JPH0678788A - 骨ぜい弱性と骨粗しょう症骨折の危険性の検査方法 - Google Patents
骨ぜい弱性と骨粗しょう症骨折の危険性の検査方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 骨ぜい弱性と骨粗しょう症骨折の危険性の効
果的検査方法を提供する。 【構成】 血清、血漿もしくは尿のような生体流体試料
中の低カルボキシル化オステオカルシンの濃度を生体外
で測定し、試験試料中の低カルボキシル化オステオカル
シンの濃度を、正常範囲の上限を示す濃度の低カルボキ
シル化オステオカルシンを含有する対照試料の濃度と比
較する、ことからなり、上記の上限を越える濃度が骨折
の危険性が増大していることを示す、ことを特徴とす
る、骨のぜい弱性と骨粗しょう症骨折の危険性を検査す
る方法。
果的検査方法を提供する。 【構成】 血清、血漿もしくは尿のような生体流体試料
中の低カルボキシル化オステオカルシンの濃度を生体外
で測定し、試験試料中の低カルボキシル化オステオカル
シンの濃度を、正常範囲の上限を示す濃度の低カルボキ
シル化オステオカルシンを含有する対照試料の濃度と比
較する、ことからなり、上記の上限を越える濃度が骨折
の危険性が増大していることを示す、ことを特徴とす
る、骨のぜい弱性と骨粗しょう症骨折の危険性を検査す
る方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、循環している（circul
ating ）低カルボキシル化オステオカルシン（under-ca
rboxylated osteocalcin ，ucOC）の定量測定値を用い
る骨ぜい弱性（bone fragility ）と骨粗しょう症骨折
（osteoporotic fracture）の危険性を検査する方法に
関する。さらに本発明は、上記測定を行うのに用いるキ
ットおよびその試験に用いるのに適した抗体に関する。
ating ）低カルボキシル化オステオカルシン（under-ca
rboxylated osteocalcin ，ucOC）の定量測定値を用い
る骨ぜい弱性（bone fragility ）と骨粗しょう症骨折
（osteoporotic fracture）の危険性を検査する方法に
関する。さらに本発明は、上記測定を行うのに用いるキ
ットおよびその試験に用いるのに適した抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】骨粗しょう症は、高齢者の特に女性によ
くみられる骨がぜい弱な疾患であり、「ぜい弱骨折（fr
agility fracture ）」すなわち非外傷かもしくは弱い
外傷による骨折の発生率が高いのが特徴である。骨粗し
ょう症の症状の特徴である骨の代謝の異常は、極端に複
雑でかつ微妙で、しかも長期間にわたって極めてゆるや
かに起こることが多いので、骨粗しょう症の臨床症状で
の発見と危険性の決定は特に難しい。
くみられる骨がぜい弱な疾患であり、「ぜい弱骨折（fr
agility fracture ）」すなわち非外傷かもしくは弱い
外傷による骨折の発生率が高いのが特徴である。骨粗し
ょう症の症状の特徴である骨の代謝の異常は、極端に複
雑でかつ微妙で、しかも長期間にわたって極めてゆるや
かに起こることが多いので、骨粗しょう症の臨床症状で
の発見と危険性の決定は特に難しい。
【０００３】したがって、骨の代謝回転、すなわち骨芽
細胞による新しい骨の形成と破骨細胞による古い骨の吸
収との平衡状態のパラメータの測定は、ページェット病
もしくは腎性骨形成不全症のような劇的な代謝の変異を
伴う他の骨の疾患を試験するのにしばしば利用される
が、骨粗しょう症に用いるには制限がある。実際に、骨
形成および骨吸収の一般的なマーカー、例えばそれぞれ
血清中のオステオカルシンおよび尿中のピリジノリンが
あるが、それらの値は一部の骨粗しょう症患者では正常
な範囲内にあることが見られる場合がある。骨粗しょう
症は低骨量を伴うことが多いので、吸光光度法を用いる
骨量の測定は、一定の症例では有用なことがある。しか
し、骨ぜい弱性の決定についてのこの検査法は、間接的
で費用が高く、かつ連続して起こる骨脱落の程度につい
ての情報を与えないし骨構造状態についての情報も与え
ない。
細胞による新しい骨の形成と破骨細胞による古い骨の吸
収との平衡状態のパラメータの測定は、ページェット病
もしくは腎性骨形成不全症のような劇的な代謝の変異を
伴う他の骨の疾患を試験するのにしばしば利用される
が、骨粗しょう症に用いるには制限がある。実際に、骨
形成および骨吸収の一般的なマーカー、例えばそれぞれ
血清中のオステオカルシンおよび尿中のピリジノリンが
あるが、それらの値は一部の骨粗しょう症患者では正常
な範囲内にあることが見られる場合がある。骨粗しょう
症は低骨量を伴うことが多いので、吸光光度法を用いる
骨量の測定は、一定の症例では有用なことがある。しか
し、骨ぜい弱性の決定についてのこの検査法は、間接的
で費用が高く、かつ連続して起こる骨脱落の程度につい
ての情報を与えないし骨構造状態についての情報も与え
ない。
【０００４】骨粗しょう症の危険性の予知方法を改良す
る試みとして、現在用いられている大部分の方式は骨量
と骨代謝の測定の組合せを用いるものであり、後者のパ
ラメータはいくつもの異なるマーカーによって決定さ
れ、組織形態観察法のような侵襲的方法によって確認さ
れている。現在に至るまで、骨のぜい弱性、即ち骨折の
危険性の生化学的マーカーは全く報告されていない。
る試みとして、現在用いられている大部分の方式は骨量
と骨代謝の測定の組合せを用いるものであり、後者のパ
ラメータはいくつもの異なるマーカーによって決定さ
れ、組織形態観察法のような侵襲的方法によって確認さ
れている。現在に至るまで、骨のぜい弱性、即ち骨折の
危険性の生化学的マーカーは全く報告されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、この
ような生化学的マーカーを提供することである。
ような生化学的マーカーを提供することである。
【０００６】本発明は、循環している低カルボキシル化
オステオカルシンの濃度が連続して起こる骨折の危険性
を予報するという、本発明者らの知見に基づいたもので
ある。
オステオカルシンの濃度が連続して起こる骨折の危険性
を予報するという、本発明者らの知見に基づいたもので
ある。
【０００７】オステオカルシンは、骨中Gla 残基含有タ
ンパク質とも呼ばれ、骨形成細胞である骨芽細胞によっ
て合成される細胞外マトリックスに存在する特徴的な非
コラーゲン性タンパク質である。オステオカルシンは、
分子中に４９のアミノ酸を含有し、これにはγ−カルボ
キシグルタミン酸（ＧＬＡ）すなわちビタミンＫ依存性
の翻訳後修飾を受けたグルタミン酸残基（ＧＬＵ）を分
子中に３残基含有している。カルボキシル化ＧＬＡ残基
は１７，２１および２４番目の位置にある。オステオカ
ルシンは、試験管内でヒドロキシアパタイト生成を阻害
し、カルシウム調節ホルモン１，２５−ジヒドロキシビ
タミンＤで調節されるが、その正確な生理学的機能は不
明のままである。オステオカルシンは走化性を有し、骨
芽細胞の漸増と骨の吸収の開始に役割を演じているかも
しれないがこれは依然として推測の域を出ない。
ンパク質とも呼ばれ、骨形成細胞である骨芽細胞によっ
て合成される細胞外マトリックスに存在する特徴的な非
コラーゲン性タンパク質である。オステオカルシンは、
分子中に４９のアミノ酸を含有し、これにはγ−カルボ
キシグルタミン酸（ＧＬＡ）すなわちビタミンＫ依存性
の翻訳後修飾を受けたグルタミン酸残基（ＧＬＵ）を分
子中に３残基含有している。カルボキシル化ＧＬＡ残基
は１７，２１および２４番目の位置にある。オステオカ
ルシンは、試験管内でヒドロキシアパタイト生成を阻害
し、カルシウム調節ホルモン１，２５−ジヒドロキシビ
タミンＤで調節されるが、その正確な生理学的機能は不
明のままである。オステオカルシンは走化性を有し、骨
芽細胞の漸増と骨の吸収の開始に役割を演じているかも
