DE69332138T2 - Bestimmung von glykosyliertem hämoglobin durch dämpfung der fluoreszenz - Google Patents
Bestimmung von glykosyliertem hämoglobin durch dämpfung der fluoreszenzInfo
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Description
- Glykosyliertes Hämoglobin ist ein generischer Ausdruck, der auf eine Reihe von kleinen Hämoglobinverbindungen verweist, die durch die Anlagerung von verschiedenen Zuckern, für gewöhnlich Glukose, an das Hämoglobinmolekül gebildet werden. Die wichtigste dieser kleinen Hämoglobinkomponenten bezüglich Diabetes ist Hämoglobin A1c. Es wird gebildet durch die Anlagerung von Glukose an den N-terminalen Aminosäurerest, Valin, an einer oder beiden b-Ketten von Hämoglobin A (Goldstein, D. E., et al., Clin. Chem. 32: B64-B70, 1986).
- Der menschliche Erythrozyt ist frei durchlässig für Glukose. Innerhalb jedes Erythrozyten wird glykosyliertes Hämoglobin aus Hämoglobin A (die natürliche, normale Form) mit einer Geschwindigkeit proportional zu der umgebenden Glukosekonzentration gebildet. Die Reaktion ist spontan, nicht enzymatisch katalysiert, aber langsam genug, dass nur ein Abschnitt des Hämoglobins während der Lebensspanne des Erythrozyten (120 Tage) modifiziert wird, und sie ist irreversibel. Als ein Ergebnis stellt glykosyliertes Hämoglobin einen gewichteten "laufenden" Mittelwert vergangener Blutglukosespiegel bereit, wobei jüngere Glukosespiegel einen größeren Einfluss haben (Singer, et al., Ann. Clin. Biochem. 26: 213-219, 1989).
- Erhöhte Spiegel von glykosyliertem Hämoglobin sind bekannt dafür, mit Diabetes mellitus einherzugehen. Glykosyliertes Hämoglobin ist bei Nicht-Diabetikern mit einem Spiegel von ungefähr 5% des Gesamthämoglobins vorhanden, während Diabetiker 2-4 mal diese Menge aufweisen. Spiegel von glykosyliertem Hämoglobin sind relativ unbeeinflusst von Kurzzeitschwankungen (von Stunde zu Stunde) im Blutzuckerspiegel und geben daher eine relativ genaue Reflektion des Zustandes der Blutglukosekontrolle bei Diabetikern ab. Die Ergebnisse sind ein Hinweis auf die zeitlich mittlere Blutglukosekonzentration über die letzten 1 bis 3 Monate. Messungen von glykosyliertem Hämoglobin werden verwendet für die Abschätzung der Schwere der Glukoseintoleranz bei einem Diabetikpatienten und bei der Behandlung von Diabetes mellitus (Lester, Ann. Clin. Biochem. 26: 213-219, 1989; Kennedy, et al., Br. Med. Bull. 45: 174-190, 1989; Fluckiger, et al., J. Chromatogr. 429: 279-292, 1988; Goldstein, et al., Clin. Chem. 32: B64-70, 1986; Mortensen, Dan. Med. Bull. 32: 309-328, 1985; Goldstein, et al., CRC Crit. Rev. Clin. Lab. Bei. 21 : 187-228, 1984; Peacock, J. Clin. Pathol. 37: 841-851, 1984; Miedema, et al., Ann. Clin, Biochem. 21: 2-15, 1984; Mayer, et al., Clin. Chem. Acta 127: 147-184, 1983; Gabbay, Med. Clin. North Am., 66: 1309-1315, 1982).
- Es gibt verschiedene Verfahren zum Messen von glykosyliertem Hämoglobin; als Hämoglobin A1c oder als Hämoglobin A1, oder als glykosyliertes Gesamthämoglobin (Ionenaustauschchromatographie, Thiobarbitursäure-Verfahren, isoelektrische Fokussierung und Affinitätschromatographieassays) (Cole, R. A., et al., Metabolism 27: 289-301, 1978; Nathan, D. M., Clin. Chem. 27: 1261- 1263, 1981; Moore, J. C., et al., Ann. Clin. Biochem. 23: 85-91, 1986). Bei einer Ionenaustauschchromatographie sind viele glykosylierte Hämoglobinspezies, einschließlich Hämoglobin A1c, weniger positiv geladen bei neutralem pH als Hämoglobin A&sub0;, und binden weniger gut an ein negativ geladenes Harz (Rosenthal, P. K., et al., AM. J. Clin. Pathol., 75: 45-49, 1981; US-Patent Nr. 4.407.961, US-Patent Nr. 4.649.122). Einige Verfahren sind beschrieben worden, die Hämoglobin A von der Hämoglobin A- Fraktion trennen (Goldstein, D. E., et al., Diabetes 31: 70-78, 1982; Maquart, F. X., et al., Clin. Chim. Acta 108: 329-332, 1980; Jones, M. D., et al., Hemoglobin 2: 53-58, 1978; Clarke, J. T., et al.. Diabete Metabol. 5: 293-296, 1979; Davis, J. E., et al., Diabetes 27: 102-107, 1978; Cole, R. A., et al., Metabolism 27: 289-301, 1978; US-Patent Nr. 4.389.491; Bio-Rad Laboratories, Hemoglobin A1c Micro Column Test Instruction Manual, March 1990). Jedoch leiden diese Verfahren an einem oder mehreren Nachteilen. Viele der Verfahren schließen die Verwendung von zwei Puffern ein, der erste, um ungebundenes Material von dem Ionenaustauscherharz so zu eluieren, dass keine Desorption des spezifisch gebundenen Materials herbeigeführt wird. Ein zweiter Puffer, der bei unterschiedlichem pH, unterschiedlicher Ionenstärke verwendet wird oder der einen kompetitiven Hemmer enthält, wird benötigt, um das spezifisch gebundene Material zu eluieren. Die Temperatur, der pH, die Ionenstärke oder die Gegenwart eines kompetitiven Hemmers wird benötigt, um das spezifisch gebundene Material zu eluieren. Die Temperatur, der pH, die Ionenstärke und die Säulengröße beeinflussen die Versuchsergebnisse (Simon, M., et al., Diabetes 29: 467-474, 1980; Schellekens, A. P. M., et al., Clin. Chem. 27: 94-99, 1981; Castagnola, M., et al., J. Chromatogr. 272: 51-65, 1983). Darüber hinaus erfordern die Verfahren mehrere unterschiedliche Schritte, mehrere Kessel, und die meisten der Verfahren sind nicht automatisiert oder nur halb automatisiert.
- Andere Beschränkungen für diese Tests, je nach verwendetem Verfahren, umfassen eine reversible glykosylierte Zwischenform, "Prä-Hämoglobin-Alc", welche entfernt werden muss, bevor der Test durchgeführt wird (Goldstein, D. E, et al., Diabetes 31: 70- 78, 1982; Bunn, H. F., Diabetes 30: 613-617, 1981; Nathan, D. M., Clin. Chem. 27: 1261-1263, 1981; Mayer, T. K., et al., Clin. Chim. Acta 127: 147-184, 1983; Health and Public Policy Committee, American College of Physicians Ann. Intern Med. 101: 710-713, 1984) (Nathan, D. M. Clin. Chem. 27: 1261-1263, 1981). Hohe Spiegel von fetalem Hämoglobin, Sichelzellenhämoglobin und andere seltenere Zustände können diesen Test stören (Niejadlik, D. C., et al., JAMA 224: 1734- 1736, 1973).
