KR100460292B1 - 체액중의단백질파편검정 - Google Patents

Abstract

골 콜라겐과 같은 체 단백질의 분해는 아스파르트산의 α -카복실산 그룹에 결합되는 펩티드 또는 아스파라긴이 아스파르트산의 측쇄 카복실산 그룹의 아미드 결합으로 이성질화되는 상기 단백질의 이성질화 펩티드 단편을 체액 중에서 검출하여 조사된다. 이성질화 펩티드 시퀀스에 대해 특이적인 항체를 검정에 사용한다.

Description

체액 중의 단백질 파편 검정

본 발명은 콜라겐 또는 다른 단백질 분해 생성물의 검정 및 이것에 유용한 물질에 관한 것이다.

콜라겐 및 콜라겐 대사 질환

골다공증은 인간에게 있어서 가장 흔한 골질환이다. 골절의 감수성 증가에 수반되는 1차 골다공증은 골격 질량의 감소로 인한 것이다. 미국에서만도 15∼20 백만명이 이 질환에 걸려 있는 것으로 추정된다. 이것은 골 개조, 즉 골조직의 형성 및 흡수에 있어서. 연령에 따르는 불평형에 기초를 두고 있다.

미국에서는, 약 1.2 백만명의 골다공증과 관련된 골절 환자가 매년마다 약 538,000명의 척추 압축성 골절, 약 227,000명의 요부골절 및 상당수의 초기에 골절된 주변 골격을 포함하여 중고년층에 발생되고 있다. 요부 골절이 12∼20%이면 치명적인데, 심한 외상 및 출혈을 일으키므로 생존자 중 절반은 개인 병원 치료를 받아야 하기 때문이다. 현재, 골다공증과 관련된 부상에 대한 총지출은 미국에서 해마다 $10억에 달한다(Riggs, New England Journal of Medicine, 327 : 620-627(1992)).

골다공증은 폐경기후 10년내에 골격질량이 평균하여 15% 유실된 폐경기후의 여성들에게 가장 흔하다. 이 질환은 또한 나이가 든 남자 및 젊은 무월경 여성 운동선수에게도 발생된다. 골다공증에 대한 보다 중대하고 증대된 사회적, 경제적 결론에도 불구하고, 환자 또는 건강한 사람의 골 재흡수를 측정하기 위한 신뢰할 만한 검정의 이용가능성은 매우 제한되어 있다. 콜라겐 대사 이상을 수반하는 질환으로는 페제트병, 마르팡증후군, 골형성부전증, 콜라겐 조직의 신생물 성장, 왜소발육증, 류머티스성 관절염, 골관절염 및 맥관염증후군을 들 수 있다. 지금까지 사람의 콜라겐에 대하여는 세가지 클래스(class)가 공지되어 있다. 타입 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, V 및 X Ⅰ로 세분화되는 클래스Ⅰ 콜라겐은 피브릴(fibril)을 형성하는 것으로 알려져 있다. 타입 Ⅰ∼Ⅲ의 아미노산 시퀀스(설명된 정도로)는 WO95/08115호의 부록 A에 나타나 있다.

콜라겐 타입Ⅰ은 골의 유기 매트릭스의 90% 이상을 차지하므로, 원칙적으로 콜라겐 타입Ⅰ의 분해를 모니터함으로써 골 재흡수율을 평가할 수 있다. 마찬가지로, 결합조직에 관련된 다수의 기타 질병 상태는 콜라겐의 분해를 측정함으로써 모니터할 수 있다. 예를 들면, 류머티스성 관절염 및 골관절염과 관련된 콜라겐 타입 Ⅱ 분해 및 맥관염 증후군에서의 콜라겐 타입 Ⅲ 분해반응을 들 수 있다.

사람의 타입Ⅲ 콜라겐, 사람의 프로(pro) α 1(Ⅱ)콜라겐 및 사람의 타입Ⅲ 콜라겐의 전체 프리프로(prepro) α 1(Ⅲ)쇄에 대한 아미노산 시퀀스 및 이들에 대응하는 cDNA 클론은 여러 그룹의 연구원들에 의해 조사되고, 결정되었다(Loil et al., Nucleic Acid Research 12:9383-9394 (1984); Sangiorgi et al., Nucleic Acids Research, 13:2207-2225 (1985) ; Baldwin et al., Biochem J., 262:521-528 (1989) ; and Ala-Kokko et al., Biochem. J., 260:509-516 (1989)).

N-말단 및 C-말단 프로펩티드 시퀀스를 포함하는 타입 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 콜라겐은 모두 코어 콜라겐 분자에 부착되어 있는 프로콜라겐 분자로서 유기체내에 형성되어 있다. 콜라겐 합성시에 생체내에서 자연적으로 발생되는 프로펩티드의 제거후에, 잔존하는 콜라겐 분자의 코어는 주로 비삼중 나사선인 말단 텔로펩티드 시퀀스를 갖는 삼중 나사선 영역으로 구성되어 있다. 이와 같은 텔로펩티드 시퀀스는 콜라겐 피브릴 세포외의 분자간 가교자리로서의 중요한 기능을 갖고 있다. 알파 나사선 영역도 가교성 자리를 포함하고 있다.

분자간 가교에 의해 콜라겐 피브릴 생체 역학적 안정성을 지니게 된다. 이와 같은 가교 형성은 리신 및 히드록시리신 잔기의 대응하는 알데히드로의 변형에 의해 개시된다. 콜라겐의 인접 쇄에 위치하는 이들 잔기 중 일정 잔기는 상이한 분자간 가교를 자발적으로 형성할 것이다. 나사선 영역으로부터 콜라겐 텔로펩티드 상의 가교 자리에 대한 정확한 위치는 이미 기술되어 있다(참조 :

K., In Immunochemistry of the extracellular matrix, 1:1-29, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1982), Eyre, D.R., Ann.Rev. Biochem., 53:717-48 (1984) or US Patent No. 5140103 and 5455179). 또한, 타입 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 콜라겐에 있어서 몇몇 잠재적인 가교 자리의 아미노산 시퀀스는 하기의 표 1 에 주어진다.

