JPH04271795A - インターロイキン５の微量定量 - Google Patents
インターロイキン５の微量定量Info
- Publication number
- JPH04271795A JPH04271795A JP3032829A JP3282991A JPH04271795A JP H04271795 A JPH04271795 A JP H04271795A JP 3032829 A JP3032829 A JP 3032829A JP 3282991 A JP3282991 A JP 3282991A JP H04271795 A JPH04271795 A JP H04271795A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- monoclonal antibody
- human
- buffer
- novel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 title abstract description 45
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 title abstract description 45
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 title abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 101000960969 Homo sapiens Interleukin-5 Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 19
- 102000055228 human IL5 Human genes 0.000 abstract description 17
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 abstract description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 abstract description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 abstract 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 abstract 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 abstract 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical group OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 210000003200 peritoneal cavity Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100024165 G1/S-specific cyclin-D1 Human genes 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 101000980756 Homo sapiens G1/S-specific cyclin-D1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100230428 Caenorhabditis elegans hil-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000960966 Mus musculus Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000035409 positive regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013214 routine measurement Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトインターロイキン
５（ヒトＩＬ−５と称する）に対するモノクローナル抗
体、このモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ法に
よるヒトＩＬ−５の測定方法、及びこの測定方法のため
に使用する測定キットに関する。
５（ヒトＩＬ−５と称する）に対するモノクローナル抗
体、このモノクローナル抗体を用いるサンドイッチ法に
よるヒトＩＬ−５の測定方法、及びこの測定方法のため
に使用する測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＩＬ−５はＴ細胞代替因子（Ｔ ｃｅｌ
ｌ−ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）とも称され、
最初、活性化されたＢ細胞が免疫グロブリン分泌細胞に
分化するための最終段階のために必要な因子として記載
された（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２５ ， ２６４６
， １９８０， Ｋｉｙｏｓｈｉ Ｔａｋａｔｓｕ ら
）。最近、マウス及びヒトについてＩＬ−５をコードす
るｃＤＮＡが単離され（Ｎａｔｕｒｅ ３２４ ， ７
０， １９８６， Ｔａｔｓｕｏ Ｋｉｎａｓｈｉら；
Ｃｅｌｌ １４， ９１４８， １９８６， Ｃｈｉｈ
ｉｒｏ Ａｚｕｍａ ら）、精製されたＩＬ−５が入手
可能になったことから、広範な研究が可能となり、この
結果ＩＬ−５が種々の生物学的活性、例えば好中球の分
化の誘導（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６７ ， ４３，
１９８８， Ｙｕｊｉ Ｙａｍａｇｕｃｈｉら）、Ｂ
細胞の増殖の刺激（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８３， ４３７， １９８６， Ｃｏｌ
ｉｎ Ｊ．Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら）、細胞傷害（ｃｙｔ
ｏｔｏｘｉｃ） Ｔ細胞形成の増強（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４， ４２３４，
１９８７， Ｋｉｙｏｓｈｉ Ｔａｋａｔｓｕ ら）等
、を有することが明らかになった。しかしながら、正常
状態及び疾患状態におけるＩＬ−５の正確な役割は解明
されていない。
ｌ−ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）とも称され、
最初、活性化されたＢ細胞が免疫グロブリン分泌細胞に
分化するための最終段階のために必要な因子として記載
された（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２５ ， ２６４６