- Andere Verfahren zur Bestimmung von glykosyliertem Hämoglobin nutzen spezifische Affinitäts- oder Bindungsmittel, um glykosyliertes Hämoglobin zu binden. In den folgenden Patenten, US-Patent Nr. 4.200.435; 4.260.516; 4.274.978; 4.255.385 und 4.438.204, wird glykosyliertes Hämoglobin unter Verwendung von Affinitätsverfahren oder der allosterischen Eigenschaften von Hämoglobin bestimmt. In DE-Patent 1595 69 wird ein Zuckerbindendes Protein als ein Affinitätsreagenz beschrieben.
- Andere Affinitätsbindungsverfahren basieren auf spezifischer Komplexbildung zwischen glykosyliertem Hämoglobin und Boronsäurederivaten (Middle, et al., Biochem. J. 209: 771-779, 1983; Klenk, et al., Clin. Chem. 28 : 2088-2094, 1982; Little, et al., Clin. Chem. 32: 358-360, 1986; US-Patent Nr. 4.269.605; US- Patent Nr. 4.861.728; UK-Patentanmeldung GB 2 206 411 A; Isolab, Inc. Technical Publication:Glyc-Affin GHb, 1986; Forrest, R. D., et al., Clin. Chem. 34: 145-148, 1988). Auch wenn Affintätsbindungsverfahren glykosylierte Hämoglobinspezies zusätzlich zu HbA1c nachweisen, korrelieren sie linear mit Verfahren, die für HbA1c spezifischer sind, wie zum Bespiel Ionenaustauschchromatographie (Little, et al., Clin. Chem. 32: 358-360, 1986). Ähnlich wie der Ionenaustausch- und kolorimetrische Test für glykosyliertes Hämoglobin haben Affinitätsverfahren auch Beschränkungen. Eine der Beschränkungen ist, dass zwei unterschiedliche Puffer erforderlich sind. Der erste Puffer eluiert die nicht-glykosylierte Fraktion, welche keine cis-Diolgruppen aufweist. Die gebundene Fraktion, reich an glykosyliertem Hämoglobin, wird mit einem zweiten Puffer eluiert, welcher ein Verdrängungsmittel wie einen Zuckeralkohol enthält, das glykosyliertes Hämoglobin von der Säule verdrängt. Zusätzlich begrenzt die Strömungsgeschwindigkeit und die Größe der Säule die Menge von Hämoglobin, die an das Affinitätsmittel gebunden wird.
- US-A-4 269 605 offenbart ein Verfahren zur Trennung von glykosylierten und nicht-glykosylierten Hämoglobinen aus einer Blutprobe. Die endgültige Bestimmung jedoch wird durch einen kolorimetrischen Test basierend auf der Absorption von Hb bei 413 nm ausgeführt.
- Es gibt einen Bedarf für einen Test für glykosyliertes Hämoglobin, der einfach durchzuführen, frei von Wechselwirkungen und relativ unempfindlich für experimentelle Variablen wie pH und Temperatur ist. Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ein Testverfahren und Reagenzien zu entwickeln, um Messungen von glykosyliertem Hämoglobin genau und mit Exaktheit durchzuführen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Messung von glykosyliertem Hämoglobin durch Fluoreszenzlöschung. Auch wenn glykosyliertes Hämoglobin und normales Hämoglobin beide Fluoreszenz in dem gleichen Ausmaß löschen, entdeckten die Erfinder unerwartet, dass Fluoreszenzlöschung verwendet werden kann, um die glykosylierten Hämoglobinspiegel in Blutproben zu beurteilen. Die vorliegende Erfindung schließt einzigartig die Durchführung von zwei aufeinanderfolgenden Fluoreszenzlöschungsmessungen ein: eine Messung der Fludreszenzlöschung verursacht durch Gesamthämoglobin in der Probe, und eine Messung der Fluoreszenzlöschung verursacht durch glykosyliertes oder nicht-glykosyliertes Hämoglobin, das in der Probe vorhanden ist. Glykosyliertes Hämoglobin und nicht- glykosyliertes Hämoglobin können durch eine Vielfalt von Verfahren, wie hierin beschrieben, getrennt werden, einschließlich Ioneneinfang- und Festphasentrennungen.
- Die analytischen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden in den Ansprüchen 1 und 14 dargelegt.
- Fig. 1: Typische Kalibrierkurven (% Fluoreszenz relativ zum Kalibrator A versus Hämoglobinkonzentration in mM) für Gesamthämoglobin und glykosyliertes Hämoglobin unter Verwendung der Kalibratoren, die in Tabelle 1 aufgelistet sind, in der Testform von Beispiel 6 der vorliegenden Erfindung.
- Fig. 2: Eine Korrelationskurve von 201 Patientenproben, die auf den prozentualen Anteil von glykosyliertem Hämoglobin unter Verwendung dieser Erfindung (Beispiel 6) und des Glyc-Affn-Tests von Isolab getestet wurden.
- Fig. 3: Eine typische Kalibrierkurve (Reziprokwert der Fluoreszenz in Zählungen pro Sekunde versus der Hämoglobinkonzentration in mM) für glykosyliertes Hämoglobin unter Verwendung der Kalibratoren von Beispiel 4 in dem Assayformat von Beispiel 8 der vorliegenden Erfindung.
- Fig. 4: Eine typische Kalibrierkurve (Reziprokwert der Fluoreszenz in Zählungen pro Sekunde versus der Hämoglobinkonzentration in mM) für Gesamthämoglobin unter Verwendung der Kalibratoren von Beispiel 4 in dem Assayformat von Beispiel 8 der vorliegenden Erfindung.
- Fig. 5: Eine Korrelationskurve von 20 Patientenproben, die auf den prozentualen Anteil von glykosyliertem Hämoglobin unter Verwendung dieser Erfindung (Beispiel 8) und des Glyc-Affn-Tests von Isolab getestet wurden.
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Messung von glykosyliertem Hämoglobin durch Fluoreszenzlöschung. Auch wenn glykosyliertes Hämoglobin und normales Hämoglobin beide Fluoreszenz in dem gleichen Ausmaß löschen, entdeckten die Erfinder unerwartet, dass Fluoreszenzlöschung verwendet werden kann, um die glykosylierten Hämoglobinspiegel in Blutproben zu beurteilen. Die vorliegende Erfindung schließt einzigartig die Durchführung von zwei aufeinanderfolgenden Fluoreszenzlöschungsmessungen ein: eine Messung der Fluoreszenzlöschung verursacht durch Gesamthämoglobin in der Probe, und eine zweite Messung der Fluoreszenzlöschung verursacht durch glykosyliertes Hämoglobin, das in der Probe vorhanden ist, nachdem das nicht-glykosylierte Hämoglobin entfernt ist. Glykosyliertes Hämoglobin und nicht-glykosyliertes Hämoglobin können durch eine Vielfalt von Verfahren, wie hierin beschrieben, getrennt werden, einschließlich Ioneneinfang- und Festphasentrennungen.