섬유상 단백질, 콜라겐 및 엘라스틴은 리신 또는 히드록시리신 측쇄로부터의 알데히드로의 형성에 기초한 독특한 메카니즘에 의해 가교결합된다. 가교결합상태에서 4개의 상동 자리는 타입 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 콜라겐에서 뚜렷이 나타난다(참조 :

K., In Immunochemistry of the extracellular matrix, 1:1-29 (1982)). 2개는 각각 텔로펩티드 영역에 있는 알데히드 자리이고, 나머지 2개는 각각 분자 말단으로부터 약 90개의 잔기에 대칭적으로 위치하는 히드록시리신이다. 콜라겐 분자가 피브릴로 팩킹되는 경우, 나사선 영역에서의 히드록시리신 자리는 인접 분자의 텔로펩티드 알데히드와 일렬로 정렬되어 반응한다. 3-히드록시피리디늄 잔기가 히드록시리신 유도형 알데히드로부터 형성된 성숙 가교결합 상태인 것을 입증하는 유력한 증거가 있다. 그러나, 다른 경로, 즉 리신 잔기의 알데히드 형성으로부터의 성숙 가교 잔기는 아직도 알려져 있지 않다.

후술하는 EP-0394296의 공보에 기재된 식에 의해 예시된 바와 같이, 2개의 3-히드록시피리디늄 가교결합이 히드록시리실피리디놀린(또한 간단히 “ 피리디놀린”으로서 알려져 있음) 및 리실피리디놀린(또한 간단히 “ 데옥시피리디놀린”으로서 알려져 있음)인 것으로 밝혀졌다. 이러한 가교 화합물은 자연 형광성을 지닌다. 몇몇 히드록시리실피리디놀린 가교결합은 예를 들면 EP-A-0424428의 공보에 토의된 바와 같이 글리코실레이트되는 것으로 밝혀졌다.

그러나, 다른 가교결합은 콜라겐에서 자연적으로 발생된다(참조 : Last et al., Int. J. Biochem. Nol. 22, No. 6, pp 559-564, 1990).

콜라겐 분해에 대한 종래의 검정

종래에는, 일부가 콜라겐 분해 생성물인 각종 생화학적 지표인자를 측정함으로써 생체내에서 콜라겐 분해를 모니터 하는 검정이 개발되었다.

예를 들면, 주로 콜라겐 및 골 및 기타 모든 결합조직에서의 주요 구조 단백질에 한정되는 아미노산인 히드록시프롤린은 요에 배설된다. 이의 배설속도는 특정 상태, 그 중에서도 특히 페제트병, 후술하는 골 교체가 크게 증가되는 골대사 질환에서 증가하는 것으로 알려져 있다.

이때문에, 요의 히드록시프롤린은 콜라겐 분해에 대한 아미노산 지표인자로서 광범위하게 사용되어 왔다(Singer, F.R. et al., Metabolic Bone Disease, Vol Ⅱ(eds. Avioli, L. V., and Kane, S.M.), 489-575 (1978), Academic Press, New York).

미합중국 특허 제3600132호의 공보에는 콜라젠 대사의 이상을 모니터하기 위해 혈청, 요추액 및 기타 세포사이의 액과 같은 체액에서 히드록시프롤린을 측정하는 방법이 개시되어 있다. 상기 특허 명세서에는 히드록시프롤린이 페제트병, 마르팡증후군, 골형성부전증, 콜라겐 조직의 신생물 성장, 각종 형태의 왜소발육증과 같은 병리 상태와 관련된 증가된 콜라겐 동화작용 또는 이화작용과 상관관계가 있는 것으로 기재되어 있다.

페제트병과 관련된 골 재흡수는 또한 골 콜라겐의 분해에 의해 요에 분비되는 히드록시프롤린을 함유하는 작은 펩티드를 측정하여 모니터되었다(Russell et al., Metab. Bone Dis. and Rel. Res. 4 and 5, 2250262 (1981), and Singer, F.R., et al., supra.).

페제트병의 경우에는, 증가된 요의 히드록시프롤린은 아마도 주로 골분해에 의해 발생되지만, 히드록시프롤린은 통상 골분해의 특이적 지표인자로서 사용될 수 없다. 요 중의 다량의 히드록시프롤린은 새로운 콜라겐 합성(새로 생성된 상당량의 단백질은 조직 섬유로 혼입되지 않고, 분해되어 배설된다)과, 특정 혈액 단백질 및 히드록시피롤을 함유하는 다른 단백질의 교체로부터 생겨날 수 있다.

또한, 단백질 분해로부터 유도된 유리 히드록시프롤린 중 약 80%는 간에서 물질대사를 하며, 요 중에는 전혀 나타나지 않는다(Kiviriko, K.I., Int. Rev. Connect. Tissue Res. 5:93 (1970), and Weiss, P.H. and Klein, L., J. Clin. Invest. 48:1 (1969)). 히드록시프롤린은 골 재흡수에 대하여 특이적이지 않더라도 골의 콜라겐에 대하여 특이성을 나타내기 때문에 골다공증에 대한 양호한 지표인자이지만 다루기가 힘들다.

콜라겐 단백질 특유의 히드록시리신 및 이의 글리코시드 유도체는 콜라겐 분해의 지표인자로서 히드록시프롤린보다 훨씬 더 정확한 것으로 예기된다. 그러나, 히드록시프롤린에 관한 상술한 이유로, 히드록시리신 및 이의 글리코시드는 아마도 동일하게 골조직의 비특이성 지표인자이다(Krane, S.M. and Simon, L.s., Develop. Biochem. 22 : 185 (1981)).

다른 연구원들은 관절 질환에 있어서 콜라겐 분해의 지표로서 요 중의 가교 화합물 3-히드록시피리디늄을 측정하였다. 이에 대한 배경 및 실례로는 다음 문헌에 기술되어 있다(참조 : Wu and Eyre, Biochemistry, 23:1850 (1984); Black et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 45:969-973 (1986); and Seibel et al., The Journal of Dermatology, 16:964 (1989)). 본 발명과는 대조적으로, 상기 이전의 연구원들은 체액의 펩티드를 가수분해한 후 유리 3-히드록시피리디늄 잔기의 존재를 찾아냈다.

