das Verfahren der Hitzebehandlung ein Problem mit sich, daß die Analyse schließlich in dem Fall unmöglich sein kann, wenn das Protein im Blut denaturiert ist, was zum Auftreten von Präzipitaten führt, die Leitungen und Filter verstopfen können.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin und eine Vorrichtung zum Messen desselben bereitzustellen, dadurch gekennzeichnet, daß A_1c in stabiler Form (s-A_1c) von anderen Hämoglobinkomponenten in kurzer Zeit abgetrennt werden kann und daß das Verstopfen von Leitungen und Filtern verhindert werden kann. Um die obige Aufgabe zu lösen, umfaßt das Meßverfahren der vorliegenden Erfindung gleichzeitiges Durchführen eines Verfahrens zum Trennen von Glycohämoglobin, Hämoglobin und Hämoglobinderivaten im Blut und eines Verfahrens zum Abbau von Hämoglobin in labiler Form im Blut in Glukose und Hämoglobin, wodurch die Hämoglobin- Komponente in labiler Form entfernt wird und Hämoglobin in stabiler Form mittels Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie gemessen wird.

Das Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin im Blut durch Hochleistungschromatographie gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt Durchleiten von Elutionsmitteln durch eine Trennsäule, die mit einem Füllmaterial gepackt ist, das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen besteht, wodurch Hämoglobin in labiler Form im Blut abgebaut und entfernt wird, und umfaßt anschließendes Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form im Blut.

Das Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin im Blut durch Hochleistungschromatographie gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt Durchleiten von Elutionsmitteln durch eine Trennsäule, wobei ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen prorösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen miteinander vermischt werden, wodurch Hämoglobin in labiler Form im Blut abgebaut und entfernt wird, und umfaßt anschließendes Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form im Blut.

Das Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin im Blut durch Hochleistungschromatographie gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt Durchleiten von Elutionsmitteln durch einen Typ von Füllmaterialien, wobei jedes aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen besteht und folgendes Durchleiten der Elutionsmittel durch einen anderen Typ von Füllmaterialien, wobei jedes aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen besteht, oder Durchleiten der Elutionsmittel in einer Elutions-Folge, die gegensätzlich zu der vorher genannten Folge ist, wodurch Hämoglobin in labiler Form im Blut abgebaut und entfernt wird, und umfaßt anschließendes Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form im Blut.

Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie, die umfaßt: eine Trennsäule zum Trennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum Einleiten von Elutionsmitteln in die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei die Trennsäule mit der Funktion zum gleichzeitigen Ausführen des Verfahrens zur Trennung von Glycohämoglobin, Hämoglobin und Hämoglobin-Derivaten und des Verfahrens zum Abbau von Hämoglobin in labiler Form im Blut in Glukose und Hämoglobin und zur Entfernung des Hämoglobins in labiler Form ausgestattet ist.

Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie, die umfaßt: eine Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum Einleiten von Elutionsmitteln in die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei die Trennsäule mit einem Füllmaterial gepackt ist, das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen besteht.

Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie, die umfaßt: eine Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum Einleiten von Elutionsmitteln in die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei die Trennsäule mit einem Füllmaterial gepackt ist, das durch Mischen eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxylalkylgruppen und eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, hergestellt ist.

Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie, die umfaßt: eine Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum Einleiten von Elutionsmitteln in die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat der Trennsäule, wobei ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, getrennt in zwei Schichten in die Trennsäule gepackt sind.

Die vorliegende Erfindung ist eine Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie, die umfaßt: eine Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum Einleiten von Elutionsmitteln in die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei die Trennsäule in zwei Teile in Fließrichtung der Elutionsmittel getrennt ist; ein Teil ist mit einem Füllmaterial gepackt, das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen besteht und der andere Teil ist mit einem Füllmaterial gepackt, das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen besteht.

Weiter ist die Trennsäule der vorliegenden Erfindung mit einem Füllmaterial gepackt, das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkyl- und Dihydroxyboronylgruppen besteht.

Weiterhin ist die Trennsäule der vorliegenden Erfindung mit einem Füllmaterial gepackt, das durch Mischen eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, hergestellt ist.

Weiter wird die Trennsäule der vorliegenden Erfindung durch Packen eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxylalkylgruppen und eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, getrennt in zwei Schichten in Fließrichtung der Elutionsmittel, hergestellt.

Fig. 1 zeigt das in Beispiel 1 erhaltene Chromatogramm;

Fig. 2 zeigt das in Vergleichsbeispiel 1 erhaltene Chromatogramm;

Fig. 3 zeigt das in Beispiel 2 erhaltene Chromatogramm;

Fig. 4 zeigt das in Vergleichsbeispiel 2 erhaltene Chromatogramm;

Fig. 5 ist eine Figur, die die Korrelation zwischen den Leveln von A_1c in stabiler Form (s-A_1c), gemessen durch das Verfahren von Beispiel 2 und den Leveln von s-A_1c, gemessen durch das Verfahren von Vergleichsbeispiel 1 darstellt;

Fig. 6 ist ein Ausführungsbeispiel der analytischen Vorrichtung der vorliegenden Erfindung;

Fig. 7 ist eine Konstruktions-Figur von elementaren Teilen der Trenn- Vorrichtung der vorliegenden Erfindung;

Fig. 8 ist eine Konstruktions-Figur von elementaren Teilen der Trenn-Vorrichtung von Vergleichsbeispiel 3.

Durch Verwendung einer Trennsäule, die mit einem Füllmaterial mit Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen gepackt ist, als Trennsäule für die Analyse von Glycohämoglobin, kann der Abbau von l-A_1c und die Trennung in die individuellen Komponenten von Hämoglobin (Hb) gleichzeitig ausgeführt werden.