- Fluoreszenzlöschung umfasst die Fähigkeit bestimmter Moleküle, wie z. B. die Häm-Komponente von Hämoglobin, die Anregungsenergie benachbarter fluoreszierender Verbindungen, welche einfallender Anregungsstrahlung ausgesetzt worden sind, zu absorbieren. Normalerweise absorbiert eine fluoreszierende Verbindung, die einfallender Anregungsstrahlung mit der geeigneten Wellenlänge ausgesetzt wird, Energie (Strahlung) und setzt dann die Energie in Form von Fluoreszenzstrahlung frei. Im angeregten Zustand kann die fluoreszierende Verbindung die absorbierte Energie auch freisetzen, indem die Energie an ein anderes Agens, wie z. B. eine Löscherverbindung wie das Häm von Hämoglobin, übertragen wird. Diese Energieübertragung verringert den Betrag der Fluoreszenz, die normalerweise produziert würde, und wird als Löschung bezeichnet.
- Als ein erster Schritt bei der Bestimmung von glykosyliertem Hämoglobin in Blutproben ist es notwendig, die roten Blutzellen aufzulösen. Durch Auflösen der Blutzellen wird sowohl glykosyliertes Hämoglobin als auch nicht-glykosyliertes Hämoglobin aus den Zellen freigesetzt. Gewöhnliche kationische (z. B. Cetyltrimethylammoniumbromid), anionische (z. B. Natriumdodecylsulfat und Natriumdesoxycholat) und neutrale (z. B. Saponin und Polyoxyethylen) Detergenzien sind nützlich zum Auflösen roter Blutzellen. Neutrale Detergenzien wie Saponin im Konzentrationsbereich von ungefähr 0,1 bis 5% (V/V) werden bevorzugt, und noch besser Konzentrationen innerhalb des Bereichs von ungefähr 0,5% bis ungefähr 2% (V/V). Mechanische Spaltung, zum Beispiel Ultraschall- und hypotone Lyse, sind ebenfalls wirksame Arten der Freisetzung von Hämoglobin aus roten Blutzellen. Vorzugsweise wird die Auflösung roter Blutzellen erreicht durch Zugabe eines Detergens wie Triton X- 100® mit ungefähr 0,5%, gefolgt von zwei Zyklen schnellem Ansaugen der Mischung in eine Pipette und Dispensieren daraus. Dieses Verfahren ergab nahezu sofortige Hämolyse von frischem Vollblut.
- In einem bevorzugten Verfahren wird nach dem Auflösen der roten Blutzellen die Probe mit einem Indikatorreagenz in Kontakt gebracht, das ein detektierbares Fluoreszenzsignal aufweist. Eine erste Messung der Fluoreszenzlöschung, die durch die Mischung von glykosyliertem Hämoglobin und nicht-glykosyliertem Hämoglobin (Gesamthämoglobin) hervorgerufen wird, wird erhalten. Das glykosylierte Hämoglobin und das nicht-glykosylierte Hämoglobin werden getrennt, und eine zweite Messung der Fluoreszenzlöschung, die durch das glykosylierte oder das nicht- glykosylierte Hämoglobin hervorgerufen wird, wird erhalten. Der prozentuale Anteil von glykosyliertem Hämoglobin kann dann aus diesen zwei Messungen berechnet werden.
- In einem alternativen bevorzugten Verfahren wird nach dem Auflösen der roten Blutzellen die Probe mit einem Indikatorreagenz in Kontakt gebracht, das ein detektierbares Fluorszenzsignal aufweist, und das glykosylierte Hämoglobin und das nicht-glykosylierte Hämoglobin werden getrennt. Eine erste Messung der Fluoreszenzlöschung, die durch das glykosylierte oder nicht-glykosylierte Hämoglobin hervorgerufen wurde, wird erhalten. Dann wird eine zweite Messung der Fluoreszenzlöschung erhalten, die sowohl durch das glykosylierte Hämoglobin als auch durch das nicht-glykosylierte Hämoglobin hervorgerufen wurde. Diese zweite Messung kann erreicht werden entweder durch Messung der Fluoreszenzlöschung verursacht durch das Gesamthämoglobin, oder durch Messen der Fluoreszenzlöschung verursacht durch das nicht-glykosylierte Hämoglobin und Addieren dieses Wertes zu der ersten Messung. Der prozentuale Anteil von glykosyliertem Hämoglobin kann dann aus der ersten und zweiten Messung berechnet werden.
- In noch einem anderen bevorzugten Verfahren wird das Indikatorreagenz direkt oder indirekt auf einer feste Phase oder Matrix eingelagert, die zur Trennung von glykosyliertem Hämoglobin und nicht-glykosyliertem Hämoglobin verwendet wird.
- Ein Indikatorreagenz umfasst eine fluoreszierende Verbindung, deren Fluoreszenz durch Hämoglobin messbar gelöscht wird. fluoreszierende Verbindungen, welche in dieser Erfindung verwendet werden können, umfassen Umbelliferon, Methylumbelliferon und andere Cumarine, Fluorescein, Rhodamin und dergleichen.
- Die Trennung von glykosyliertem Hämoglobin und dem nicht- glykosylierten Hämoglobin kann durch eine Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein spezifisches Bindungsglied, das spezifisch ist für glykosyliertes Hämoglobin, in dem Trennverfahren verwendet. Ein spezifisches Bindungsglied, wie hier verwendet, bedeutet ein Glied eines spezifischen Bindungspaares, d. h. zwei unterschiedliche Moleküle, wobei eines der Moleküle durch chemische oder physikalische Mittel spezifisch an das zweite Molekül bindet. Spezifisches Bindungsglied schließt Dihydroxyborylkomponenten, Lectine, monoklonale oder polyklonale Antikörper wie Anti-HbA1c-Antikörper und andere Bindungsproteine einschließlich rekombinanter Proteine ein. Ein beispielhafter monoklonaler Anti-HbA1c-Antikörper ist beschrieben in Knowles, et al., US-Patent 4.727.036.
- Ein bevorzugtes spezifisches Bindungsglied, das spezifisch ist für glykosyliertes Hämoglobin, ist die Dihydroxyborylkomponente, wie beschrieben in US-Patent 4.269.605. Die Komponente ist vorzugsweise Phenyl oder substituierte Phenylboronsäure, Borsäure oder andere Boronsäuren, wie Ethanboronsäure und 1- Propanboronsäure, und dergleichen. Das Boronat muss zuerst in der tetraedrischen anionischen Form sein, bevor diese Reaktion wirksam eintreten kann (d. h. der pH der Lösung muss größer als der pK des Boronats sein). Durch einen Mechanismus, der nicht gut verstanden wird, kann tetraedrisches Boronat Hydroxyle mit einem 1,2-cis-Diol austauschen, wobei zwei Wassermoleküle freigesetzt werden und der fünfgliedrige Ring-kovalente Komplex gebildet wird.