타입 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ 콜라겐의 분해도를 측정하기 위한 검정은 EP-0394296, 미합중국 특허 제4973666호 및 미합중국 특허 제5140103호에 개시되어 있다. 그러나, 이들 특허는 가교 화합물 3-히드록시피리디늄을 함유하는 콜라겐 단편에 한정되어 있다. 또한, 상술한 검정은 검정에 있어서 항체 및 항원을 생성하는데 사용되는 3-히드록시피리디늄을 함유하는 콜라겐 단편의 요로부터 장황하고 복잡한 정제과정을 필요로 한다.

현재에는, 미합중국 특허 제4973666호 및 미합중국 특허 제5140103호에 개시된 접근방법을 이용하는 극소수의 임상 데이터를 이용할 수 있다. 특히, 타입Ⅰ 콜라겐의 텔로펩티드를 함유하는 3-히드록시 피리디늄의 요 농도(상술한 특허공보에 기재된 방법에 의해 측정)와 실제 골격 유실(골격 비중계에 의한 반복 측정에 의해 측정)의 상관관계에 관한 데이터는 공개되지 않았다. 요 중에 텔로펩티드를 함유하는 3-히드록시 피리디늄이 존재하면 골 재흡수 과정 이전에 수 회 상기 특정 가교 구조의 골조직이 적절히 생성되어야 한다. 상기 과정에 대한 정보는 거의 없고 이와 같은 정확한 가교 구조의 형성에 대한 의존성을 피하는 것이 바람직하다.

영국 특허출원 제2205643호에 의하면, 체내의 타입 Ⅲ 콜라겐 분해는 체액의 타입 Ⅲ 콜라겐으로부터 N-말단 텔로펩티드의 농도를 측정함으로써 정량적으로 결정될 수 있다. 이러한 방법은 타입 Ⅲ 콜라겐의 세균성 콜라게나아제 분해에 의해 방출된 N-말단 텔로펩티드에 생성된 항체를 사용하며, 상기 텔로펩티드는 라벨을 붙여서 사용한다.

콜라겐 타입 Ⅰ 및 Ⅱ의 CNBr 단편을 기제로 하는 면역 측정 시스템이 문헌에 기재되어 있다(참조 :

-Kermani et al., Immunol. Invest. 19:475-491 (1990)). 용법은 조직내에 텔로펩티드가 잔존하는 펩신이 용해된 콜라겐으로 제조된다(참조 : 상술한 영국 특허출원 제2205643호). 따라서, 단편과 이로부터 발생된 항체는 일치하지 않는다. 또한, 상기 문헌에는 추출된 조직 샘플에 대한 측정에 대해서만 기술하고 있다.

펩신 용해된 타입 Ⅰ 콜라겐에 대한 모노클로널 항체의 제조는 다음 문헌에 기술되어 있다(참조 : Werkmeister et al., Eur. J. Biochem. 1987 : 439-443 (1990)). 항체는 조직 분절의 세포조직화학적 염색 및 세포 배양에서 콜라겐 함량을 측정하기 위해 사용된다. 체액에 대하여는 측정되지 않는다.

EP 특허출원 제 0505210호의 공보에는 타입 Ⅰ 콜라겐으로부터 정제된 가교 C-말단 텔로펩티드로 면역성을 부여하여 항체 시약을 개발한 것에 대하여 기술되어 있다. 면역원은 세균 콜라게나아제로 사람의 골 콜라겐을 용해함으로써 제조된다. 이렇게 하여 제조된 항체는 가교 및 비가교 텔로펩티드와, 피리디놀린이외의 가교 화합물과 반응할 수 있다.

국제특허출원 제WO 91/09114호의 공보에는 고체 기질에 대한 세포 부착성을 향상시키는데 사용되는 특정 합성 펩티드에 대해 기술되어 있다. 면역성 시약으로서의 합성 펩티드의 용도에 대해서는 언급되어 있지 않다.

여러 보고서에 따르면, 특정 프로콜라겐 펩티드의 정량분석에 의해 콜라겐 분해도를 측정할 수 있는 것으로 기술하고 있다. 프로펩티드는 프로콜라겐 분자내에서의 이들의 위치 및 생체내에서의 이들의 절단 시간에 의해 텔로펩티트 및 콜라겐 코어의 알파 나사선 영역과 구별된다(참조 : US Patent No. 4504587; US Patent No. 4312853; Pierard et al., Analytical Biochemistry 141:127-136 (1984); Niemela, Clin. Chem. 31/8:1301-1304 (1985); and Rohde et al., European Journal of Clinical Investigation, 9:451-459 (1979)).

EP 특허출원 제0298210호 및 제0339443호의 공보에는 프로콜라겐 펩티드 타입 Ⅲ 및 이의 단편의 면역 측정에 대하여 기재되어 있다. 또한, 프로콜라겐의 측정에 의거한 방법은 EP 특허출원 제0465104호의 공보에 개시되어 있다.

면역성 시약을 계발하기 위한 타입 IX 콜라겐으로부터 유도된 시퀀스를 갖는 합성 펩티드의 용도에 대하여 국제특허출원 제WO90/08195호의 공보에 개시하고 있다. 마찬가지로, 상기 특허출원 명세서에는 체액 중의 타입 IX 콜라겐 단편을 측정하기 위한 상기와 같이 제조한 항체의 용도에 대하여 기술하고 있다.

미합중국 특허 제4778768호는 활액 샘플 중의 프로테오글리칸 단량체 또는 이의 항원성 단편의 정량을 포함하는 관절연골에 일어나는 변화를 측정하는 방법에 관한 것이다.