， １９８０， Ｋｉｙｏｓｈｉ Ｔａｋａｔｓｕ ら
）。最近、マウス及びヒトについてＩＬ−５をコードす
るｃＤＮＡが単離され（Ｎａｔｕｒｅ ３２４ ， ７
０， １９８６， Ｔａｔｓｕｏ Ｋｉｎａｓｈｉら；
Ｃｅｌｌ １４， ９１４８， １９８６， Ｃｈｉｈ
ｉｒｏ Ａｚｕｍａ ら）、精製されたＩＬ−５が入手
可能になったことから、広範な研究が可能となり、この
結果ＩＬ−５が種々の生物学的活性、例えば好中球の分
化の誘導（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １６７ ， ４３，
１９８８， Ｙｕｊｉ Ｙａｍａｇｕｃｈｉら）、Ｂ
細胞の増殖の刺激（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８３， ４３７， １９８６， Ｃｏｌ
ｉｎ Ｊ．Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら）、細胞傷害（ｃｙｔ
ｏｔｏｘｉｃ） Ｔ細胞形成の増強（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４， ４２３４，
１９８７， Ｋｉｙｏｓｈｉ Ｔａｋａｔｓｕ ら）等
、を有することが明らかになった。しかしながら、正常
状態及び疾患状態におけるＩＬ−５の正確な役割は解明
されていない。
【０００３】ＩＬ−５の測定のため、ネズミＢ細胞リン
パ腫 ＢＣＬ１細胞の ＩｇＭ分泌を誘導するその能力
に基くバイオアッセイが用いられているが、この方法は
感度が低く、そして日常的測定法としてはふさわしくな
い。しかも、 ＢＣＬ１細胞はＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ
等の他のサイトカイン類にも応答する。従って、ＩＬ
−５の生物学的研究及び実用のためには、前記の方法に
代る、特異性が高く、高感度でありそして信頼性の高い
ＩＬ−５の測定方法が必要である。
パ腫 ＢＣＬ１細胞の ＩｇＭ分泌を誘導するその能力
に基くバイオアッセイが用いられているが、この方法は
感度が低く、そして日常的測定法としてはふさわしくな
い。しかも、 ＢＣＬ１細胞はＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ
等の他のサイトカイン類にも応答する。従って、ＩＬ
−５の生物学的研究及び実用のためには、前記の方法に
代る、特異性が高く、高感度でありそして信頼性の高い
ＩＬ−５の測定方法が必要である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、日常
的に使用することができ、ＩＬ−５に対して特異性が高
く、しかも高感度の、ＩＬ−５の測定方法及び該方法の
実施のためのキットを提供するものであり、さらにこの
技術の前提となるＩＬ−５に対するモノクローナル抗体
を提供するものである。
的に使用することができ、ＩＬ−５に対して特異性が高
く、しかも高感度の、ＩＬ−５の測定方法及び該方法の
実施のためのキットを提供するものであり、さらにこの
技術の前提となるＩＬ−５に対するモノクローナル抗体
を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、ＩＬ−５の
測定のために有用な抗ＩＬ−５モノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマを得ることに成功し、ＩＬ−５の
高感度で且つ特異的なサンドイッチ測定法及びそのため
のキットを開発することに成功した。従って、本発明は
、ＩＬ−５に対するモノクローナル抗体、該モノクロー
ナル抗体を生産するハイブリドーマ、該モノクローナル
抗体及びＩＬ−５に対するポリクローナル抗体を使いる
サンドイッチ法によるＩＬ−５の測定方法、並びに該測
定方法に使用するための測定キットを提供する。
測定のために有用な抗ＩＬ−５モノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマを得ることに成功し、ＩＬ−５の
高感度で且つ特異的なサンドイッチ測定法及びそのため
のキットを開発することに成功した。従って、本発明は
、ＩＬ−５に対するモノクローナル抗体、該モノクロー
ナル抗体を生産するハイブリドーマ、該モノクローナル
抗体及びＩＬ−５に対するポリクローナル抗体を使いる
サンドイッチ法によるＩＬ−５の測定方法、並びに該測
定方法に使用するための測定キットを提供する。
【０００６】
【具体的な説明】本発明のモノクローナル抗体を生産す
るハイブリドーマを作製するための免疫系としては任意
のＩＬ−５含有標品を用いることができるが、組換えイ
ンターロイキン５を用いるのが好ましく、その製造方法
は例えば特開昭６３−１８５３８７に詳細に記載されて
おり、ＩＬ−５をコードする遺伝子を含有する発現ベク
ターが導入された大腸菌は微工研条寄第１４７７号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１４７７）として寄託されている。
るハイブリドーマを作製するための免疫系としては任意
のＩＬ−５含有標品を用いることができるが、組換えイ
ンターロイキン５を用いるのが好ましく、その製造方法
は例えば特開昭６３−１８５３８７に詳細に記載されて
おり、ＩＬ−５をコードする遺伝子を含有する発現ベク
ターが導入された大腸菌は微工研条寄第１４７７号（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１４７７）として寄託されている。
【０００７】ハイブリドーマの作製は、Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎら、 Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５， １９７
５ により最初に記載された常法に従って行うことがで
きる。具体的な方法は実施例１に記載する。
ｎら、 Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５， １９７
５ により最初に記載された常法に従って行うことがで
きる。具体的な方法は実施例１に記載する。
【０００８】モノクローナル抗体の調製は、ハイブリド
ーマを常用の培地中で培養するか、又は動物の腹腔に感
染させ、腹水を回収することにより行うことができ、後
者の方法がより好ましい。この方法においては、ハイブ
リドーマをまずＢＡＬＢ／ｃ マウス等の動物の腹腔に
接種し、該動物から腹水を回収する。次に、この腹水を
遠心分離等の常法に従って清澄にした後、免疫グロブリ
ンを特異的に吸着するプロテインＡを固定化した担体、
例えばプロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂに適用し、
吸着した抗体を常法に従って溶出することにより精製さ
れたモノクローナル抗体が得られる。
ーマを常用の培地中で培養するか、又は動物の腹腔に感
染させ、腹水を回収することにより行うことができ、後
者の方法がより好ましい。この方法においては、ハイブ