- Vorzugsweise werden die Boronat/Diol-Komplexe in Gegenwart von Puffern gebildet, die dazu dienen, den Boronat/Diol-Komplex zu verstärken. Kompatible Puffer in diesem Testsystem sind Puffer mit einem pKa in dem ungefähren Bereich von 7,5 bis 11,0. Puffer innerhalb dieses Bereichs sind auf dem Gebiet bekannt. Bevorzugter sind Puffer mit pKa-Werten von ungefähr 8,5 bis 9,2, um den pH während des Tests in dem pH-Bereich von ungefähr 7,8 bis 9,6 bei 37ºC zu halten, besser zwischen ungefähr 8,5 und 9,2, am besten im Bereich von 9 bis 9,2. Amine können dazu dienen, den Komplex zu verstärken, folglich können Puffer wie Glycin, Morpholin, HEPES, oder Additive wie Ammoniumsalze oder Piperadin vorteilhaft sein, um die Boronat/Diol-Komplexbildung zu fördern. Unprotonierte Amine können als Elektronendonatoren dienen, um einen neutralen Komplex mit Boronat zu bilden, worin es eine negative Ladungsdichte auf dem Boronat und positive Ladung auf dem Amin gibt. In diesem Zustand sind zwei Boronhydroxyle noch verfügbar für die Bindung an 1,2-cis-Diole wie glykosyliertes Hämoglobin. Vorzugsweise wird ein Aminopuffer, wie HEPES-Puffer, zu der Boron/Diol-Reaktion hinzugegeben, vorzugsweise in der roten Zellauflösungsreaktion. Amine scheinen die gebildeten Boronat/Diol-Komplexe zu verstärken, möglicherweise durch Senken des scheinbaren pKa- Werts des Boronats. Jedoch können Hydroxyl-Amino-Puffer wie Tris-Puffer die Boronat/Diol-Komplexbildung stören, indem sie mit dem Boron Komplexe bilden.
- Vorzugsweise wird der Boronat/Diol-Komplex in Gegenwart von Mg gebildet. US-Patentanmeldung Serien-Nr. 717.558, veröffentlicht in Europa als WO 92/228, mit der Bezeichnung "Rapid Determination of Glycated Hemoglobin", welche sich des gemeinsamen Eigentums erfreut, Middle, et al., Biochem. J. 209: 771-779 (1983), und in Boronate Ligands in Biochemical Separations, Publication 501, Amicon Corporation (1981), beschreiben die Verwendung bivalenter Kationen, primär Mg abgeleitet von MgCl&sub2; oder MgSO&sub4;, um die Abstoßung zwischen dem negativ geladenen Boronat und den negativ geladenen Liganden zu überwinden.
- Vorzugsweise wird der Trennprozess erreicht, indem die Probe von aufgelösten Blutzellen, die glykosyliertes und nicht- glykosyliertes Hämoglobin enthält, mit einer festen Phase in Kontakt gebracht wird, an die ein spezifisches Bindungsglied gebunden ist, das spezifisch ist für glykosyliertes Hämoglobin, und die feste Phase und der Rest der Probe getrennt werden. Das spezifische Bindungsglied kann an die feste Phase durch physikalische oder chemische Mittel gebunden werden, vorzugsweise mittels einer direkten kovalenten Bindung. Das spezifische Bindungsglied sollte an die feste Phase so gebunden werden, dass sich im Wesentlichen das gesamte spezifische Bindungsglied während nachfolgender Reaktionen nicht ablöst. Ungeachtet des spezifischen Bindungsglieds und des gewählten Kopplungsverfahrens muss das spezifische Bindungsglied in der Lage sein, an das glykosylierte Hämoglobin zu binden. Zum Beispiel muss ungeachtet der Dihydroxyborylkomponente und des gewählten Kopplungsverfahrens die Dihydroxyborylkomponente in der Lage sein, an die Zuckerkomponente des glykosylierten Hämoglobins zu binden.
- Eine feste Phase gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Mischung von polymeren Mikropartikeln sein mit chemisch oder physikalisch gebundenen spezifischen Bindungsgliedern, die spezifisch sind für glykosyliertes Hämoglobin. Mikropartikel, die verwendet werden können, umfassen Polystyrol, carboxyliertes Polystyrol, Polymethylacrylat oder ähnliche Partikel mit einem Radius im Bereich von ungefähr 0,1 um bis ungefähr 0,25 Inch (etwa 6,4 mm). Ein bevorzugtes Trennverfahren für diese Partikel ist die Verwendung von Mikropartikeleinfang auf einer porösen Matrix wie Glasfaser.
- Andere feste Phasen, die verwendet werden können, schließen eine Mischung aus magnetisierbaren polymeren Mikropartikeln mit chemisch oder physikalisch gebundenen spezifischen Bindungsgliedern ein, die spezifisch sind für glykosyliertes Hämoglobin. Magnetisierbare Mikropartikel, die verwendet werden können, haben vorzugsweise Eisenoxid- oder Chromoxidkerne und eine Polystyrol-, carboxylierte Polystyrol- oder Polymethylacrylatbeschichtung. Noch andere feste Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen die Wände von Vertiefungen einer Reaktionsschale, Teströhrchen, Polystyrolkügelchen, Nitrocellulosestreifen, Membranen und dergleichen. Natürliche, synthetische oder natürlich vorkommende Materialien, die synthetisch modifiziert sind, können als ein Festphasenmaterial verwendet werden, einschließlich Polysacharide, z. B. Cellulosematerialien wie Papier, und Cellulosederivate wie Celluloseacetat und Nitrocellulose; Silikamaterial; anorganische Materialien wie deaktiviertes Aluminiumoxid, Diatomeenerde, MgSO, oder anderes anorganisches fein verteiltes Material, das gleichförmig in einer porösen Polymermatrix aus Polymeren wie Vinylchlorid, Vinylchlorid-Propylen-Copolymer und Vinylchlorid- Vinylacetat-Copolymer verteilt ist; Stoff, sowohl natürlich vorkommender (z. B. Baumwolle) als auch synthetischer (z. B. Nylon); poröse Gele wie Kieselgel, Agarose, Dextran und Gelatine; Polymerfolien wie Polyacrylamid; und dergleichen. Das Festphasenmaterial sollte eine angemessene Festigkeit haben, oder die Festigkeit kann mittels eines Trägers bereitgestellt werden, und es sollte die Herstellung eines detektierbaren Signals nicht stören.
- Ein alternatives bevorzugtes Trennverfahren ist das Verfahren, das in der mit anhängigen US-Patentanmeldung Serien-Nr. 150.278, veröffentlicht in Europa als EP < EP-326 100> , und US- Patentanmeldung Serien-Nr. 375.029, veröffentlich in Europa als EP 406 477 < EP-406 473> beschrieben ist, die sich beide eines gemeinsamen Eigentums erfreuen. Diese Anmeldungen beschreiben die Verwendung von Ioneneinfangtrennung, worin die spezifischen Bindungsglieder, die in dem in Frage kommenden Test verwendet werden, chemisch angelagert sind an eine erste polyionische Verbindung und eine poröse Matrix, an die eine zweite polyionische Verbindung gebunden ist, die an die erste polyionische Verbindung bindet. Ein spezifisches Bindungspaar wird gebildet und aus dem Reaktionsgemisch getrennt durch eine elektrostatische Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten polyionischen Verbindung. Das spezifische Bindungsglied ist vorzugsweise kovalent an die erste polyionische Verbindung gekoppelt.
