JPS6363859B2 - - Google Patents
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- JPS6363859B2 JPS6363859B2 JP55151046A JP15104680A JPS6363859B2 JP S6363859 B2 JPS6363859 B2 JP S6363859B2 JP 55151046 A JP55151046 A JP 55151046A JP 15104680 A JP15104680 A JP 15104680A JP S6363859 B2 JPS6363859 B2 JP S6363859B2
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- phosphate buffer
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/78—Thyroid gland hormones, e.g. T3, T4, TBH, TBG or their receptors
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、甲状腺刺激ホルモン（TSH）の酵
素免疫測定法（以下EIAと略）に関するものであ
る。免疫反応を利用した測定法としてラジオイム
ノアツセイ（以下RIAと略）やEIAの原理が知ら
れ、RIAは種々の物質の測定に利用されている。
EIAはRIAに比し感度が低く、TSHの測定法と
しても満足できるものではなかつた。そこで、本
発明者は抗体の処理方法につき検討し、感度の上
昇を企り、本発明を完成した。
素免疫測定法（以下EIAと略）に関するものであ
る。免疫反応を利用した測定法としてラジオイム
ノアツセイ（以下RIAと略）やEIAの原理が知ら
れ、RIAは種々の物質の測定に利用されている。
EIAはRIAに比し感度が低く、TSHの測定法と
しても満足できるものではなかつた。そこで、本
発明者は抗体の処理方法につき検討し、感度の上
昇を企り、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、いわゆるサンドイツチ法
EIAにおいて、抗TSHIgGをPH１〜４の酸性条件
で処理した抗体を用いることを特徴とするTSH
の測定法を提供するものである。
EIAにおいて、抗TSHIgGをPH１〜４の酸性条件
で処理した抗体を用いることを特徴とするTSH
の測定法を提供するものである。
ここで原料として用いる抗TSHIgGは、基本
的には、通常の方法で哺乳類に免疫して得る抗血
清を、硫酸アンモニウムを加えて沈澱させたIgG
分画でよく、必要に応じ透析やゲル濾過等の精製
工程を加えてもよく、また、アガロース等の担体
に抗原のTSHを結合させ、これを用いたアフイ
ニテイークロマトグラフイーにより精製してもよ
い。
的には、通常の方法で哺乳類に免疫して得る抗血
清を、硫酸アンモニウムを加えて沈澱させたIgG
分画でよく、必要に応じ透析やゲル濾過等の精製
工程を加えてもよく、また、アガロース等の担体
に抗原のTSHを結合させ、これを用いたアフイ
ニテイークロマトグラフイーにより精製してもよ
い。
抗TSHIgGを酸性条件で処理するには、グリ
シン−塩酸バツフアーでIgGを数十倍乃至数百倍
に希釈し、必要であればさらにPHを調整して室温
で数分乃至数十分、好ましくは10分前後放置し、
そののちPHを中性付近に戻せばよい。PHの範囲は
１乃至４程度が適しており特に２乃至３が好まし
く、処理後はトリス塩酸バツフアー等のやや塩基
性のバツフアーを加えてPHを中性付近に保つ。
シン−塩酸バツフアーでIgGを数十倍乃至数百倍
に希釈し、必要であればさらにPHを調整して室温
で数分乃至数十分、好ましくは10分前後放置し、
そののちPHを中性付近に戻せばよい。PHの範囲は
１乃至４程度が適しており特に２乃至３が好まし
く、処理後はトリス塩酸バツフアー等のやや塩基
性のバツフアーを加えてPHを中性付近に保つ。
標識抗体は常法により酵素を抗体に結合させた
ものを用いるが、この抗体としては抗TSHIgG
もしくはアフイニテイークロマトグラフイーによ
り精製した抗TSHIgGまたはパパインフラグメ
ント（Fab）もしくはペプシンフラグメント（Ｆ
（ab′）2もしくはFab′）が挙げられるが、Fabまた
はFab′が特に好ましい。
ものを用いるが、この抗体としては抗TSHIgG
もしくはアフイニテイークロマトグラフイーによ
り精製した抗TSHIgGまたはパパインフラグメ
ント（Fab）もしくはペプシンフラグメント（Ｆ
（ab′）2もしくはFab′）が挙げられるが、Fabまた
はFab′が特に好ましい。
酵素による標識化は、通常の方法を用いること
ができるが、特に抗体と酵素のSH基をマレイミ
ドにより中継させる方法が適当である。
ができるが、特に抗体と酵素のSH基をマレイミ
