JPS59203957A - α↓２−マクログロブリン結合性カリクレイン活性測定用試薬 - Google Patents
α↓２−マクログロブリン結合性カリクレイン活性測定用試薬Info
- Publication number
- JPS59203957A JPS59203957A JP7815783A JP7815783A JPS59203957A JP S59203957 A JPS59203957 A JP S59203957A JP 7815783 A JP7815783 A JP 7815783A JP 7815783 A JP7815783 A JP 7815783A JP S59203957 A JPS59203957 A JP S59203957A
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- JP
- Japan
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- callicrein
- macroglobulin
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- Prior art date
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- Pending
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒト体液中のα、−マクログロブリン（以下α
、−ＭＧと称す）に結合した血漿カリクレイン活性′！
ｉ″％異的に測定する試薬に関する。
、−ＭＧと称す）に結合した血漿カリクレイン活性′！
ｉ″％異的に測定する試薬に関する。
本発明の試薬は肝疾患の疑いのある患者の血漿中のＱ−
ＭＧ結合性カリクレインを測定するのに有用であシ、従
って肝疾患の診断に有用である。
ＭＧ結合性カリクレインを測定するのに有用であシ、従
って肝疾患の診断に有用である。
血漿カリクレインがヒト血清中α２−マクログロブリン
と結合することは知られているがα２−マクログロブリ
ンに結合したカリクレイン活性の特異的測定方法は確立
されていない。そこで今回不発明者らは抗α、−ＭＧ抗
体の特異性を利用し体液中よシ（Ｘ、−ＭＧおよび（４
−ＭＧ結合物を分離し、次にカリクレインに特異的な基
質と反応させることにより、（４−ＭＧ結合性カリクレ
イン（以下％−ＭＧ−にと称す）活性の特異的測定法を
確立することを見出し本発明を完成した。
と結合することは知られているがα２−マクログロブリ
ンに結合したカリクレイン活性の特異的測定方法は確立
されていない。そこで今回不発明者らは抗α、−ＭＧ抗
体の特異性を利用し体液中よシ（Ｘ、−ＭＧおよび（４
−ＭＧ結合物を分離し、次にカリクレインに特異的な基
質と反応させることにより、（４−ＭＧ結合性カリクレ
イン（以下％−ＭＧ−にと称す）活性の特異的測定法を
確立することを見出し本発明を完成した。
本発明の試薬は次のようにして製造することができる。
即ち、ヒト血漿よフ精製した偽−ＭＧを家兎に感作し抗
血清を作製し、硫安分画、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅによシ精製し抗体とした。この抗体をポリスチレンビ
ーズには物理的吸着により、またガラスピーズおよびナ
イロンビーズについては共有結合によシ結合し、抗体結
合不溶性担体全調製した。
血清を作製し、硫安分画、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅによシ精製し抗体とした。この抗体をポリスチレンビ
ーズには物理的吸着により、またガラスピーズおよびナ
イロンビーズについては共有結合によシ結合し、抗体結
合不溶性担体全調製した。
この不溶化抗体を用い、血漿中よ＃）（ＩＥ、 −ＭＧ
−Ｋを特異的に吸着した後、この不溶化抗体を洗浄し他
の夾雑タンパクを除き、吸着している（４−ＭＧ−に活
性をカリクレインに特異性の高い合成基質であるＬ−グ
ロリール・Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−４
−メチルクマリル−７−アミドによシ測定するものであ
る。
−Ｋを特異的に吸着した後、この不溶化抗体を洗浄し他
の夾雑タンパクを除き、吸着している（４−ＭＧ−に活
性をカリクレインに特異性の高い合成基質であるＬ−グ
ロリール・Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−４
−メチルクマリル−７−アミドによシ測定するものであ
る。
肝疾患患者血漿のα２−ＭＧ−に活性を測定したところ
健常人に比べ、特異的にα２−ＭＧ−に活性力；低下す
ることか判明した。
健常人に比べ、特異的にα２−ＭＧ−に活性力；低下す
ることか判明した。
したがって、本発明物質は肝疾患の診断に有用である０
次に実施例金あげて本発明の詳細な説明する。
実施例
（１） ｃｔ２−ＭＧ抗体の作製
％−ＭＧ２７Ｖ’ｅ含む溶液１ｙｄ ｋ Ｆｒｅｕｎｄ
のコンフ゛リートーｙ−、ｉ−バント（ｃｏｍｐｌｅｔ
ｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ） １ ｍｌ ｋ混合して作
製した乳剤を家兎１匹に対して背中の皮下および四肢の
