DE3650238T2 - Immunologische Bestimmung eines Gerinnungsfaktors in einer Probe. - Google Patents
Immunologische Bestimmung eines Gerinnungsfaktors in einer Probe.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung und gegebenenfalls zur Bestimmung biologischer Substanzen.
- Es gibt zahlreiche Verfahren zum Nachweis biologischer Substanzen. Die gebräuchlichsten dieser Verfahren sind die Hämagglutinierung sowie die Fluoreszenz-, Enzym- oder Radioimmunoassays.
- Die oben genannten Immunoassays erfordern den Einsatz künstlicher Kopplungsprodukte, wie Antikörper-Enzym-Konjugate, oder eine radioaktive Markierung.
- Als Beispiel für den Stand der Technik seien genannt die Druckschrift Patent Abstracts of Japan, Vol. 9, Nr. 72 (p-345) (1795), 2. April 1985, Seite 57, Seite 345; und JP-A-59 203 957, Sigiura Shinyaku Kaihatsu Kenyusho K.K. 19.11.1984.
- Aus dieser Druckschrift ist ein Reagens bekannt, das dazu dient, die Aktivität des Plasmaenzyms Kallikrein, das im Blutplasma mit α&sub2;-Makroglobulin konjugiert ist, in Gegenwart eines synthetischen Substrats zu messen. Die verwendete Enzymimmunoassaytechnik erfordert den Einsatz von Antikörper-Enzym-Konjugaten als künstliche Kopplungsprodukte
- Eine solche Druckschrift beschreibt kein Verfahren zur immunologischen Bestimmung eines Gerinnungsfaktors, bei dem die Gegenwart des Gerinnungsfaktors mit Hilfe einer Eigenschaft nachgewiesen wird, die diesem Faktor, der vor dem Nachweisschritt aktiviert werden muß, inhärent ist.
- Das Patent US-A-3,990,850 beschreibt eine besondere Ausführung eines Gruppentests durch die klassische Agglutinierungsreaktion in flüssiger Phase; um es für den Anwender (insbesondere am Krankenbett) bequemer zu machen, liegen die Reagentien einfach in trockener Form auf einer gebrauchsfertigen Karte vor. Wenn man einen Tropfen Blut hinzufügt, wird das Immunoserum rehydratisiert und führt zu einer klassischen Agglutinierungsreaktion.
- Das US-Patent 3,502,437 betrifft eine tragbare Identifizierungskarte, die sich für den Blutgruppentest und Histokompatibilitätstest zwischen einem Blutspender und -empfänger verwenden läßt oder auch das Ergebnis dieser Tests im Hinblick auf eine spätere Verwendung in haltbarer Weise anzeigt. Die Tests beruhen auf klassischen Hämagglutinierungsreaktionen.
- Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, das nicht auf künstliche Kopplungsprodukte oder radioaktive Produkte zurückgreift und das im Unterschied zur Hämagglutinierung in fester Phase eingesetzt werden kann. Dieses Verfahren bietet insbesondere den Vorteil, daß es einfach und schnell ist und automatisiert werden kann, wobei es zugleich sehr empfindlich ist.
- Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Gerinnungsfaktors in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) ein eine Fixierungsaffinität für den Gerinnungsfaktor aufweisender Antikörper auf einem Feststoff aufgebracht wird,
- b) die Probe in Gegenwart des Feststoffs, auf dem der Antikörper aufgebrachtt ist, inkubiert wird,
- c) der Feststoff nach erfolgter Inkubation gewaschen wird und
- d) die Gegenwart des Gerinnungsfaktors, der mittels des Antikörpers auf der festen Phase fixiert ist, mit Hilfe einer inhärenten Eigenschaft des Gerinnungsfaktors nachgewiesen wird.
- Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erlaubt den Nachweis aller biologischen Substanzen, die im folgenden "selbstnachweisbar" genannt werden, das heißt, jedes biologischen Produkts, das eine inhärente Eigenschaft besitzt, die für den Menschen oder die Maschine direkt erkennbar gemacht werden kann.
- Selbstnachweisbare Substanzen sind insbesondere Substanzen, die eine natürliche Färbung zeigen oder aber unter künstlicher Bestrahlung ein besonderes Aussehen zeigen, oder auch Substanzen, die in der Lage sind, direkt, wenn es sich um ein Makromolekül handelt, oder aufgrund bestimmter Bestandteile, die sie enthalten, zum Beispiel ein endogenes Enzym oder eine chemische Verbindung, ein Substrat zu färben oder eine Fluoreszenz oder eine Lumineszenz hervorzurufen, zum Beispiel Protein C.