Im Fall, daß Glycohämoglobin (GHb) in seine Komponenten durch Hochleistungs- Flüssig-Chromatographie (HPLC) getrennt wird, wird als Füllmaterial, ein Kationenaustauscherharz mit geringer Azidität, verwendet, wobei Carboxymethylgruppen in ein hydrophiles Substrat, wie Silicagel, Methacrylatgel, Vinylalkoholgel oder ähnlichem, eingeführt werden. Durch die Ionenaustauscher-Chromatographie wird Hb durch Ausnutzung der unterschiedlichen isoelektrischen Punkte in seine individuellen Komponenten getrennt. Als andere Möglichkeit wird ein Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen in der Affinitäts-Chromatographie verwendet. Wenn ein Elutionsmittel durch eine Säule geleitet wird, die mit einem Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen gepackt ist, wird l-A_1c in HbA₀ und Glukose abgebaut. Weil l-A_1c durch Bindung des N-Terminus der β-Kette von Hb mit dem reduzierenden Terminus von Glukose hergestellt ist, wie es in Formel 1 gezeigt ist, ist es extrem instabil. Aus diesem Grund wandert das Gleichgewicht in die rechte Richtung und l-A_1c wird in HbA₀ abgebaut.

Wie in der Formel 2 gezeigt ist, wird Glycohämoglobin, indem ein Zucker, wie z. B. Glukose, an Hb gebunden ist, von Nicht-Glycohämoglobin (Hb) durch Affinitätschromatographie getrennt, im allgemeinen durch Ausnützung der spezifischen Reaktion der Dihydroxyboronylgruppen, die in eine feste Phase mit einer 1,2-Cis- Diolgruppe eingeführt ist. Diese Reaktion läuft bei pH 8 oder mehr ab.

Weil das Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen für den Zweck l-A_1c in Glukose und Hb abzubauen, verwendet wird und nicht für die Trennung von Glycohämoglobin und Nicht-Glycohämoglobin, ist pH 8 oder weniger bevorzugt, insbesondere ist pH 7 oder weniger bevorzugt.

Bei pH 8 oder mehr wird Glycohämoglobin spezifisch an die Dihydroxyboronylgruppen gebunden und an das Füllmaterial adsorbiert.

Die isoelektrischen Punkte von Hb und GHb liegen von 6,90 bis 6,95. Wenn Hb und GHb voneinander durch Ionenaustauscher-Chromatographie unter Verwendung eines schwach-aziden Kationenaustauscherharzes (mit eingeführten Carboxyalkylgruppen) getrennt werden, sollte ein Elutionsmittel mit einem geringeren pH als die individuellen isoelektrischen Punkte von Hb und GHb verwendet werden. Demgemäß gibt es keine Chance, daß Glycohämoglobin an die Dihydroxyboronylgruppen gebunden werden kann.

Unter Verwendung des Füllmaterials mit Carboxyalkyl- und Dihydroxyboronylgruppen, wie es beschrieben worden ist, kann s-A_1c abgetrennt und vermessen werden, ohne Beeinflussung durch l-A_1c, das infolge physiologischer Faktoren und Nahrung variabel ist.

Als Trennsäule kann eine Säule verwendet werden, die mit einem Füllmaterial mit Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen gepackt ist.

Andererseits wird nach Entfernung von l-A_1c auf einer Säule, die mit einem Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen gepackt ist, Hb in seine individuellen Komponenten auf einer Trennsäule, die mit einem Füllmaterial mit Carboxyalkylgruppen gepackt ist, getrennt.

Im Gegensatz dazu, kann, nachdem Hb in seine individuellen Komponenten auf einer Trennsäule, die mit einem Füllmaterial mit Carboxyalkylgruppen gepackt ist, getrennt ist, l-A_1c auf einer Säule, die mit einem Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen gepackt ist, entfernt werden.

Weiter kann eine Säule verwendet werden, wobei ein Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen und ein Füllmaterial mit Carboxylalkylgruppen miteinander vermischt werden und gepackt werden, oder sie werden aufeinanderfolgend in Schichten gepackt.

Nach dem vorliegenden Verfahren können die Elutionsmittel, die üblicherweise für Ionenaustauscher-Chromatographie verwendet worden sind, verwendet werden wie sie sind. Also ist die Prüfung der Elutionsbedingungen nicht speziell erforderlich.

Weil die Entfernung von l-A_1c wegen der Vorbehandlung nicht notwendig ist, ist das analytische Verfahren einfach und die Zeit für die Analyse ist verkürzt, weil die Vorbehandlung nicht erforderlich ist. Der Abbau und die Degeneration von Hb und GHb findet nicht statt, ausgenommen von l-A_1c.

So kann dem Trennverfahren von Glycohämoglobin unter Verwendung solch einer Trennsäule gemäß der vorliegenden Erfindung folgend, A_1c in stabiler Form (s-A_1c) im Blut schnell analysiert werden, stabil mit guter Reproduzierbarkeit und einfach ohne Einfluß von A_1c in labiler Form (l-A_1c), dessen Spiegel abhängig von physiologischen Faktoren variiert.

Beispiele

Die Beispiele der vorliegenden Erfindung werden nun mit den nachfolgenden Zeichnungen erklärt.

Als Füllmaterial der vorliegenden Erfindung kann eines verwendet werden, wobei Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen in ein Partikel eingeführt werden. Als Trennsäule kann eine Säule verwendet werden, die gleichzeitig mit einem Füllmaterial, in das Carboxyalkylgruppen eingeführt worden sind und mit einem Füllmaterial, in das Dihydroxyboronylgruppen eingeführt worden sind, gepackt ist. Weiterhin kann als Säule eine Säule verwendet werden, die getrennt mit einem Füllmaterial, in das Carboxyalkylgruppen eingeführt worden sind und mit einem Füllmaterial, in das Dihydroxyboronylgruppen eingeführt worden sind, gepackt ist.