しれないがこれは依然として推測の域を出ない。
【０００８】新たに合成されたオステオカルシン分子の
一部が循環系中に漏洩するので、オステオカルシンの血
清中濃度は骨形成の指標として使用されている。いくつ
かの検討により、血清中のオステオカルシン値が、種々
の骨代謝疾患や腎臓障害での骨形成度合の鋭敏で特異的
な指数であることが示されている。また血清中のオステ
オカルシンは、骨の代謝と骨量に影響する特殊治療法の
効果判定上の有用なマーカーでもある。血清中オステオ
カルシンの検定法は、そのγ−カルボキシル化度のいか
んにかかわらず、循環しているオステオカルシン分子の
量を定量する血清オステオカルシン測定はポリクローナ
ル抗体および／またはモノクローナル構体を使用して行
われる（Delmas，P. D. ，Endocrinol. Clin. North A
m.、１９巻、１〜１８頁、１９９０年）。最近、Koyama
ら（J. Immunol. Meth. 、１３９巻、１７〜２３頁、１
９９１年）は、オステオカルシンの定量法に関して、完
全にカルボキシル化したオステオカルシンに特異的なモ
ノクローナル抗体を使うことを報告した。
一部が循環系中に漏洩するので、オステオカルシンの血
清中濃度は骨形成の指標として使用されている。いくつ
かの検討により、血清中のオステオカルシン値が、種々
の骨代謝疾患や腎臓障害での骨形成度合の鋭敏で特異的
な指数であることが示されている。また血清中のオステ
オカルシンは、骨の代謝と骨量に影響する特殊治療法の
効果判定上の有用なマーカーでもある。血清中オステオ
カルシンの検定法は、そのγ−カルボキシル化度のいか
んにかかわらず、循環しているオステオカルシン分子の
量を定量する血清オステオカルシン測定はポリクローナ
ル抗体および／またはモノクローナル構体を使用して行
われる（Delmas，P. D. ，Endocrinol. Clin. North A
m.、１９巻、１〜１８頁、１９９０年）。最近、Koyama
ら（J. Immunol. Meth. 、１３９巻、１７〜２３頁、１
９９１年）は、オステオカルシンの定量法に関して、完
全にカルボキシル化したオステオカルシンに特異的なモ
ノクローナル抗体を使うことを報告した。
【０００９】１９８１年に Priceら（J. Biol. Chem.、
２５６巻、２４号、１２７６０〜１２７６６頁、１９８
１年）は、γ−カルボキシル化プロセスの強力な阻害剤
であるワルファリンを長期にわたって注射するとオステ
オカルシンのカルボキシル化が低下することを実証し
た。オステオカルシンに対するγ−カルボキシグルタミ
ン酸の役割は、このタンパク質を、骨の主な成分である
ヒドロキシアパタイトに強力に結合できるようにするこ
とである。それ故に低カルボキシル化オステオカルシン
は、もはや骨中マトリックスに組込まれずに循環系に放
出される。Priceの方法によれば、血清中のカルボキシ
ル化されていないオステオカルシンの測定は、血清をヒ
ドロキシアパタイトとともにインキュベートした後、標
準の放射線免疫検定法によって行われる。全オステオカ
ルシンのカルボキシル化された分子はヒドロキシアパタ
イトと結合し、上清中に残存する非カルボキシル化分子
は、カルボキシル化オステオカルシンと非カルボキシル
化オステオカルシン（ non-carboxylated osteocalci
n，ncOC）の両方に対して等しい親和性を有する抗体を
使って測定される。
２５６巻、２４号、１２７６０〜１２７６６頁、１９８
１年）は、γ−カルボキシル化プロセスの強力な阻害剤
であるワルファリンを長期にわたって注射するとオステ
オカルシンのカルボキシル化が低下することを実証し
た。オステオカルシンに対するγ−カルボキシグルタミ
ン酸の役割は、このタンパク質を、骨の主な成分である
ヒドロキシアパタイトに強力に結合できるようにするこ
とである。それ故に低カルボキシル化オステオカルシン
は、もはや骨中マトリックスに組込まれずに循環系に放
出される。Priceの方法によれば、血清中のカルボキシ
ル化されていないオステオカルシンの測定は、血清をヒ
ドロキシアパタイトとともにインキュベートした後、標
準の放射線免疫検定法によって行われる。全オステオカ
ルシンのカルボキシル化された分子はヒドロキシアパタ
イトと結合し、上清中に残存する非カルボキシル化分子
は、カルボキシル化オステオカルシンと非カルボキシル
化オステオカルシン（ non-carboxylated osteocalci
n，ncOC）の両方に対して等しい親和性を有する抗体を
使って測定される。
【００１０】このヒドロキシアパタイトインキュベーシ
ョン法を用いて、循環中のオステオカルシンの低カルボ
キシル化現象が、抗凝固療法を受けている患者にみとめ
られている（Pietschmann ，P.ら、J. Clin. Endocrin.
Metab. 、６６巻、５号、１０７１〜１０７４頁、１９
８８年）。
ョン法を用いて、循環中のオステオカルシンの低カルボ
キシル化現象が、抗凝固療法を受けている患者にみとめ
られている（Pietschmann ，P.ら、J. Clin. Endocrin.
Metab. 、６６巻、５号、１０７１〜１０７４頁、１９
８８年）。
【００１１】最近、 Plantalech ， L. ら（J. Bone M
iner. Res.、６巻、１１号、１２１１〜１２１６頁、１
９９１年）は、非カルボキシル化オステオカルシンの循
環液中濃度が、若年健常者にみられる平均濃度に比べて
老年女性の場合著しく増大していることを示した。さら
に、かなりの人数の高齢女性の非カルボキシル化オステ
オカルシン濃度は正常範囲を越えていた。これらの濃度
上昇は、既に完全にカルボキシル化された分子の脱カル
ボキシル化反応によるというよりはむしろ新しく合成さ
れるオステオカルシン分子のカルボキシル化反応が不完
全であることによると考えられる。非カルボキシル化オ
ステオカルシンの濃度を、骨折の経歴のある女性とない
女性で比較したところ有意差はみとめられなかった。非
カルボキシル化オステオカルシンの測定は、間接的でそ
れほど鋭敏でない Priceのヒドロキシアパタイト結合法
を用いて行われた。この文献では、低カルボキシル化オ
ステオカルシンの増大した濃度の意義について考察して
おらず、およびこの濃度増大が、骨粗しょう症の特徴で
ある骨量の減少と骨ぜい弱性の増大に関連があるという
ことを指摘していない。
iner. Res.、６巻、１１号、１２１１〜１２１６頁、１
９９１年）は、非カルボキシル化オステオカルシンの循
環液中濃度が、若年健常者にみられる平均濃度に比べて
老年女性の場合著しく増大していることを示した。さら
に、かなりの人数の高齢女性の非カルボキシル化オステ
オカルシン濃度は正常範囲を越えていた。これらの濃度
上昇は、既に完全にカルボキシル化された分子の脱カル
ボキシル化反応によるというよりはむしろ新しく合成さ
れるオステオカルシン分子のカルボキシル化反応が不完
全であることによると考えられる。非カルボキシル化オ
ステオカルシンの濃度を、骨折の経歴のある女性とない
女性で比較したところ有意差はみとめられなかった。非
カルボキシル化オステオカルシンの測定は、間接的でそ
れほど鋭敏でない Priceのヒドロキシアパタイト結合法
を用いて行われた。この文献では、低カルボキシル化オ
ステオカルシンの増大した濃度の意義について考察して
おらず、およびこの濃度増大が、骨粗しょう症の特徴で
ある骨量の減少と骨ぜい弱性の増大に関連があるという
ことを指摘していない。
【００１２】また、高齢女性について、非カルボキシル
化オステオカルシンが血清中に増大していることを、全
OCの百分率として測定して、Knapenらが報告した（Ann.
Intern. Med. 、１１１巻１００１〜１００５頁、１９
８９年）。やはりヒドロキシアパタイト結合法が利用さ
れた。検定条件はこの文献には詳細に述べられていな
い。骨ぜい弱性との関連づけは全くなされていない。
化オステオカルシンが血清中に増大していることを、全
OCの百分率として測定して、Knapenらが報告した（Ann.