- Dieses Verfahren ist außerdem besonders interessant für den Nachweis biologischer Substanzen, die durch eine Färbung oder eine endogene enzymatische Reaktion in Gegenwart eines Substrats sowie gegebenenfalls nach enzymatischer Aktivierung indirekt nachweisbar sind.
- Die selbstnachweisbaren biologischen Substanzen gemäß der Erfindung sind Gerinnungsfaktoren. Ein Beispiel wird im folgenden mit dem Plasmaprotein C gegeben.
- Bei der festen Phase kann es sich um irgendeinen Träger handeln, der gewöhnlich für Immunoassays verwendet wird, sei es ein Träger in Form von Kügelchen, Vertiefungen auf Mikrotiterplatten, reaktiven Streifen oder andere. Dieser Träger kann aus irgendeinem Polymer natürlicher oder synthetischer Herkunft oder einer amorphen Substanz wie Glas bestehen. Vorteilhafterweise verwendet man für reaktive Streifen Nitrocellulose- oder Nylonmembranen, für Kügelchen oder Mikrotiterplatten die Kunststoffe Polyvinyl, Polypropylen, Polystyrol oder andere. Man kann außerdem Gele oder Teilchen auf Agarose-, Acrylamid- oder batexbasis verwenden.
- Die Sensibilisierung der festen Phase durch den Antikörper mit einer Affinität für die zu bestimmende Substanz erfolgt je nach der Natur des Trägers und den Erfordernissen des Tests entweder durch passive Adsorption oder durch kovalente Kopplung. Die feste Phase kann nach der Adsorption des Antikörpers mit Proteinen oder Makromolekülen, wie Rinderalbumin, fetalem Kälberserum, Gelatine, gesättigt oder durch chemische Agentien, wie Tween , chemisch modifiziert werden, um nichtspezifische Wechselwirkungen zu verhindern. Diese feste Phase kann zur Konservierung in getrocknete oder lyophilisierte Form modifiziert werden.
- In einer besonders interessanten Ausführungsform der Erfindung besteht die feste Phase aus einem reaktiven Streifen oder einer Platte, die durch wenigstens zwei unterschiedliche Antikörper sensibilisiert sind, welche für verschiedene biologische Substanzen, die in der zu testenden Probe zugegen sein können, spezifisch sind.
- Die selbstnachweisbaren biologischen Substanzen werden in wäßrigem Medium in Gegenwart der festen Phase inkubiert. Dieses Medium kann eine normale oder pathologische biologische Flüssigkeit sein, wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, eine Flüssigkeit aus einem Pleura-, Peritoneal-, Synovial- oder anderen Erguß, oder ein künstliches isotonisches Medium, das gegebenenfalls Optimierungssubstanzen (Proteine, Salze, Makromoleküle, chemische Agentien, wie Tween) enthält und in dem die Probe suspendiert ist. Die Inkubation erfolgt mit oder ohne Rühren bei Raumtemperatur oder modifizierter Temperatur während einer Zeit, die von der Natur der Substanz und ihrer Fähigkeit der Fixierung auf dem Antikörper abhängen wird. Nach der Inkubation wird die flüssige Phase durch Phasentrennung oder Waschen, zum Beispiel in einer Lösung wie PBS-Tween-Puffer (0,05%), entfernt.
- Das folgende Beispiel soll die Merkmale und Vorteile des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung erläutern.
- gereinigte monoklonale Anti-Protein-C-Antikörper werden auf einer Mikrotiterplatte des Typs Microelisa M 129 B der Gesellschaft DYNATECH oder auf schneidbaren Stäbchen M 1798 A derselben Gesellschaft passiv adsorbiert.
- Dazu werden die gereinigten monoklonalen Antikörper in der optimalen Konzentration (5 bis 10 ug/ml) in einem Hydrogencarbonatpuffer (0,1 M pH 9,6) in einer Menge von 200 ul pro Vertiefung 3 Stunden bei 37ºC inkubiert, wobei die Platte mit einer Klebefolie abgedeckt ist. Nach Spülen der Platte in PBS-Puffer (0,15 M, pH 7,4), der 0,1% Tween 20 enthält, werden die Plasmaproben oder deren Verdünnungen in 0,5 M TBS-Tris-Puffer mit 0,1 M NaCl, 1% Rinderalbumin (pH 7,35) mit einem Volumen von 200 ul 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
- Die Platte wird in 4 Cyclen mit 0,15 M PBS-Puffer (pH 7,4), der 0,05% Tween 20 enthält, automatisch gewaschen (Multiwash Dynatech).