- Vorzugsweise ist die erste polyionische Verbindung eine polyanionische Säure, wie Polyasparaginsäure, Heparin, Carboxymethylamylose, Polyglutaminsäure oder Polyacrylsäure, und die zweite polyionische Verbindung ist ein kationisches Polymer, wie GafQuattm, welches eine polymere quartäre Ammoniumverbindung ist (GAF Corporation, Wayne, NJ, 07470), Diethylaminoethyl- Dextran (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO.), wasserlösliche Cellulosederivate wie Celquat L-200 und Celquat H-100 (National Starch & Chemical Corporation, Bridgewater, NJ, 08807), welche beide polymere quartäre Verbindungen sind, oder Merquat® 100 (kommerziell erhältlich von Calgon Corporation). Die poröse Matrix wird mit dem kationischen Polymer behandelt, um die Matrix positiv geladen zu machen. Das kationische Polymer wird an die Matrix durch Absorption, Adsorption, oder kovalente oder ionische Kopplung gebunden. Die Trennung der Reaktionsprodukte wird durch die elektrostatische Wechselwirkung zwischen der positiv geladenen Unterlage und dem negativ geladenen Polyanionkomplex bewirkt.
- Die poröse Matrix kann jedes geeignete poröse Material einschließen. Durch "porös" ist gemeint, dass das Material ein Material ist, durch das Flüssigkeiten fließen und wodurch sie leicht hindurchfließen können. In der vorliegenden Erfindung kann die Matrix eine Polypropylen-, Polyethylen-, Teflon-, Glasfaser-, Cellulose- oder Nylonunterlage oder ein anderes poröses Material einschließen, das dem Fachmann für die Verwendung in einem Gieß- und Durchflusstestgerät mit einer oder zwei Schichten, die ein oder mehrere Testreagenzien enthalten, gut bekannt ist.
- Bevorzugte Festphasenmaterialien umfassen ein porösen Glasfasermaterial, wie ein "Whatman 934-AH"-Filterpapier, welches eine Nenndicke von 0,33 mm hat, oder die wegwerfbaren IMx®-Patronen und TestPack (Fasermatrix)-Geräte von Abbott Laboratories (Abott Park, IL, 60064). Die Dicke von solchem Material ist nicht kritisch und wird eine Sache der Wahl sein, großteils basierend auf den Eigenschaften der Probe oder des zu untersuchenden Analyten, wie die Fluidität der Testprobe.
- Die tatsächliche Fluoreszenzlöschung durch Hämoglobin kann gemessen werden nach jedem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren. Zum Beispiel ist ein Fluoreszenzspektrometer wünschenswert, auch wenn das Fluoreszenzspektrum mit einem visuellen Spektrometer beobachtet werden kann, oder mit einem Spektrograph hoher Lichtstärke fotografiert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fluoreszenz detektiert unter Verwendung eines automatisierten IMx®- Tischanalysegeräts (Abbott Laboratories, Inc.), das eine optische Baugruppe enthält, welche ein Fluorofotometer ist, das eine Quecksilberdampflampe als seine Lichtquelle verwendet. Dieses Messgerät wird beschrieben durch Fiore, M., et al. 1988, Clin. Chem. 34/9: 1726-1732, dessen Inhalt hier durch Literaturhinweis eingefügt wird. Die beobachtete Fluoreszenzlöschung ist proportional zu dem Hämoglobin, das in der gemessenen Probe vorhanden ist.
- In einem am meisten bevorzugten Verfahren werden zwei Fluoreszenzmessungen nacheinander vorgenommen unter Verwendung der gleichen Fasermatrix, wie z. B. der IMx® Wegwerfpatrone (kommerziell erhältlich von Abbott Laboratones, IL). Die roten Blutzellen in der Probe werden aufgelöst. Das Hämolysat wird in einem ersten Behälter oder einer ersten Vertiefung verdünnt, indem ein Aliquot des Hämolysats mit einem wässrigen Puffer, wie HEPES-Puffer, gemischt wird, und das Hämolysat wird in einem zweiten Behälter oder einer zweiten Vertiefung verdünnt, indem ein Aliquot des Hämolysats mit einem wässrigen Puffer, wie HEPES-Puffer, gemischt wird, der ein spezifisches Bindungsglied enthält, das spezifisch ist für glykosyliertes Hämoglobin, das entweder an ein Mikropartikel gebunden ist oder an eine polyionische Verbindung wie Meta-Aminobenzenboronsäure, die kovalent an ein Latexmikropartikel oder an Polyacrylsäure gebunden ist (alternativ können die Boratpartikel oder das Polymer zu der Lyselösung hinzugegeben werden). Boronatglykosyliertes Hämoglobin-Komplexe werden in der Mischung in dem zweiten Behälter gebildet, aber nicht in dem ersten Behälter. Ein Aliquot der Mischung in dem zweiten Behälter wird überführt zu einer Fasermatrix wie Glasfaser oder Glasfaser, die mit einer polyionischen Verbindung wie Merquat beschichtet ist, die an die erste polyionische Verbindung bindet. Boronat-glykosyliertes Hämoglobin-Komplexe werden durch die Matrix eingefangen, und die Matrix wird mit einem Waschpuffer gewaschen, welcher auch eine fluoreszierende Verbindung wie 4-Methylumbelliferon enthält (alternativ und vorzugsweise kann die fluoreszierende Verbindung in jeder Lösung vorhanden sein, die in dem Test verwendet wird). Die Waschung entfernt nicht-glykosyliertes Hämoglobin, und die Fluoreszenz der Matrix wird gemessen. Die gemessene Fluoreszenzlöschung wird verursacht durch das glykosylierte Hämoglobin, das in der Matrix vorhanden ist. Die Matrix wird dann mit einer Lösung gewaschen, die eine cis-1,2-Diolverbindung wie einen Zucker wie Sorbitol enthält. Die cis-1,2- Diolverbindung wird vorzugsweise auch zu der Mischung in dem ersten Behälter hinzugegeben. Sorbitol konkurriert mit glykosyliertem Hämoglobin um das Bindungsaffinitätsreagenz, und das glykosylierte Hämoglobin wird entfernt. Vorzugsweise wird eine Waschlösung verwendet, die eine Sorbitolkonzentration im Bereich von ungefähr 1 bis ungefähr 30% (M/V), besser bei einer Konzentration im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 30%. und am besten bei einer Konzentration von 10% enthält. Andere Verbindungen, die die Boronat-glykosyliertes Hämoglobin-Komplexe zerstören, können ebenfalls verwendet werden, z. B. 1/2- Aminohydroxyverbindungen wie Tris-Puffer. Ein Aliquot der Mischung in dem ersten Behälter wird zu der gewaschenen Matrix überführt und die Fluoreszenz der Matrix wird gemessen. Die gemessene Fluoreszenzlöschung wird verursacht durch sowohl glykosyliertes als auch nicht-glykosyliertes Hämoglobin. Die Konzentrationen von Gesamthämoglobin und glykosyliertem Hämoglobin können dann aus ihrer jeweiligen Kalibrierkurve bestimmt werden, und der prozentuale Anteil von glykosyliertem Hämoglobin an Gesamthämoglobin wird berechnet.