ドにより中継させる方法が適当である。
EIAによる測定に当つては、ポリエチレン、ポ
リスチレン、ポリプロピレン等のプラスチツク
や、種々のRIA用抗体等の、ビーズ状、シート
状、チユーブ状等のものを適宜用い、これに吸着
法やブロムシアンを用いて反応させる方法等常法
により抗体を結合させ、これにTSHを含有する
標準液または検体を反応させ、次いでこれに酵素
標識抗体を反応させ、必要に応じ反応生成物の固
相と液相を分離し、いずれかの酵素活性を測定す
る。酵素活性は、その酵素に適応する基質と測定
液を作用させ生成物に螢光または着色の強さを測
定し決定する。
リスチレン、ポリプロピレン等のプラスチツク
や、種々のRIA用抗体等の、ビーズ状、シート
状、チユーブ状等のものを適宜用い、これに吸着
法やブロムシアンを用いて反応させる方法等常法
により抗体を結合させ、これにTSHを含有する
標準液または検体を反応させ、次いでこれに酵素
標識抗体を反応させ、必要に応じ反応生成物の固
相と液相を分離し、いずれかの酵素活性を測定す
る。酵素活性は、その酵素に適応する基質と測定
液を作用させ生成物に螢光または着色の強さを測
定し決定する。
例
TSH抗血清の作成
ヒトTSH（150μｇ／ml）に等量のフロインド
コンプリートアジユバントを混合してエマルジ
ヨンとし、その２mlを家兎の背部皮内に注射す
る。初回注射の1.5ケ月後及び2.5ケ月後にヒト
TSH（100μｇ／ml）に等量のフロンドコンプリ
ートアジユバントを混合しエマルジヨンとし、
その２mlを家兎の背部皮下に注射し追加免疫を
行う。最終注射の10日後に耳静脈より採血し、
血球を分離してTSH抗血清を得た。
コンプリートアジユバントを混合してエマルジ
ヨンとし、その２mlを家兎の背部皮内に注射す
る。初回注射の1.5ケ月後及び2.5ケ月後にヒト
TSH（100μｇ／ml）に等量のフロンドコンプリ
ートアジユバントを混合しエマルジヨンとし、
その２mlを家兎の背部皮下に注射し追加免疫を
行う。最終注射の10日後に耳静脈より採血し、
血球を分離してTSH抗血清を得た。
抗TSHIgGの作成
により得られたTSH抗血清２mlに硫酸ア
ンモニウム0.36ｇを加えIgG分画の沈澱を得る。
これを0.0175Mリン酸ナトリウムバツフアー
（PH6.3）で透析したのち、DEA−セルロース
カラム（１×３cm）により同一バツフアーを溶
出液として用いて抗IgGを精製する。抗
TSHIgG15mgを得た。
ンモニウム0.36ｇを加えIgG分画の沈澱を得る。
これを0.0175Mリン酸ナトリウムバツフアー
（PH6.3）で透析したのち、DEA−セルロース
カラム（１×３cm）により同一バツフアーを溶
出液として用いて抗IgGを精製する。抗
TSHIgG15mgを得た。
抗TSHIgGの酸性条件での処理
により得られた抗TSHIgG（10mg／ml）を
0.1Mグリシン−塩酸バツフアー（PH2.5、1M
塩化ナトリウム）で90倍に希釈し、0.1N塩酸
を用いてPH2.5に調整する。これを室温で10分
間放置したのち、0.5Mトリス塩酸バツフアー
（PH8.0）を用いてPHを7.3〜7.4に調整する。
0.1Mグリシン−塩酸バツフアー（PH2.5、1M
塩化ナトリウム）で90倍に希釈し、0.1N塩酸
を用いてPH2.5に調整する。これを室温で10分
間放置したのち、0.5Mトリス塩酸バツフアー
（PH8.0）を用いてPHを7.3〜7.4に調整する。
抗TSHIgG結合ポリスチレンビーズの作成
ポリスチレンビーズ（3.2mm径、Precision
Plastic Ball Co.）を非イオン性界面活性剤
（Scat20−Ｘ）で洗浄後、またはで得られ
た抗TSHIgG溶液（IgG総量として約100μｇ／
ml、0.25Mリン酸ナトリウムバツフアー、PH
7.5、0.1M塩化ナトリウム）またはで得られ
た酸性処理抗TSHIgG溶液に30分間浸し、つ
いで４℃で１晩放置する。放置後、ポリスチレ
ンビーズを0.25Mリン酸ナトリウムバツフアー
（PH7.5、0.1M塩化ナトリウム）及び0.01Mリン
酸ナトリウムバツフアー（PH7.0.0.1M塩化ナト
リウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、0.1％アジ
化ナトリウム、0.1％牛血清アルブミン）で洗
浄する。
Plastic Ball Co.）を非イオン性界面活性剤
（Scat20−Ｘ）で洗浄後、またはで得られ
た抗TSHIgG溶液（IgG総量として約100μｇ／
ml、0.25Mリン酸ナトリウムバツフアー、PH
7.5、0.1M塩化ナトリウム）またはで得られ
た酸性処理抗TSHIgG溶液に30分間浸し、つ
いで４℃で１晩放置する。放置後、ポリスチレ
ンビーズを0.25Mリン酸ナトリウムバツフアー
（PH7.5、0.1M塩化ナトリウム）及び0.01Mリン
酸ナトリウムバツフアー（PH7.0.0.1M塩化ナト
リウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、0.1％アジ
化ナトリウム、0.1％牛血清アルブミン）で洗
浄する。
抗TSHFab′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼの
作成 により得られた抗TSHIgG20mgを0.1M酢
酸ナトリウムバツフアー（PH4.5）で透析した
のち、ペプシン0.8mgを加え37℃で16時間イン
キユベートする。0.1N水酸化ナトリウムを用
いてPHを8.0に調整し、セフアデツクスＧ−150
カラム（1.5×40cm）により0.1Mホウ酸ナトリ
ウムバツフアー（PH8.0）を溶出液として用い
て溶出する。抗TSHF（ab′）2を含む分画を採取
し、0.1Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH
6.0）で透析し濃縮したのち、アジ化ナトリウ
ムを0.1％の濃度となるよう加える。上記によ
つて得られたＦ（ab′）24mgを0.1Mリン酸ナトリ
ウムバツフアー（PH6.0、１ｍＭエデド酸ナト
リウム）で透析したのち、その0.9mlに0.1M2
−メルカプトエチルアミン0.1mlを加え37℃で
90分間インキユベートする。次に、セフアデツ
クスＧ−25カラム（１×30cm）により、0.1M
リン酸ナトリウムバツフアー（PH6.0、１ｍＭ
エデト酸ナトリウム）を溶出液として用いて溶
出する。Fab′を含む分画を採取し、0.1M酢酸
ナトリウムバツフアー（PH5.0）を加えて
Fab′が２〜３mg／mlの濃度となるように希釈
する。この溶液２mlを0.75ｍＭ Ｎ，N′−０−
フエニレンジマレイドの0.1M酢酸ナトリウム
バツフアー（PH5.0）１mlに滴下し、30℃で20
分間インキユベートする。セフアデツクスＧ−
25カラム（１×40cm）により、0.02M酢酸ナト
リウムバツフアー（PH5.0）を溶出液として用
いて抗TSHFab′−マレイドを分離したのち、
0.25Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH7.5）
を加えてPHを6.5に調整する。これを2.2M硫酸
アンモニウム中に懸濁させたβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ0.44mgと４℃で40時間インキユベート
する。セフアローズ6Bカラム（1.5×40cm）に
より0.01Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH
7.0、0.1M塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネ
シウム、0.1％牛血清アルブミン、0.1％アジ化
ナトリウム）を溶出液として用いて溶出し、抗
TSHFab′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを得る。
作成 により得られた抗TSHIgG20mgを0.1M酢
酸ナトリウムバツフアー（PH4.5）で透析した
のち、ペプシン0.8mgを加え37℃で16時間イン
キユベートする。0.1N水酸化ナトリウムを用
いてPHを8.0に調整し、セフアデツクスＧ−150
カラム（1.5×40cm）により0.1Mホウ酸ナトリ
ウムバツフアー（PH8.0）を溶出液として用い
て溶出する。抗TSHF（ab′）2を含む分画を採取
し、0.1Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH
6.0）で透析し濃縮したのち、アジ化ナトリウ
ムを0.1％の濃度となるよう加える。上記によ
つて得られたＦ（ab′）24mgを0.1Mリン酸ナトリ
ウムバツフアー（PH6.0、１ｍＭエデド酸ナト
リウム）で透析したのち、その0.9mlに0.1M2
−メルカプトエチルアミン0.1mlを加え37℃で
90分間インキユベートする。次に、セフアデツ
クスＧ−25カラム（１×30cm）により、0.1M
リン酸ナトリウムバツフアー（PH6.0、１ｍＭ
エデト酸ナトリウム）を溶出液として用いて溶
出する。Fab′を含む分画を採取し、0.1M酢酸
ナトリウムバツフアー（PH5.0）を加えて
Fab′が２〜３mg／mlの濃度となるように希釈
する。この溶液２mlを0.75ｍＭ Ｎ，N′−０−
フエニレンジマレイドの0.1M酢酸ナトリウム
バツフアー（PH5.0）１mlに滴下し、30℃で20
分間インキユベートする。セフアデツクスＧ−
25カラム（１×40cm）により、0.02M酢酸ナト
リウムバツフアー（PH5.0）を溶出液として用
いて抗TSHFab′−マレイドを分離したのち、
0.25Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH7.5）
を加えてPHを6.5に調整する。これを2.2M硫酸