爪の間に注射した。第１回目の免疫から２週間後に第１
回目と同様の乳剤全家兎の皮下に注射した。同様の免疫
操作全５回繰り返した後、家兎の動動脈よシ血液を採取
し、３７℃で３０分間のカロ温後、３゜０００ ｒｐｍ
で１５分遠心を行い血清を得た。この血清を５６℃で３
０分熱処理を行って補体の非動化全行い、２０ｍＭ！Ｊ
ン酸緩衝液（ＰＨ８，０）全血清と同量加え、次いで血
清と同容量の飽和硫酸アンモニウムを加えて３３％飽和
とし、そこで析出する沈澱を１２．０００ｒｐｍで１５
分間の遠心を行って集め、少量の上記リン酸紛衝液に溶
解後、同緩衝液を用いて透析を行い、硫酸アンモニウム
を完全に除いた。ここで得られた両分を２０ｍＭリン酸
緩衝液（ＰＨ８，０）によシ緩衝化されたＤＥＡＥ−セ
ルロースカラム（２，５Ｘ１５ｅ）Ｋ添加し、カラムに
吸着せず上記緩衝液によシ流出する画分を集め、２０η
／ｌｒｉのタンパク量になるよう゛に上記緩衝液で希釈
し、これ全抗α２−ＭＧ抗体とし、それぞれを分注し、
凍結乾燥し一３０℃で保存した０ （２）抗α２−ＭＧ抗体結合ポリスチレンビーズの調製
凍結乾燥した抗体４０■’（（５０ｍＭ塩化ナトリウム
を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７，０）
４００ゴに溶解し、この溶液中に、充分洗浄（強力な洗
剤等を用いて）したポリスチレンビーズ（直径約６．５
お）を１，０００〜１０，０００個加え、３０℃で２時
間振とうした。抗体溶液を除いた後、０．１ ％ウシ血
清アルブミンを含む上記リン酸ナトリウム緩衝液でビー
ズを洗浄後、同緩衝液を加え、さらに３０℃で２時間振
とうした。さらに同緩衝液で洗浄後、濃度が帆１％にな
るようにアジ化ナトリウムを加え、同一緩衝液中にビー
ズを保存した０ （３）抗（Ｉｌ、 −ＭＧ抗体結合ガラスピーズの調製
ガラスピーズ（直径約４Ｉｌｌｌ＋１）５，０００〜１
０，０００個全１０％γ−アミノプロピル・トリエトオ
シシランを含むトルエン溶液２００ｙｄに加え３０分間
室温で反応後、上記溶液をガラスフィルターにて除去し
、トルエンにて充分洗浄後、アルキルアミン化ガラスピ
ーズ を乾燥した後、０．２％抗α２−ＭＧ抗体を含有
する２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，４）５００づ中に
加えた後、よく攪拌しながらグルタルアルデヒドを終濃
度０．１〜１％になるように加え、４℃にて１２時間振
とう反応させた。
のコンフ゛リートーｙ−、ｉ−バント（ｃｏｍｐｌｅｔ
ｅ ａｄｊｕｖａｎｔ ） １ ｍｌ ｋ混合して作
製した乳剤を家兎１匹に対して背中の皮下および四肢の
爪の間に注射した。第１回目の免疫から２週間後に第１
回目と同様の乳剤全家兎の皮下に注射した。同様の免疫
操作全５回繰り返した後、家兎の動動脈よシ血液を採取
し、３７℃で３０分間のカロ温後、３゜０００ ｒｐｍ
で１５分遠心を行い血清を得た。この血清を５６℃で３
０分熱処理を行って補体の非動化全行い、２０ｍＭ！Ｊ
ン酸緩衝液（ＰＨ８，０）全血清と同量加え、次いで血
清と同容量の飽和硫酸アンモニウムを加えて３３％飽和
とし、そこで析出する沈澱を１２．０００ｒｐｍで１５
分間の遠心を行って集め、少量の上記リン酸紛衝液に溶
解後、同緩衝液を用いて透析を行い、硫酸アンモニウム
を完全に除いた。ここで得られた両分を２０ｍＭリン酸
緩衝液（ＰＨ８，０）によシ緩衝化されたＤＥＡＥ−セ
ルロースカラム（２，５Ｘ１５ｅ）Ｋ添加し、カラムに
吸着せず上記緩衝液によシ流出する画分を集め、２０η
／ｌｒｉのタンパク量になるよう゛に上記緩衝液で希釈
し、これ全抗α２−ＭＧ抗体とし、それぞれを分注し、
凍結乾燥し一３０℃で保存した０ （２）抗α２−ＭＧ抗体結合ポリスチレンビーズの調製
凍結乾燥した抗体４０■’（（５０ｍＭ塩化ナトリウム
を含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７，０）
４００ゴに溶解し、この溶液中に、充分洗浄（強力な洗
剤等を用いて）したポリスチレンビーズ（直径約６．５
お）を１，０００〜１０，０００個加え、３０℃で２時
間振とうした。抗体溶液を除いた後、０．１ ％ウシ血
清アルブミンを含む上記リン酸ナトリウム緩衝液でビー
ズを洗浄後、同緩衝液を加え、さらに３０℃で２時間振
とうした。さらに同緩衝液で洗浄後、濃度が帆１％にな
るようにアジ化ナトリウムを加え、同一緩衝液中にビー
ズを保存した０ （３）抗（Ｉｌ、 −ＭＧ抗体結合ガラスピーズの調製
ガラスピーズ（直径約４Ｉｌｌｌ＋１）５，０００〜１
０，０００個全１０％γ−アミノプロピル・トリエトオ
シシランを含むトルエン溶液２００ｙｄに加え３０分間
室温で反応後、上記溶液をガラスフィルターにて除去し
、トルエンにて充分洗浄後、アルキルアミン化ガラスピ
ーズ を乾燥した後、０．２％抗α２−ＭＧ抗体を含有
する２０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，４）５００づ中に
加えた後、よく攪拌しながらグルタルアルデヒドを終濃
度０．１〜１％になるように加え、４℃にて１２時間振
とう反応させた。
ラム緩衝液（ｐＨ７，ｏ）にて充分に洗浄した後Ｘ０．
１％アジ化ナトリウムを含む同上緩衝液５００ゴ中にて
４℃で保存した。