Intern. Med. 、１１１巻１００１〜１００５頁、１９
８９年）。やはりヒドロキシアパタイト結合法が利用さ
れた。検定条件はこの文献には詳細に述べられていな
い。骨ぜい弱性との関連づけは全くなされていない。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、循環中の低カ
ルボキシル化オステオカルシンの濃度を特異的に測定す
ることによって、骨のぜい弱性と骨折の危険性を検査す
る方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、血清、血
漿または尿のような生体液試料中の低カルボキシル化オ
ステオカルシンの濃度を生体外で測定し、試験試料中の
低カルボキシル化オステオカルシンの濃度を、低カルボ
キシル化オステオカルシンの正常範囲の上限の濃度を含
む正常対照試料の濃度と比較し、この上限を越える濃度
が骨折の危険性が増大していることを示す、ことを特徴
とする骨のぜい弱性と骨折の危険性の検査方法に関す
る。
ルボキシル化オステオカルシンの濃度を特異的に測定す
ることによって、骨のぜい弱性と骨折の危険性を検査す
る方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、血清、血
漿または尿のような生体液試料中の低カルボキシル化オ
ステオカルシンの濃度を生体外で測定し、試験試料中の
低カルボキシル化オステオカルシンの濃度を、低カルボ
キシル化オステオカルシンの正常範囲の上限の濃度を含
む正常対照試料の濃度と比較し、この上限を越える濃度
が骨折の危険性が増大していることを示す、ことを特徴
とする骨のぜい弱性と骨折の危険性の検査方法に関す
る。
【００１４】本発明の好ましい実施態様によれば、低カ
ルボキシル化オステオカルシンの濃度の測定は、少なく
とも一つのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗
体またはそのフラグメントによって行われる。前記抗体
またはそのフラグメントは低カルボキシル化オステオカ
ルシンに対して特異的である。
ルボキシル化オステオカルシンの濃度の測定は、少なく
とも一つのモノクローナル抗体またはポリクローナル抗
体またはそのフラグメントによって行われる。前記抗体
またはそのフラグメントは低カルボキシル化オステオカ
ルシンに対して特異的である。
【００１５】本発明において、「低カルボキシル化オス
テオカルシン（ucOC）」という用語は、ＧＬＡ残基の数
が正常値より少ないオステオカルシンを意味する。通
常、オステオカルシン分子は、三つのＧＬＡ残基を有す
るので「低カルボキシル化」という用語は、０，１もし
くは２のＧＬＡ残基を有する分子を意味する。１もしく
は２のＧＬＡ残基を有するオステオカルシン分子につい
ては、これらの残基は１７，２１もしくは２４の位置の
いずれかに存在している。１７位置のＧＬＡ残基は、低
カルボキシル化分子にはない場合が多い。低カルボキシ
ル化オステオカルシンは非カルボキシル化オステオカル
シンまたはncOCと呼ばれることもある。本発明について
は、これらの用語は交互に使用される。ucOCという用語
は、低カルボキシル化分子に特有でかつ充分にカルボキ
シル化された形態のオステオカルシン中には存在しない
低カルボキシル化オステオカルシンのフラグメントを含
むと解すべきである。
テオカルシン（ucOC）」という用語は、ＧＬＡ残基の数
が正常値より少ないオステオカルシンを意味する。通
常、オステオカルシン分子は、三つのＧＬＡ残基を有す
るので「低カルボキシル化」という用語は、０，１もし
くは２のＧＬＡ残基を有する分子を意味する。１もしく
は２のＧＬＡ残基を有するオステオカルシン分子につい
ては、これらの残基は１７，２１もしくは２４の位置の
いずれかに存在している。１７位置のＧＬＡ残基は、低
カルボキシル化分子にはない場合が多い。低カルボキシ
ル化オステオカルシンは非カルボキシル化オステオカル
シンまたはncOCと呼ばれることもある。本発明について
は、これらの用語は交互に使用される。ucOCという用語
は、低カルボキシル化分子に特有でかつ充分にカルボキ
シル化された形態のオステオカルシン中には存在しない
低カルボキシル化オステオカルシンのフラグメントを含
むと解すべきである。
【００１６】本発明の方法によれば生物学的試料中のuc
OCの濃度の特異的な測定は、分子の低カルボキシル化形
態に対して特異的な抗体またはそのフラグメントを使っ
て実施することが好ましく、この「特異的な」という用
語は、所定のさまざまの反応条件下で、同じ抗体が、充
分にカルボキシル化されたオステオカルシンとよりも低
カルボキシル化オステオカルシンと高い親和性で反応す
ることを意味する。通常、試験に利用される反応条件下
では充分にカルボキシル化されたオステオカルシンとの
交差反応は全くみとめられない。
OCの濃度の特異的な測定は、分子の低カルボキシル化形
態に対して特異的な抗体またはそのフラグメントを使っ
て実施することが好ましく、この「特異的な」という用
語は、所定のさまざまの反応条件下で、同じ抗体が、充
分にカルボキシル化されたオステオカルシンとよりも低
カルボキシル化オステオカルシンと高い親和性で反応す
ることを意味する。通常、試験に利用される反応条件下
では充分にカルボキシル化されたオステオカルシンとの
交差反応は全くみとめられない。
【００１７】本発明の方法に用いるのに適した抗体は、
０，１もしくは２のカルボキシ基を有するオステオカル
シン分子に対して特異的なポリクローナル血清である。
０，１もしくは２のカルボキシ基を有するオステオカル
シン分子に対して特異的なポリクローナル血清である。
【００１８】また上記の抗体は、低カルボキシル化オス
テオカルシンに特有のエピトープのいずれか一つを認識
するモノクローナルでもよい。これらモノクローナル抗
体の混液も使用することができる。本発明によれば、低
カルボキシル化オステオカルシン分子のアミノ酸１７〜
２４の領域に存在するエピトープを認識する抗体を使用
することが特に好ましい。
テオカルシンに特有のエピトープのいずれか一つを認識
するモノクローナルでもよい。これらモノクローナル抗
体の混液も使用することができる。本発明によれば、低
カルボキシル化オステオカルシン分子のアミノ酸１７〜
２４の領域に存在するエピトープを認識する抗体を使用
することが特に好ましい。
【００１９】特に有利な他のタイプの抗体は、オステオ
カルシンのγ−カルボキシル化状態に関連する三次構造
を認識する高次構造の抗体である。実際にDELMASらは
（Biochemistry、２３巻、４７２０〜４７２５頁、１９
８４年）、γ−カルボキシル化の程度とカルシウムが存
在するかまたは存在しないかによってオステオカルシン
の高次構造が大きく変化することを示した。この種の高
次構造の抗体の例は、DELMASらの１９８４年の上記論文
に記載された抗体（ Serum Ｒ１０２）であり、そのオ
ステオカルシンへの結合性は、オステオカルシンが充分
にカルボキシル化されている場合はカルシウム依存性で
あるが、オステオカルシンがγ−カルボキシル化されて
いない場合はカルシウム依存性ではない。
カルシンのγ−カルボキシル化状態に関連する三次構造
を認識する高次構造の抗体である。実際にDELMASらは
（Biochemistry、２３巻、４７２０〜４７２５頁、１９
８４年）、γ−カルボキシル化の程度とカルシウムが存
在するかまたは存在しないかによってオステオカルシン
の高次構造が大きく変化することを示した。この種の高
次構造の抗体の例は、DELMASらの１９８４年の上記論文
に記載された抗体（ Serum Ｒ１０２）であり、そのオ
ステオカルシンへの結合性は、オステオカルシンが充分
にカルボキシル化されている場合はカルシウム依存性で
あるが、オステオカルシンがγ−カルボキシル化されて
いない場合はカルシウム依存性ではない。
【００２０】本発明の方法では、低カルボキシル化され
たオステオカルシンに対する特異性が保持されているな
らば、抗体のフラグメントを用いることもできる。この
ようなフラグメントの例としては、Fab ，F(ab′)2， F
ab′もしくはFacbのフラグメントである。特に重要なの
はFab フラグメントとF(ab′)2フラグメントである。こ
れらのフラグメントはそれぞれ、全抗体のパパインによ
る消化作用とペプシンによる消化作用により調製され
る。
たオステオカルシンに対する特異性が保持されているな
らば、抗体のフラグメントを用いることもできる。この
ようなフラグメントの例としては、Fab ，F(ab′)2， F
ab′もしくはFacbのフラグメントである。特に重要なの
はFab フラグメントとF(ab′)2フラグメントである。こ
れらのフラグメントはそれぞれ、全抗体のパパインによ
る消化作用とペプシンによる消化作用により調製され
る。
【００２１】特異的な抗体を製造するのに使用する抗原
としては、MERLE ら、Bone and Mineral、１１巻、２
０７〜２４５頁、１９９０年に記載された方法のような
熱的もしくは化学的方法によって部分的もしくは全体的
に脱カルボキシル化されたヒト、ヒツジもしくはウシの
オステオカルシンが挙げられる。ウシとヒツジのオステ
オカルシンはそれぞれ、アミノ酸２０〜４９とアミノ酸
１２〜４９がヒトのオステオカルシンと相同である。生
体中にもともと存在しているかまたはワルファリンによ
る治療で生じた標準のヒト、ヒツジもしくはウシの低カ
ルボキシル化オステオカルシンも使用できる。しかしヒ
トのオステオカルシンは非常に不安定で精製が難しい。
それ故に、抗体を製造できるように充分な量のヒトの低
カルボキシル化オステオカルシンを単離することは面倒
である。この問題を克服するには、例えば大腸菌（E. c
oli ）内で発現した組換え低カルボキシル化オステオカ
ルシンを用いることが特に好ましい。実際に、組換えuc
OCはＧＬＡを含有せず、かつ大量に製造することができ
る。
としては、MERLE ら、Bone and Mineral、１１巻、２
０７〜２４５頁、１９９０年に記載された方法のような