Als Matrix (Substrat) zum Einführen von Carboxyalkylgruppen und/oder Dihydroxyboronylgruppen können solche Matrizen verwendet werden, die üblicherweise für Flüssigchromatographie verwendet worden sind. Jedoch sind solche mit intensiver mechanischer Stabilität, geringer nicht-spezifischer Proteinabsorption (nicht zu intensive Hydrophile) und chemischer Stabilität bevorzugt. Als die solche Erfordernisse befriedigende Matrix können hydrophile, organische, poröse Substanzen (vernetztes Polymer) einschließlich Methacrylatgel und Vinylalkoholgel verwendet werden. Wenn ein Puffer von pH 7 oder weniger als Elutionsmittel verwendet wird, können anorganische poröse Substanzen, wie z. B. Silicagel, benutzt werden.

Das Verfahren zum Einführen von Dihydroxyboronylgruppen in solche oben beschriebenen Matrices wird in den folgenden Verfahren veranschaulicht. Solche Matrices haben mit Epihalohydrin, Bis-Epoxid und ähnlichem reagiert, gefolgt durch die Reaktion mit meta-Aminophenyl-Boroniger Säure, wodurch die Einführung von Dihydroxyboronylgruppen in die Matrices erreicht wird. Durch Einführen von Carboxyalkylgruppen in die Hydroxylgruppe einer Matrix durch bekannte Methoden und anschließendes Überführen der Carboxyalkylgruppe in das Azid, das dann mit meta-Aminophenyl-Boroniger Säure reagiert, wird die Einführung von Dihydroxyboronylgruppen in die Matrix erreicht. Durch Reaktion von Bromcyan mit der Hydroxylgruppe einer Matrix, gefolgt von der Reaktion mit einem Oligopeptid und der Reaktion von meta-Aminophenyl-Boroniger Säure in Anwesenheit von Carbodiimid wird die Einführung von Dihydroxyboronylgruppen in die Matrix erreicht.

Das Verfahren zum Einführen von Carboxyalkylgruppen in die Matrices schließt ein Verfahren ein, bei dem eine halogenierte Essigsäure einschließlich Monochloressigsäure und Monobromessigsäure mit der Hydroxylgruppe der Matrices reagiert.

Vorzugsweise beträgt die Menge der einzuführenden Carboxyalkylgruppen 0,1 bis 1 meq (milli-Äquivalent) pro g×Trockengewicht eines Füllmaterials. Vorzugsweise beträgt die Menge der einzuführenden Dihydroxyboronylgruppe 0,1 bis 1 meq (milli-Äquivalent) pro g×Trockengewicht eines Füllmaterials.

Die Menge der Dihydroxyboronylgruppen kann gemessen und bestimmt werden, z. B., durch Alkalititration unter der Bedingung, daß ein Füllmaterial mit Dihydroxyboronylgruppen und Sorbitol in einer wäßrigen Lösung anwesend sein können [Japanese Chemical Society "New Experimental Chemistry Series (Shin-Jikken Kagaku Koza) (Analytical Chemistry I)", (1976), Maruzen, Seite 77]. Die Menge von Borsäure, die durch Wasserstoffperoxidbehandlung eines Füllmaterials mit Dihydroxyboronylgruppen frei wird, kann durch die oben beschriebene Titration bestimmt werden. Die Menge an Borsäure kann durch Atomabsorptions- und Emissions-Spektral-Analyse bestimmt werden. Die Menge der Carboxyalkylgruppen kann durch ein üblicherweise bekanntes und allgemein verwendetes Verfahren der Messung der Austauschkapazität der Carboxylgruppe bestimmt werden.

Als Füllmittel mit Carboxyalkylgruppen können verschiedene Füllmaterialien verwendet werden, einschließlich solche, die Carboxymethylgruppen, Carboxyethylgruppen oder ähnliches haben. Insbesondere kann ein Füllmaterial mit Carboxymethylgruppen verwendet werden kann.

Die Form des gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Füllmaterials schließt verschiedene Formen ein, z. B. kugelförmige Formen und gequetschte Formen, aber kugelförmige sind mehr bevorzugt, um eine höhere Temperatur zu erreichen. Der Partikel-Durchmesser ist 1 bis 200 µm, bevorzugt 1 bis 20 µm, und insbesondere bevorzugt 1 bis 10 µm.

Die Säule der vorliegenden Erfindung hat wunschgemäß eine zylindrische Form mit einem Innen-Durchmesser von 1 bis 10 mm und eine Länge von 20 cm oder weniger, vorzugsweise eine zylindrische Form mit einem Innendurchmesser von 1 bis 6 mm und eine Länge von 1 bis 10 cm.

Als Verfahren zum Packen eines Füllmaterials in eine Säule kann jedes üblicherweise bekannte Verfahren verwendet werden, solange es das Packen in einheitlichem Zustand gewährleistet und die Füll-Rate kontrolliert werden kann. Die Füll- Rate kann durch die Kontrolle des Drucks und der Packungs-Zeit reguliert werden.

Das Elutionsmittel kann ein Elutionsmittel sein, das gewöhnlich für die Analyse von Glycohämoglobin bei der Flüssig-Chromatographie verwendet wird, vorausgesetzt, daß das Elutionsmittel ein Puffer mit pH 5,0 bis 7,0 ist. Dort werden z. B. Puffer einschließlich Natriumacetat, Natriumphosphat, Kaliumphosphat o. ä. oder Lösungen, die Salze wie Natriumchlorid, Natriumsulfat o. ä. enthalten, verwendet.

Harnstoff und Guanidin können ebenso hinzugesetzt werden. Organische Lösungsmittel, wie Acetonitril, Ethanol, Methanol, Mercaptoethanol o. ä. können hinzugemischt werden.

Die Konzentration und der pH einer Elutionsmittel-Zusammensetzung einschließlich Puffer, Salze, Harnstoff, organische Lösungsmittel o. ä. sind nicht notwendigerweise konstant für die Analyse von Hämoglobin, Glycohämoglobin und Hämoglobin- Derivaten. Sie können einem Wechsel unterworfen werden, z. B. durch das kontinuierliche Gradienten-Verfahren oder das schrittweise Gradienten-Verfahren. Der Fluß eines zu übertragenden Elutionsmittels fließt nicht notwendigerweise konstant und kann kontinuierlich oder in schrittweiser Art gemäß dem Zeitverlauf modifiziert werden.