リドーマをまずＢＡＬＢ／ｃ マウス等の動物の腹腔に
接種し、該動物から腹水を回収する。次に、この腹水を
遠心分離等の常法に従って清澄にした後、免疫グロブリ
ンを特異的に吸着するプロテインＡを固定化した担体、
例えばプロテインＡ−セファロースＣＬ４Ｂに適用し、
吸着した抗体を常法に従って溶出することにより精製さ
れたモノクローナル抗体が得られる。
【０００９】ポリクローナル抗体の調製も常法に従って
行うことができる。例えば精製された組換えヒトＩＬ−
５をフロインドの完全アジュバント中に懸濁し、これを
動物、例えばウサギに注射して免疫及び追加免疫を行う
。 最終追加免疫の１〜２週間後に採血し、常法に従って血
清を得、硫酸アンモニウム塩析により、例えば硫酸アン
モニウム０〜５０％飽和画分として目的のポリクローナ
ル抗体を含有する蛋白質画分を得る。次にこれを、担体
結合プロテインＡ、例えばプロテインＡ−セファロース
ＣＬ−４Ｂに適用することにより免疫グロブリンを吸着
せしめる。次に、この結合した免疫グロブリンを常法に
従って溶出した後、ＩＬ−５を固定した担体、例えばＩ
Ｌ−５を固定したセファロース４Ｂに適用し、ＩＬ−５
に対するポリクローナル抗体のみを吸着せしめ、次にそ
れを常法に従って溶出し、精製ポリクローナル抗体を得
る。
行うことができる。例えば精製された組換えヒトＩＬ−
５をフロインドの完全アジュバント中に懸濁し、これを
動物、例えばウサギに注射して免疫及び追加免疫を行う
。 最終追加免疫の１〜２週間後に採血し、常法に従って血
清を得、硫酸アンモニウム塩析により、例えば硫酸アン
モニウム０〜５０％飽和画分として目的のポリクローナ
ル抗体を含有する蛋白質画分を得る。次にこれを、担体
結合プロテインＡ、例えばプロテインＡ−セファロース
ＣＬ−４Ｂに適用することにより免疫グロブリンを吸着
せしめる。次に、この結合した免疫グロブリンを常法に
従って溶出した後、ＩＬ−５を固定した担体、例えばＩ
Ｌ−５を固定したセファロース４Ｂに適用し、ＩＬ−５
に対するポリクローナル抗体のみを吸着せしめ、次にそ
れを常法に従って溶出し、精製ポリクローナル抗体を得
る。
【００１０】本発明のサンドイッチ測定法は常法に従っ
て行うことができる。すなわち、まず、適当な固体担体
の表面にＩＬ−５に対するモノクローナル抗体を吸着固
定し、次にこの抗体をヒトＩＬ−５を含有すると予想さ
れるサンプルと接触せしめる。これによりサンプル中の
ヒトＩＬ−５が、固体担体に固定されているモノクロー
ナル抗体と特異的に結合し、この結果、サンプル中のヒ
トＩＬ−５があらかじめ固定されているモノクローナル
抗体を介して固体担体に固定される。
て行うことができる。すなわち、まず、適当な固体担体
の表面にＩＬ−５に対するモノクローナル抗体を吸着固
定し、次にこの抗体をヒトＩＬ−５を含有すると予想さ
れるサンプルと接触せしめる。これによりサンプル中の
ヒトＩＬ−５が、固体担体に固定されているモノクロー
ナル抗体と特異的に結合し、この結果、サンプル中のヒ
トＩＬ−５があらかじめ固定されているモノクローナル
抗体を介して固体担体に固定される。
【００１１】次に、前記担体を、二次担体としてＩＬ−
５に対するポリクローナル抗体を含有する溶液と接触せ
しめる。これにより該ポリクローナル抗体はＩＬ−５の
、モノクローナル抗体との結合に利用されなかった第二
のエピトープと結合し、該ポリクローナル抗体はあらか
じめ固定されているモノクローナル抗体及びＩＬ−５を
介して固体担体に結合し、この場合ポリクローナル抗体
の固定量がサンプル中のＩＬ−５の量、すなわち固定さ
れているＩＬ−５の量を反映する。
５に対するポリクローナル抗体を含有する溶液と接触せ
しめる。これにより該ポリクローナル抗体はＩＬ−５の
、モノクローナル抗体との結合に利用されなかった第二
のエピトープと結合し、該ポリクローナル抗体はあらか
じめ固定されているモノクローナル抗体及びＩＬ−５を
介して固体担体に結合し、この場合ポリクローナル抗体
の固定量がサンプル中のＩＬ−５の量、すなわち固定さ
れているＩＬ−５の量を反映する。
【００１２】従って、固定されたポリクローナル抗体の
量を測定することによりサンプル中のＩＬ−５の量を決
定することができる。固定されたポリクローナル抗体の
量の測定法は後で詳細に記載する。
量を測定することによりサンプル中のＩＬ−５の量を決
定することができる。固定されたポリクローナル抗体の
量の測定法は後で詳細に記載する。
【００１３】上記の方法において、固体担体としては、
例えば、マイクロタイタープレート、例えばポリ塩化ビ
ニル製マイクロタイタープレート、又はポリスチレン製
マイクロタイタープレート等を用いることができる。モ
ノクローナル抗体の固定は、例えば、モノクローナル抗
体を適当な緩衝液、例えば炭酸緩衝液、リン酸緩衝液等
に希釈した後、これを固体担体の表面に適用し、そして
４℃〜３７℃にて３０分間以上インキュベートすること
により行うことができる。
例えば、マイクロタイタープレート、例えばポリ塩化ビ
ニル製マイクロタイタープレート、又はポリスチレン製
マイクロタイタープレート等を用いることができる。モ
ノクローナル抗体の固定は、例えば、モノクローナル抗
体を適当な緩衝液、例えば炭酸緩衝液、リン酸緩衝液等
に希釈した後、これを固体担体の表面に適用し、そして
４℃〜３７℃にて３０分間以上インキュベートすること
により行うことができる。
【００１４】次に、固体担体を、洗浄液、例えばＴｗｅ
ｅｎ ２０のごとき界面活性剤を含有する緩衝液、例え
ばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等により
数回洗浄して、未吸着のモノクローナル抗体を除去する
。
ｅｎ ２０のごとき界面活性剤を含有する緩衝液、例え
ばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等により
数回洗浄して、未吸着のモノクローナル抗体を除去する
。
【００１５】次に、固体担体表面上の遊離結合基をブロ
ックするため、ブロッキング緩衝液により固体担体を処
理する。ブロッキング緩衝液として、例えば、１〜数％
のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） 、卵白アルブミン、
スキムミルク等を含有する緩衝液、例えばトリス緩衝液
、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いることができ、
処理は４℃〜３７℃にて３０分間以上のインキュベーシ
ョンにより行うことができる。
ックするため、ブロッキング緩衝液により固体担体を処
理する。ブロッキング緩衝液として、例えば、１〜数％
のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） 、卵白アルブミン、
スキムミルク等を含有する緩衝液、例えばトリス緩衝液
、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いることができ、
処理は４℃〜３７℃にて３０分間以上のインキュベーシ
ョンにより行うことができる。
【００１６】次に、固体担体を洗浄することよりブロッ
キング緩衝液を除去する。この洗浄は、前記モノクロー
