JPH02242696A - モノクローナル抗体及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、γ−カルボキシグルタミン酸（以下、Ｇｔａ
と略す）残基を有するオステオカルシン（以下、ＯＣと
略す）に対して特異性を有する抗ＯＣモノクローナル抗
体及びその使用方法に関する。

〔従来の技術〕

ＯＣはビタミンに依存性のＧｌａ残基を有するカルシウ
ム結合蛋白であり、骨芽細胞により合成される。一般に
骨の代謝が亢進している骨疾患にふいて血中レベルの上
昇が認められ、骨代謝の生化学的な指標となるといわれ
ている。近年、閉経後骨粗髭症、ミエローマ、ベージェ
ット病、慢性腎不全、副甲状腺機能亢進症等の診断に有
用な指標であることが示されてきた。この目的のため、
Ｐ、＾、プライスら［Ｐ、　Ａ、Ｐｒ１ｃｅら、ブロシ
ーデインダス　オブ　ナショナル　アカデミ−オブ　サ
イエンシイス　オブ　ｆＵＳ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ　）第７７巻、第
２２３４頁（１９８０）］によってポリクローナル抗体
を用いたラジオイムノアッセイ法が開発され、ヒト血中
のＯＣ濃度を測定することが可能となった。また、モノ
クローナル抗体を用いるエンザイムイムノアツセイ方法
も本発明者らにより先に提案されている（特願昭６２−
３１８５６４号） 一方、ＯＣの持つ性質としてカルシウム及びハイドロキ
シアパタイトに対する親和性があり、ＯＣを加熱脱炭酸
反応によりＧｌａ残基をＧｌｕ残基に変えるとカルシウ
ム結合能が消失すること［Ｊ、Ｗ、ボーサー（Ｊ、　Ｗ
、　Ｐｏ５ｅｒ）　　ジャーナルオブ　バイオロジカル
　ケミストリー（Ｊ、　　ロｉｏｔ。

Ｃｈｅ＋ｎ、　）第２５４巻、第４３１頁（１９７９）
：Ｉから、Ｇｌａ残基がカルシウム結合に不可欠なこと
が示されている。したがって、ＯＣ中のＧｌａ残基は骨
から体液へのカルシウムの移動を調節するという重要な
役割を果たしていると考えられる。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、従来報告されているｏｃの免疫学的測定
方法では抗ＯＣポリクローナル抗体を用いたＨ、タナ力
［Ｈ１７’ａｎａｋａら、ジャーナルオブ　イムノロジ
カル　メソッズ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ。

ｒ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）第９４巻、第１９頁（１９８６
）］の方法、モノクローナル抗体を用いた本発明者らの
方法（特願昭６２−３１８５６４号）においてもＧｌａ
残基を有するＯＣと有しないｏｃを区別して測定するこ
とは不可能であり、実際に生体内で生理作用を有するＧ
ｌａ残基を持ったｏｃｌすなわち活性型ＯＣの量を知る
ことはできなかった。

本発明の目的は、Ｇｌａ残基を有する活性型ＯＣのみに
特異性を有するモノクローナル抗体及びその使用方法を
提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明はＧｌａ残基
を有するＯＣと特異的に反応し、Ｇｌａ残基を有しない
ＯＣとは反応しないモノクローナル抗体に関し、また第
２の発明はＯＣの特異的測定方法に関する発明であって
、生体試料中のＧｌａ残基を有するＯＣの免疫学的な測
定に際して、上記第１の発明の抗ＯＣモノクローナル抗
体を使用することを特徴とする。

本発明者らは、前述した課題を克服するため鋭意研究を
重ねた結果、細胞融合によりＧｌａ残基を有するＯＣに
対して特異性を有するモノクローナル抗体を取得するこ
とに成功し、このモノクローナル抗体を用いれば、Ｇｌ
ａ残基を有するＯＣのみを特異的に高感度で測定可能で
あることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法に
よって製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細
胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブ
リドーマをクローン化し、Ｇｌａ残基を有するＯＣに対
し特異性を示す抗体を産生ずるクローンを選択すること
によって製造される。抗体産生細胞は例えばＧｌａ残基
を有するＯＣによって免疫された動物からの牌細胞、リ
ンパ節細胞、Ｂ　ＩＪンバ球等が利用できる。免疫させ
る動物としては、マウス、ラット、馬、ヤギ、ウサギ等
が例示される。抗原としては動物の骨由来のＯＣが利用
可能であり、例えば次のようにして製造され、免疫に使
用される。ウシ骨粉末をＢＤＴＡ溶液で抽出し、ＯＤＳ
カラムを用いたＨＰＬＣによりウシＯＣを精製する。

かくして得られたウシＯＣは例えばＫＬＨ（にｅｙｈｏ
ｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に代表さ
れるキャリア蛋白と結合後、又はｐｖｐ　＜ポリビニル
ピロリドン）と混合後、フロイントのアジュバントと混
合し、動物の免疫用として使用する。

又はウシＯＣを直接フロイントのアジュバントと混合し
、動物の免疫用として使用する。特にＧｌａ残基又はこ
れを含有するペプチドを認識するモノクローナル抗体を
取得するためには、ＯＣのアミノ基を利用してＫＬＨ等
のキャリア蛋白と結合させることが望ましい。この目的
においては例えばＳＭＣＣＣスクシンイミジル−４−（
Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキ
シレート〕等によりマレイミド化したＯＣと、２−イミ
ノチオレイン等により、ＳＨ基を導入したＫＬＨとを反
応させることで達成される。

免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に１回に２０
〜２００μｇ、２〜３週間に１回、３〜７週間投与する
ことによって行われる。最終免疫より約３〜５日後、免
疫動物から抗体産生細胞を分取する。

骨髄腫細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のもの
が使用される。細胞融合は例えばＧ６ケラ−（Ｇ、　Ｋ
６ｈｌｅｒ　）ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）第２５６
巻、第４９５頁（１９７５）に記載の方法、又はこれに
準する方法によって行われる。この際、３０〜５０％ポ
リエチレングリコール（分子量１０００〜４０００　）
を用い、３０〜４０℃の温度下約１〜３分間程度反応さ
せることよって行われる。

細胞融合によって得られたハイブリドーマはスクリーニ
ングに付される。すなわち、スクリニングは抗原として
Ｇｌａ残基を含むＯＣと含まないＯＣを用いて酵素抗体
法等によって行われる。得られた抗体産生ハイブリドー
マはクロニングに付される。すなわち、当該ハイブリド
ーマを例えば限界希釈法によってクローニングを行って
クローンを得る。得られたクローンは、次いで目的とす
るモノクローナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニ
ングに付され、例えば酵素抗体法等によって行われる。

選ばれたクローンは、例えばあらかじめブリスタン（２
゜６、　１０．１４−テトラメチルペンタデカン）を投
与した口＾ＬＢ／ｃマウスの腹腔内へ移植し、１０〜１
４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採収
する。この腹水からのモノクローナル抗体の回収はイム
ノグロブリンの精製法として従来既知の硫安分画法、ポ
リエチレングリコール分画法、イオン交換クロマトグラ
フ法、ゲルクロマトグラフ法、アフィニティークロマト
グラフ法等を応用することで容易に達成される。

かくして得られたＧｌａ残基を有するＯＣに特異的なモ
ノクローナル抗体は、生体由来の試料、例えば血清、血
しよう又は尿中のＧｌａ残基を有するＯＣすなちわ活性
型ＯＣを特異的に高感度で測定するために極めて好適で
ある。この測定のために、モノクローナル抗体そのもの
、又は、それからの相応する免疫学的特性を有するフラ
グメント、例えばＦａｂ’　フラグメント等を使用する
ことができる。

〔実施例〕

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１．　モノクローナル抗体の作製（１）抗原の精
製 ウシ大腿骨を細砕し、０．５Ｍ　ＢＵＴ＾（ｐＨ８）で
骨蛋白を抽出した。抽出懸濁液を遠心分離し、上清を凍
結乾燥後ＯＤＳカラムを用いたＨＰＬＣでウシＯＣを精
製した。

（２）　　マウスの免疫 ウシＯＣ５＋＋＋ｇを０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ
７，０）０．５ｍｆに溶かし、ＳＭＣＣ２，９ｍｇをＤ
ＭＦ　（ジメチルホルムアミド）１０μｌに溶解した溶
液を加え、３０℃で１時間反応させた。この反応液を０
．１ＭＩＪン酸バッファー（ｐＨ７，０）で平衡化した
セファデックスＧ−２５カラム（１，Ｏｘ４５ｃｎ＋　
）に付し、マレイミド化したＯＣを得た。一方、ＫＬＨ
ｌｏｍｇを０゜ＩＭ　リン酸バッファー（ｐＨ７、ＯＳ
ｌ　ｍＭ　ＢＤＴ八含へ）に溶かし、２−イミノチオレ
イン０．３ｍｇを加え、室温で３０分反応させた。この
反応液を０．１ＭＩＪン酸バッファー（ｐＨ７，０，０
，１Ｍ　ＢＤＴＡ含有）で平衡化したセファデックス６
−２５カラム（１，ＯＸ　４５ｃｍ）に付し、ＳＨ化Ｋ
ＬＨを得た。マレイミド化ＯＣ溶液及びＳＨ化ＫＬＨ溶
液を各々約１−にまでコロジオンバッグを用いて濃縮し
た後、混合し、４℃で一晩反応させ、０．１Ｍリン酸バ
ッファー（ｉ７、Ｏ）で平衡化させたウルトロゲル八ｃ
Ａ４４力ラム（１，５ｘ　４８　ｃｍ）に付し、１００
滴ずつ分画し、分画番号１２〜１４をＱＣ−ＫＬＨ結合
物として分取した。

ロＣ−ＫＬＨ結合物溶液をフロイントの完全アジュバン
トと１　：　１　　（Ｖ／Ｖ）の割合でよく混合し、マ
ウス１匹当りＱＣ−ＫＬＨ結合物が５０μｇとなるよう
に腹腔内に免疫した。初回免疫から１４日後にＤＣ−Ｋ
ＬＨ結合結合液溶液ロイントの不完全アジュバントとｌ
　：　１　（ｖ／ｖ）の割合でよく混合し、マウス−匹
当りＱＣ−ＫＬＨ結合物が５０μｇとなるように腹腔内
に免疫した。更にその１４日後、ＤＣ−ＫＬＨ結合物を
マウス−匹当り５０μｇを腹腔内に最終免疫した。

（３）細胞融合及びクローニング 最終免疫の３日後にマウスのｎ＠を取出し、その牌細胞
とマウスミエローマＰ３０１とヲｌｏ：１の割合で混合
し、前記ネーチャー記載のケラ−らの方法を用いて細胞
融合を行った。次に、９６穴マイクロタイタープレート
に植え込み、ＨＡＴ　（ヒボキサンチン１　ｘ　１０−
’Ｍ　ｓアミノプテリン４　Ｘ　１０−’Ｍ　、チミジ
ン１．６　Ｘ　１０−’Ｍ　）を含んだＤＭＢＭ−１０
％ＦＣ３（ＨＡＴ培地）で１０〜１７日間培養後、ＨＴ
　（ヒボキサンチンｌＸ１０−’Ｍ　、チミジン１．６
　ｘｌＯ−’Ｍ　）を含んだＤＭＢＭ−１０％ＦＣ３培
地（ＨＴ培地）に移し、更にＤＭＢＭ−１０％ＦＣ３培
地で培養した。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗
体価を酵素抗体法により測定し、抗体産生能のあったウ
ェルのハイブリドーマを限界希釈法により、クローニン
グを行い、クローニング株を得た。

（４）　　スクリーニング法 バイブリドーマ及びクローンが増殖したウェルの培養上
清を分取し、エンザイム　リンクドイムノソルベント　
アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉ口ｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓ
ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ　（ＢＬＩＳＡ　）法により
Ｇｌａ残基を有するウシｏＣには反応するがＧｌａ残基
を有しないウシＯＣには反応しない抗体を産生じている
ハイブリドーマ及びクローンを調べた。

なお、Ｇｌａ残基を有しないＯＣはボーサーら（Ｐｏ５
ｅｒ、　Ｊ、？ｉ、　　らジャーナル　オブ　バイオケ
ミストリー第２５４巻、第４３１頁　１９７９年）の方
法により塩酸酸性下凍結乾燥したウシＯＣを１１０℃加
熱処理することで行った。

マイクロタイタープレートにＧｌａ残基を有するウシＯ
Ｃ又はＧｌａ残基を有しないウシＯＣを別々に各０．５
μｇ１５０μｌ／ウェルとなるように分注し、４℃で１
８時間静置して両ウシＯＣを固相に吸着させた。１０ｍ
ＭＩＪン酸緩衝食塩酸（ＰＢＳ）　（ｐｔｌ　７．４　
）２００μｍで３回洗浄した後、１％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳ＾）を含むＰＢＳ１００μｊｉ！／ウェルを加
え、３７℃で１時間静置し、各ウェルの未吸着部分をブ
ロックした。次いで、試料である培養上清を５０μｌ／
ウェル加え３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで３回洗
浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（カペ
ル社）を５０μｌ／ウエル添加し、３７℃で１時間反応
させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、　０゜０１％過酸化
水素、０．５５■／−ムロＴＳ（２，２’−アジノージ
（３−エチルベンゾチアゾリン−スルホネート）、ベー
リンガー　マンハイム社）を含む０．１Ｍクエン酸−水
酸化ナトリウムバッファー（ｐＨ４，０）を加え、波長
４１０ｎｍでの吸光度を測定した。試料中、Ｇｌａ残基
を有するウシＯＣに対して発色し、Ｇｌａ残基を有しな
いウシＯＣに対して発色を示さない抗体を産生じている
バイプリドーマ及びクローン株をスクリーニングした。

この結果、Ｇｌａ残基を有するウシＯＣに対してのみ反
応性を示すクローン株ＯＣ４−３０が得られた。

本りローン株はＨｙｂｒｉｄｏｍａ　ＯＣ４−３０と表
示し、微工研菌寄第１０５８３号（ＦＢＲＭ　Ｐ−１０
５８３）として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている。一方、Ｇｌａ残基を有するＤＣ１有さない
ＯＣ両方に反応性を示すクローン株ＤＣ−６４が得られ
、本りローン株はＨｙｂｒｉｄｏｍａ　ＱＣ−Ｇ４と表
示し、微工研菌寄第１０５８２号（ＦＢＲＭＰ−１０５
８２）として同じく寄託されている。

（５）モノクローナル抗体の作製 ７週令のＢＡＬ口／Ｃマウスにブリスタン（アルドリッ
チ社）０．５−を腹腔内に投与し、１週間以上経過した
後培養、増殖させたクローン株１〜９　Ｘ　１０−”個
／マウスを腹腔内に接種した。１０〜１４日後にマウス
より腹水を採取した。これを３．００Ｏｒｐｍ　１０分
間遠心分離し、５〜１５ｄ／匹のモノクローナル抗体含
有腹水を得た。

（６）モノクローナル抗体の精製 上記（５）によって得られた腹水を５０ｍＭ！Ｊン酸バ
ッフ塩酸（ｐＨ７，３）で２倍希釈した後、等量の飽和
硫酸アンモニウムを加え、沈殿画分を分取した。

この画分をなるべく少量の上記リン酸バッファーに溶解
させ、同じバッファーに対して透析した。このサンプル
をＤＲＡＢ−セルロースカラムにかけ、クローン株ＯＣ
Ａ−３０からＧｌａ残基を有するウシＯＣに特異的なモ
ノクローナル抗体ＯＣ４−３０を得た。また、同様にク
ローン株ＤＣ−６４からモノクローナル抗体ＱＣ−Ｇ４
を得た。

（７）モノクローナル抗体の物理化学的性質モノクロー
ナル抗体ＯＣ４−３０のイムノグロブリンサブクラスは
オフタロニー法によりＩｇＬａであった。また分子量は
５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により１４
５０００であった。また、モノクローナル抗体［ＩＣ−
０４のイムノグロブリンサブクラスはＩｇＧ、　、分子
量は１４５０００であった。

一方、ＢＬＩＳＡ法によりＧｌａ残基を有するウシＯＣ
とＧｌａ残基を有しないウシｏｃに対する反応性を表１
に示すが、モノクローナル抗体ＯＣ４３０がＧｌａ残基
を有するウシｏｃに特異的に反応していることが示され
た。

表　　　　１ 実施例２　モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥ
ＩＡ法によるＧｌａ残基含有 ＯＣの定量 実施例１で得たモノクローナル抗体ＯＣ４−３０、口Ｃ
−６４を用いてＧｌａ残基残基含有側Ｃ測定試薬整した
。

（１）　　西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識
モモツクローナル抗体の作製 ＨＲＰ　４　ｍｇを１ｒｎｌの蒸留水に溶かし、０．１
Ｍ過ジヨウ素酸）　ＩＪウム０．２Ｆｎ１を加えて室温
で２０分間反応させた後、１　ｍＭ　　酢酸ナトリウム
バッファー（ＰＨ９，５）　０．０２−を加えてＩ）Ｈ
９〜９．５にすると同時にモノクローナル抗体ＤＣ−６
４８■／−［０，０１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐ
Ｈ９，５）に対して透析したもの〕を加える。室温で２
時間反応させた後、水素化ホウ素ナトリウム４ｍｇ／−
を０．１ｒｎ１加えて４℃で２時間反応させる。これを
セファデックスＧ−２００カラムでゲルろ過し、０．Ｉ
Ｍ　ＮａＣ１を含む０．１Ｍリン酸ナトリウムバッファ
ーＰＨ７，５で溶出させ、ＨＲＰＰＡ識ＱＣ−Ｇ４モノ
クローナル抗体を分取した。

（２）　　サンドイッチＥＩＡ測定系 ９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウェルにＰＢ
Ｓに溶解したモノクローナル抗体ＯＣ４−３０，２０μ
ｇ／−を１００μｌずつ添加し、４℃１晩インキユベー
トし、溶液を捨てた後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を
１００μｌずつ各ウェルに添加し、３７℃で１時間ブロ
ッキングを行った。ＰＢＳでよく洗浄し、１％ＢＳＡを
含むＰＢＳで希釈したＨＲＰ標識ＱＣ−Ｇ４モノクロー
ナル抗体液５０μｌを添加して４℃で１８時間反応させ
た。ＰＢＳで３回洗浄したのち、０．０１％過酸化水素
、１　ｍｇ　／　ｍｌ　ｏ−フエニレンジアミンヲ含ｔ
ｉ’０．ＩＭクエン酸バッファー（ｐＨ４，５）０．１
艷を加え、２０分間室温で反応させた後、Ｉ　Ｎ　Ｈ２
ＳＯ，０，１ｍｌ？を加え、波長４９２ｎｍでの吸光度
を測定した。

（３）測定系の感度、特異性 オリス工業社製オステオカルシンＲＩＡキット中の積重
ＯＣ溶液（０、５〜５５ｎｇ／　ｍｌり　　　ヒト標準
血清、及びＧｌａを含まないＯＣを用いて感　ナル抗体
が提供された。

度及び特異性を検討した。　　　　　　　　　　　本発
明のモノクローナル抗体を利用するこその結果を第１図
に示す。すなわち第１図　　とで、Ｇｌａ残基を有する
ＯＣに特異的な測定は本発明のモノクローナル抗体を用
いたサン　　方法が可能になり、骨代謝における活性型
ＤＣドイツチＥＩＡ法によるＯＣ測定の感度と特　　の
役割の解明、骨疾患における血中活性型ＱＣ異性を示し
たグラフであり、横軸はＯＣ濃度　　の測定等に非常に
有用である。

（ｎｇ／ｍｌり　、縦軸は４９２ｎｍでの吸光度であ　
４、図面の簡単な説明る。第１図に示すように、サンド
イッチＥＩ　　　　第１図は本発明のモノクローナル抗
体を用ＡによるＱＣ（図中・で示す）の測定感度は　　
いたサンドイッチＥＩＡ法によるＯＣ測定の０．５　ｎ
ｇ／−であり、ヒト標準血清中のＯＣ感度と特異性を示
したグラフである。

（図中△で示す）の測定感度は６．Ｏｎｇ／ｍｊｉ！で
あった。更にＧｌａを含まないＱＣ（図中○で示す）の
測定感度は１１０００ｎ／ｍｉ、まで発色は認められす
、本モノクローナル抗体を用いた測　　　　　　特許出
願人　　賓酒造株式会社定系はＧｌａ残基を有するＯＣ
に特異的な測定　　　　　　代　理　人　　　中　本　
　　宏方法であり、一方、ヒト血中ＯＣ量の測定も　　
　　　　　　同　　　　　井　上　　　昭可能であるこ
とが示された。　　　　　　　　　　　　　　　　同　
　　　　吉　嶺　　　桂〔発明の効果〕 以上詳細に説明した通り、本発明によりＧｌａ残基を有
するＯＣに特異的なモノクロー３丁目４番１号　實酒造
株式会社中央研究所内 手続補正書（自発） 平成２年１月２５日 特許庁長官　　吉　１）文　毅　殿 平成１年特許願第６２１２６号 モノクローナル抗体及びその使用方法 １、事件の表示 ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 住　所　　京都府京都市伏見区竹中町６０９番地名称　
賓酒造株式会社 代表者　　１）辺　　　哲 ７、補正の内容 明細書の発明の詳細な説明の欄を下記のとおり補正する
。

（１）明細書第１４頁１２行の「微工研・・・・５８３
）Ｊなる全文を下記のとおり補正する。

「微工研条寄第２７２５号（ＦＯＲＭ　ＢＰ−２７２５
）Ｊ（２）同第１４頁下から４〜３行の「微工研・・・
・５Ｂ２）Ｊなる全文を下記のとおり補正する。

「微工研条寄第２７２４号（ＦＢＲＭ　０Ｐ−２７２４
）Ｊ（３）　　同第１８頁８行の「・・・洗浄し、」の
次に下記の文を加入する。

「試料５０μｌを加え、」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、γ−カルボキシグルタミン酸残基を有するオステオ
   カルシンと特異的に反応し、γ−カルボキシグルタミン
   酸残基を有しないオステオカルシンとは反応しないこと
   を特徴とする抗オステオカルシンモノクローナル抗体。 ２、該抗オステオカルシンモノクローナル抗体が下記の
   性質を有するＯＣ４−３０である請求項１記載のモノク
   ローナル抗体。 ａ）分子量：１４５，０００ ｂ）Ｉｇクラス：ＩｇＧ＿２＿ａ ｃ）反応性：少なくともγ−カルボキシグルタミン酸残
   基を有するウシ−オステオカルシンに対して反応性を示
   し、γ−カルボキシグルタミン酸残基を有しないウシ−
   オステオカルシンに対して反応性を示さない。 ３、生体試料中のオステオカルシンの免疫学的測定に際
   して、γ−カルボキシグルタミン酸残基を有するオステ
   オカルシンと特異的に反応し、γ−カルボキシグルタミ
   ン酸残基を有しないオステオカルシンとは反応しない抗
   オステオカルシンモノクローナル抗体を使用することを
   特徴とするオステオカルシンの測定方法。