Glycohämoglobin, Hämoglobin und Hämoglobin-Derivate, die von dem Eluat mittels der Trennsäule der vorliegenden Erfindung getrennt werden, können basierend auf der Messung von sichtbarem Licht bei einer Wellenlänge von 415 nm detektiert werden. Wenn der pH und die Konzentration eines Elutionsmittels einem Wechsel unterworfen werden, induziert der Wechsel des Brechungsindexes eine Absorption. Deshalb kann sichtbares Licht bei einer Wellenlänge von 690 nm, bei dem die Absorption von Glycohämoglobin, Hämoglobin u. ä. nicht stattfindet, für die Referenz-Messung verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen erklärt.

Beispiel 1

Dort wurde ein Füllmaterial verwendet, wobei Carboxymethylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen als funktionelle Gruppen in ein Methacrylatpolymer als Matrix eingeführt wurden.

Tabelle 1 zeigt die Meßergebnisse der physikalischen Werte und des Druckverlustes des Füllmaterials in Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1. Das Füllmaterial von Beispiel 1 ist hergestellt durch Einführen von Dihydroxyboronylgruppen in das Füllmaterial mit Carboxymethylgruppen von Vergleichsbeispiel 1. Beispiel 1 ist nahezu gleich zu Vergleichsbeispiel 1 bezüglich Partikel-Durchmesser, spezifischer Oberfläche und der Menge an Carboxymethylgruppen. Sogar, wenn Dihydroxyboronylgruppen eingeführt worden sind, ändern sich der Partikel-Durchmesser, die spezifische Oberfläche und die Menge an Carboxymethylgruppen nicht sehr viel.

Diese zwei Füllmaterialien werden getrennt in eine Säule aus rostfreiem Stahl mit einem Innen-Durchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 80 mm als Trennsäule gepackt. Das Packen wurde nach der Aufschlämmungsmethode durchgeführt. 80 mM Kaliumphosphat mit einem pH 6,2 wurde als Aufschlämmungs-Lösungsmittel und Pack-Lösungsmittel verwendet. Das Pack-Lösungsmittel wurde bei einem Pack- Druck von 150 kg/cm² für eine Stunde eluiert.

Tabelle 1

Als eine Probe wurde frisch gesammeltes Blut von gesunden Erwachsenen, nach Zugabe von Natriumethylendiamintetraacetat als Anti-Koagulanz, verwendet. Ein käuflich erhältliches hämolytisches Agenz wurde zu dem frischen Blut für eine 200fache Verdünnung hinzugegeben und die erhaltene hämolytische Lösung wurde als Probe verwendet.

Als Elutionsmittel wurden Monokaliumphosphat (KH₂PO₄) und Dikaliumphosphat (K₂HPO₄) verwendet, nachdem sie vorbereitend in deionisiertem Wasser gelöst worden waren, so daß sie auf ihre Konzentration wie folgt eingestellt worden sind.

A Lösung:
33 mM KH₂PO₄
7 mM K₂HPO₄
pH 6,2

B Lösung:
66 mM KH₂PO₄
14 mM K₂HPO₄
pH 6,2

C Lösung:
160 mM KH₂PO₄
40 mM K₂HPO₄
pH 6,1

Als experimentelle Systeme wurden individuell eine intelligente Pumpe von Hitachi vom Typ L-6200, eine Einspritz-Vorrichtung mit 10 µl Kapazität, ein Detektor von Hitachi vom Typ L-4200 UV-VIS, ein Datenprozessor von Hitachi vom Typ D-2500 verwendet.

Die Detektion wurde durchgeführt bei einer Säulentemperatur von 25°C und einer Nachweiswellenlänge von 415 nm. Die Trennung von individuellen Komponenten war gemäß der schrittweisen Gradienten-Methode, wie im folgenden gezeigt wird:

Erste Lösung:
A Lösung 0-0,4 min

Zweite Lösung:
A Lösung/B Lösung=50/50 0,5-3,0 min

Dritte Lösung:
C Lösung 3,1-3,8 min

Vierte Lösung:
A Lösung 3,9-7,0 min

Fluß des Eltionsmittels: 1,2 ml/min

Injektions-Volumen der Probe: 10 µl

Unter den hier beschriebenen analytischen Bedingungen sind in Fig. 1 bzw. 2 das Chromatogramm, das auf der Trennsäule von Beispiel 1 erhalten worden ist, und das Chromatogramm, das auf der Trennsäule von Vergleichsbeispiel 1 erhalten worden ist, gezeigt.

In den Fig. 1 und 2 stellt Peak 1 A_1a; Peak 2 A_1b; Peak 3 HbF; Peak 4 A_1c in stabiler Form (s-A_1c); Peak 5 HbAc; Peak 6 A_1c in labiler Form (l-A_1c) dar.

Die individuellen Peaks wurden wie folgt identifiziert: Verschiedene Typen von Glycohämoglobin können durch Inkubation von Blut mit Zuckerderivaten erzeugt werden und die Bestätigung der dann verstärkten Peaks erlaubt die Identifizierung der individuellen Peaks.

Peak 1 (A_1c) wurde durch Hinzufügen von Fructose-1,6-Diphosphat und Glukose-6- Phosphat identifiziert, während Peak 2 (A_1a) durch Hinzufügen von Brenztraubensäure identifiziert wurde. Es wird angenommen, daß Peak 6 l-A_1c ist, weil Peak 6 deutlich verstärkt war, wenn eine Probe hergestellt und vermessen worden ist, nachdem Glukose zum Blut für die Inkubation hinzugefügt worden ist und weil sich Peak 6 verkleinerte, wenn eine Probe hergestellt und vermessen worden ist, nachdem Glukose zu dem Blut für die Inkubation hinzugefügt worden ist und das Blut dann in physiologischer Salzlösung bei 45°C für 4 Stunden inkubiert worden war. Andererseits kann Peak 4 als s-A_1c betrachtet werden, weil Peak 4 sich nicht vergrößerte oder verkleinerte, sogar nach Hinzufügen von Glukose oder der Inkubation in physiologischer Salzlösung. Es wird angenommen, daß Peak 3 HbF ist, weil dieser Peak das gleiche Erscheinungsbild zeigte, wie das der Hauptkomponenten von Nabelblut.