ナル抗体の固定後の洗浄と同様に行うことができる。こ
うして、固体担体が調製される。
キング緩衝液を除去する。この洗浄は、前記モノクロー
ナル抗体の固定後の洗浄と同様に行うことができる。こ
うして、固体担体が調製される。
【００１７】次に、この固体担体を、適当な緩衝液、例
えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等の中
に希釈されたサンプルと接触せしめる。この接触は、４
℃〜３７℃にて３０分間以上のインキュベーションによ
り行うことができる。次に前記のようにして固体担体を
洗浄する。
えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等の中
に希釈されたサンプルと接触せしめる。この接触は、４
℃〜３７℃にて３０分間以上のインキュベーションによ
り行うことができる。次に前記のようにして固体担体を
洗浄する。
【００１８】次に、二次抗体、すなわちＩＬ−５に対す
るポリクローナル抗体を含有する緩衝液に前記固体担体
を接触せしめる。この場合の緩衝液としては、例えばリ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いるこ
とができる。この接触は４℃〜３７℃にて３０分間以上
のインキュベーションにより行う。次に、前記のように
して固体担体を洗浄する。
るポリクローナル抗体を含有する緩衝液に前記固体担体
を接触せしめる。この場合の緩衝液としては、例えばリ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液等を用いるこ
とができる。この接触は４℃〜３７℃にて３０分間以上
のインキュベーションにより行う。次に、前記のように
して固体担体を洗浄する。
【００１９】次に、上記のようにして結合固定された二
次抗体の検出・測定は任意の常法に従って行うことがで
きる。二次抗体自体を例えば放射性核種、蛍光物質、酵
素等により標識しておき、直接検出・測定することも可
能である。しかしながら、本発明の好ましい方法におい
ては、二次抗体に対して特異的な三次抗体を用い、この
三次抗体を種々の方法により標識しておく。
次抗体の検出・測定は任意の常法に従って行うことがで
きる。二次抗体自体を例えば放射性核種、蛍光物質、酵
素等により標識しておき、直接検出・測定することも可
能である。しかしながら、本発明の好ましい方法におい
ては、二次抗体に対して特異的な三次抗体を用い、この
三次抗体を種々の方法により標識しておく。
【００２０】三次抗体としては、二次抗体の調製に用い
た動物の種と異る種の動物の抗体であって、二次抗体の
調製に用いた動物種の免疫グロブリンに対するもの又は
その断片が用いられる。例えば、二次抗体がウサギを用
いて調製された場合、三次抗体としてウサギ免疫グロブ
リンに対するヤギの抗体を用いることができる。
た動物の種と異る種の動物の抗体であって、二次抗体の
調製に用いた動物種の免疫グロブリンに対するもの又は
その断片が用いられる。例えば、二次抗体がウサギを用
いて調製された場合、三次抗体としてウサギ免疫グロブ
リンに対するヤギの抗体を用いることができる。
【００２１】三次抗体を標識するため、常用の標識物質
、例えば放射性核種、例えば １２５Ｉ， ３Ｈ，１４
Ｃ；蛍光物質、例えばフルオレッセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド；酵素
、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、ウレアーゼ等を用いることができる。本発明
の好ましい態様においては三次抗体の標識として酵素が
用いられ、本発明のサンドイッチ法は酵素免疫測定法（
ＥＬＩＳＡ）として行われる。酵素の検出には、その酵
素に対応する基質、好ましくは発色性の酵素基質が用い
られ、例えば酵素としてパーオキシダーゼが用いられる
場合、その基質として過酸化水素、発色試薬として、例
えばオルソフェニレンジアミン、３，３′，５，５′−
テトラメチルベンジジン等が用いられる。
、例えば放射性核種、例えば １２５Ｉ， ３Ｈ，１４
Ｃ；蛍光物質、例えばフルオレッセインイソチオシアネ
ート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド；酵素
、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスフ
ァターゼ、ウレアーゼ等を用いることができる。本発明
の好ましい態様においては三次抗体の標識として酵素が
用いられ、本発明のサンドイッチ法は酵素免疫測定法（
ＥＬＩＳＡ）として行われる。酵素の検出には、その酵
素に対応する基質、好ましくは発色性の酵素基質が用い
られ、例えば酵素としてパーオキシダーゼが用いられる
場合、その基質として過酸化水素、発色試薬として、例
えばオルソフェニレンジアミン、３，３′，５，５′−
テトラメチルベンジジン等が用いられる。
【００２２】本発明はＩＬ−５の測定用キットをも提供
し、このキットは少なくともＩＬ−５に対するモノクロ
ーナル抗体、及びＩＬ−５に対するポリクローナル抗体
を含んで成る。モノクローナル抗体は溶液状又は凍結乾
燥品でもよく、あるいは固体担体に固定されたものでも
よい。キットが固体担体に固定されたモノクローナル抗
体を含む場合、この固体担体は好ましくはブロッキング
剤により処理された後のものである。
し、このキットは少なくともＩＬ−５に対するモノクロ
ーナル抗体、及びＩＬ−５に対するポリクローナル抗体
を含んで成る。モノクローナル抗体は溶液状又は凍結乾
燥品でもよく、あるいは固体担体に固定されたものでも
よい。キットが固体担体に固定されたモノクローナル抗
体を含む場合、この固体担体は好ましくはブロッキング
剤により処理された後のものである。
【００２３】測定キットはさらに、第三の要素として前
記ポリクローナル抗体（二次抗体）に特異的に結合する
標識された三次抗体を含むことができる。この場合の三
次抗体の標識が酵素である場合はさらに、該酵素の基質
を含む発色試薬をキットに含めることもできる。しかし
ながら、酵素標識された三次抗体及び対応する発色試薬
は市販品を使用することができ、本発明のキットの必須
要素ではない。
記ポリクローナル抗体（二次抗体）に特異的に結合する
標識された三次抗体を含むことができる。この場合の三
次抗体の標識が酵素である場合はさらに、該酵素の基質
を含む発色試薬をキットに含めることもできる。しかし
ながら、酵素標識された三次抗体及び対応する発色試薬
は市販品を使用することができ、本発明のキットの必須
要素ではない。
【００２４】本発明の測定キットはまた、任意的要素と
して、サンプル希釈用緩衝液、各種の試薬希釈用緩衝液
、洗浄液等を含むことができる。
して、サンプル希釈用緩衝液、各種の試薬希釈用緩衝液
、洗浄液等を含むことができる。
【実施例】次に、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。
説明する。
【００２５】実施例１ ハイブリドーマの作製ハイブ