- Nach dem Waschen wird das immunoadsorbierte Protein C in Gegenwart von 6 mM Human-Thrombin/Kaninchen-Thrombomodulin-Komplexen in 0,15 M TBS-Puffer (pH 7,35) + 9 mM CaCl&sub2; aktiviert. Diese Aktivierungslösung wird mit einem Volumen von 200 ul verteilt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach Waschen gemäß derselben Vorschrift wie oben werden in jeden Ansatz 200 ul Substrat (Substrat 2366 von KABI Diagnostic, 1 mM) in 0,05 M Tris-Puffer mit 0,15 M NaCl (pH 8,3) gegeben.
- Die Reaktion wird nach einer Stunde durch Zugabe von Essigsäure auf eine Endkonzentration von 15% abgebrochen.
- Die Bestimmung des Beispiels wurde auf normale oder pathologische Plasmen angewendet.
- Ein Pool von 20 normalen Humanplasmen wird als Bezugsprobe für 100% Protein C genommen. Vier Verdünnungen dieser Bezugsprobe, die den Protein-C-Konzentrationen 20%, 15%, 10% bzw. 5% entsprachen, werden dem Test unterzogen, um die Bezugskurve zu erhalten. Die negative Blindprobe (0%) wird von einem Plasma gebildet, dem das Protein C zuvor durch Immunoadsorption entzogen wurde. Die Bezugskurve wird vorgelegt (Figur). Die Figur ist ein Diagramm, auf dessen Abszisse die Protein-C-Konzentrationen als Prozentwerte, bezogen auf ein normales Plasma, und auf dessen Qrdinate die bei 405 nm abgelesene optische Dichte DO aufgetragen sind.
- Sechs Gruppen von Plasmaproben wurden getestet, um die klinische Korrelation des Tests der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu einem klassischen Sandwich-ELISA-Test der quantitativen Bestimmung zu bewerten.
- Die Ergebnisse sind in der Tabelle angegeben.
- Die mit dem Test der vorliegenden Erfindung erhaltenen Ergebnisse sind mit der Klinik und den quantitativen Ergebnissen des ELISA- Tests eng korreliert. Der Test gemäß der Erfindung erlaubt es außerdem, qualitative Defizite an Protein C zu erkennen (Veränderung der biologischen Aktivität des Enzyms ohne quantitativen Defizit), die die ELISA-Bestimmung nicht nachweisen kann, da der letztere Test rein quantitativ ist.
- Das Verfahren der Erfindung kann noch in Varianten durchgeführt werden.
- So kann das Plasmaprotein C vor der Verteilung der Proben auf die Vertiefungen der Mikrotiterplatten oder auch im Verlaufe der ersten Inkubation der Proben aktiviert werden. In diesem Fall wird das Substrat direkt nach dem Waschen der festen Phase hinzugefügt. Ebenso kann die Aktivierung mit Thrombin allein oder mit anderen Aktivatorenzymen und insbesondere mit bestimmten aus Schlangengift extrahierten Enzymen erfolgen (zum Beispiel das Gift RVVX der Gesellschaft SIGMA). Es ist weiterhin möglich, ein fluoreszierendes Substrat zu verwenden. Tabelle untersuchte Gruppe Anzahl der Plasmen mittlere Konzentration an Protein C (ELISA) mittlere Konzentration an Protein C (Verfahren der Erfindung) I normale Patienten II Patienten unter Anti-Vitamin-K III angeborene Protein-C-Mängel IV angeborene Protein-C-Mängel + Anti-Vitamin-K V angeborene Mängel an anderen Gerinnungsfaktoren als Protein C Vl qualitatives Defizit von Protein C
Claims (4)
1. Verfahren zur Bestimmung des Gerinnungsfaktors in einer
Probe, dadurch gekennzeichnet, dar
(a) ein eine Fixierungsaffinität für den Gerinnungsfaktor
aufweisender Antikörper auf einem Feststoff aufgebracht
wird,
(b) die Probe in Gegenwart des Feststoffs, auf dem der
Antikörper aufgebracht ist, inkubiert wird,
(c) der Feststoff nach erfolgter Inkubation gewaschen
wird,
(d) die enzymatische Aktivität des Gerinnungsfaktors, der
auf dem Feststoff mittels des Antikörpers fixiert ist, in
Gegenwart eines farbgebenden oder fluoreszierenden
Substrats entwickelt wird,
wobei der Faktor vor der Entwicklungsstufe aktiviert
worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dar der
zu dosierende Gerinnungsfaktor C-Plasma-Protein ist.
3. Feststoff zur Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder
2, dadurch gekennzeichnet, dap er mehrere auf ihm fixierte
Antikörper in getrocknetem Zustand aufweist.
4. Feststoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß er
in Form von Bändchen oder Mikrotitrierplatten oder Kugeln
vorliegt.
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