熱的もしくは化学的方法によって部分的もしくは全体的
に脱カルボキシル化されたヒト、ヒツジもしくはウシの
オステオカルシンが挙げられる。ウシとヒツジのオステ
オカルシンはそれぞれ、アミノ酸２０〜４９とアミノ酸
１２〜４９がヒトのオステオカルシンと相同である。生
体中にもともと存在しているかまたはワルファリンによ
る治療で生じた標準のヒト、ヒツジもしくはウシの低カ
ルボキシル化オステオカルシンも使用できる。しかしヒ
トのオステオカルシンは非常に不安定で精製が難しい。
それ故に、抗体を製造できるように充分な量のヒトの低
カルボキシル化オステオカルシンを単離することは面倒
である。この問題を克服するには、例えば大腸菌（E. c
oli ）内で発現した組換え低カルボキシル化オステオカ
ルシンを用いることが特に好ましい。実際に、組換えuc
OCはＧＬＡを含有せず、かつ大量に製造することができ
る。
【００２２】合成の低カルボキシル化オステオカルシン
も抗原として用いることができ、およびそのフラグメン
トが低カルボキシル化オステオカルシンに特有のエピト
ープをもっているかまたは低カルボキシル化分子の三次
構造の少なくとも一部を示す場合、ucOCのフラグメント
に対応する合成ペプチドも同様に抗原として使用でき
る。特に好ましいフラグメントは、アミノ酸１７〜２４
を含むフラグメントである。一般に、このフラグメント
は少なくとも八つのアミノ酸、例えば１０〜２０のアミ
ノ酸を含有している。合成のオステオカルシンもしくは
そのフラグメントは、０，１もしくは２のＧＬＡ残基を
有する分子を所望どおりに合成できる限り特に有利であ
る。この合成が可能であれば低カルボキシル化の異なる
程度を特異的に認識する抗体を製造することができる。
１７位にＧＬＡ基がないフラグメントは、抗体を生成さ
せるのに特に好ましい。また抗体を生成させるのに抗原
として用いる低カルボキシル化オステオカルシンのフラ
グメントは、全低カルボキシル化オステオカルシン分子
の開裂反応によって製造することができる。例えば酸に
よる開裂反応でアミノ酸１５〜４８で構成されたフラグ
メントが得られ、またはトリプシンによる開裂反応によ
りアミノ酸２１〜４２のフラグメントがまたはＶ８−プ
ロテアーゼによる消化反応でアミノ酸８〜３１のフラグ
メントが得られる。
も抗原として用いることができ、およびそのフラグメン
トが低カルボキシル化オステオカルシンに特有のエピト
ープをもっているかまたは低カルボキシル化分子の三次
構造の少なくとも一部を示す場合、ucOCのフラグメント
に対応する合成ペプチドも同様に抗原として使用でき
る。特に好ましいフラグメントは、アミノ酸１７〜２４
を含むフラグメントである。一般に、このフラグメント
は少なくとも八つのアミノ酸、例えば１０〜２０のアミ
ノ酸を含有している。合成のオステオカルシンもしくは
そのフラグメントは、０，１もしくは２のＧＬＡ残基を
有する分子を所望どおりに合成できる限り特に有利であ
る。この合成が可能であれば低カルボキシル化の異なる
程度を特異的に認識する抗体を製造することができる。
１７位にＧＬＡ基がないフラグメントは、抗体を生成さ
せるのに特に好ましい。また抗体を生成させるのに抗原
として用いる低カルボキシル化オステオカルシンのフラ
グメントは、全低カルボキシル化オステオカルシン分子
の開裂反応によって製造することができる。例えば酸に
よる開裂反応でアミノ酸１５〜４８で構成されたフラグ
メントが得られ、またはトリプシンによる開裂反応によ
りアミノ酸２１〜４２のフラグメントがまたはＶ８−プ
ロテアーゼによる消化反応でアミノ酸８〜３１のフラグ
メントが得られる。
【００２３】本発明のポリクローナル抗体とモノクロー
ナル抗体は、上記の免疫原を用いて通常の方法によって
製造される。低カルボキシル化オステオカルシンに対す
るこれら抗体の特異性は、産生された抗体を、カルボキ
シル化オステオカルシンと低カルボキシル化オステオカ
ルシンおよび合成ペプチドの両方を用いてCa2+の存在下
および非存在下でスクリーニングし、次に、非カルボキ
シル化形と比較してのカルボキシル化形との交差反応性
がはるかに少ないかまたは全く交差反応性を示さない抗
体を選択することによって保証される。０，１もしくは
２のＧＬＡ分子を有するオステオカルシン分子に対する
特異性を有する抗体は、その特異性が求められている分
子とカルボキシ基の数が異なる分子と、抗体を接触させ
ることによって選択することができる。
ナル抗体は、上記の免疫原を用いて通常の方法によって
製造される。低カルボキシル化オステオカルシンに対す
るこれら抗体の特異性は、産生された抗体を、カルボキ
シル化オステオカルシンと低カルボキシル化オステオカ
ルシンおよび合成ペプチドの両方を用いてCa2+の存在下
および非存在下でスクリーニングし、次に、非カルボキ
シル化形と比較してのカルボキシル化形との交差反応性
がはるかに少ないかまたは全く交差反応性を示さない抗
体を選択することによって保証される。０，１もしくは
２のＧＬＡ分子を有するオステオカルシン分子に対する
特異性を有する抗体は、その特異性が求められている分
子とカルボキシ基の数が異なる分子と、抗体を接触させ
ることによって選択することができる。
【００２４】血清中に一般に存在する非カルボキシル化
オステオカルシンの濃度、例えば０．５ng／mlの正確な
検出を確実に行うには、選択された抗体の感度を確認す
ることが有利である。
オステオカルシンの濃度、例えば０．５ng／mlの正確な
検出を確実に行うには、選択された抗体の感度を確認す
ることが有利である。
【００２５】本発明の方法によれば、低カルボキシル化
オステオカルシンの濃度は、絶対値かまたは全循環オス
テオカルシンの百分率として算出することができる。両
方のパラメータはともに骨折の危険性のマーカーである
が、絶対値が特に好ましい。全循環オステオカルシンの
百分率として算出する場合、全濃度は、カルボキシル化
分子と非カルボキシル化分子に対して等しい親和性を有
する先に述べたような抗体を用いて測定することができ
る。あるいは、全濃度は、DELMASらが報告したような抗
体（Biochemistry、２３巻、４７２０〜４７２５頁、１
９８４年）を用いて測定することができる。二価の金属
イオンが存在していなければこのような抗体は低カルボ
キシル化形のオステオカルシンに対して特異的である。
カルシウムもしくはマグネシウムのような金属のイオン
を添加すると、その抗体はカルボキシル化形オステオカ
ルシンも認識できるようになる。この最後の方法を用い
て、低カルボキシル化オステオカルシンと全オステオカ
ルシンの両方を迅速かつ便利に測定できる。というのは
同じ抗体が各々の測定の役割を果たすからである。
オステオカルシンの濃度は、絶対値かまたは全循環オス
テオカルシンの百分率として算出することができる。両
方のパラメータはともに骨折の危険性のマーカーである
が、絶対値が特に好ましい。全循環オステオカルシンの
百分率として算出する場合、全濃度は、カルボキシル化
分子と非カルボキシル化分子に対して等しい親和性を有
する先に述べたような抗体を用いて測定することができ
る。あるいは、全濃度は、DELMASらが報告したような抗
体（Biochemistry、２３巻、４７２０〜４７２５頁、１
９８４年）を用いて測定することができる。二価の金属
イオンが存在していなければこのような抗体は低カルボ
キシル化形のオステオカルシンに対して特異的である。
カルシウムもしくはマグネシウムのような金属のイオン
を添加すると、その抗体はカルボキシル化形オステオカ
ルシンも認識できるようになる。この最後の方法を用い
て、低カルボキシル化オステオカルシンと全オステオカ
ルシンの両方を迅速かつ便利に測定できる。というのは
同じ抗体が各々の測定の役割を果たすからである。
【００２６】本発明の方法によれば、生体液試料は、血
清、血漿、尿もしくは血液である。血清が特に好まし
い。生体液の試料は、容積を、約１０〜約２５０μl 例
えば約５０〜１００μl の範囲で変えることができる。
清、血漿、尿もしくは血液である。血清が特に好まし
い。生体液の試料は、容積を、約１０〜約２５０μl 例
えば約５０〜１００μl の範囲で変えることができる。
【００２７】試料を採取される患者は、ビタミンＫアン
タゴニストを使用して抗凝血薬による治療を受けていて
はならない。というのは、このような医薬は循環非カル
ボキシル化オステオカルシンの濃度を増大させるので試
験結果をゆがめてしまうからである。普通、患者は閉経
後の女性であるが、高齢の男性の前記危険性の検査も重
要である。
タゴニストを使用して抗凝血薬による治療を受けていて
はならない。というのは、このような医薬は循環非カル
ボキシル化オステオカルシンの濃度を増大させるので試
験結果をゆがめてしまうからである。普通、患者は閉経
後の女性であるが、高齢の男性の前記危険性の検査も重
要である。
【００２８】本発明の方法を実施する際には、特異的な
抗体を生体液試料と接触させるが、その反応条件は、低
カルボキシル化オステオカルシンの定量検出が可能な条
件である。試料中の濃度が測定されたならば、その濃度
は、若年者の正常範囲の上限を示すくらいの低カルボキ
シル化オステオカルシンを含有する対照試料の濃度と比
較される。正常範囲の上限は、非カルボキシル化オステ
オカルシンの濃度の平均値＋２×標準偏差（平均値＋２
ＳＤ）として定義される。この値は、例えば３１±７歳
の閉経前の健康な一群の女性について、試験に利用する
のと同じ実験条件と試薬を用いて決定される。閉経前の
女性の群は通常、少なくとも２０名の女性で構成されて
いなければならない。またこれらの女性は、骨の代謝疾
患の病歴がなく健康でなければならず、および骨の代謝
に影響を与えることが知られている薬剤もしくはビタミ
ンＫアンタゴニストタイプの抗凝血剤を服用していては
ならない。正常濃度の上限の正確な値は、実験条件と使
用される試薬、例えば抗体によって変化する。いまま
で、ヒドロキシアパタイト結合法を用いて、低カルボキ
シル化オステオカルシンの正常な範囲の上限を平均値＋
２×標準偏差として計算してきたが、約１．６５ng／ml
（全体の１６．７％）である。この限度は、間接的で相