Im Fall von Vergleichsbeispiel 1 in Fig. 2, taucht Peak 6, der l-A_1c darstellt, auf. Im Gegensatz dazu, ist, im Fall der Verwendung der Trennsäule von Beispiel 1, l-A_1c komplett entfernt, wie in Fig. 1 zu sehen ist. Die Retentionszeiten der individuellen Komponenten, d. h. A_1a, A_1b, HbF, s-A_1c und HbA₀ sind nahezu gleich auf den Trennsäulen von Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1. Die Druckverluste der Säulen bei einem Elutionsmittel-Fluß von 0,2 ml/min waren fast gleich, nämlich 98 kg/cm² in Beispiel 1 und 95 kg/cm² in Vergleichsbeispiel 1.

Gemäß dem vorliegenden Beispiel kann die Entfernung (Abbau) von Hb und die Trennung davon in die individuellen Komponenten gleichzeitig ausgeführt werden, wie es oben beschrieben worden ist, so daß es möglich ist, die Behandlungszeit zum Entfernen von l-A_1c zu verkürzen, welche eine Zeit von 15 min bis 4 Stunden nach Stand der Technik betrug. Weil l-A_1c kontinuierlich innerhalb des Systems entfernt werden kann, sind solche komplexen Verfahren, wie sie üblicherweise ausgeführt worden sind, nicht mehr erforderlich. Weil die für den Abbau von l-A_1c benötigte Zeit kurz ist, kann ein genau gemessener Wert von s-A_1c erreicht werden, ohne die Degeneration oder den Abbau von GHb und Hb, die im Verfahren zur Entfernung von l-A_1c enthalten sind.

Gemäß dem vorliegenden Beispiel wird in Fig. 1 von Beispiel 1 beobachtet, daß die individuellen Hb-Komponenten ganz auf der Trennsäule von Beispiel 1 getrennt werden. Folglich kann die analytische Zeit weiter verkürzt werden durch die Verwendung einer kürzeren Säule und die Vergrößerung des Elutionsmittel-Volumens.

Beispiel 2

Betreffend Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2 zeigt Tabelle 2 die physikalischen Werte und den Druckverlust der Füllmaterialien. Die Trennsäulen von Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2 werden hergestellt durch Packen der Füllmaterialien von Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1 in kürzere Säulen (Durchmesser: 4,6×35 mm). Das Pack-Verfahren war dasselbe wie in Beispiel 1.

Unter Verwendung der Trennsäulen von Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2 wurden Glycohämoglobin und Hämoglobin gemessen. Das gleiche System wie in Beispiel 1 wurde verwendet. Die gleiche Probe wie in Beispiel 1 wurde nochmals verwendet. Die Trennung der individuellen Komponenten war gemäß des schrittweisen Gradienten-Verfahrens wie hier nachfolgend gezeigt. Die Zusammensetzungen der Eluentionsmittel-Lösungen A, B und C sind dieselben wie in Beispiel 1, aber das Gradienten-Programm und der Fluß der Elutionsmittel sind verschieden von denen in Beispiel 1.

Erste Lösung:
A Lösung 0-0,2 min

Zweite Lösung:
B Lösung 0,3-1,5 min

Dritte Lösung:
C Lösung 1,6-1,9 min

Vierte Lösung:
A Lösung 2,0-3,5 min

Fluß des Elutionsmittels: 1,4 ml/min

Tabelle 2

Unter den hier oben beschriebenen analytischen Bedingungen sind das auf die Trennsäule von Beispiel 2 erhaltene Chromatogramm und das auf der Trennsäule von Vergleichsbeispiel 2 erhaltene Chromatogramm in den Fig. 3 bzw. 4 gezeigt.

Die Druckverluste der Säulen bei einem Elutionsmittel-Fluß von 1,4 ml/min, in Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2, waren 48 kg/cm² bzw. 47 kg/cm².

In Fig. 3 stellt Peak 1 A_1a; Peak 2 A_1b; Peak 3 HbF; Peak 4 s-A_1c; Peak 5 HbA₀ dar. In Fig. 4 stellt Peak 1 A_1a; Peak 2 A_1b; Peak 3 HbF; Peak 7 {(l-A_1c) +(s-A_1c)}; Peak 5 HbA₀ dar.

In den Fig. 3 und 4 sind die Retentionszeiten der individuellen Komponenten nahezu gleich. Die Retentionszeit von Peak 4 (s-A_1c) in Fig. 3 ist gleich zu der Retentionszeit von Peak 7 {(l-A_1c)+(s-A_1c)}. Die Peak-Fläche von Peak 7 ist ungefähr 10% größer als die Peak-Fläche von Peak 4. Die Retentionszeit von Peak 7 in Fig. 4 ist identisch mit der Retentionszeit von Peak 4 in Fig. 3. Jedoch wird angenommen, weil Peak 7 l-A_1c enthält, daß die Peak-Fläche für diesen Teil größer ist.

Die Chromatogramme von 60 Proben wurden durch die Verfahren von Beispiel 2 und Vergleichsbeispiel 2 analysiert. Die Fläche von Peak 4 (s-A_1c) wurde mit der Fläche von Peak 7 {(l-A_1c)+(s-A_1c)} verglichen. Die Fläche von Peak 7 war im Mittel 6,8% größer (Bereich zwischen 3 und 12%) als die von Peak 4. Der Wert von Glycohämoglobin bei Hunger wurde gemessen und es ist erwägt worden, daß der Anteil von l-A_1c sofort nach der Mahlzeit größer wird.