- Kalibrierkurven werden allgemein erzeugt aus Kalibrierlösungen, die eine bekannte Konzentration von glykosyliertem Hämoglobin oder Hämoglobin enthalten. US-Patentanmeldung Serien-Nr. 717.558, veröffentlicht in Europa als WO 92/22818, mit der Bezeichnung "Rapid Determination of Glycated Hemoglobin", welche sich eines gemeinsamen Eigentums erfreut, offenbart stabile glykosylierte Hämoglobinkalibratoren und Kontrollen, die in glykosylierten Hämoglobintests nützlich sind. Vorzugsweise werden sechs Kalibratoren verwendet, um eine Kalibrierkurve zu erhalten, obgleich mehr oder weniger Kalibratoren verwendet werden können, je nach gewünschter Genauigkeit und Präzision der Ergebnisse. Vorzugsweise enthalten die Kalibratoren ansteigende Mengen von Hämoglobin ([Gesamt-Hb]) und glykosyliertem Hämoglobin ([Gly-Hb]), aber das Verhältnis von glykosyliertem Hämoglobin zu Gesamthämoglobin (% Gly-Hb) kann konstant gehalten werden. Tabelle 1 zum Beispiel veranschaulicht die Zusammensetzung von einem Satz an Kalibratoren (siehe Beispiel 4). Ein Fachmann wäre in der Lage, andere Kalibrator- und Kontrollzusammensetzungen auszudenken. Kontrollen werden allgemein in Zusammenhang mit einem Test verwendet, um die Lebensfähigkeit einer Kalibrierkurve oder von Testreagenzien zu bestätigen. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung der Kontrollen die gleiche wie die der Kalibratoren mit der Ausnahme, dass der prozentuale Anteil von glykosyliertem Hämoglobin, die Hämoglobinkonzentration und die Konzentration an glykosyliertem Hämoglobin nicht mit irgendeinem der Kalibratoren identisch sein können. Tabelle 1
- Um aseptische Bedingungen während des Verfahrens aufrechtzuerhalten, kann es wünschenswert sein, eine kleine Menge eines antimikrobiellen Mittels zu dem System hinzuzugeben, welches Lösungsmittel, Antibiotika und Gifte umfassen kann. Andere Biochemikalien, z. B. KCN, zur Bestimmung von glykosyliertem Hämoglobin können in die aufgelöste Blutprobe eingeführt werden.
- Die folgenden Beispiele sind veranschaulichend für die Erfindung und sind keinesfalls als Begrenzung des Umfangs der Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, zu interpretieren. Es wird anerkannt werden, dass sich ein Fachmann viele andere Geräte und Verfahren zur Verwendung ausdenken kann, auf welche die vorliegenden erfinderischen Konzepte angewandt werden können.
- Fünfzig Mikroliter (50 ul) einer Hämoglobinprobe (siehe Tabelle 2) wurden gemischt mit 200 ul von 0,25 mM Methyl-umbelliferon in 50 mM Ammoniumacetatpuffer bei pH 8,0, der 50 mM MgCl&sub2; und 50% (V/V) Dihydroxyborylharz (Glyco-gel, kommerziell erhältlich von Pierce Chemical Company, IL) enthält). Die Mischung wurde auf eine Glasfasermatrix überführt, welche in flüssiger Verbindung mit einer absorbierenden Unterlage (wie einer wegwerfbaren IMx®- Patrone, erhältlich von Abbott Laboratories, IL) steht, und die Fluoreszenz wurde mit einem Fluorofotometer gemessen, das eine Quecksilberdampflampe als Lichtquelle verwendet (wie beschrieben durch Fiore, M et al. 1988. Clin. Chem 34/9: 1726-1732). Das Ausmaß der Fluoreszenzlöschung wird verursacht durch Gesamthämoglobin. Die Matrix wurde drei Mal mit 200 ul des Ammoniumacetatpuffers gewaschen, der 0,20 mM Methyl-umbelliferon enthält. Die Fluoreszenz wurde wieder gemessen. Das Ausmaß der Fluoreszenzlöschung wird verursacht durch das glykosylierte Hämoglobin. Die Konzentration von Gesamthämoglobin ([Gesamt-Hb]) und glykosyliertem Hämoglobin ([Gly-Hb]) kann aus einer Standardkurve erhalten werden, die mit 0, 0,1, 0,6, 2,9 mM Hämoglobin-Kalibratoren erzeugt wurde (siehe Tabelle 2). Der prozentuale Anteil von glykosyliertem Hämoglobin (% Gly-Hb), welcher das Verhältnis von glykosyliertem Hämoglobin zu Gesamthämoglobin ist, kann auch bestimmt werden (siehe Tabelle 2). Tabelle 2
- * Hämoglobin-Kalibrator von Pierce Chemical Company, IL.
- Fünfzig Mikroliter (50 ul) von jeder Hämoglobinprobe mit bekannter Hämoglobin-Konzentration, dargestellt in Tabelle 3, wurden mit 200 ul von 0,25 mM Methyl-umbelliferon in 50 mM Ammoniumacetatpuffer bei pH 8,0, der 50 mM MgCl enthält, gemischt, und die Mischung wurde auf eine Fasermatrix in flüssiger Verbindung mit einer absorbierenden Unterlage (wie einer wegwerfbaren IMx®-Patrone, erhältlich von Abbott Laboratories, IL) überführt. Die Fluoreszenz wurde umgehend mit einem Fluorofotometer gemessen, das eine Quecksilberdampflampe als Lichtquelle verwendet (wie beschrieben durch Fiore, M et al. 1988. Clin. Chem 34/9: 1726-1732). Die Ergebnisse, dargestellt in Tabelle 3, veranschaulichen, dass die Fluoreszenzintensität (in Millivolt) mit zunehmender Hämoglobinkonzentration abnimmt. Tabelle 3
- Die Fluoreszenzlöschung verursacht durch Gesamthämoglobin von den Proben, die in Tabelle 4 dargestellt sind, wurde bestimmt durch Mischen von 50 ul von jeder Probe mit 200 ul von 0,25 mM Methylumbelliferon in 50 mM Ammoniumacetatpuffer bei pH 8,0, der 50 mM MgCl enthält. Überführen der Mischung auf die Fasermatrix, welche in flüssiger Verbindung mit einer absorbierenden Unterlage (wie einer wegwerfbaren IMx®-Patrone, erhältlich von Abbott Laboratories, IL) steht, und Messen der Fluoreszenz mit einem Fluorofotometer, das eine Quecksilberdampflampe als Lichtquelle verwendet (wie beschrieben durch Fiore, M. et al. 1988. Clin. Chem 34/9: 1726-1732).
- Die Fluoreszenzlöschung hervorgerufen durch glykosyliertes Hämoglobin von den Proben, die in Tabelle 4 dargestellt sind, wurde bestimmt durch Mischen von 50 ul von jeder Probe mit 200 ul von 0,25 mM Methylumbelliferon in 50 mM Ammoniumacetatpuffer bei pH 8,0, der 50 mM MgCl&sub2; und 50% (V/V) Dihydroxyborylharz (Glyco-gel) enthält. Überführen der Mischung auf die Fasermatrix einer IMx®-Wegwerfpatrone, Waschen der Matrix mit 300 ul des Ammoniumacetatpuffers, der 0,20 mM Methylumbelliferon enthält, und Messen der Fluoreszenz auf der Fasermatrix unter Verwendung eines IMx®-Messgerätes. Die Fluoreszenzlöschung wurde dann erneut gemessen, nachdem die Matrix mit dem Ammoniumacetatpuffer, der 0,20 mM Methyl-umbelliferon und 200 mM Sorbitol enthält, gewaschen wurde. Alle Fluoreszenzablesungen sind in Millivolt. Tabelle 4
- ¹ Erste Messung von glykosyliertem Hämoglobin.
- ² Messung von glykosyliertem Hämoglobin nach Sorbitolwaschung.