対的な値を与える上記の方法を用いた場合の正常範囲の
上限を示すということを強調するものである。
抗体を生体液試料と接触させるが、その反応条件は、低
カルボキシル化オステオカルシンの定量検出が可能な条
件である。試料中の濃度が測定されたならば、その濃度
は、若年者の正常範囲の上限を示すくらいの低カルボキ
シル化オステオカルシンを含有する対照試料の濃度と比
較される。正常範囲の上限は、非カルボキシル化オステ
オカルシンの濃度の平均値＋２×標準偏差（平均値＋２
ＳＤ）として定義される。この値は、例えば３１±７歳
の閉経前の健康な一群の女性について、試験に利用する
のと同じ実験条件と試薬を用いて決定される。閉経前の
女性の群は通常、少なくとも２０名の女性で構成されて
いなければならない。またこれらの女性は、骨の代謝疾
患の病歴がなく健康でなければならず、および骨の代謝
に影響を与えることが知られている薬剤もしくはビタミ
ンＫアンタゴニストタイプの抗凝血剤を服用していては
ならない。正常濃度の上限の正確な値は、実験条件と使
用される試薬、例えば抗体によって変化する。いまま
で、ヒドロキシアパタイト結合法を用いて、低カルボキ
シル化オステオカルシンの正常な範囲の上限を平均値＋
２×標準偏差として計算してきたが、約１．６５ng／ml
（全体の１６．７％）である。この限度は、間接的で相
対的な値を与える上記の方法を用いた場合の正常範囲の
上限を示すということを強調するものである。
【００２９】本発明者らは、骨粗しょう症を検査するた
め高年齢の女性群を試験したところ、ほとんどの被検者
が、若い対照者にみられる平均値より高いncOC濃度を示
す（例えば０．６５ng／mlより大きい）ことを見出した
のである。しかしいくらかの被検者は、前記上限より高
い濃度を示す（例えば１．６５ng／mlより高い）。これ
ら後者の被検者は、骨折の危険性が大きく増大している
被検者である。骨折の危険性は上記濃度が上記濃度範囲
を越えて増大するにつれて増大する。
め高年齢の女性群を試験したところ、ほとんどの被検者
が、若い対照者にみられる平均値より高いncOC濃度を示
す（例えば０．６５ng／mlより大きい）ことを見出した
のである。しかしいくらかの被検者は、前記上限より高
い濃度を示す（例えば１．６５ng／mlより高い）。これ
ら後者の被検者は、骨折の危険性が大きく増大している
被検者である。骨折の危険性は上記濃度が上記濃度範囲
を越えて増大するにつれて増大する。
【００３０】抗原／抗体反応の検出は通常の検出法を用
いて実施することができる。検出手段として、例えば
125Ｉを用いて放射能標識をつけた非カルボキシル化オ
ステオカルシンによる競合放射線免疫検定法を利用する
ことが特に好ましい。この実施態様によれば、特異的な
抗体を固相に結合させ、試料（標識をつけていない）と
標識をつけた非カルボキシル化オステオカルシンの混合
物を添加する。その標識をつけた抗原と標識をつけてい
ない抗原が、抗体の結合部位に対して、互いに競合す
る。存在する試験抗原の量が多ければ多いほど、抗体に
結合する標識付き抗原の量が少なくなる。既知量の標識
なしの抗原を用いて標準曲線を作成する。
いて実施することができる。検出手段として、例えば
125Ｉを用いて放射能標識をつけた非カルボキシル化オ
ステオカルシンによる競合放射線免疫検定法を利用する
ことが特に好ましい。この実施態様によれば、特異的な
抗体を固相に結合させ、試料（標識をつけていない）と
標識をつけた非カルボキシル化オステオカルシンの混合
物を添加する。その標識をつけた抗原と標識をつけてい
ない抗原が、抗体の結合部位に対して、互いに競合す
る。存在する試験抗原の量が多ければ多いほど、抗体に
結合する標識付き抗原の量が少なくなる。既知量の標識
なしの抗原を用いて標準曲線を作成する。
【００３１】別の検出法は、酵素の標識を付けた非カル
ボキシル化オステオカルシンを用いる競合酵素免疫測定
法である。適切な酵素標識は、TANAKAら、Journal of
Immunological Methods 、１９２４〜１９８６頁、１
９８４年に記載されている。
ボキシル化オステオカルシンを用いる競合酵素免疫測定
法である。適切な酵素標識は、TANAKAら、Journal of
Immunological Methods 、１９２４〜１９８６頁、１
９８４年に記載されている。
【００３２】その他の可能性がある方法は、低カルボキ
シル化オステオカルシン分子の二つの異なる部位に結合
する二つのモノクローナル抗体が選択されるサンドイッ
チ酵素免疫測定法である。これらの抗体のなかの一方は
“捕獲”抗体であり、固体の支持体に固定化するのが好
ましく、もうひとつの抗体は“検出”抗体である。この
検出抗体には酵素の標識を付けるか、または例えば 125
Ｉを用いて放射能標識をつけてもよい。
シル化オステオカルシン分子の二つの異なる部位に結合
する二つのモノクローナル抗体が選択されるサンドイッ
チ酵素免疫測定法である。これらの抗体のなかの一方は
“捕獲”抗体であり、固体の支持体に固定化するのが好
ましく、もうひとつの抗体は“検出”抗体である。この
検出抗体には酵素の標識を付けるか、または例えば 125
Ｉを用いて放射能標識をつけてもよい。
【００３３】本発明の検定法の感度は、少なくとも０．
２ng／mlが好ましい。
２ng／mlが好ましい。
【００３４】骨ぜい弱性の危険が増大して骨粗しょう症
の徴候が診断されたならば、骨減損の速度を下げかつ骨
折の危険性を減らすことができる適切な治療介護法を適
用することができる。
の徴候が診断されたならば、骨減損の速度を下げかつ骨
折の危険性を減らすことができる適切な治療介護法を適
用することができる。
【００３５】本発明者らは、非カルボキシル化オステオ
カルシンの濃度が高い被検者にビタミンＤを投与する
と、その濃度を少し正常化させる作用があることを実証
した。また本発明者らは、非カルボキシル化オステオカ
ルシンの濃度が高齢者のビタミンＤ欠乏症のマーカーで
あることをも示した。実際にビタミンＤ欠乏症は、骨粗
しょう症のよく知られている危険因子である。それ故に
本発明の試験法は、骨粗しょう症骨折の危険性とビタミ
ンＤの状態を同時に検査することができる。
カルシンの濃度が高い被検者にビタミンＤを投与する
と、その濃度を少し正常化させる作用があることを実証
した。また本発明者らは、非カルボキシル化オステオカ
ルシンの濃度が高齢者のビタミンＤ欠乏症のマーカーで
あることをも示した。実際にビタミンＤ欠乏症は、骨粗
しょう症のよく知られている危険因子である。それ故に
本発明の試験法は、骨粗しょう症骨折の危険性とビタミ
ンＤの状態を同時に検査することができる。
【００３６】本発明はさらに、血清、血漿もしくは尿の
ような生体液試料中の低カルボキシル化オステオカルシ
ンの濃度を測定する手段、および必要な検出手段、とか
らなる循環している低カルボキシル化オステオカルシン
を定量測定することによって、骨のぜい弱性と骨折の危
険性を検査するのに用いるキットに関する。
ような生体液試料中の低カルボキシル化オステオカルシ
ンの濃度を測定する手段、および必要な検出手段、とか
らなる循環している低カルボキシル化オステオカルシン
を定量測定することによって、骨のぜい弱性と骨折の危
険性を検査するのに用いるキットに関する。
【００３７】本発明のキットには、好ましくは、ucOCの
濃度を測定する手段としての、低カルボキシル化オステ
オカルシンに対して特異的な少なくとも一つの、モノク
ローナル抗体もしくはポリクローナル抗体もしくはその
フラグメントおよび抗原−抗体反応を検出する手段およ
び任意にCa2+のような二価の金属イオンが入っている。
濃度を測定する手段としての、低カルボキシル化オステ
オカルシンに対して特異的な少なくとも一つの、モノク
ローナル抗体もしくはポリクローナル抗体もしくはその
フラグメントおよび抗原−抗体反応を検出する手段およ
び任意にCa2+のような二価の金属イオンが入っている。
【００３８】本発明のキットに入っている抗体と検出手
段は、上記のとおりである。抗体は、膜、容器の器壁も
しくはミクロスフェアのような固体支持体に固定化する
ことが好ましい。
段は、上記のとおりである。抗体は、膜、容器の器壁も
しくはミクロスフェアのような固体支持体に固定化する
ことが好ましい。
【００３９】本発明のキットにはさらに、例えばCa2+の
ような二価の金属イオンを例えば塩化カルシウムの形態
で入っていてもよい。カルシウムを入れておくと抗体が
高次構造のものであるとき有利である。
ような二価の金属イオンを例えば塩化カルシウムの形態
で入っていてもよい。カルシウムを入れておくと抗体が
高次構造のものであるとき有利である。
【００４０】キットにはさらに、測定される試料を、検
定法によって規定されたカットオフ値と、測定される試
料を比較できるように、既知濃度の低カルボキシル化オ
ステオカルシンを含有する一つ以上の対照試料を入れて
もよい。このカットオフ値（正常範囲の上限値）は上記
のようにして定義される。
定法によって規定されたカットオフ値と、測定される試
料を比較できるように、既知濃度の低カルボキシル化オ
ステオカルシンを含有する一つ以上の対照試料を入れて
もよい。このカットオフ値（正常範囲の上限値）は上記
のようにして定義される。
【００４１】また本発明は、本発明の定量測定法の実施
に使用するのに適した上記のモノクローナル抗体とポリ
クローナル抗体に関する。これらの抗体は、金属イオン
の存在のような反応条件のいかんにかかわらず、カルボ
キシル化オステオカルシンとの交差反応性が小さい方が
好ましい。これらの抗体の感度は、約０．５ng／mlおよ
び好ましくは０．２ng／mlの濃度の非カルボキシル化オ
ステオカルシンを検出可能な感度である。
に使用するのに適した上記のモノクローナル抗体とポリ
クローナル抗体に関する。これらの抗体は、金属イオン
の存在のような反応条件のいかんにかかわらず、カルボ
キシル化オステオカルシンとの交差反応性が小さい方が
好ましい。これらの抗体の感度は、約０．５ng／mlおよ
び好ましくは０．２ng／mlの濃度の非カルボキシル化オ
ステオカルシンを検出可能な感度である。