특히 사람 및 소의 타입 Ⅱ 콜라겐의 감겨 있지 않은 알파 쇄 및 브롬화시아노겐 유도형 펩티드와 반응하는 폴리클로널 항혈청을 이용하는 타입 Ⅱ 콜라겐 분해 분석방법에 대하여 문헌에 기재되어 있다(Dodge, J:Clin Invest 83:647-661(1981)). 콜라겐 분해 생성물은 체액 중에서 검출되지 않으나, 세포배양 염색, 즉 “ 인 시투(in situ)”검출에 의해 조직화학적으로 검출된다.

WO94/03813의 공보에는 샘플 중의 콜라겐 또는 콜라겐 단편을 검출하기 위한 경합 면역학적 검정에 대하여 기술하고 있는데, 콜라겐의 비나사선형 C-말단 또는 N-말단 영역에 대응하는 합성 선형 펩티드를 함유하는 결합 상대를 선형 합성 펩티드 및 샘플의 항체와 함께 배양하여, 결합 상대에 대한 항체의 결합력을 측정한다.

WO95/08115의 공보에는 체액 중의 콜라겐 단편이 합성 펩티드에 대해 반응성을 지닌 항체와의 반응에 의해 측정되는 검정법이 개시되어 있다. 상기 검정법은 샘플 및 펩티드가 항체, 아마도 콜라겐의 콜라게나아제 분해에 의해 얻어진 콜라겐의 단편에 대해 발생된 폴리클로널 항체와 경쟁하는 경쟁 검정법일 수 있다. 택일적으로, 이러한 합성 펩티드에 대해 발생된 항체, 아마도 모노클로널 항체가 사용되는 검정일 수 있다.

체액, 특히 요에서 발견한 한 특정 펩티드는 하기 일반식 1을 갖고 있다.

상기식에서, K-K-K는 예를 들면 히드록시피리디늄 가교결합일 수 있지만, 자연발생된 가교결합, 특히 상술한 문헌(Last et al.)에 기재된 가교결합일 수 있다.

상기 작은 단편을 포함하여 큰 펩티드 단편은 EP 0394296에 기재되어 있다.

본 발명자들은 체액 중의 “ 펩티드”단편의 비율이 일반식의 아스파르트산의 이소아스파르트산으로의 이성질화에 의해 이에 상당하는 아미노산 시퀀스의 펩티드, 예를 들면 일반식 1의 펩티드에 관계가 있는 것을 알아냈다. 본 발명자들은 “ 펩티드”를 인용부호에 넣어 이들이 더이상 펩티드로서 간주되지 않는 이성질화 된 것을 의미한다.

아스파르트산을 함유하는 단백질의 이성질화 반응은 생리적 조건하에 발생하는 자발적 반응인 것으로 이전에 보고된 바 있다(참조 : Brennan et al., Protein Science 1993, 2, 331-338, Galletti et al., Biochem. J. 1995, 306, 313-325, Lowenson et al., Blood Cells 1988, 14, 103-117 and Oliya et al., Pharmaceutical Research, Vol. 11, No. 5, 1994, p.751).

이성질화 반응은 하기에 도시된 바와 같이, 아스파르트산 잔기의 아래쪽 부분인 펩티드 쇄의 일부를, 정상 단백질에서는 펩티드 결합을 통하여 결합되어 있는 아스파르트산의 알파 카복실산으로부터 비펩티드 아미드 결합의 측쇄 카복실산으로 카복시 말단 방향으로 이동시키는 효과를 가진다.

비펩티드 결합된 아스파르트산 잔기는 “이소아스파르트산”이라고 한다.

유사한 이성화 반응이 아스파라긴 잔기(즉, 상기 반응도식의 출발 단백질 중의 -OH 대신에 -NH₂)를 함유하는 단백질에서 일어날 수 있다.

이러한 사실은 상기 이성화 반응이 골조직에서도 일어나고, 이로써 상기 이성화 정도(extent of isomerization)가 관련된 골 조직의 연령에 대한 지표인자가 될 수 있다는 것에 대한 기대를 나타낸다.

또한, 이성질화된 펩티드의 골 펩티드 단편의 존재로써 상기 단편이 골내로 전혀 혼입되지 않은 새로 생성된 콜라겐의 분해와 같은 다른 원천으로부터가 아니라 진실로 골 분해로부터 유도된 단편이라는 것을 확인할 수 있다.

도 1은 실시예 3a에 기술된 바와 같이, * 자리에서 이소아스파르트산(피크 2)과 표준 아스파르트산(피크 3)으로 상이한 시퀀스 EKAH*GGR의 합성 펩티드와 펩티드 유사체의 HPLC 분리를 도시한다;

도 2는 실시예 3a에 기술된 바와 같이, 두가지 형태의 ELISA로 도 1의 분리된 펩티드 및 펩티드 유사체의 상이한 반응성을 도시한다;

도 3(a) 및 3(b)는 실시예 3b에 기술된 바와 같이 HPLC에 의해 분리한 요로부터의 가교 펩티드 및 펩티드 유사체의 형광(a) 및 흡광도(b)를 도시한다;

도 4 및 도 5는 골 재흡수에 대한 비스포스포네이트의 효과를 모니터하는데 상이한 항체를 사용하는 혈청에 대한 검정 결과를 도시한다.

본 발명의 방법에 대한 한 양호한 실시형태에 있어서, 요 또는 다른 체액 중의 타입Ⅰ,Ⅱ 또는 Ⅲ 콜라겐 단편의 검정은 콜라겐으로부터 유도된 시퀀스를 갖는 합성 펩티드 유사체 및 상기 합성 펩티드 유사체와 면역 반응성을 지닌 항체를 샘플과 접촉시키는 요 체액 샘플을 미터하여 저지 ELISA (효소면역 흡착 측정법)에 의해 수행된다. 합성 펩티드 유사체는 고체 지지체상에 고정된다. 항체는 합성 펩티드 유사체에 대하여 발생될 수 있거나, 콜라겐 분해 생성물에 대하여 발생될 수 있으며, 이러한 합성 펩티드 유사체를 사용하여 스크린될 수 있다.