１％アジ化ナトリウムを含む同上緩衝液５００ゴ中にて
４℃で保存した。
（４）抗（４−ＭＧ抗体結合ナイロンビーズのＤ山部ナ
イロンビーズ（直径約３ ｒｒａ ） １，０００〜１
０，０００個に１２．５％トリエチル・オキソニウム・
テトラフルオロボレートラ含むジクロメタン溶液１００
ｆｆ１７！に加え２５℃で１５分間反応後、水素化カル
シウムで水分を除いたジクロルメタン５００ｆｎｔにて
洗浄した。上記〇−アルキル化ナイロンビーズをジアミ
ノメタン１０〇−中に加えて、室温で２時間反応後、０
．２Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ８，５）にて５００−にて洗
浄後、５％グルタルアルデヒドを含む同上緩衝液１０〇
−中に加えて室温で１５分反応させた０このビーズをさ
らに２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，０）５０
０ゴで洗浄後、１■／−の抗体？含む上記ホウ酸緩衝液
５００ゴ中に加え、４ｃで一夜反応全行い、０．１％ウ
シ血清アルブミ／と０．１％アジ化ナトリウムを含む２
０ｍＭＩＪン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，０）で充分洗
浄した後、同上緩衝液中４℃で保存した。
イロンビーズ（直径約３ ｒｒａ ） １，０００〜１
０，０００個に１２．５％トリエチル・オキソニウム・
テトラフルオロボレートラ含むジクロメタン溶液１００
ｆｆ１７！に加え２５℃で１５分間反応後、水素化カル
シウムで水分を除いたジクロルメタン５００ｆｎｔにて
洗浄した。上記〇−アルキル化ナイロンビーズをジアミ
ノメタン１０〇−中に加えて、室温で２時間反応後、０
．２Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ８，５）にて５００−にて洗
浄後、５％グルタルアルデヒドを含む同上緩衝液１０〇
−中に加えて室温で１５分反応させた０このビーズをさ
らに２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，０）５０
０ゴで洗浄後、１■／−の抗体？含む上記ホウ酸緩衝液
５００ゴ中に加え、４ｃで一夜反応全行い、０．１％ウ
シ血清アルブミ／と０．１％アジ化ナトリウムを含む２
０ｍＭＩＪン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，０）で充分洗
浄した後、同上緩衝液中４℃で保存した。
実施例
（１）抗α２−ＭＧ抗体ポリスチレンビーズを用いる方
法測定対象試料１μｔｆ２００μｔの０．５％ゼラチン
。
法測定対象試料１μｔｆ２００μｔの０．５％ゼラチン
。
０．１％ウシ血清アルブミン、０．０１％チオメルサー
ル、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ＰＨ７゜０）を加えて、前記（２）で得られた抗体
結合ポリスチレンビーズをそれぞれ１個加え、３７℃で
３酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７，４）にて２回洗浄した
。
ル、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ＰＨ７゜０）を加えて、前記（２）で得られた抗体
結合ポリスチレンビーズをそれぞれ１個加え、３７℃で
３酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７，４）にて２回洗浄した
。
このビーズに２００ μｔの０．１ Ｍ Ｔｒ ｉ ！
！−ＨＣ４緩衝液（ＰＨ８，２）および１０μｔのＬ−
プロリール・Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−
４−メチルクマリル−７−アミド（ジメチルスルホキサ
イドによ、９１０ｍＭとしたもの）を加え、３７℃で１
時間反応後、０．４Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４，０）を２．
０−加え、励起波長３８０ｎｍ、螢光波長４４０ ｎｍ
にて螢光測距し、α、−ＭＧ−に活性を測定した。
！−ＨＣ４緩衝液（ＰＨ８，２）および１０μｔのＬ−
プロリール・Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−アルギニル−
４−メチルクマリル−７−アミド（ジメチルスルホキサ
イドによ、９１０ｍＭとしたもの）を加え、３７℃で１
時間反応後、０．４Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ４，０）を２．
０−加え、励起波長３８０ｎｍ、螢光波長４４０ ｎｍ
にて螢光測距し、α、−ＭＧ−に活性を測定した。
（２）抗α、−ＭＧ抗体結合ガラスピーズを用いる方法
前記（３）で調製した抗α、−ＭＧ抗体結合ガラスピー
ズを使用する以外は実験例（１）と同様に操作を行った
。
前記（３）で調製した抗α、−ＭＧ抗体結合ガラスピー
ズを使用する以外は実験例（１）と同様に操作を行った
。
（３）抗α、−ＭＧ抗体結合ナイロンビーズを用いる方
法前記（４）で調製した抗α２−ＭＧ抗体結合ナイロン
ビーズを使用する以外は実験例（１）と同様に操作を行
った。
法前記（４）で調製した抗α２−ＭＧ抗体結合ナイロン
ビーズを使用する以外は実験例（１）と同様に操作を行
った。
各実験例における血漿検における同時再現性（同一試料
を同時に測定したときのバラツキの度合）および日差変
動（日をかえて同一試料全測定したときのバラツキの度
合）を表に示す。
を同時に測定したときのバラツキの度合）および日差変
動（日をかえて同一試料全測定したときのバラツキの度
合）を表に示す。
表：抗α、−ＭＧ抗体結合担体を用いたα２−ＭＧ−に
活性測定法の再現性 Ｃ＋７％：変動係数 （ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏ
ｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）Ｌ 各検体の同時再現性は
５種の濃度の異なる検体の１０回繰り返し実験を行った
結果である。
活性測定法の再現性 Ｃ＋７％：変動係数 （ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏ
ｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）Ｌ 各検体の同時再現性は
５種の濃度の異なる検体の１０回繰り返し実験を行った
結果である。
２、各検体の日差変動は５種の濃度の異なる検体全１０
日量線９返し実験を行った結果である。
日量線９返し実験を行った結果である。
各種疾患患者血漿中のα、−ＭＧ−に活性の本測定法に
よる測定結果 各種疾患患者血漿中のα、−ＭＧ−に活性を図に示した
。図中、０内の数字は症例数を表わす。
よる測定結果 各種疾患患者血漿中のα、−ＭＧ−に活性を図に示した
。図中、０内の数字は症例数を表わす。
この結果、血漿中でα、 −ＭＧ −Ｋ活性は肝硬変。
亜急性肝炎で特異的に低下していた。
図は本発明の試薬を用いた各種疾患患者の血漿のα２−
ＭＧ−に活性量を示すグラフである。
ＭＧ−に活性量を示すグラフである。
Claims (1)
- Ｌ 精製した偽−マクログロブリンを抗原として得られ
る抗へ−マクログロブリン抗体を共有結合または物理的
吸着によシネ溶性担体に結合した不溶化抗体と、カリク
レインに特異的な基質とからなることを特徴とするα２
−マクログロブリン結合性カリクレイン活性測定用試薬
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7815783A JPS59203957A (ja) | 1983-05-06 | 1983-05-06 | α↓２−マクログロブリン結合性カリクレイン活性測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7815783A JPS59203957A (ja) | 1983-05-06 | 1983-05-06 | α↓２−マクログロブリン結合性カリクレイン活性測定用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59203957A true JPS59203957A (ja) | 1984-11-19 |
Family
ID=13654079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7815783A Pending JPS59203957A (ja) | 1983-05-06 | 1983-05-06 | α↓２−マクログロブリン結合性カリクレイン活性測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59203957A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2582103A1 (fr) * | 1985-03-19 | 1986-11-21 | Canavaggio Michel | Procede de determination d'une substance biologique dans un echantillon |
| WO2003012450A1 (en) * | 2001-08-02 | 2003-02-13 | The Scripps Research Institute | Diagnostic markers of liver dysfunction |
-
1983
- 1983-05-06 JP JP7815783A patent/JPS59203957A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2582103A1 (fr) * | 1985-03-19 | 1986-11-21 | Canavaggio Michel | Procede de determination d'une substance biologique dans un echantillon |
| WO2003012450A1 (en) * | 2001-08-02 | 2003-02-13 | The Scripps Research Institute | Diagnostic markers of liver dysfunction |
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