アンモニウム中に懸濁させたβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ0.44mgと４℃で40時間インキユベート
する。セフアローズ6Bカラム（1.5×40cm）に
より0.01Mリン酸ナトリウムバツフアー（PH
7.0、0.1M塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネ
シウム、0.1％牛血清アルブミン、0.1％アジ化
ナトリウム）を溶出液として用いて溶出し、抗
TSHFab′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを得る。
EIAによるTSHの測定
によつて得られた抗TSHIgG結合ポリス
チレンビーズ１個及び数種類の濃度の標準
THS溶液（0.01Mリン酸ナトリウムバツフア
ー、PH7.0、0.1M塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化
マグネシウム、0.1％牛血清アルブミン、0.1％
アジ化ナトリウム）0.15mlとを37℃で４時間、
さらに４℃で15時間インキユベートする。反応
液を除去し、ビーズを0.01Mリン酸ナトリウム
バツフアー（PH7.0、0.1M塩化ナトリウム、１
ｍＭ塩化マグネシウム、0.1％牛血清アルブミ
ン、0.1％アジ化ナトリウム）１mlで２回洗浄
したのち、で得られた抗TSHFab′−β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ（0.01Mリン酸ナトリウム
バツフアー、PH7.0、0.1M塩化ナトリウム、１
ｍＭ塩化マグネシウム、0.1％牛血清アルブミ
ン、0.1％アジ化ナトリウム）0.15ml（2000μU）
を加えて37℃で６時間インキユベートする。ビ
ーズを別の試験管に移し、0.01Mリン酸ナトリ
ウムバツフアー（PH7.0、0.1M塩化ナトリウ
ム、１ｍＭ塩化マグネシウム、0.1％牛血清ア
ルブミン、0.1％アジ化ナトリウム）0.1mlを加
え、30℃で５分間放置する。次に３×10-4M4
−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクシ
ド（0.01Mリン酸バツフアー、PH7.0、0.1M塩
化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、0.1
％牛血清アルブミン、0.1％アジ化ナトリウム）
50μを加え、30℃で10分間インキユベートす
る。0.1Mグリシン−水酸化ナトリウムバツフ
アー（PH10.3）2.5mlを加え反応を停止させ遊
離した４−メチルウンベリフエロン及び標準４
−メチルウンベリフエロンにつき励起光360n
ｍで450nｍにおける螢光強度を測定し、遊離
した４−メチルウンベリフエロンの量を求め
る。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の１ユニツ
トは上記の条件で１分間に１マイクロモルの４
−メチルウンベルフエリル−β−Ｄ−ガラクト
シドを加水分解するものと定義して求めた。
チレンビーズ１個及び数種類の濃度の標準
THS溶液（0.01Mリン酸ナトリウムバツフア
ー、PH7.0、0.1M塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化
マグネシウム、0.1％牛血清アルブミン、0.1％
アジ化ナトリウム）0.15mlとを37℃で４時間、
さらに４℃で15時間インキユベートする。反応
液を除去し、ビーズを0.01Mリン酸ナトリウム
バツフアー（PH7.0、0.1M塩化ナトリウム、１
ｍＭ塩化マグネシウム、0.1％牛血清アルブミ
ン、0.1％アジ化ナトリウム）１mlで２回洗浄
したのち、で得られた抗TSHFab′−β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ（0.01Mリン酸ナトリウム
バツフアー、PH7.0、0.1M塩化ナトリウム、１
ｍＭ塩化マグネシウム、0.1％牛血清アルブミ
ン、0.1％アジ化ナトリウム）0.15ml（2000μU）
を加えて37℃で６時間インキユベートする。ビ
ーズを別の試験管に移し、0.01Mリン酸ナトリ
ウムバツフアー（PH7.0、0.1M塩化ナトリウ
ム、１ｍＭ塩化マグネシウム、0.1％牛血清ア
ルブミン、0.1％アジ化ナトリウム）0.1mlを加
え、30℃で５分間放置する。次に３×10-4M4
−メチルウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクシ
ド（0.01Mリン酸バツフアー、PH7.0、0.1M塩
化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、0.1
％牛血清アルブミン、0.1％アジ化ナトリウム）
50μを加え、30℃で10分間インキユベートす