In Beispiel 2 (Fig. 3) wird l-A_1c innerhalb der Trennsäule abgebaut, so daß 5 Komponenten von A_1a, A_1b, HbF, s-A_1c und HbA₀ in nur 3,5 Minuten voneinander getrennt werden können. So kann s-A_1c gemessen werden. Im Fall, daß l-A_1c und s-A_1c, wie in Vergleichsbeispiel 1 (Fig. 2), voneinander durch Chromatographie getrennt worden sind, sollte notwendigerweise eine längere Säule verwendet werden, verglichen mit der Säule von Beispiel 2, falls identische Füllmaterialien verwendet werden, was in einer längeren Analysezeit für diesen Teil resultiert. Wie es in Fig. 2 erscheint, ist die für die Messung einer Probe erforderliche Zeit sieben Minuten, was die einfache Zeit von Beispiel 2 (Fig. 3) bedeutet.

Gemäß dem vorliegenden Beispiel, wie es oben beschrieben worden ist, kann s-A_1c in einer kürzeren Zeit gemessen werden, verglichen mit der chromatographischen Methode zur Trennung von s-A_1c von l-A_1c. Weil die Menge von zu packenden Füllmaterialien geringer ist, wenn die Länge der Säulen kürzer wird, kosten die Säulen weniger. Weiterhin wird die Menge eines zu verwendenden Elutionsmittels geringer, was eine Verringerung der laufenden Kosten bedeutet.

Es wurde ein Vergleich zwischen den gemessenen Werten von Beispiel 2 und den gemessenen Werten von Vergleichsbeispiel 1 durchgeführt.

Als Proben wurde Anti-Koagulenz-enthaltendes frisches Blut von gesunden Erwachsenen oder von diabetischen Patienten, welches vorläufig mit einem hämolytischen Agenz verdünnt worden war, verwendet. Die Ergebnisse von 60 vermessenen Proben sind in Fig. 5 gezeigt. Die Abszisse der Figur stellt die s-A_1c-Konzentration (in %), gemessen durch das Verfahren von Beispiel 2, dar, während die Ordinate s-A_1c, gemessen nach der Methode von Vergleichsbeispiel 1, darstellt.

Der Korrelations-Koeffizient, γ, zwischen dem Verfahren von Beispiel 2 und dem von Vergleichsbeispiel 1, war 0,992. Die Korrelations-Formel wird durch Y= 1,03X-0,31 dargestellt, wobei die durch das Verfahren von Beispiel 2 erhaltene s-A_1c-Konzentration durch X dargestellt ist und die durch das Verfahren von Vergleichsbeispiel 1 erhaltene s-A_1c-Konzentration durch Y dargestellt ist. So wurde eine extrem gute Korrelation zwischen den beiden Verfahren erhalten.

Wie es oben beschrieben ist, kann das Verfahren von Beispiel 2 als ein Verfahren betrachtet werden, das in der Lage ist, A_1c in stabiler Form (s-A_1c) in Blut schnell und mit guter Reproduzierbarkeit zu analysieren.

Beispiel 3

Fig. 6 stellt ein Beispiel für ein Trennsystem für Glycohämoglobin in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung dar.

Als Proben wurde frisch gesammeltes Blut, nach Zusatz von Natriumethylendiamintetraacetat als Anti-Koagulanz, verwendet. Das Blut wurde 200fach mit einem käuflich erhältlichen hämolytischen Agenz verdünnt und das verdünnte Blut wurde auf einen Probentisch 19 einer selbstabtastenden Einrichtung 20 gestellt.

Als Trennsäule 23 wurde die gleiche verwendet wie sie im Vergleichsbeispiel 2 verwendet wurde. Die Säule hatten einen Innen-Durchmesser von 4,6 mm und eine Länge von 35 mm. Als Füllmaterial wurde eines verwendet, bei dem Carboxymethylgruppen in ein Methacrylatgel mit einem Partikel-Durchmesser von 4,5 µm eingeführt worden waren. In einer Vorbehandlungssäule 22, die eine Säule zum Entfernen von l-A_1c darstellt, wurde ein Füllmaterial mit einem Partikel-Durchmesser von 8 µm verwendet, wobei Dihydroxyboronylgruppen in ein Methacrylatgel eingeführt worden waren. Die Vorbehandlungssäule hatte einen Innen-Durchmesser von 4,6 mm und eine Länge von 10 mm. Im Fall, daß die Säule, die in Beispiel 2 verwendet wurde und bei der Carboxymethylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen in ein Methacrylatgel eingeführt wurden und bei der die Partikelgröße 4,5 µm ist, verwendet werden soll, wird die Entfernung von l-A_1c und die Trennung von Hb in seine individuellen Komponenten in einer einzigen Säule ausgeführt, so daß die Vorbehandlungssäule 22 nicht notwendig ist. Die Temperatur des Säulen-Thermostates 24 war auf 30°C voreingestellt. Als Elutionsmittel wurden eine erste Lösung 8, eine zweite Lösung 9 und eine dritte Lösung 10 verwendet, wie es in Beispiel 2 gezeigt ist.

In Fig. 6 stellt der durchgezogene Pfeil den Fluß von flüssigen Proben oder Elutionsmittel dar, während der gestrichelte Pfeil den Fluß von Signalen darstellt.

Die Trennung von individuellen Komponenten wurde im schrittweisen Gradienten- Verfahren wie folgend ausgeführt:

Erste Lösung:
A-Lösung 0-0,2 min

Zweite Lösung:
B-Lösung 0,3-1,5 min

Dritte Lösung:
C-Lösung 1,6-1,9 min

Vierte Lösung:
A-Lösung 2,0-3,5 min

Fluß des Elutionsmittels: 1,4 ml/min.

Die auf den Probentisch 19 gestellte Probe wird über den Ansaugstutzen 18 und die Probenübertragungsleitung 27 in die Probenschleife 16 mittels einer Spritze 14 übertragen und wird dann gemessen. Die Waschlösung 11 wird über einen Drei- Wege-Hahn 15 zugeführt. Durch Umlegen des Sechs-Wege-Hahns 17 wird die in der Probenschleife 16 gemessene Probe durch einen Filter 21 geführt und in die Vorbehandlungssäule 22 überführt und wird dann kontinuierlich in die Trennsäule 23 übergeleitet.