【００４２】
I. 生体試料中の、股関節骨折（hip fracture ）がひ
き続き起こる危険性との相関性を有するカルボキシル化
オステオカルシン（carbOC）と非カルボキシル化オステ
オカルシン（ncOC）などの骨代謝のパラメータの測定
き続き起こる危険性との相関性を有するカルボキシル化
オステオカルシン（carbOC）と非カルボキシル化オステ
オカルシン（ncOC）などの骨代謝のパラメータの測定
【００４３】施設に収容されている１９５名の高齢者の
女性（７０〜１０１歳）の血清について、全OC、ncOC、
カルシウム、リン酸塩、パラトルモン（ＰＴＨ）、２５
−ヒドロキシビタミンＤ（２５ OHD）、アルカリホスフ
ァターゼおよびクレアチニンを測定した。重篤な内科症
状のある女性は、骨代謝に影響を与える医薬、すなわち
ビタミンＤおよび／またはカルシウム（１年以上）、フ
ッ化ナトリウム（３カ月以上）およびワルファリン同族
体（漸増中）を投与中の女性とともに試験から除外し
た。
女性（７０〜１０１歳）の血清について、全OC、ncOC、
カルシウム、リン酸塩、パラトルモン（ＰＴＨ）、２５
−ヒドロキシビタミンＤ（２５ OHD）、アルカリホスフ
ァターゼおよびクレアチニンを測定した。重篤な内科症
状のある女性は、骨代謝に影響を与える医薬、すなわち
ビタミンＤおよび／またはカルシウム（１年以上）、フ
ッ化ナトリウム（３カ月以上）およびワルファリン同族
体（漸増中）を投与中の女性とともに試験から除外し
た。
【００４４】オステオカルシンの濃度は、ncOCとcarbOC
に対して同じ親和性を有するウサギポリクローナル抗血
清（AS １４０）を使用し、さきに記載した放射線免疫
検定法／ヒドロキシアパタイト法（Merle ，B.ら、Bone
Miner.、１１巻、２３７〜２４５頁、１９９０年）で
測定した。ヒドロキシアパタイトと結合したOCが、ヒツ
ジ抗ウサギIgG 抗血清とポリエチレングリコール（フラ
ンス、PR CIS BIOIndustrie 社）の混合物によって沈
澱し、さらに遠心分離した。得られた沈澱を、検定用緩
衝液で洗浄し再び遠心分離を行った。この検定法の感度
は０．２ng／mlである。carbOCとncOCのヒドロキシアパ
タイトに対する親和性が異なることに基づいてncOCを測
定する方法が、Merle ，B.らの前記文献に記載されてい
る。簡単に述べれば次のとおりである。２５０μl の試
料を５mgと１０mgのヒドロキシアパタイト（リン酸カル
シウム三塩酸IV、Sigma Chemicals社）とともにエッペ
ンドルフ管中でインキュベートし、転倒混和させながら
＋４℃で１時間混合し、次いで遠心分離した。上記の量
のヒドロキシアパタイトが２５０μl の血清中に存在し
ているcarbOCとncOCの結合能力において最高に識別性を
示す。ncOCの濃度は両者の上澄み液（５mgおよび１０mg
のヒドロキシアパタイトによる）中に測定された濃度の
平均値として算出した。またncOCの濃度は全OC濃度の百
分率（ncOC％）としても示した。carbOCの濃度は全OCと
ncOCの差として算出した。
に対して同じ親和性を有するウサギポリクローナル抗血
清（AS １４０）を使用し、さきに記載した放射線免疫
検定法／ヒドロキシアパタイト法（Merle ，B.ら、Bone
Miner.、１１巻、２３７〜２４５頁、１９９０年）で
測定した。ヒドロキシアパタイトと結合したOCが、ヒツ
ジ抗ウサギIgG 抗血清とポリエチレングリコール（フラ
ンス、PR CIS BIOIndustrie 社）の混合物によって沈
澱し、さらに遠心分離した。得られた沈澱を、検定用緩
衝液で洗浄し再び遠心分離を行った。この検定法の感度
は０．２ng／mlである。carbOCとncOCのヒドロキシアパ
タイトに対する親和性が異なることに基づいてncOCを測
定する方法が、Merle ，B.らの前記文献に記載されてい
る。簡単に述べれば次のとおりである。２５０μl の試
料を５mgと１０mgのヒドロキシアパタイト（リン酸カル
シウム三塩酸IV、Sigma Chemicals社）とともにエッペ
ンドルフ管中でインキュベートし、転倒混和させながら
＋４℃で１時間混合し、次いで遠心分離した。上記の量
のヒドロキシアパタイトが２５０μl の血清中に存在し
ているcarbOCとncOCの結合能力において最高に識別性を
示す。ncOCの濃度は両者の上澄み液（５mgおよび１０mg
のヒドロキシアパタイトによる）中に測定された濃度の
平均値として算出した。またncOCの濃度は全OC濃度の百
分率（ncOC％）としても示した。carbOCの濃度は全OCと
ncOCの差として算出した。
【００４５】OCとその画分の正常範囲の上限値は、２１
名の閉経前の健康な２１〜４４歳の女性について平均値
±２ＳＤ（標準偏差）として算出した。この測定法につ
いてのこれらの限界値は、全OCは１３．９ng／ml、carb
OCは１２．５ng／mlおよびncOCは１．６５ng／ml（全体
の１６．７％）である。
名の閉経前の健康な２１〜４４歳の女性について平均値
±２ＳＤ（標準偏差）として算出した。この測定法につ
いてのこれらの限界値は、全OCは１３．９ng／ml、carb
OCは１２．５ng／mlおよびncOCは１．６５ng／ml（全体
の１６．７％）である。
【００４６】カルシウム、無機リン、全タンパク質およ
びクレアチニンの血清中濃度を通常の方法を用いて測定
した。完全分子（intact）パラトルモン（ＰＴＨ）の濃
度をMagic Lite Intact PTH Immunoassay （CIBA
CORNING 社）を用いて測定した。２５ OHDの濃度はキッ
ト（スイス、Buehlmann Laboratories AG 社）を用い
て測定した。アルカリホスファターゼの活性はBoehring
er Mannheim社製自動分析機を用いて測定した。
びクレアチニンの血清中濃度を通常の方法を用いて測定
した。完全分子（intact）パラトルモン（ＰＴＨ）の濃
度をMagic Lite Intact PTH Immunoassay （CIBA
CORNING 社）を用いて測定した。２５ OHDの濃度はキッ
ト（スイス、Buehlmann Laboratories AG 社）を用い
て測定した。アルカリホスファターゼの活性はBoehring
er Mannheim社製自動分析機を用いて測定した。
【００４７】血清中のncOCは、若年の対照者（０．６５
±０．１１ng／ml）に比べて、高年齢の女性の場合
（１．１８±０．１２ng／ml）増大していることが見出
された（ｐ＜０．０１）。４５名の女性（２３．１％）
の血清中ncOCは、若年女性の正常範囲の上限を越えた
（すなわち＞１．６５ng／ml）。ncOCは、年齢、ＰＴＨ
および部分的相関関係（ｒ＝−０．２４、ｐ＜０．００
２）をもつクレアチニンの効果を除外しても、２５ OHD
と負の相関関係があった（ｒ＝−０．３２、ｐ＜０．０
０１）。上記の最後の測定結果は、ncOC濃度が高いほど
ビタミンＤの濃度が低いということを意味し特に重要で
ある。それ故に、ncOC濃度は、高齢者のビタミンＤ欠乏
症すなわち骨粗しょう症のよく認識されている危険因子
のマーカーである。
±０．１１ng／ml）に比べて、高年齢の女性の場合
（１．１８±０．１２ng／ml）増大していることが見出
された（ｐ＜０．０１）。４５名の女性（２３．１％）
の血清中ncOCは、若年女性の正常範囲の上限を越えた
（すなわち＞１．６５ng／ml）。ncOCは、年齢、ＰＴＨ
および部分的相関関係（ｒ＝−０．２４、ｐ＜０．００
２）をもつクレアチニンの効果を除外しても、２５ OHD
と負の相関関係があった（ｒ＝−０．３２、ｐ＜０．０
０１）。上記の最後の測定結果は、ncOC濃度が高いほど
ビタミンＤの濃度が低いということを意味し特に重要で
ある。それ故に、ncOC濃度は、高齢者のビタミンＤ欠乏
症すなわち骨粗しょう症のよく認識されている危険因子
のマーカーである。
【００４８】これらの女性は、その後１８カ月間追跡調
査され、医療状況、治療および骨折の発生を６カ月毎に
記録した。股関節骨折の発生に対するCaとビタミンＤの
作用についての予測的試験の一部として、これらの女性
から無作為に抽出して、Ca（１．２ｇ／ｄ）とビタミン
Ｄ（８００Ｕ／ｄ）または二重プラセボを投与した。１
８カ月の追跡期間中１５名の女性が股関節骨折した。こ
れら患者の基本的な生化学測定値を骨折しなかった１８
０名と比較した。試験結果を表Ｉに要約する。
査され、医療状況、治療および骨折の発生を６カ月毎に
記録した。股関節骨折の発生に対するCaとビタミンＤの
作用についての予測的試験の一部として、これらの女性
から無作為に抽出して、Ca（１．２ｇ／ｄ）とビタミン
Ｄ（８００Ｕ／ｄ）または二重プラセボを投与した。１
８カ月の追跡期間中１５名の女性が股関節骨折した。こ
れら患者の基本的な生化学測定値を骨折しなかった１８
０名と比較した。試験結果を表Ｉに要約する。
【００４９】 ＮＳ＝有意差なし表Ｉ：股関節骨折を受けた女性と骨折をしなかったグル
ープの女性とのncOC、carbOC、全OCおよび一般的なカル
シウム代謝パラメータの比較
ープの女性とのncOC、carbOC、全OCおよび一般的なカル
シウム代謝パラメータの比較
【００５０】これらの結果は、ncOCが、その後に股関節
骨折を受けた女性の方が骨折をしなかったグループより
高いことを示し、アルカリホスファターゼ、ＰＴＨ、２
５ OHD、全OCおよびカルボキシル化OCならびに血清中の
カルシウム、リン酸塩およびクレアチニンのような他の
パラメータについては有意差がないということと対照的
である。股関節骨折の危険性は、疾患と、股関節骨折の
危険性に対して影響があることが分かっている医薬とに
ついての、治療グループに対する治療（Ca＋ビタミンＤ
／プラセボ）に対して適応したOdds Ratio （O. R. ，
Mantel−Haenszel法によって計算）を用いて評価した。
股関節骨折の危険性は、ncOC濃度が高い（＞１．６５ng
／ml）女性（O. R. ７．１、９９．９％CI １．１〜４
６．３、ｐ＜０．００１）およびncOC％が高い（＞１