- ³ Fluoreszenz in Abwesenheit von Hämoglobin ist 4,06 mV.
- Das Sorbitol verdrängt deutlich im Wesentlichen das gesamte glykosylierte Hämoglobin, das in der Matrix vorhanden ist.
- Hämoglobin- und glykosylierte Hämoglobin-Kalibratoren wurden hergestellt durch Reihenverdünnung menschlicher Blutproben mit aufgelösten roten Zellen, die künstlich auf ungefähr 40% glykosyliertes Hämoglobin (durch Glyc-Affn, Isolab) glykosyliert worden sind durch Mischen mit 250 mM Glukose bei 37ºC 96 Stunden lang (wie beschrieben in US-Patentanmeldung Serien-Nr. 717.558, veröffentlicht in Europa als WO 92/22818, mit der Bezeichnung "Rapid Determination of Glycated Hemoglobin", welche sich eines gemeinsamen Eigentums erfreut). Der Glyc-Affn-Test (Isolab, Inc., OH) wurde verwendet, um die Konzentration von Hämoglobin und glykosyliertem Hämoglobin in einer Probe zu messen. Der Kalibrator mit der höchsten Konzentration von glykosyliertem Hämoglobin (Kalibrator F) wurde hergestellt durch Vermischen von menschlichen glykosylierten Hämoglobinproben mit niederem und hohem Anteil (hergestellt nach dem Verfahren, das in US- Patentanmeldung Serien-Nr. 717.558, veröffentlich in Europa als WO 92/22818, mit der Bezeichnung "Rapid Determination of Glycated Hemoglobin, beschrieben ist, welches sich eines gemeinsamen Eigentums erfreut), bis eine glykosylierte Hämoglobinkonzentration von 20% erhalten wurde, und dann Verdünnen der Mischung mit phosphatgepufferter Salzlösung, bis eine Gesamthämoglobinkonzentration von 12 mM (19,3 g/dl) erhalten wurde. Andere Kalibratoren wurden dann aus dem Kalibrator F durch Verdünnen mit phosphatgepufferter Salzlösung zu einer endgültigen Gesamthämoglobinkonzentration von 9, 6, 3 und 1 mM (Kalibratoren E, D, C bzw. B) hergestellt. Ein sechster Kalibrator wurde aus phosphatgepufferter Salzlösung hergestellt und hatte eine Gesamthämoglobinkonzentration von 0 mM. Die Hämoglobin- und glykosylierte Hämoglobinkonzentrationen der Kalibratoren sind in Tabelle 1 auf gelistet. Typische Kalibrierkurven für Gesamthämoglobin und glykosyliertes Hämoglobin sind in Fig. 1 dargestellt und wurden nach Beispiel 6 hergestellt.
- Boronatpolyacrylsäure wurde folgendermaßen hergestellt. Pölyacrylsäure (48,6 g) in 25 mM MES-Puffer (pH 5,5) und Meta- Aminobenzenboronsäure (8 g) in 25 mM MES-Puffer (pH 5,5) wurden gemischt, und der pH wurde auf 6,1 eingestellt. 1-Ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC) (20,7 g) wurde hinzugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 50 Minuten gerührt, und die Reaktion wurde durch die Zugabe von 24% Glycin bei pH 9,8 gelöscht. Die Reaktion wurde gegen sechs Volumen 50 mM Taurin (pH 9,0) diafiltriert und steril filtriert.
- Die Testform hierin wurde durchgeführt auf einem IMx®-Messgerät (kommerziell erhältlich von Abbott Laboratories, IL und beschrieben in EP-A-288 793 und in Fiore et al., Clin. Chem. 34/9; 1726-1732 (1988)). Die roten Blutzellen in einer Probe (10 ul) wurden aufgelöst durch Zugabe von Lyselösung (70 ul 1%iges (M/V) Triton X-100® und 0,70 mM 4-Methyl-umbelliferon in 50 mM HEPES-Puffer (pH 8,0), der 50 mM MgCl, 100 mM Natriumchlorid und 0,1% Natriumazid enthält) und polyanionischer Reagenzlösung (0,9% (M/V) der Boronatpolyacrylsäure von Beispiel 5 in 50 mM Taurin bei pH 9,0), gefolgt von zwei Zyklen schnellen Ansaugens der Mischung in die Pipettiervorrichtung des Messgerätes und Dispensieren daraus. Dieser Prozess ergab nahezu sofortige Hämolyse von frischem Vollblut.
- Eine zweite Mischung wird aus dieser ersten Mischung hergestellt, indem ein Aliquot (17 ul) dieser ersten Mischung in die Reaktionsvertiefung der IMx®-Wegwerfpatrone überführt wird und 170 ul von 100 mM Tris-Puffer bei pH 7,5, der 300 mM Natriumchlorid enthält, und 40 ul Sorbitolwaschlösung (10% (M/V) Sorbitol und 17,5 mM 4-Methyl-umbelliferon in 100 mM Tris-Puffer bei pH 7,5, der 300 mM Natriumchlorid enthält) in die Reaktionsvertiefung hinzugegeben wird.
- Ein zweites Aliquot (50 ul) der ersten Mischung wird überführt auf die Fasermatrix der IMx®-Wegwerfpatrone (erhältlich von Abbott Laboratories, IL), welche beschichtet ist mit einer 0,2%igen (M/V) (5,425 g/l) Merquat® 100 (kommerziell erhältlich von Calgon Corporation)-Lösung (6,06 g/l Tris-Puffer bei pH 7,5, der 6,35 g/l Tromethan, 5,84 g/l Natriumchlorid, 1 g/l Sucrose und 0,95 ml/l Fischgelatine enthält). Die Boronatpolyacrylsäureglykosyliertes Hämoglobin-Komplexe binden an das Merquat® 100, und die Matrix wird gewaschen mit 240 ul Waschlösung (7,5 mM 4- Methyl-umbelliferon in 50 mM Taurin-Puffer (pH 9,0), der 25 mM Asparagin, 25 mM Methionin, 100 mM MgCl und 0,1% Natriumazid enthält), um im Wesentlichen das gesamte nicht-glykosylierte Hämoglobin zu entfernen. Die Fluoreszenzlöschung verursacht durch das glykosylierte Hämoglobin, das auf der Matrix vorhanden ist, wird dann gemessen.
- Die Matrix wird mit ungefähr 50 ul Sorbitolwaschlösung gewaschen. Sorbitol konkurriert mit glykosyliertem Hämoglobin um das gebundene Affinitätsreagenz, und das glykosylierte Hämoglobin wird entfernt. Ein Aliquot (50 ul) der zweiten Mischung wird auf die Matrix überführt, und die Fluoreszenzlöschung sowohl verursacht durch glykosyliertes Hämoglobin als auch durch nicht-glykosyliertes Hämoglobin wird gemessen. Die Konzentrationen von. Gesamthämoglobin und glykosyilertem Hämoglobin werden getrennt aus den Kalibrierkurven, die mit den Kalibratoren von Beispiel 4 hergestellt wurden, nach dieser Testform bestimmt, und der prozentuale Anteil von glykosyliertem Hämoglobin wird berechnet.
- Unter Verwendung der Testform von Beispiel 6 wurden 201 Patientenproben untersucht und mit den Ergebnissen verglichen, die mit dem Glyc-Affn-Test von Isolab erhalten wurden. Die Daten sind in der Korrelationskurve von Fig. 2 dargestellt.