Nach Durchgang durch eine elektrische Drei-Wege-Pumpe 12 mittels einer Übertragungspumpe 13 und nach Übertragen über einen Filter 21 in die Vorbehandlungssäule 22 werden die Elutionsmittel Erste Lösung 8, Zweite Lösung 9, Dritte Lösung 10 in die Trennsäule 23 eingeleitet. Durch ein UV-VIS-Detektor 25 wird die Absorption des Eluats von der Trennsäule 23 bei einer Wellenlänge von 415 nm gemessen; die Absorption bei einer Wellenlänge von 690 nm wurde als Referenz gemessen.

Unter den Gradienten-Bedingungen kann das in Fig. 3 gezeigte Chromatogramm erhalten werden. Es kann, wie in Fig. 3 gezeigt, Hämoglobin in A_1a, A_1b, HbF, s- A_1c und HbA₀ bei einem Zyklus von nur 3,5 Minuten getrennt werden. Das Verhältnis von s-A_1c (in Prozent) zu Gesamt-Hb wurde basierend auf den Chromatogrammen mittels eines Daten-Prozessors 26 (Datenprozessierungseinheit) bestimmt.

Weil die Entfernung von l-A_1c kontinuierlich innerhalb des Systems gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden kann, kann eine Automatisierung eines solchen Prozesses leicht erreicht werden. Wenn l-A_1c automatisch entfernt werden kann, ist die Meß-Genauigkeit gut. Mit anderen Worten: die Reproduzierbarkeit der gemessenen Werte ist gut. Weiterhin ist das Verfahren einfach.

Die Hauptsystemkonstruktion der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 7 abgebildet, während ein Ausführungsbeispiel der Systemkonstruktion der Vorrichtung von Vergleichsbeispiel 3 in Fig. 8 abgebildet ist. Wie in Fig. 8 abgebildet ist, wird die auf den Probentisch 19 der selbstabtastenden Einrichtung vorgegebene Probe durch die Probenüberführungsleitung 27 in der Probenschleife 16 vermessen und die Probe wird in den l-A_1c-entfernenden Teil 28 durch Umlegen des Sechs- Wege-Hahnes 17 eingeführt. Das l-A_1c im Blut wird entfernt oder reduziert bei dem l-A_1c-entfernenden Teil 28 durch Hitzebehandlung oder ähnliches. Die Probe, aus der l-A_1c entfernt wird, wird in die Trennsäule 23 eingeführt. Andererseits werden die Elutionsmittel 8 und 9 über den elektromagnetischen Drei-Wege-Hahn 12 in die Trennsäule 23 mittels einer Überführungspumpe 13 eingeleitet. Das Eluat von der Trennsäule 23 wird durch eine UV-VIS-Detektor 25 detektiert. Wie oben beschrieben worden ist, ist das in die Trennsäule von Vergleichsbeispiel 3 gepackte Füllmaterial ein Ionenaustauscherharz, wobei Carboxylgruppen, in z. B. Silikagel und Methacrylatgel, eingeführt sind. Somit hat es keine Kapazität zur Entfernung von l-A_1c, so daß ein Teil zum Entfernen von l-A_1c vor dem Injektionsteil der Säule plaziert werden sollte. Im Gegenteil hat die Trennsäule der vorliegenden Erfindung die folgenden zwei Wirkungen, d. h. die Trennung von Hämoglobin und Glycohämoglobin und das Entfernen von l-A_1c. Wie in Fig. 7 gezeigt, ist das Positionieren eines l-A_1c-entfernenden Mechanismus nicht erforderlich. Also ist die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung einfacher in seiner System-Konstruktion und kann mit kleineren Abmessungen entworfen werden.

Als Trennsäule 23 ist eine der drei nachfolgend beschriebenen Typen eingebaut, nämlich 1. eine Trennsäule, die mit einem Füllmaterial gepackt ist, das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkyl- und Dihydroxyboronylgruppen besteht; 2. eine Trennsäule, die mit einem Füllmaterial gepackt ist, das durch Mischen eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen, und eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, hergestellt ist; und 3. eine Trennsäule, wobei ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, getrennt in zwei Schichten in Fließrichtung der Elutionsmittel gepackt werden. Die Füllmaterialien innerhalb der Trennsäule sind spezifiziert, so daß die spezifische Oberfläche 5 bis 200 m²/g in trockenem Zustand ist, so daß die Menge der Carboxyalkylgruppen 0,1 bis 1 meq pro g×Trockengewicht ist, und so daß die Menge der Dihydroxyboronylgruppen 0,1 bis 1 meq pro g×Trockengewicht ist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Entfernung von l-A_1c und die Trennung von Hb in seine individuellen Komponenten auf einer identischen Trennsäule ausgeführt werden oder kontinuierlich innerhalb des Systems, so daß der für den Abbau von l-A_1c erforderliche Zeitraum, der üblicherweise eine lange Zeit, d. h. 15 Minuten bis vier Stunden erforderte, abgekürzt werden kann.

Weil das komplexe Verfahren der Entfernung von l-A_1c nicht notwendigerweise ausgeführt werden muß, kann das Verfahren auch extrem vereinfacht werden.

Weil der Abbau von l-A_1c nicht die Degeneration von GHb und Hb umfaßt, kann ein genau gemessener Wert von s-A_1c ebenso erhalten werden.

Weil l-A_1c kontinuierlich innerhalb des Systems entfernt werden kann, kann eine Automatisierung des Verfahrens einfach realisiert werden, wobei die Präzision in der Messung und die Reproduzierbarkeit der gemessenen Ergebnisse verbessert werden kann.