リドーマの作製は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ
， ２５６ ， ４９５， １９７５ により最初に記
載された常法に従って行うことができる。すなわち、例
えば精製された組換えヒトＩＬ−５をフロインドの完全
アジュバント中に懸濁し、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹
腔内に７〜１０日毎に３回注射しマウスを免疫する。最
終免疫の３日後該マウスの脾臓の細胞（脾細胞）とマウ
スミエローマ細胞とポリエチレングリコールを用いて融
合させ、常法に従いＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ １６４０＋
１０％血清にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ンを含む培地）による融合細胞（ハイブリドーマ）の選
択的培養後、その培養上清について ＥＬＩＳＡ法を用
いヒトＩＬ−５に対する反応により第一次スクリーニン
グを行った。
リドーマの作製は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ
， ２５６ ， ４９５， １９７５ により最初に記
載された常法に従って行うことができる。すなわち、例
えば精製された組換えヒトＩＬ−５をフロインドの完全
アジュバント中に懸濁し、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の腹
腔内に７〜１０日毎に３回注射しマウスを免疫する。最
終免疫の３日後該マウスの脾臓の細胞（脾細胞）とマウ
スミエローマ細胞とポリエチレングリコールを用いて融
合させ、常法に従いＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ １６４０＋
１０％血清にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジ
ンを含む培地）による融合細胞（ハイブリドーマ）の選
択的培養後、その培養上清について ＥＬＩＳＡ法を用
いヒトＩＬ−５に対する反応により第一次スクリーニン
グを行った。
【００２６】上記のスクリーニングで陽性（ｐｏｓｉｔ
ｉｖｅ）と判定されたハイブリドーマは、さらに限界希
釈法によるサブクローニングによって単クローン（モノ
クローン）とした。単一クローン化されたハイブリドー
マの産生する抗体（即ちＭｏＡｂ）のサブクラスは市販
のマウスグロブリン同定キットを用いて同定した。
ｉｖｅ）と判定されたハイブリドーマは、さらに限界希
釈法によるサブクローニングによって単クローン（モノ
クローン）とした。単一クローン化されたハイブリドー
マの産生する抗体（即ちＭｏＡｂ）のサブクラスは市販
のマウスグロブリン同定キットを用いて同定した。
【００２７】上記のようにして４個のハイブリドーマク
ローンＤ１３８，Ｃ２１３，Ｄ１７１、及びＥ０６０を
得た。なお、この明細書においては、便宜上、ハイブリ
ドーマの標示及びそのハイブリドーマにより生産された
モノクローナル抗体の標示を同じ記号により行う。なお
、上記ハイブリドーマＤ１３８は工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条第３２８９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３２８９）として寄託されている。
ローンＤ１３８，Ｃ２１３，Ｄ１７１、及びＥ０６０を
得た。なお、この明細書においては、便宜上、ハイブリ
ドーマの標示及びそのハイブリドーマにより生産された
モノクローナル抗体の標示を同じ記号により行う。なお
、上記ハイブリドーマＤ１３８は工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条第３２８９号（ＦＥＲＭ ＢＰ−
３２８９）として寄託されている。
【００２８】実施例２ モノクローナル抗体の調製得
られたハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃ マウスの腹腔に
接種し、腹水を回収した。上記のようにして得た腹水２
０ｍｌを遠心分離して清澄化した後、３５ｍｌのプロテ
インＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐ
ｐｓａｌａ，スェーデン）に適用し、カラムを３Ｍ Ｎ
ａＣｌ を含有する１．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．
９）で洗浄した後、カラムに吸着したモノクローナル抗
体を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）により溶出
した。他のハイブリドーマについても同様の操作を行い
、それぞれ対応するモノクローナル抗体を得た。
られたハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃ マウスの腹腔に
接種し、腹水を回収した。上記のようにして得た腹水２
０ｍｌを遠心分離して清澄化した後、３５ｍｌのプロテ
インＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐ
ｐｓａｌａ，スェーデン）に適用し、カラムを３Ｍ Ｎ
ａＣｌ を含有する１．５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．
９）で洗浄した後、カラムに吸着したモノクローナル抗
体を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）により溶出
した。他のハイブリドーマについても同様の操作を行い
、それぞれ対応するモノクローナル抗体を得た。
【００２９】上記のようにして得られた４種類のモノク
ローナル抗体Ｄ１３８， Ｃ２１３， Ｄ１７１、及び
Ｅ０６０はそれぞれ ＩｇＧ２ａ， ＩｇＧ１， Ｉｇ
Ｇ２ａ 、及びＩｇＧ１のイムノグロブリンサブクラス
に属する。これらの抗体の結合性はヒトＩＬ−５に特異
的であり、他のサイトカイン、例えばインターフェロン
γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦ 、並びに
マウスの組換ＩＬ−５には交差反応を示さない。さらに
、これらの抗体が認識するエピトープ（抗原決定基）は
すべてのペプチド部位である。
ローナル抗体Ｄ１３８， Ｃ２１３， Ｄ１７１、及び
Ｅ０６０はそれぞれ ＩｇＧ２ａ， ＩｇＧ１， Ｉｇ
Ｇ２ａ 、及びＩｇＧ１のイムノグロブリンサブクラス
に属する。これらの抗体の結合性はヒトＩＬ−５に特異
的であり、他のサイトカイン、例えばインターフェロン
γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦ 、並びに
マウスの組換ＩＬ−５には交差反応を示さない。さらに
、これらの抗体が認識するエピトープ（抗原決定基）は
すべてのペプチド部位である。
【００３０】実施例３ ポリクローナル抗体の調製５
０μｇの組換えＩＬ−５をフロインドの完全アジュバン