- Glykosyliertes Hämoglobin wurde gemessen unter Verwendung von Boronatacrylamid-Mikropartikeln (hergestellt unter Verwendung der Verfahren von Hageman, et al.. Anal. Biochem. 80: 547 (1977), und Imman, et al., Biochem. 8: 4078 (1969)), und einer Modifikation der Testform von Beispiel 6, modifiziert insofern, als dass das glykosylierte Hämoglobin nach der Gesamthämoglobinmessung gemessen wurde. Eine 1%ige (M/V) Lösung der Borat-Mikropartikel wurde anstatt der Boronatpolyacrylsäure verwendet. Kalibrierkurven wurden aus den Kalibratoren von Beispiel 4 hergestellt und sind in Fig. 3 und Fig. 4 dargestellt. Zwanzig Patientenproben wurden unter Verwendung dieser Testform getestet, und die Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen verglichen, die von dem Glyc-Affn-Test von Isolab erhalten wurden. Fig. 5 zeigt die Korrelationskurve der 20 Patientenproben, die auf den prozentualen Anteil von glykosyliertem Hämoglobin unter Verwendung dieser Testform und des Glyc-Affn-Tests von Isolab getestet wurden.
- Die beschriebenen Ausführungsformen und die dargestellten alternativen Ausführungsformen sind eher als Beispiele anstatt als Begrenzungen beabsichtigt. Folglich soll die Beschreibung der Erfindung die Erfindung nicht auf die einzelnen offenbarten Ausführungsformen begrenzen, sondern soll alle äquivalenten Formen und den Erfindungsgegenstand innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung umfassen, der wie oben beschrieben ist und in den folgenden Ansprüchen bekannt gemacht wird.
Claims (20)
1. Ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamthämoglobins
oder von nicht-glykosyliertem Hämoglobin oder glykosyliertem
Hämoglobin in einer Blutprobe, das folgendes umfasst:
a) Lysieren der roten Blutzellen einer Probe, um das
Gesamthämoglobin freizusetzen;
b) In Kontakt-bringen des Hämolysats mit einer
fluoreszierenden Verbindung;
c) Im Fall von glykosyliertem oder nicht-glykosyliertem
Hämoglobin Trennen des glykosylierten oder nicht-glykosylierten
Hämoglobins von der Probe;
d) Bestimmen der Fluoreszenzlöschung, die durch das
Gesamthämoglobin oder das nicht-glykosylierte oder glykosylierte
Hämoglobin hervorgerufen wird; und
e) Vergleichen der Fluoreszenzlöschung von dem
Gesamthämoglobin oder dem nicht-glykosylierten Hämoglobin oder
dem glykosylierten Hämoglobin mit einer Kalibrierkurve für
Gesamthämoglobin oder nicht-glykosyliertes Hämoglobin oder
glykosyliertes Hämoglobin.
2. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Lyse der roten
Blutzellen das Mischen der Blutprobe mit einem Detergens
umfasst.
3. Das Verfahren von Anspruch 2, worin das Detergens
Triton X-100® ist.
4. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Trennung des
glykosylierten Hämoglobins das In-Kontant-bringen des
glykosylierten Hämoglobins mit einem spezifischen Bindungsglied,
das spezifisch ist für glykosyliertes Hämoglobin, um einen
spezifischen Bindungsglied/glykosyliertes Hämoglobin-Komplex zu
bilden, und Trennen des Komplexes von der Probe umfasst.
5. Das Verfahren von Anspruch 4, worin das spezifische
Bindungsglied an eine feste Phase gebunden ist.
6. Das Verfahren von Anspruch 5, worin die feste Phase
ein Partikel, ein Film, eine Faser, ein Röhrchen oder eine
Vertiefung ist.
7. Das Verfahren von Anspruch 4, worin das spezifische
Bindungsglied an eine erste polyionische Verbindung gebunden
ist, die an eine zweite polyionische Verbindung bindet, welche
an eine feste Phase gebunden ist.
8. Das Verfahren von Anspruch 7, worin die erste
polyionische Verbindung Polyasparaginsäure, Heparin,
Carboxymethylamylose, Polyglutaminsäure oder Polyacrylsäure ist.
9. Das Verfahren von Anspruch 7, worin die zweite
polyionische Verbindung eine polymere quartäre
Ammoniumverbindung, Diethylaminoethyl-Dextran oder Merquat® 100
ist.
10. Das Verfahren von Anspruch 7, worin die feste Phase
eine Fasermatrix ist.
11. Das Verfahren von Anspruch 4, worin das spezifische
Bindungsglied eine Dihydroxyborylkomponente, einen
Antiglykosylierten Hämoglobin-Antikörper oder Lectin umfasst.
12. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die
fluoreszierende Verbindung Fluorescein, Rhodamin, Umbelliferon,
Methylumbelliferon oder andere Cumarine oder Derivate davon ist.
13. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die
fluoreszierende Verbindung an eine feste Phase gebunden ist.
14. Ein Verfahren zum Bestimmen des Verhältnisses von
glykosyliertem Hämoglobin zu Gesamthämoglobin in einer
Blutprobe, das folgendes umfasst:
a) Lysieren der roten Blutzellen einer Probe, um das
Hämoglobin freizusetzen;
b) Mischen der aufgelösten Blutprobe mit einer
fluoreszierenden Verbindung;
c) Bestimmen der Fluoreszenzlöschung, die durch den
Gesamthämoglobingehalt eines Aliquots der lysierten Blutprobe
hervorgerufen wird;
d) Trennen des glykosylierten Hämoglobins von dem nicht-
glykosylierten Hämoglobin eines Aliquots der Probe, und
Bestimmen der Fluoreszenzlöschung, die entweder durch das
glykosylierte oder das nicht-glykosylierte Hämoglobin, das aus
diesem Aliquot gewonnen wurde, hervorgerufen wird; und
e) Vergleichen der Gesamthämoglobinkonzentration mit der
glykosylierten Hämoglobinkonzentration.
15. Das Verfahren von Anspruch 14, worin die Trennung des
glykosylierten Hämoglobins In-Kontant-bringen des glykosylierten
Hämoglobins mit einem spezifischen Bindungsglied, das spezifisch
ist für glykosyliertes Hämoglobin, um einen spezifischen
Bindungsglied/glykosyliertes Hämoglobin-Komplex zu bilden, und
Trennen des Komplexes von der Probe umfasst.
16. Das Verfahren von Anspruch 14, worin das spezifische
Bindungsglied an einen Partikel oder an eine erste polyionische
Verbindung gebunden ist, die an eine zweite polyionische
Verbindung bindet, welche an eine Fasermatrix gebunden ist.
17. Das Verfahren von Anspruch 14, worin die Bestimmung
der Fluoreszenzlösung in den Schritten c und d auf einer
gemeinsamen Matrix durchgeführt wird.
18. Das Verfahren von Anspruch 17, worin der Schritt d
vor Schritt c durchgeführt wird und die Matrix mit einer
Waschlösung nach Schritt d gewaschen wird.
19. Das Verfahren von Anspruch 18, worin die Waschlösung
eine 1,2-cis-Diolverbindung umfasst.
20. Das Verfahren von Anspruch 18, worin die 1,2-cis-
Diolverbindung Sorbitol ist.
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