Claims

1. Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin durch Hochleistungs-Flüssig- Chromatographie, das umfaßt: gleichzeitiges Ausführen eines Verfahrens der Trennung von Glycohämoglobin, Hämoglobin und Hämoglobinderivaten im Blut und eines Verfahrens des Abbaus von Hämoglobin in labiler Form im Blut in Glukose und Hämoglobin, wodurch die Hämoglobinkomponente in labiler Form entfernt wird, und anschließendes Messen von Hämoglobin in stabiler Form.

2. Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin im Blut durch Hochleistungs- Flüssig-Chromatographie, das umfaßt: Durchleiten von Elutionsmitteln durch eine Trennsäule, die mit einem Füllmaterial gepackt ist, das aus einer anorganischen oder organischen pörosen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen besteht, wodurch Hämoglobin in labiler Form im Blut abgebaut und entfernt wird, und anschließendes Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form im Blut.

3. Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin nach Anspruch 2, wobei die Elutionsmittel Puffer mit pH 5 bis 6 sind.

4. Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin im Blut durch Hochleistungs- Flüssig-Chromatographie, das umfaßt: Durchleiten von Elutionsmitteln durch eine Trennsäule, wobei ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen miteinander vermischt werden, wodurch Hämoglobin in labiler Form im Blut abgebaut und entfernt wird, und anschließendes Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form im Blut.

5. Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin nach Anspruch 4, wobei die Elutionsmittel Puffer mit pH 5 bis 7 sind.

6. Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin im Blut durch Hochleistungs- Flüssig-Chromatographie, das umfaßt: Durchleiten von Elutionsmitteln durch Füllmaterialien, wobei jedes aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen besteht und anschließendes Durchleiten der Elutionsmittel durch Füllmaterialien, wobei jedes aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen besteht, oder Durchleiten der Elutionsmittel in einer Elutions-Folge, die zu der oben genannten Folge umgekehrt ist, wodurch Hämoglobin in labiler Form im Blut abgebaut und entfernt wird, und anschließendes Messen von Glycohämoglobin in stabiler Form im Blut.

7. Verfahren zum Messen von Glycohämoglobin nach Anspruch 6, wobei die Elutionsmittel Puffer mit pH 5 bis 7 sind.

8. Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin, um Hämoglobin in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie zu messen, die umfaßt: eine Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum Injizieren einer verdünnten Blutgruppe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum Durchleiten von Elutionsmitteln durch die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei die Trennsäule mit der Funktion zum gleichzeitigen Ausführen des Verfahrens der Trennung von Glycohämoglobin, Hämoglobin und Hämoglobinderivaten und des Verfahrens zum Abbau von Hämoglobin in labiler Form im Blut in Glukose und Hämoglobin, um Hämoglobin in labiler Form zu entfernen, ausgestattet ist.

9. Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin, um Hämoglobin in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie zu messen, die umfaßt: eine Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum Durchleiten von Elutionsmitteln durch die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei die Trennsäule mit einem Füllmaterial gepackt ist, das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkyl- und Dihydroxyboronylgruppen besteht.

10. Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin, um Hämoglobin in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie zu messen, die umfaßt: eine Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum Durchleiten von Elutionsmitteln durch die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei die Trennsäule mit einem Füllmaterial gepackt ist, das durch Mischen eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxybornylgruppen, hergestellt ist.

11. Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin, um Hämoglobin in stabiler Form im Blut durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie zu messen, die umfaßt: eine Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum Durchleiten von Elutionsmitteln durch die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, getrennt in zwei Schichten sind und einzeln in die Trennsäule gepackt sind.

12. Vorrichtung zum Messen von Glycohämoglobin, um Hämoglobin in stabiler Form durch Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie zu messen, die umfaßt: eine Trennsäule zum Abtrennen von Glycohämoglobin im Blut, eine Einrichtung zum Injizieren einer verdünnten Blutprobe in die Trennsäule, eine Einrichtung zum Durchleiten von Elutionsmitteln durch die Trennsäule und eine Einrichtung zum Detektieren von Hämoglobin in stabiler Form in einem Eluat von der Trennsäule, wobei die Trennsäule in zwei Teile in Fließrichtung der Elutionsmittel geteilt ist, wobei ein Teil mit einem Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen gepackt ist und der andere Teil mit einem Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, gepackt ist.

13. Trennsäule, die mit einem Füllmaterial gepackt ist, das aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und Dihydroxyboronylgruppen besteht.

14. Trennsäule nach Anspruch 13, wobei das Füllmaterial eine spezifische Oberfläche von 5 bis 200 m²/g hat, die Menge der Carboxyalkylgruppen pro g× Trockengewicht des Füllmaterials 0,1 bis 1 meq ist und die Menge der Dihydroxyboronylgruppen pro g×Trockengewicht des Füllmaterials 0,1 bis 1 meq ist.

15. Trennsäule, die mit einem Füllmaterial gepackt ist, das durch Mischen eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und eines Füllmaterials, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, hergestellt ist.

16. Trennsäule nach Anspruch 15, wobei das Füllmaterial eine spezifische Oberfläche von 5 bis 200 m²/g hat, die Menge der Carboxyalkylgruppen pro g× Trockengewicht des Füllmaterials 0,1 bis 1 meq ist und die Menge der Dihydroxyboronylgruppen pro g×Trockengewicht des Füllmaterials 0,1 bis 1 meq ist.

17. Trennsäule, wobei ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Carboxyalkylgruppen und ein Füllmaterial, bestehend aus einer anorganischen oder organischen porösen Substanz mit Dihydroxyboronylgruppen, getrennt in zwei Schichten in Fließrichtung der Elutionsmitteln, gepackt sind.

18. Trennsäule nach Anspruch 17, wobei das Füllmaterial eine spezifische Oberfläche von 5 bis 200 m²/g hat, die Menge der Carboxyalkylgruppen pro g× Trockengewicht des Füllmaterials 0,1 bis 1 meq ist und die Menge der Dihydroxyboronylgruppen pro g×Trockengewicht des Füllmaterials 0,1 bis 1 meq ist.