ト中に懸濁し、これをウサギに３〜５週間毎に３回免疫
し、最終免疫の７日後に採血し、そして常法に従って血
清を得た。こうして得られた血清２０ｍｌに硫酸アンモ
ニウムを加えて５０％飽和とした後、遠心分離により蛋
白質画分の沈澱を回収し、そしてＰＢＳに対して透析す
ることにより硫酸アンモニウムを除去した。次に、この
蛋白質画分をプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカ
ラムに適用することにより免疫グロブリンを吸着せしめ
、モノクローナル抗体の精製の場合と同様にして免疫グ
ロブリン画分を溶出した。
０μｇの組換えＩＬ−５をフロインドの完全アジュバン
ト中に懸濁し、これをウサギに３〜５週間毎に３回免疫
し、最終免疫の７日後に採血し、そして常法に従って血
清を得た。こうして得られた血清２０ｍｌに硫酸アンモ
ニウムを加えて５０％飽和とした後、遠心分離により蛋
白質画分の沈澱を回収し、そしてＰＢＳに対して透析す
ることにより硫酸アンモニウムを除去した。次に、この
蛋白質画分をプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂカ
ラムに適用することにより免疫グロブリンを吸着せしめ
、モノクローナル抗体の精製の場合と同様にして免疫グ
ロブリン画分を溶出した。
【００３１】次に、この免疫グロブリン画分をＩＬ−５
を固定したセファロース４Ｂ（ＩＬ−５セファロース４
Ｂ；ファルマシア製のＣＮＢｒ−活性化セファロース４
Ｂを用い、常法に従ってＩＬ−５を結合させたもの；２
００μｇ ｈＩＬ−５／０．３ｇセファロース）に適用
してＩＬ−５に対する抗体を特異的に吸着させ、次にこ
れを０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）により溶出
した。こうして、ＩＬ−５に対する精製されたポリクロ
ーナル抗体を得た。
を固定したセファロース４Ｂ（ＩＬ−５セファロース４
Ｂ；ファルマシア製のＣＮＢｒ−活性化セファロース４
Ｂを用い、常法に従ってＩＬ−５を結合させたもの；２
００μｇ ｈＩＬ−５／０．３ｇセファロース）に適用
してＩＬ−５に対する抗体を特異的に吸着させ、次にこ
れを０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２．５）により溶出
した。こうして、ＩＬ−５に対する精製されたポリクロ
ーナル抗体を得た。
【００３２】実施例４ ＥＬＩＳＡ法によるＩＬ−
５の測定９６−ウエルのポリ塩化ビニルマイクロプレー
ト（Ｆａｌｃｏｎ ３９１２）の中央部の６０個のウエ
ルに、緩衝液Ａ（０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５）に
溶解したモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）の溶液
１００μｌを入れ、プラスチック製カバー（Ｆａｌｃ
ｏｎ ３９１３）でマイクロプレートを覆った後４℃に
て一夜インキュベートした。
５の測定９６−ウエルのポリ塩化ビニルマイクロプレー
ト（Ｆａｌｃｏｎ ３９１２）の中央部の６０個のウエ
ルに、緩衝液Ａ（０．１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．５）に
溶解したモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ）の溶液
１００μｌを入れ、プラスチック製カバー（Ｆａｌｃ
ｏｎ ３９１３）でマイクロプレートを覆った後４℃に
て一夜インキュベートした。
【００３３】前記マイクロプレートのウエルから液を注
ぎ出した後、ウエルに２００μｌの緩衝液Ｂ（０．１％
のＴｗｅｅｎ ２０を含有するリン酸緩衝液）を加え、
３分間の後、前記のようにして液を除去した。これをさ
らに３回繰返すことによりウエルの洗浄を行った。
ぎ出した後、ウエルに２００μｌの緩衝液Ｂ（０．１％
のＴｗｅｅｎ ２０を含有するリン酸緩衝液）を加え、
３分間の後、前記のようにして液を除去した。これをさ
らに３回繰返すことによりウエルの洗浄を行った。
【００３４】次にリン酸緩衝液中の１％ウシ血清アルブ
ミンの溶液 ２００μｌを各ウエルに加え、室温にて３
０分間インキュベートすることによりウエルの非特異的
結合部位のブロッキングを行った。次に前記の様にして
３回洗浄した。緩衝液Ｃ（１０％ウシ胎児血清を含有す
る緩衝液Ｂ）中に希釈されたＩＬ−５の溶液（濃度 ５
００〜７．８ｐｇ／ｍｌ）（標準溶液）又は緩衝液Ｂ中
に希釈された被験サンプル １００μｌをウエルに加え
、カバーを付した後室温にて一夜インキュベートし、そ
して前記の方法により５回洗浄した。
ミンの溶液 ２００μｌを各ウエルに加え、室温にて３
０分間インキュベートすることによりウエルの非特異的
結合部位のブロッキングを行った。次に前記の様にして
３回洗浄した。緩衝液Ｃ（１０％ウシ胎児血清を含有す
る緩衝液Ｂ）中に希釈されたＩＬ−５の溶液（濃度 ５
００〜７．８ｐｇ／ｍｌ）（標準溶液）又は緩衝液Ｂ中
に希釈された被験サンプル １００μｌをウエルに加え
、カバーを付した後室温にて一夜インキュベートし、そ
して前記の方法により５回洗浄した。
【００３５】次に、緩衝液Ｄ（３％のポリエチレングリ
コール６０００を含有する緩衝液Ｂ）中に希釈したＩＬ
−５に対するポリクローナル抗体（二次抗体）（濃度４
０ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを各ウエルに加え、カバーを
付した後、室温にて４時間インキュベートした。次に、
前記の方法により２回洗浄した。次に、ヤギの抗−ウサ
ギ免疫グロブリン抗体にパーオキシダーゼを結合してい
る標識された三次抗体の緩衝液Ｄ中の溶液 １００μｌ
に入れ、そしてカバーを付した後室温にて４時間インキ
ュベートした。次に前記の方法により５回洗浄した。
コール６０００を含有する緩衝液Ｂ）中に希釈したＩＬ
−５に対するポリクローナル抗体（二次抗体）（濃度４
０ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを各ウエルに加え、カバーを
付した後、室温にて４時間インキュベートした。次に、
前記の方法により２回洗浄した。次に、ヤギの抗−ウサ
ギ免疫グロブリン抗体にパーオキシダーゼを結合してい
る標識された三次抗体の緩衝液Ｄ中の溶液 １００μｌ
に入れ、そしてカバーを付した後室温にて４時間インキ
ュベートした。次に前記の方法により５回洗浄した。
【００３６】０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中に０
．００２７％の過酸化水素及び０．５５ｎＭの３，３′
，５，５′−テトラメチルベンジジンを含有する、新し
く調製した基質溶液 １００μｌを各ウエルに加え、室
温にて１０分間インキュベートして酵素反応させた後、
１００μｌの１Ｎ ＨＣｌ を加えて反応を停止させた
。次に、 ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより ４５０
ｎｍでの吸収を読み取った。
．００２７％の過酸化水素及び０．５５ｎＭの３，３′