합성 펩티드 유사체의 제조방법

합성 펩티드 및 펩티드 유사체의 제조방법은 종래 기술에 공지된 방법, 예를 들면 “ 메리필드 신세시스 (Merrifield synthesis)”로서 통상 기술되는 고체상 펩티드 합성 기술에 의해 수행될 수 있다. 또한 종래의 용액상 기술도 사용될 수 있다. 목적 대상의 시퀀스는 콜라겐 가교결합의 가능 자리를 포함한다(참조 :

K., in Immunochemistry of the extracellular matrix, 1:1-29 (1982), Eyre, D.R., Ann. Rev. Biochem. 53:717-48 (1984), or US Patent No. 5140103). 이러한 펩티드 시퀀스는 하기의 표 1에 나타낸다. 종래의 펩티드 합성방법은 아스파르트산에 결합시키기 위한 이성질화 반응에 의해 펩티드(표준 펩티드 결합형 아스파르트산을 포함)와 펩티드 유사체의 혼합물을 생성시킬 수 있다. 일반적으로 이러한 혼합물은 펩티드가 검정시에 삽입되므로 만족스러울 것이다. 그러나, 상기 혼합물의 가열로 통상 펩티드의 이성질화 반응에 의해 이소 형태가 생성될 것이다.

합성 펩티드 유사체에 관해서는, (a) 대응하는 자연 콜라겐 단편의 이소아스파르트산 유사체를 인지하는 항체를 생성시키거나 또는 (b) 자연 단편의 상기 유사체에 대한 이러한 항체의 결합을 저해하는 능력을 실질적으로 손실하지 않고서 가교성 자리 시퀀스로부터 하나 이상의 아미노산 잔기를 제거하거나 또는 가교성 자리 시퀀스에 하나 이상의 아미노산 잔기를 가할 수 있다. 항체를 생성시키기 위해 긴 콜라겐 유사체 및/또는 키메라 펩티드 유사체를 사용할 수 있으며, 원칙적으로 경쟁 검정에서 면역원과 동일한 펩티드 및 경쟁자를 반드시 사용하지 않아도 된다.

표 1

본 발명에 따른 이소아스파르산 함유 합성 펩티드 유사체에 대한 기제로서 사용되는 각종 타입의 콜라겐에서 가교를 위한 가능 자리를 갖는 아미노산 시퀀스의 실례

모노클로널 및 폴리클로널 항체의 제조방법은 종래기술에 공지되어 있다(참조 : Campbell, A.M., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 12 (1986)). 면역법에 의해 합성 이성질화 펩티드의 항체를 생성할 수 있다. 그러나, 이들 화합물의 비교적 낮은 분자량으로 인해, 합텐이 캐리어 분자에 컨쥬게이트되는 것이 바람직하다. 적절한 캐리어 분자로는 소 혈청 알부민, 티로글로불린, 오발부민, 파상풍 톡소이드 및 키홀 림핏(limpet) 헤모시아닌을 들 수 있는데, 이것들로 한정되어 있지 않다. 바람직한 캐리어는 소 혈청 알부민이다. 면역성을 지닌 동물의 세포를 생성하는 항체에 대한 통상적인 면역원 형태로 합텐을 나타내기 위해, 다수의 커플링 프로토콜이 사용될 수 있다. 적절한 결합제로는 글루타르알데히드, 카보디이미드 및 과요오드산염을 들 수 있는데, 이것들로 한정되어 있지 않다. 바람직한 결합제는 글루타르알데히드 및 카보디이미드이다.

항체의 제조방법은 캐리어에 컨쥬케이트된 콜라겐 단편 함유 천연 이성질화 또는 합성 이성질화 펩티드를 사용한 면역법을 포함하는 종래의 기술에 의해 수행될 수 있다. 면역원성을 향상시키기 위해, 면역원을 주사하기 전에 좌약과 혼합하는 것이 바람직하다. 좌약의 예로는 수산화알루미늄, 프로인트 좌약 및 면역자극 복합체(ISCOMs)을 들 수 있는데, 이것들로 한정되어 있지 않다. ISCOMs는 문헌에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다(참조 : Morein, B. et al., Nature 308:457-460 (1984)).

합텐 캐리어 분자의 모노클로널 또는 폴리클로널 항체는 생성될 수 있다. 모노클로널 항체를 생성하기 위해서는, 쥐에게 면역성을 부여하는 것이 바람직하다. 면역성을 지닌 쥐의 비장 세포를 수확하여 균질화한 후에, 폴리에틸렌 글리콜의 존재하에 종양 세포와 융합시켜서 콜라겐으로부터 유도된 이성질화 펩티드 단편에 대해 특이성을 지닌 모노클로널 항체를 생성하는 세포 잡종을 생성시킨다. 적절한 종양세포로는 골수종, 간종양, 암종 및 육종 세포를 들 수 있는데, 이것들로 한정되어 있지 않다. 모노클로널 항체의 생성법에 대하여 문헌에 기술되어 있다(참조 : Goding, J.W., in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, (1986)). 바람직한 예비 검진 프로토콜은 캐리어에 컨쥬게이트되고 마이크로타이터 플레이트의 고체표면에 피복된 합성 이성질화 펩티드의 용도를 포함한다.

콜라겐으로부터 유도된 이성질화 펩티드 단편에 대해 반응성을 지닌 폴리클로널 항체를 제조하기 위해, 상이한 동물종을 면역화시킬 수 있다. 적절한 종으로는 닭, 토끼 및 염소를 들 수 있는데, 이것들로 한정되어 있지 않다. 닭 및 토끼가 바람직하다.

이렇게 하여 생성된 항체는 적절한 시퀀스의 이소아스파르트산 함유 합성 펩티드 유사체와의 반응성을 테스트함으로써 본 발명의 용도에 대한 적합성을 위해 조사될 수 있다.

항체 단편은 종래기술에 공지된 방법에 의해 제조된다(참조 : E. Ishikawa. Journal of Immunoassay 3:209-327 (1983)).