る。0.1Mグリシン−水酸化ナトリウムバツフ
アー（PH10.3）2.5mlを加え反応を停止させ遊
離した４−メチルウンベリフエロン及び標準４
−メチルウンベリフエロンにつき励起光360n
ｍで450nｍにおける螢光強度を測定し、遊離
した４−メチルウンベリフエロンの量を求め
る。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性の１ユニツ
トは上記の条件で１分間に１マイクロモルの４
−メチルウンベルフエリル−β−Ｄ−ガラクト
シドを加水分解するものと定義して求めた。
このようにして得たTSHの検量線を第１図に
示した。
示した。
第１図は抗TSHIgGまたはこれを酸性条件
で処理したものをポリスチレンビーズに結合さ
せ、それぞれを用いて得た検量線である。酸性条
件での処理により高いバウンドの急峻な検量線が
得られ、感度の上昇が認められる。
で処理したものをポリスチレンビーズに結合さ
せ、それぞれを用いて得た検量線である。酸性条
件での処理により高いバウンドの急峻な検量線が
得られ、感度の上昇が認められる。
第１図は検量線である。
Claims (1)
- １ 抗体が結合した固相に抗原であるTSHを含
有する検体を作用させ、さらにこれに酵素標識抗
体を作用させ、固相に結合したまたは結合しない
標識抗体の酵素活性を測定するTSHのサンドイ
ツチ法酵素免疫測定法において、抗体がPH１〜４
で処理されたTSHIgGであることを特徴とする
TSHの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15104680A JPS5774663A (en) | 1980-10-28 | 1980-10-28 | Tsh measuring method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15104680A JPS5774663A (en) | 1980-10-28 | 1980-10-28 | Tsh measuring method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5774663A JPS5774663A (en) | 1982-05-10 |
| JPS6363859B2 true JPS6363859B2 (ja) | 1988-12-08 |
Family
ID=15510108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15104680A Granted JPS5774663A (en) | 1980-10-28 | 1980-10-28 | Tsh measuring method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5774663A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2028600B1 (en) | 2007-08-24 | 2016-10-26 | Sysmex Corporation | Diagnosis support system for cancer, diagnosis support for information providing method for cancer, and computer program product |
| JP2009085753A (ja) | 2007-09-28 | 2009-04-23 | Sysmex Corp | サンドイッチイムノアッセイ法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54122722A (en) * | 1978-02-21 | 1979-09-22 | Mallinckrodt Chemical Works | Radioimmunological assay of human thyroid stimulating hormone |
-
1980
- 1980-10-28 JP JP15104680A patent/JPS5774663A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54122722A (en) * | 1978-02-21 | 1979-09-22 | Mallinckrodt Chemical Works | Radioimmunological assay of human thyroid stimulating hormone |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5774663A (en) | 1982-05-10 |
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