，５，５′−テトラメチルベンジジンを含有する、新し
く調製した基質溶液 １００μｌを各ウエルに加え、室
温にて１０分間インキュベートして酵素反応させた後、
１００μｌの１Ｎ ＨＣｌ を加えて反応を停止させた
。次に、 ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより ４５０
ｎｍでの吸収を読み取った。
【００３７】上記の方法により、モノクローナル抗体と
して、Ｄ１３８，Ｃ２１３，Ｄ１７１、及びＥ０６０を
用いて種々の濃度のＩＬ−５標準サンプルを測定した場
合、測定感度は次の表１に示す通りであった。
して、Ｄ１３８，Ｃ２１３，Ｄ１７１、及びＥ０６０を
用いて種々の濃度のＩＬ−５標準サンプルを測定した場
合、測定感度は次の表１に示す通りであった。
【００３８】
【表１】
【００３９】モノクローナル抗体Ｄ１３８又はＤ１７１
を一次抗体（捕捉抗体）として使用することにより検出
限界７．８ｐｇ／ｍｌという、従来法では得られない高
い感度の測定を行うことができる。一例として図１にモ
ノクローナル抗体Ｄ１３８を使用した場合の、ＩＬ−５
濃度（ｐｇ／ｍｌ）と ４５０ｎｍにおける吸光度との
間の検量線を示す。
を一次抗体（捕捉抗体）として使用することにより検出
限界７．８ｐｇ／ｍｌという、従来法では得られない高
い感度の測定を行うことができる。一例として図１にモ
ノクローナル抗体Ｄ１３８を使用した場合の、ＩＬ−５
濃度（ｐｇ／ｍｌ）と ４５０ｎｍにおける吸光度との
間の検量線を示す。
【００４０】次に、本発明のサンドイッチ法の特異性を
調べるため、捕捉抗体としてＤ１３８を用い、種々のサ
イトカイン類、細胞培養上清、及びヒト血清を測定し、
これらが本発明の方法により検知されるか否かを調べた
。その結果を表２に示す。
調べるため、捕捉抗体としてＤ１３８を用い、種々のサ
イトカイン類、細胞培養上清、及びヒト血清を測定し、
これらが本発明の方法により検知されるか否かを調べた
。その結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】この表から明らかな通り、本発明の測定法
は、ＩＬ−５以外のヒトのサイトカインを検知せず、ま
たマウスのＩＬ−５を検知しなかった。また、健常人の
血清中の成分も検知しなかった。従って、本発明のサン
ドイッチ測定法はヒトＩＬ−５に対して極めて特異性が
高い。
は、ＩＬ−５以外のヒトのサイトカインを検知せず、ま
たマウスのＩＬ−５を検知しなかった。また、健常人の
血清中の成分も検知しなかった。従って、本発明のサン
ドイッチ測定法はヒトＩＬ−５に対して極めて特異性が
高い。
【００４３】次に、本発明の測定方法の同時再現性（同
時に同一のサンプルについて複数個の測定を行った場合
のバラツキの程度）、及び日差再現性（同一サンプルを
日を替えて測定した場合の測定結果の差）を調べた。
時に同一のサンプルについて複数個の測定を行った場合
のバラツキの程度）、及び日差再現性（同一サンプルを
日を替えて測定した場合の測定結果の差）を調べた。
【００４４】ＩＬ−５の濃度を異にする３種類のサンプ
ルＡ，Ｂ及びＣを５連で測定し、他方、同じサンプルを
１日１回ずつ別々の日に５回測定した。各サンプルにつ
き、平均値及び標準偏差、並びに平均値に対する標準偏
差の割合（ＣＶ％）を表３に示す。
ルＡ，Ｂ及びＣを５連で測定し、他方、同じサンプルを
１日１回ずつ別々の日に５回測定した。各サンプルにつ
き、平均値及び標準偏差、並びに平均値に対する標準偏
差の割合（ＣＶ％）を表３に示す。
【００４５】
【表３】
【００４６】上記の通り、同時再現性及び日差再現性共
に良好であった。
に良好であった。
【図１】図１は、捕捉抗体としてヒトＩＬ−５に対する
モノクローナル抗体Ｄ１３８を用いてサンドイッチ Ｅ
ＬＩＳＡ法によりヒトＩＬ−５を測定した場合のヒトＩ
Ｌ−５濃度と吸光度との関係の一例を示す。
モノクローナル抗体Ｄ１３８を用いてサンドイッチ Ｅ
ＬＩＳＡ法によりヒトＩＬ−５を測定した場合のヒトＩ
Ｌ−５濃度と吸光度との関係の一例を示す。
Claims (5)
- 【請求項１】 ヒトインターロイキン５に対するモノ
クローナル抗体。 - 【請求項２】 ハイブリドーマ（微工研条寄第３２８
９号）により生産される請求項１に記載のモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項３】 ヒトインターロイキン５に対するモノ
クローナル抗体及びヒトインターロイキン５に対するポ
リクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイ法であ
ることを特徴とするヒトインターロイキン５の測定方法
。 - 【請求項４】 固体担体に固定されていてもよいヒト
インターロイキン５に対するモノクローナル抗体、及び
ヒトインターロイキン５に対するポリクローナル抗体を
含んで成る、ヒトインターロイキン５測定用キット。 - 【請求項５】 請求項１に記載のモノクローナル抗体
を生産するハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03282991A JP3202029B2 (ja) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | インターロイキン５の微量定量 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03282991A JP3202029B2 (ja) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | インターロイキン５の微量定量 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04271795A true JPH04271795A (ja) | 1992-09-28 |
| JP3202029B2 JP3202029B2 (ja) | 2001-08-27 |
Family
ID=12369718
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03282991A Expired - Fee Related JP3202029B2 (ja) | 1991-02-27 | 1991-02-27 | インターロイキン５の微量定量 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3202029B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009229351A (ja) * | 2008-03-25 | 2009-10-08 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 生理活性物質の検出方法および測定キット |
| JP2011505008A (ja) * | 2007-11-27 | 2011-02-17 | イムノヴィア・アクチエボラーグ | 診断方法及び診断に使用するためのアレイ |