면역검정법

따라서, 상기와 같이 제조된 항체를 사용하는 면역검정을 이용함으로써, 종래의 분별 또는 가수분해를 수행하지 않고서 생체액 샘플을 검정할 수 있다. 생체액 중의 원하는 콜라겐 단편에 대한 특이성은 검정 구성에 있어서 합성 이성질화 펩티드(항체가 발생되거나 항체가 면역화학적으로 반응성을 지닌 경우)의 사용과 함께 항체에 의해 부여될 수 있다. 대안으로서, 모노클로널 항체를 사용하는 면역검정이 행해질 수 있다. 이러한 검정설계에 대한 기본 개념은 특이성이 항원(콜라겐에 대한 합성 펩티드 이성체)에서 항체(토끼 항혈청으로부터 모노클로널 항체로)로 특이성이 시프트된다는 것이다. 이러한 구성을 이용하면 검정에 있어서 합성 펩티드 이성질체를 추가로 사용할 필요는 없다. 이와 같은 면역검정법의 변형은 정제된 콜라게나아제로 처리된 콜라겐으로 사전에 피복된 마이크로타이터(microtitre) 플레이트에서 환자 샘플 또는 표준용액을 퍼옥시다아제로 컨쥬게이트된 항체액을 배양함으로써 적절히 행해진다. 세정후에, 플레이트의 웰은 기질 용액을 사용하여 암흑속에서 배양된다. 정지액을 가하여 색 반응을 정지시켜서, 최종적으로 흡광도를 측정한다.

면역검정 자체는 종래기술에 일반적으로 공지되어 있는 각종 표준 검정 프로토콜 중에서 선택된 절차를 이용하여 수행될 수 있다. 통상 인지될 수 있기 때문에, 검정은 특이적인 면역결합상대와 특이성에 대한 원하는 분석물(analyte) 사이의 상호작용에 의존하고 분석물과 면역결합상대에 의해 생성된 복합체를 검출하기 위해 몇몇 수단을 이용하도록 구성된다. 면역결합상대는 고체 지지체로 합성되어 분석물용 포획 면역결합상대로서 사용될 수 있다. 이러한 프로토콜은 분석물-면역결합상대 복합체의 생성이 예를 들면 형광, 방사성 효소 표지에 의해 검출되는 직접적인 형태로 행해질 수 있거나, 또는 표지 표준물질이 면역결합상대의 분석물과 경쟁하는 경쟁 포맷으로 행해질 수 있다. 포맷은 또한 응집 검정으로 구성되거나, 또는 복합체는 반응 혼합물에 적당한 침전체를 가함으로써 침전될 수 있다. 면역검정 프로토콜에 대한 특정 설계는 광범위하게 선택될 수 있고, 종래기술에 있어서 이용할 수 있는 임상 검정장치 및 프로토콜은 다수 존재한다. 각종 프로토콜에 관해서는 미합중국 특허 제5001225호의 공보에 개시되어 있다.

표준검출 프로토콜, 예를 들면 방사성 동위원소 표지화, 형광 표지화 또는 ELISA를 이용하여 직접 또는 경쟁 포맷으로 면역검정을 행하기 위한 항체 및 발색제는 검정에 대한 필수 성분 및 지시사항을 포함하는 키트로서 편리하게 제공될 수 있다. 본 발명의 한 실시형태에 있어서, 이러한 키트는 해당 합성 이성질화 펩티드로 피복된 마이크로타이터 플레이트, 표준곡선 준비용 표준용액, 분석용 런의 특성 테스트를 위한 체액(예 : 요) 컨트롤, 상술한 합성 펩티드 이성질체에 대해 반응성을 지닌 토끼 항체, 퍼옥시다아제에 컨쥬게이트된 항토끼 면역글로불린, 정지액, 세정용 완충액 및 지시 매뉴얼을 포함한다.

면역검정은 항체 및 특이성을 지닌 합성 이성질화 펩티드를 사용하여 구성될 수 있기 때문에, 적당한 생체액 중에서의 대응하는 콜라겐 단편 시퀀스의 비율은 각각의 개별 레벨 및 전체 레벨을 측정할 수 있다. 그리하여, 검정은 항체를 포함하도록 설계될 수 있으므로, 다수의 이소아스파르트산 함유 펩티드 유사체 및 임의로 천연 펩티드 시퀀스를 측정하거나, 하나의 이소아스파르트산 함유 펩티드 유사체 시퀀스 또는 원하는 이들의 조합체를 측정할 수 있을 것이다.

골 재흡수의 지표로서의 상술한 이성질화 펩티드의 용도 이외에도, 골대사평형은 유리하게도 동일 개체로부터의 동일하거나 상이한 적절한 생체액 중에서의 골생성에 대한 지표인자를 실질적으로 동시에 측정함으로써 결정된다. “ 실질적으로 동시에”는 같은 날, 바람직하게는 4시간이내를 말한다. 예를 들면 이러한 지표인자는 오스테오칼신(osteocalcin ; BGP의 골 GLA 단백질로서도 알려짐), 프로콜라겐 타입Ⅰ의 프로펩티드, 골 알칼리성 포스파타아제 및 전체 알칼리성 포스파타아제를 포함한다. 이들 지표인자를 측정하기 위한 적절한 방법은 문헌에 기재되어 있다(참조 : Delmas, P.D., et al., J. Bone Min. Res. (1986) 1:333-337).