６．７％）女性（O. R. ＝３．９，９５％CI １．４〜
１１．３，ｐ＜０．０５）について増大していた。換言
すれば、絶対値または全OCの百分率で表した正常範囲の
上限を越えるncOC濃度の女性は、ncOC濃度が上記上限よ
り低い女性より、７倍以上その後に股関節骨折を起こし
易かった。
骨折を受けた女性の方が骨折をしなかったグループより
高いことを示し、アルカリホスファターゼ、ＰＴＨ、２
５ OHD、全OCおよびカルボキシル化OCならびに血清中の
カルシウム、リン酸塩およびクレアチニンのような他の
パラメータについては有意差がないということと対照的
である。股関節骨折の危険性は、疾患と、股関節骨折の
危険性に対して影響があることが分かっている医薬とに
ついての、治療グループに対する治療（Ca＋ビタミンＤ
／プラセボ）に対して適応したOdds Ratio （O. R. ，
Mantel−Haenszel法によって計算）を用いて評価した。
股関節骨折の危険性は、ncOC濃度が高い（＞１．６５ng
／ml）女性（O. R. ７．１、９９．９％CI １．１〜４
６．３、ｐ＜０．００１）およびncOC％が高い（＞１
６．７％）女性（O. R. ＝３．９，９５％CI １．４〜
１１．３，ｐ＜０．０５）について増大していた。換言
すれば、絶対値または全OCの百分率で表した正常範囲の
上限を越えるncOC濃度の女性は、ncOC濃度が上記上限よ
り低い女性より、７倍以上その後に股関節骨折を起こし
易かった。
【００５１】骨折を起こした女性の方が年齢が高かった
わけではない。基本的な生化学的測定値を両グループに
ついて比較したところ、ncOC（ｐ＜０．０１）とncOC％
（ｐ＜０．０１）だけが、その後に股関節骨折を受けた
患者に増大していた。他のパラメータについて有意差は
なかった。
わけではない。基本的な生化学的測定値を両グループに
ついて比較したところ、ncOC（ｐ＜０．０１）とncOC％
（ｐ＜０．０１）だけが、その後に股関節骨折を受けた
患者に増大していた。他のパラメータについて有意差は
なかった。
【００５２】結論として、ncOCとncOC％は、骨折の危険
性を検査する際の予測的測定値を示す唯一のパラメータ
である。通常のカルシウム代謝性パラメータは全く予測
的測定値を有さない。それ故に、血清中ncOCは、ぜい弱
性の増大に伴う骨マトリックスの変化を反映していると
思われる。
性を検査する際の予測的測定値を示す唯一のパラメータ
である。通常のカルシウム代謝性パラメータは全く予測
的測定値を有さない。それ故に、血清中ncOCは、ぜい弱
性の増大に伴う骨マトリックスの変化を反映していると
思われる。
【００５３】股関節骨折の発生に対するCaとビタミンＤ
の効果については、ビタミンＤ／Caによる治療を１年間
行った結果、ucOCは減少し（ｐ＜０．０５）特に、最初
高いucOC値であった患者の場合、プラセボグループのnc
OC値が増大する（ｐ＜０．０５）のと対照的に、ucOC値
が減少する（２．５±０．４１から１．４１±０．２９
ng／mlまで減少、ｐ＜０．００５）ことがみとめられ
た。
の効果については、ビタミンＤ／Caによる治療を１年間
行った結果、ucOCは減少し（ｐ＜０．０５）特に、最初
高いucOC値であった患者の場合、プラセボグループのnc
OC値が増大する（ｐ＜０．０５）のと対照的に、ucOC値
が減少する（２．５±０．４１から１．４１±０．２９
ng／mlまで減少、ｐ＜０．００５）ことがみとめられ
た。
【００５４】ビタミンＫはＧＬＡ含有タンパク質のγ−
カルボキシル化反応に大きな役割を果たすので、ビタミ
ンＫ１と、ビタミンＫ２の主要な循環誘導体であるメナ
キノン−７（ＭＫ−７）とメナキノン−８（ＭＫ−８）
との血清中濃度を股関節骨折を起こした５１名の患者に
ついて測定した。試験結果は、年齢と性別が合致した対
照者と比べて股関節骨折患者では、血清中のＫ１，ＭＫ
−７およびＭＫ−８が減少した（例えばビタミンＫ１：
３３６±３０２pg／ml対５８５±４９０pg／ml，ｐ＜
０．０１）ことを示した。これらのデータは、股関節骨
折を受けた高齢の被検者にはビタミンＫ欠乏症があるこ
とを示している。また循環しているOCの低カルボキシル
化はある程度ビタミンＫ欠乏症に関連しているというこ
とは、少投与量のビタミンＫ１（１mg／日）によってnc
OCの濃度が有意に低下するという事実によっても裏付け
られている（C. Christiansen およびK. Overgaard編、
「Osteoporosis」、１９９０年、３４５〜３４７頁のPl
antalech L.らの論文およびKnapen MHJ ら、Ann. In
t. Med.、１１１巻、１００１頁、１９８９年参照）。
それ故に本発明の試験法によってビタミンＫの状況を検
査することができる。
カルボキシル化反応に大きな役割を果たすので、ビタミ
ンＫ１と、ビタミンＫ２の主要な循環誘導体であるメナ
キノン−７（ＭＫ−７）とメナキノン−８（ＭＫ−８）
との血清中濃度を股関節骨折を起こした５１名の患者に
ついて測定した。試験結果は、年齢と性別が合致した対
照者と比べて股関節骨折患者では、血清中のＫ１，ＭＫ
−７およびＭＫ−８が減少した（例えばビタミンＫ１：
３３６±３０２pg／ml対５８５±４９０pg／ml，ｐ＜
０．０１）ことを示した。これらのデータは、股関節骨
折を受けた高齢の被検者にはビタミンＫ欠乏症があるこ
とを示している。また循環しているOCの低カルボキシル
化はある程度ビタミンＫ欠乏症に関連しているというこ
とは、少投与量のビタミンＫ１（１mg／日）によってnc
OCの濃度が有意に低下するという事実によっても裏付け
られている（C. Christiansen およびK. Overgaard編、
「Osteoporosis」、１９９０年、３４５〜３４７頁のPl
antalech L.らの論文およびKnapen MHJ ら、Ann. In
t. Med.、１１１巻、１００１頁、１９８９年参照）。
それ故に本発明の試験法によってビタミンＫの状況を検
査することができる。
【００５５】II−特異的な抗体を使用してncOCの濃度を
測定することによる骨のぜい弱性の検査
測定することによる骨のぜい弱性の検査
【００５６】充分にカルボキシル化したOCに対する抗血
清を先に記載したようにしてウサギに生成させた（DELM
ASら、J. Clin. Invest.、７１巻、１３１６〜１３２１
頁、１９８３年）。この検定用に選択した抗血清は、そ
の結合のCa2+依存性に基づいて選んだ。類似の血清がDe
lmasら、Biochemistry、２３巻、４７２０〜４７２５
頁、１９８４年に詳細に記載されている。
清を先に記載したようにしてウサギに生成させた（DELM
ASら、J. Clin. Invest.、７１巻、１３１６〜１３２１
頁、１９８３年）。この検定用に選択した抗血清は、そ
の結合のCa2+依存性に基づいて選んだ。類似の血清がDe
lmasら、Biochemistry、２３巻、４７２０〜４７２５
頁、１９８４年に詳細に記載されている。
【００５７】Ca2+またはその外のMg2+のような二価の金
属イオンの存在下では、上記抗血清は、カルボキシル化
OCおよび熱で脱カルボキシル化させたOCと同じ親和性で
結合する。エチレンジアミン四酢酸でCa2+を除去する
と、カルボキシル化OCに結合している抗体はなくなる
が、脱カルボキシル化OCに結合している抗体は維持され
ている。
属イオンの存在下では、上記抗血清は、カルボキシル化
OCおよび熱で脱カルボキシル化させたOCと同じ親和性で
結合する。エチレンジアミン四酢酸でCa2+を除去する
と、カルボキシル化OCに結合している抗体はなくなる
が、脱カルボキシル化OCに結合している抗体は維持され
ている。
【００５８】したがってCa2+が存在しない場合、充分に
カルボキシル化されたOCによって発現されなかったエピ
トープは、Ca2+を添加するかまたは脱カルボキシル化す
ることによって回復された。その上に、円二色性の試験
をしたところ、これらのCa2+−およびＧＬＡ−に依存す
る抗体結合性の変化は、分子の三次構造（見掛けのα−
ヘリックス構造）の変化に関連していることを示した。
結局これらのデータは、分子のカルボキシル化の状態に
依存する、OCの高次構造のエピトープが存在しているこ
とを示唆している。この種の抗体は本発明の検定法に用
いるのに適している。
カルボキシル化されたOCによって発現されなかったエピ
トープは、Ca2+を添加するかまたは脱カルボキシル化す
ることによって回復された。その上に、円二色性の試験
をしたところ、これらのCa2+−およびＧＬＡ−に依存す
る抗体結合性の変化は、分子の三次構造（見掛けのα−
ヘリックス構造）の変化に関連していることを示した。
結局これらのデータは、分子のカルボキシル化の状態に
依存する、OCの高次構造のエピトープが存在しているこ
とを示唆している。この種の抗体は本発明の検定法に用
いるのに適している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (23)
- 【請求項１】 血清、血漿もしくは尿のような生体液試
料中の低カルボキシル化オステオカルシンの濃度を生体
外で測定し、試験試料中の低カルボキシル化オステオカ
ルシンの濃度を、正常範囲の上限を示す濃度の低カルボ
キシル化オステオカルシンを含有する対照試料の濃度と
比較する、ことからなり、この上限を越える濃度が骨折
の危険性が増大していることを示す、ことを特徴とする
骨ぜい弱性と骨粗しょう症骨折の危険性の検査方法。 - 【請求項２】 低カルボキシル化オステオカルシンの濃
度が、少なくとも一つのモノクローナル抗体、もしくは
ポリクローナル抗体、もしくはそのフラグメントによっ
て測定され、該抗体もしくは該フラグメントが低カルボ
キシル化オステオカルシンに対して特異的である請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 低カルボキシル化オステオカルシンの濃
度が、絶対値、もしくは全循環オステオカルシンの百分