| CN113507938A (zh) * | 2019-03-29 | 2021-10-15 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途 |
-
1991
- 1991-02-27 JP JP03282991A patent/JP3202029B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011505008A (ja) * | 2007-11-27 | 2011-02-17 | イムノヴィア・アクチエボラーグ | 診断方法及び診断に使用するためのアレイ |
| JP2009229351A (ja) * | 2008-03-25 | 2009-10-08 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | 生理活性物質の検出方法および測定キット |
| CN113507938A (zh) * | 2019-03-29 | 2021-10-15 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途 |
| CN113507938B (zh) * | 2019-03-29 | 2024-04-16 | 广东恒瑞医药有限公司 | 包含抗il-5抗体的药物组合物及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3202029B2 (ja) | 2001-08-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4935343A (en) | Monoclonal antibodies for interleukin-1β | |
| Kilpatrick et al. | Demonstration of calcium-induced conformational change (s) in C-reactive protein by using monoclonal antibodies | |
| JPS6184561A (ja) | 抗原に依存しないイムノアツセイシステム | |
| Lefvert et al. | A monoclonal anti‐idiotypic antibody against anti‐receptor antibodies from myasthenic sera | |
| JPS60120825A (ja) | 抗プロテインｃモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ | |
| JP2988635B2 (ja) | ヒトＩｇＥに対するモノクローナル抗体 | |
| US4645748A (en) | Protein which is characteristic of rheumatoid arthritis | |
| EP0257010A2 (en) | Monoclonal antibody specific for human colon fibroblast-derived t-PA | |
| JPH04310861A (ja) | 抗ｅｂｎａ抗体の測定方法および抗ｅｂｎａ抗体測定キット | |
| JPH054075B2 (ja) | ||
| WO1990006515A1 (en) | Anti-idiotopic immunometric assay | |
| JP2881311B2 (ja) | 抗ヒトｂｃｄｆモノクローナル抗体及びそれを用いたヒトｂｃｄｆの定量法 | |
| US4977082A (en) | Type VI bacterial FC receptors | |
| JPH04271795A (ja) | インターロイキン５の微量定量 | |
| Ohlson et al. | High-performance liquid affinity chromatographic separation of mouse monoclonal antibodies with protein A silica | |
| US4751183A (en) | Monoclonal antibody that recognizes a structure common to human interleukin-2 (TCGF) and to the light lambda chain of human immunoglobulin and lines of hybridoma cells that produce these monoclonal antibodies | |
| Hadas et al. | Enhanced activity of immobilized dimethylmaleic anhydride-protected poly-and monoclonal antibodies | |
| Chandler et al. | Monoclonal hybridoma antibodies against human IgE and their use in a rapid and sensitive enzyme immunoassay for the semiquantitative assessment of total IgE levels in human blood | |
| Marhaug et al. | Monoclonal hybridoma antibodies to human amyloid related protein SAA. | |
| JPH02242696A (ja) | モノクローナル抗体及びその使用方法 | |
| Mollat et al. | Non–Neutralizing Monoclonal Antibodies Against RAS GTPase–Activating Protein: Production, Characterization and Use in an Enzyme Immunometric Assay | |
| IE881290L (en) | Monoclonal antibodies for the selective immunological¹determination of intact procollagen peptide (Type III) and¹procollagen (Type III) in body fluids | |
| JP3091974B2 (ja) | ８―ハイドロキシ―２’―デオキシグアノシンのモノクローナル抗体及びその製造法並びにモノクローナル抗体を生産するハイブリッド細胞 | |
| Dunbar et al. | [50] Preparation of monoclonal antibodies | |
| Würzner et al. | Determination of the epitope specificities of monoclonal antibodies using unprocessed supernatants of hybridoma cultures |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |