JPS6312961A - トリプシン測定用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｌ）産業上の利用分野 本発明はヒト体液中のトリプシンをサンドウィッチ法に
よる酵素免疫学的測定法により測定するための試薬に間
するものである。

２）従来の技術 従来、トリプシンの測定は酵素活性に基づく方法により
行われている。しかしながら、血清中でトリプシンはα
、−ブロティナーゼインヒビター、α２−マクログロブ
リン、インターαイーアンチトリプシンなどのトリプシ
ンインヒビターと結合して存在しているため、酵素活性
測定法の応用は困難である。従って、体液中のトリプシ
ン量の測定には、放射性免疫測定法（ラジオイムノアッ
セイ）が用いられていた。

３）発明が解決しようとする問題点 体液中のトリプシン量の測定には、放射性免疫測定法が
用いられているが、放射性免疫測定法は放射性物質によ
る環境汚染、人体への影響という虚で一般施設での測定
が制約され、安全な測定系の開発が望まれてきた０本発
明は体液中のトリプシン量を放射性物質を用いないで、
酵素免疫学的な測定をするものである。

４）問題を解決するための手段 本発明の試薬を用いる酵素免疫学的測定法は、トリプシ
ンと抗トリプシン抗体の抗原抗体反応を利用し、抗原抗
体結合物を生成せしめ、この結合物中の抗体に共有結合
している酵素の活性を測定することにより未知検体中の
抗原量を測定しようとするものである。本発明で用いて
いるサンドウィッチ法は複数の抗原決定基に、複数の抗
体が結合することを利用し、抗体結合不溶性担体−抗原
−酵素標識抗体のサンドウィッチ型結合物を生成させ、
その酵素標識抗体の酵素活性を測定することにより、抗
原量を測定しようとする方法であり、他の免疫学的測定
法に比較し、５０〜１０，０００倍感度が高いという利
点を有している。

即ち、精製したヒトトリプシンを家兎に感作して抗ヒト
トリプシン抗体を作成し、次にこの抗体をポリスチレン
ビーズなどの不溶性担体に物理的に吸着させて抗ヒトト
リプシン抗体の結合した不溶性担体を得る。

一方、抗ヒトトリプシン抗体に、標識酵素および使用す
る標識酵素に最適な化合物（例えばβ−ガラクトシダー
ゼおよびｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサ
クシンイミドエステル、またはパーオキシダーゼおよび
ゲルタールアルデヒドなど）を加えて反応させ、酵素標
識抗ヒトトリプシン抗体を得る。

このようにして得られた抗ヒトトリプシン抗体結合不溶
性担体と酵素標識抗ヒトトリプシン抗体を用い患者血清
で測定したところ、血清中トリプシン量は、急性膵炎、
膵癌で特異的に上昇することが判明した。従って本発明
は膵疾患の診断に有用である。

次に実施例をあげて更に詳細に説明する。

５）実施例 実施例１ 抗ヒトトリプシン抗体の製造 家兎１匹に対して、ヒトトリプシン１．５ｍｇを含む水
溶液１１とＦｒｅｕｎｄのコンプリードアシュバンド１
１を混合して作成した乳剤を背中の皮下及び四肢の爪の
間に注射して免疫した。第１回目の免疫から２週間後に
第１回目と同様の乳剤を家兎の皮下に注射した。同様な
免疫操作を４回繰り返した後、家兎の爪動脈より血液を
採取し、３７℃で３０分間の加温後、毎分３０００回転
で１５分間遠心を行い、血清を得た。この血清に対して
５６℃で３０分間の熱処理を行い補体を非動化した後、
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　　［緩衝液ｌ］
を血清と同量加えて、血清と同容量の飽和硫酸アンモニ
ウムを加えて３３％飽和とし、そこで析出する沈殿を毎
分１２，０００回転で１５分間の遠心により集め、少量
の緩衝液１に溶解後、緩衝液１を用いて透析を行った。

ここで得られた画分を緩衝液１で緩衝化されたＤＥＡＥ
−セルロースカラム（２，５Ｘ　１５ｃａ）に添加し、
吸着しないで緩衝液１にて流出する両分を集め２０ｍｇ
／ｍ　Ｉのタンパク濃度になるよう緩衝液１で希釈し、
これを抗ヒトトリプシン抗体溶液とした。

実施例２ 抗体結合ポリスチレンビーズの製造 実施例１の抗ヒトトリプシン抗体溶液２１に５０ｍ１塩
化ナトリウムを含むＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０
）　　［緩衝液２］　　４００ｎ＋Ｉを加えた液に、充
分洗浄したポリスチレンビーズ（直径約６．５＋ａａ＋
）　　１，０００〜ｔｏ、ｏｏｏ個を加え３０℃で２時
間振盪した。抗体溶液を除いた後、０．１％牛血清アル
ブミンを含むｌｌｌ液液２緩衝液３］でビーズを洗浄後
、ｍ電液３を加え、３０℃で２時間振盪した。更にビー
ズを緩衝液３で洗浄後、チメロサール濃度が０．０１％
になるように加えた。

実施例３ 酵素標識抗体液の製造 西洋ワサビから精製されたパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）
２０ｍｇを１．２５％グルタルアルデヒドを含む０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ，７，５）　０．３ｓ＋ｌに溶解
し、室温で１８時間反応させグルタルアルデヒド化ＰＯ
Ｄ溶液を得た。グルタルアルデヒド化ＰＯＤ溶液を０．
１５Ｍ塩化ナトリウムで緩衝化されたセファデックスＧ
−２５カラム（１，５Ｘ６０ｃｍ）に添加し、遊離のグ
ルタルアルデヒドを除去した。前記精製グルタルアルデ
ヒド化ＰＯＤ溶液に実施例１の抗体ｉｏＩＩＩｇを溶解
し、更に１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）　０゜２１を加
え、４℃で２４時間反応後、０．２Ｍ　Ｌ−リジンを加
え、室温で２時間反応させた。前記反応液を０．１５４
Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ρ８７
．２）により緩衝化されたセファデックスＧ−２００カ
ラム（１，５Ｘ７０ｃ＋＋）に添加し、ｐ。

Ｄ標識抗体液を得た。ＰＯＤ活性を有する抗体画分を集
め終濃度０．０１％になるように、チメロサールを加え
、４℃にて保存した。

実験例１ 未知検体２０　　あるいは濃度既知標準ヒトトリプシン
溶液（０，１８，８，３７，５，７５，１５０，３００
，６００ｎｇ／ｍｌ　）　２０　　に、０．１％牛血清
アルブミン、０．５％ゼラチン、３ｍＭ塩化ナトリウム
、０．０１％チメロサールを含む１５■Ｈリン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）　　２００を加えて、前記実施例２で得
られた抗体結合ポリスチレンビーズを各々１個加え、３
７℃で２時間反応した後゛、０．１５Ｍ塩化ナトリウム
、０．０５％ツイーン２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐ！ｌ　６．８）　　［緩衝液Ａ］２１にて２回洗浄
した０次に前記実施例３で得られた酵素標識抗体液の約
４００倍希釈液２００を加え、室温にて一夜放置した後
、緩衝液Ａ２ｍ１にて２回洗浄した。抗体結合ポリスチ
レンビーズを別の試験管に移し、０．３％オルトフェニ
レンジアミンニ塩酸塩、０．０２％過酸化水素および０
．０１％チメロサールを含む０．１Ｍクエン酸−リン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）　　２００　　を加えて３７℃で
１５分間反応を行い、ＩＮ塩酸２１を加えた後、４９２
ｎｍで吸光度を測定した。未知検体中のトリプシン濃度
は、片対数グラフ用紙にて濃度既知標準ヒトトリプシン
溶液より作成した検量線より算出した。第１図は本法に
よる標準ヒトトリプシンの標準曲線を示す。

第１表は本法による血清測定の同時再現性を示す。

第１表　トリプシンの酵素免疫学的測定法における同時
再現性 ６）発明の効果 各種疾患患者血清中のトリプシンの酵素免疫的測定法に
よる測定結果 各種疾患患者血清中のトリプシン測定の結果第２図に示
す０図中の０内の数字は症例数をす。この結果より明ら
かなごとく、血清中トリシン量は急性膵炎、膵癌で特異
的に上昇してい

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の実施例１における濃度既知率ヒトトリ
プシン量を横軸に対数でとり、吸光を縦軸にとったグラ
フを示すものである。第２は本発明の試薬を用いて各種
疾患患者血清中のリブシン量を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 精製したヒトトリプシンを抗原として得られる抗トリプ
   シン抗体を精製し、抗トリプシン抗体を酵素と共有結合
   により結合させた酵素標識抗体と、抗トリプシン抗体を
   物理的吸着により不溶性担体に結合させた抗トリプシン
   抗体結合担体とからなるヒト体液中のトリプシン測定用
   試薬。