率として算出される請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 該抗体が、０，１もしくは２のカルボキ
シ基を有するオステオカルシン分子に対して特異的なポ
リクローナル血清である請求項２記載の方法。 - 【請求項５】 該抗体が、低カルボキシル化オステオカ
ルシンに特有なエピトープのいずれか一つを認識するモ
ノクローナル抗体かまたはかような抗体の混合物である
請求項２記載の方法。 - 【請求項６】 該抗体が、低カルボキシル化オステオカ
ルシン分子のアミノ酸１７〜２４の領域に存在するエピ
トープを認識するか、または低カルボキシル化オステオ
カルシンに関連する三次構造を認識する高次構造の抗体
（ conformational antibody ）である請求項２〜５の
いずれか一つに記載の方法。 - 【請求項７】 該抗体が、低カルボキシル化オステオカ
ルシンに対する特異性がCa2+のような二価の金属イオン
の不在に依存している高次構造の抗体である請求項６記
載の方法。 - 【請求項８】 抗体のフラグメントが、Fab ，F(a
b′)2， Fab′またはFacbのフラグメントである請求項
２〜７のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項９】 特異的な抗体が、天然もしくはワルファ
リンによって誘発されたヒト、ヒツジもしくはウシの低
カルボキシル化オステオカルシン、例えば熱的もしくは
化学的な方法によって脱カルボキシル化された天然のヒ
ト、ヒツジもしくはウシのオステオカルシン、組換え低
カルボキシル化オステオカルシン、合成低カルボキシル
化オステオカルシン、または上記のもののいずれか一つ
のフラグメントに対して生成され；該フラグメントは低
カルボキシル化オステオカルシンに特有なエピトープを
持っている請求項２記載の方法。 - 【請求項１０】 血清、血漿もしくは尿のような生体液
試料中の低カルボキシル化オステオカルシンの濃度を特
異的に測定する手段であって、少なくとも一つのモノク
ローナル抗体、もしくはポリクローナル抗体、もしくは
そのフラグメントからなり、該抗体もしくは該フラグメ
ントが低カルボキシル化オステオカルシンに対して特異
的である手段；抗原抗体反応を検出するのに必要な手
段；任意に、Ca2+のような二価の金属イオン；を含む循
環低カルボキシル化オステオカルシンを定量測定するこ
とによって、骨のぜい弱性と骨折の危険性を検査するの
に用いるキット。 - 【請求項１１】 該抗体が、０，１もしくは２のカルボ
キシ基を有するオステオカルシン分子に対して特異的な
ポリクローナル血清である請求項１０記載のキット。 - 【請求項１２】 該抗体が、低カルボキシル化オステオ
カルシンに特有なエピトープのいずれか一つを認識する
モノクローナル抗体である請求項１０記載のキット。 - 【請求項１３】 該抗体が、低カルボキシル化オステオ
カルシン分子のアミノ酸１７〜２４の領域に存在するエ
ピトープを認識するか、または低カルボキシル化オステ
オカルシンに関連する三次構造を認識する高次構造の抗
体である請求項１０〜１２のいずれか一つに記載のキッ
ト。 - 【請求項１４】 該抗体が、低カルボキシル化オステオ
カルシンに対する特異性がCa2+のような二価の金属イオ
ンの不在に依存している高次構造の抗体である請求項１
３記載のキット。 - 【請求項１５】 抗体のフラグメントが、Fab ，F(a
b′)2， Fab′またはFacbのフラグメントである請求項
１０〜１４のいずれか一つに記載のキット。 - 【請求項１６】 特異的な抗体が、天然のヒトもしくは
ウシの低カルボキシル化オステオカルシン、例えば熱的
もしくは化学的な方法によって脱カルボキシル化された
天然のヒトもしくはウシのオステオカルシン、組換え低
カルボキシル化オステオカルシン、合成低カルボキシル
化オステオカルシン、または上記のもののいずれか一つ
のフラグメントに対して生成され；該フラグメントは低
カルボキシル化オステオカルシンに特有なエピトープを
もっている請求項１０記載のキット。 - 【請求項１７】 検出手段が、放射能標識をつけた非カ
ルボキシル化オステオカルシン、酵素標識を付けた非カ
ルボキシル化オステオカルシン、および非カルボキシル
化オステオカルシンを捕捉するのに使用される抗体によ
って認識されるものとは異なる非カルボキシル化オステ
オカルシンのエピトープを認識する、酵素標識を付けた
抗体からなる群から選択される請求項１０〜１６のいず
れか一つに記載のキット。 - 【請求項１８】 抗体が固体支持体に固定化されている
請求項１０〜１７のいずれか一つに記載のキット。 - 【請求項１９】 請求項１〜９に記載の方法に用いるの
に適し、かつ低カルボキシル化オステオカルシンに対し
て特異的な、モノクローナル抗体もしくはポリクローナ
ル抗体もしくはそのフラグメント。 - 【請求項２０】 ０，１もしくは２のカルボキシ基を有
するオステオカルシンを特異的に認識する請求項１９記
載の抗体もしくはそのフラグメント。 - 【請求項２１】 低カルボキシル化オステオカルシンビ
ンシ分子のアミノ酸１７〜２４の領域に存在するエピト
ープを認識するか、または低カルボキシル化オステオカ
ルシンに関連する三次構造を認識する請求項２０記載の
抗体もしくはそのフラグメント。 - 【請求項２２】 骨のぜい弱性を予報する診断試験に用
いる請求項１９〜２１のいずれか一つに記載の抗体。 - 【請求項２３】 循環低カルボキシル化オステオカルシ
ンの特異的な定量検出法により骨粗しょう症を診断する
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR92400517.6 | 1992-02-27 | ||
| EP92400517A EP0557663B1 (en) | 1992-02-27 | 1992-02-27 | Assessment of bone fragility and prediction of osteoporotic fracture risk using a quantitative determination of circulating under-carboxylated osteocalcin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0678788A true JPH0678788A (ja) | 1994-03-22 |
| JP3053503B2 JP3053503B2 (ja) | 2000-06-19 |
Family
ID=8211618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5062873A Expired - Lifetime JP3053503B2 (ja) | 1992-02-27 | 1993-02-25 | 骨ぜい弱性と骨粗しょう症骨折の危険性の検査方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0557663B1 (ja) |
| JP (1) | JP3053503B2 (ja) |
| AT (1) | ATE152525T1 (ja) |
| DE (1) | DE69219451T2 (ja) |
| ES (1) | ES2103906T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02242696A (ja) * | 1989-03-16 | 1990-09-27 | Takara Shuzo Co Ltd | モノクローナル抗体及びその使用方法 |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0792165A (ja) * | 1993-09-21 | 1995-04-07 | Hoechst Japan Ltd | 骨粗鬆症診断剤 |
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| FI990693A0 (fi) | 1999-03-29 | 1999-03-29 | Kaekoenen Sanna Maria | Menetelmä luunmurtumien ennustamiseksi osteokalsiinimääritysten avulla |
| DE10020880C2 (de) * | 1999-04-28 | 2002-11-28 | Pe Diagnostik Gmbh | Verfahren zur Ermittlung signifikanter Knochendichteverluste |
| DE19919982C2 (de) * | 1999-04-30 | 2001-06-28 | Pe Diagnostik Gmbh | Verfahren zur Ermittlung osteoporotischer Prozesse |
| WO2002057795A2 (en) * | 2001-01-19 | 2002-07-25 | Cambridge Scientific, Inc. | Methods of diagnosis and treatment of osteoporosis |
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0739439B2 (ja) * | 1989-03-16 | 1995-05-01 | 寳酒造株式会社 | モノクローナル抗体及びその使用方法 |
-
1992
- 1992-02-27 EP EP92400517A patent/EP0557663B1/en not_active Expired - Lifetime
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1993
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Non-Patent Citations (2)
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