분해가 일어나는 경우에 콜라겐 유도형 펩티드 및 이성질화 펩티드를 생성하는 조직의 대사상태의 측정 지표를 제공하는 본 발명의 검정은 각종 상황하에서 유용하다. 첫째로, 타입Ⅰ 콜라겐의 분해반응을 고려하면, 검정은 예를 들면 과잉량의 골흡수를 나타냄으로써 대상의 비정상 상태를 평가하는 방법이다. 이는 골다공증 상태의 존재를 나타내거나 악성 종양의 전이과정을 보여준다. 과잉량의 골흡수를 특징으로 하는 기타 상태로는 페제트병 및 부갑상선 기능항진증을 들 수 있다. 마찬가지로, 결합조직을 포함한 많은 기타 질병 상태는 콜라겐 분해도를 측정함으로써 모니터될 수 있다. 예를 들면, 류머티스성 관절염 및 골관절염과 관련된 콜라겐 타입 Ⅱ 분해 및 맥관염증후군에 있어서의 콜라겐 타입 Ⅲ 분해가 있다. 대상의 상태가 연속적으로 모니터될 수 있기 때문에, 상기 상태 또는 다른 상태를 치료하는데 적용되는 요법 과정을 모니터하는데 이들 검정을 이용할 수 있다. 또한, 독성 물질의 투여에 의해 종종 조직 변성을 일으키기 때문에 검정은 독성의 측도로서 이용될 수 있다.

그리하여, 검정은 콜라겐 조직의 대사 상태가 대상의 상태, 치료 또는 대상에게 직접 투여되는 물질의 효과의 지표로서 사용될 수 있거나 대상이 환경에 노출되어 있는 모든 상황에 대하여 적용될 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 예시하기 위한 것이다.

따라서, 본 발명의 제 1 측면에 따르면, 체액중에서 하나 이상의 이소아스파르트산을 함유하는 종(species)의 양을 측정하는 것을 포함하는, 예를 들어 골 유래의 콜라겐과 같은 체 단백질의 분해율을 측정하는 방법을 제공한다.

주목대상의 이성질화 펩티드는 타입Ⅰ, 타입Ⅱ 또는 타입Ⅲ 콜라겐의 특성을 나타낼 수 있지만, 바람직하게는 타입Ⅰ 콜라겐의 특성을 나타낸다.

더욱 바람직하게는, 이러한 방법은 상기 체액 중에 존재하는 하나 이상의 특정 이소아스파르트산 함유 이성화된 펩티드의 양을 측정한다.

바람직하게는, 상기 방법은 체액 중에 존재하는 하기 일반식 2의 이성질화 펩티드의 양을 측정한다.

상기식에서, * 중 하나 또는 양쪽 모두는 이소아스파르트산이다. 또는 상기 방법은 이소아스파르트산을 함유하는 일반식 2의 이성질화된 펩티드에 존재하는 에피토프를 포함하는 하나 이상의 이성질화된 펩티드의 양을 측정한다.

상기 일반식에서, K-K-K는 피리디놀린(글리코실레이트되거나 글리코실레이트되지 않음) 또는 데옥시피리디놀린일 수 있는 히드록시피리디늄 가교 결합과 같은 가교 결합이다.

바람직하게는, 상기 측정은 측정과정중에 샘플내에 존재하는 이소아스파르트산 함유 종에 특이적인, 바람직하게는, 상기 일반식 2의 이성질화된 펩티드에 특이적인, 또는 이소아스파르트산을 함유하는 일반식 2의 이성질화된 펩티드에 존재하는 에피토프를 포함하는 이성질화 펩티드에 대해 특이적인 면역결합파트너(immunological binding partner)를 사용하여 수행한다.

이러한 면역결합파트너는 모노클로널 항체 또는 폴리클로널 항체일 수 있다. 면역결합파트너가 이소아스파르트산 함유 종에 대해 특이적이어야 한다는 요건은 상기 면역결합파트너가 검정에서 유용한 정도로 상기 종과 아스파르트산 함유 유사 종(펩티드)을 구별하는 것을 의미한다.

또한, 적합한 면역결합파트너는 Fab, Fab' 및 F(ab')₂ 단편을 포함하는 동일한 항원 결정인자에 결합할 수 있는 항체 단편을 포함한다.

바람직하게는, 면역결합파트너는 상기 콜라겐 단백질 시퀀스에서의 아스파르트산 대신에 상기 아미노산 시퀀스에서 이소아스파르트산으로 치환된 콜라겐내에서의 시퀀스에 대응하는 선형 이성질화 펩티드, 바람직하게는 합성 이성질화 펩티드에 대해 생성된 항체이다.

너무나 잘 알려져서 여기에서 기술하지 않아도 되는 실험절차로서 ELISA(효소면역 흡착 측정법), RIA 또는 IRMA를 포함한 다수의 형태를 취하여 검정을 할 수 있다.

본 발명의 제 2 측면에 있어서, 본 발명은 상기 콜라겐 단백질 시퀀스의 아스파르트산 대신에 상기 아미노산 시퀀스에서 이소아스파르트산으로 치환되는 콜라겐 내의 시퀀스에 대응하는 아미노산 시퀀스를 갖는 합성 이성질화 펩티드의 콜라겐 유래 이성질화 펩티드에 대한 검정에의 용도를 제공한다. 경쟁 검정에 있어서, 상기 합성 이성질화 펩티드는 면역결합파트너에 대하여 샘플내에 하나 이상의 이성질화 펩티드와 경쟁하는데 사용될 수 있다.

이러한 타입의 ELISA에 있어서, 합성 펩티드는 고체 지지체상에 고정될 수 있다. 샘플은 펩티드의 합성 이성질체를 고체 지지체와 접촉하게 하고 폴리클로널 항체와 함께 배양될 수 있고, 세척후에, 퍼옥시다아제-컨쥬게이트(노출) 항체를 첨가할 수 있다. 추가로 배양한 후에, 퍼옥시다아제 기질 용액을 가한다. 경쟁에 의해, 항체에 대해 반응성을 지닌 샘플 중의 펩티드 이성질체는 퍼옥시다아제 반응을 억제한다.

택일적으로, 모노클로널 면역결합파트너를 생생시키기 위해 합성 펩티드 이성질체를 사용할 수 있다. 그러면, 합성 이성질화 펩티드는 검정에 있어서 경쟁 시약이 될 필요가 없다. 예를 들면, 콜라게나아제 처리된 콜라겐을 정제하고, 고체 지지체 상에 고정하고, 모노클로널 항체를 이용하여 ELISA를 수행할 수 있다.

따라서, 본 발명의 제 3 측면에 따라, 본 발명은 상기 단백질, 예를 들어 콜라겐 시퀀스의 아스파르트산이 상기 아미노산 시퀀스에서 이소아스파르트산으로 치환된 단백질 예를 들어 콜라겐 내의 시퀀스에 대응하는 아미노산 시퀀스에 대해 특이적인 항체, 바람직하게는 모노클로널 항체를 제공한다.

본 발명의 제 3 측면에 의한 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 항체는 시퀀스 EKAHiDGGR를 포함하거나, 또는 상기 시퀀스에 존재하는 iD의 존재에 대해 특이적인 에피토프를 함유하는 이성질화 펩티드 시퀀스에 대하여 특이적이다. 상기 iD는 이소아스파르트산을 표시한다.

따라서, 본 발명의 제 3 측면에 의하면, 본 발명은 항체, 바람직하게는 펩티드 이성질체 시퀀스 EKAHiDGGR를 함유하거나, 이 내부에 포함되거나, 이것으로 구성되는 에피토프에 대해 반응성을 갖는 모노클로널 항체를 포함한다. 상기 iD는 이소아스파르트을 표시한다.

본 발명의 제 4 측면에 있어서, 본 발명은 단백질, 예를 들면 상기 콜라겐 단백질 시퀀스의 아스파르트산이 상기 아미노산 시퀀스에서 이소아스파르트산으로 치환된 단백질 예를 들어 콜라겐 내의 시퀀스에 대응하는 아미노산 시퀀스를 갖는 펩티드 이성질체에 대해 생성된 모노클로널 항체를 제공한다.

본 발명은 본 발명의 제 3 측면 또는 제 4 측면에 따라 모노클로널 항체를 생산하는 세포주를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 제 3 측면 또는 제 4 측면에 따라 검출가능한 지표인자에 결합되는 항체를 포함한다. 적절한 검출가능한 지표인자로는 효소, 발색단, 형광단, 조효소, 효소저해제, 화학 루미네센스 물질, 상자기성 물질, 스핀 표지, 방사성 동위원소, 핵산 또는 핵산 유사체 시퀀스를 들 수 있는데, 이것들로 한정되지 않는다.

본 발명의 제 5 측면에 있어서, 본 발명은 체액 중에 펩티드 이성질체 또는 이성질체들을 함유하는 이소아스파르트산의 양에 관한 정보를 얻기 위한, 상기 단백질(예:콜라겐) 시퀀스의 아스파르트산 대신에 상기 아미노산 시퀀스에서 이소아스파르트산으로 치환되는 단백질(예:콜라겐)내의 시퀀스에 대응하는 아미노산 시퀀스에 특이적인 항체의 콜라겐 또는 다른 단백질 유도형 이성질화 펩티드에 대한 검정의 용도를 제공한다.

본 발명의 제 6 측면에 있어서, 본 발명은 바람직하게는 대응하는 펩티드가 적어도 실제로 존재하지 않는 경우에 상기 콜라겐 단백질 시퀀스의 아스파르트산이 상기 아미노산 시퀀스에서 이소아스파르트산으로 치환되는 콜라겐 내의 시퀀스에 대응하는 아미노산 시퀀스를 갖는 합성 펩티드 이성질체를 제공한다.

바람직하게는, 인접 글리신이 아스파르트산의 이성질화 반응을 촉진시키기 때문에, 아미노산 시퀀스의 자연 펩티드 형태에서 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기에 인접해 있다.

하나 이상의 아스파르트산 함유 펩티드 및 이들의 이소아스파르트산 함유 유사체에 대하여 각각 선택적인 항체를 제조할 수 있다. 그때 펩티드 또는 펩티트류의 변체에 대한 검정을 행할 수 있다. 이소아스파르트산의 상대량은 분해된 단백질의 단백질 연령과, 검정이 콜라겐 단편의 타입에 관한 것인 경우에는 골의 연령을 나타낼 것이다. 따라서, 본 발명의 제 6 측면에 따라, 콜라겐으로부터 유도된 하나 이상의 아스파르트산을 함유하는 펩티드 및 대응하는 이소아스파르트산 함유 펩티드 유사체의 상대량을 체액 중에서 측정하는 것을 포함하는 환자의 콜라겐 재흡수에 관한 정보를 얻는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 유용한 테스트 키트(kit)를 포함한다. 이러한 키트는 본 발명의 제 3 측면 또는 제 4 측면에 따르는 항체, 또는 유사한 특이성을 지닌 항체 단편,

바람직하게는 항체와 반응성을 지닌 이소아스파르트산을 함유하는 합성 펩티트 유사체,

항체-효소 컨쥬게이트 및/또는 이에 대한 기질,

효소 컨쥬게이트-기질 반응 정지 조성물 또는

세정액 중에서 하나 이상의 물질과 혼합하여 이루어진 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 사람 및 동물에게 적용할 수 있다.

적절한 체액으로는 사람 또는 동물의 요, 혈액, 혈청, 플라스마 및 활액을 들 수 있다. 상기 방법은 또한 침 및 땀에 대해서도 사용될 수 있다. 체액은 그 상태로 사용될 수 있거나, 또는 접촉단계전에 정제될 수 있다. 이러한 정제단계는 약포 흡착 및 용리, 분자체, 크로마토그래피, 투석, 이온교환, 알루미나 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피 및 이들의 조합체를 포함하는 다수의 표준절차를 이용하여 수행될 수 있는데, 이것들로 한정되어 있지 않다.

본 발명은 첨부도면과 관련하여 더욱 더 상세하게 설명될 것이다.

실시예 1 : 요에서의 특이적 펩티드 시퀀스의 면역검정

고체상 기술에 의해 제조된 3개의 이성질화 펩티드(α 1(Ⅰ)C1, α 1(Ⅰ)N1 및 α 2(Ⅰ)N1)를 면역원을 제조하기 위해 사용한다. 면역성을 부여하기 위해, 카보디이미드 또는 글루타르알데히드 시약 및 당해기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 펩티드 이성질체를 소 혈청 알부민에 공유 결합시킨다. 펩티드 이성질체에 대하여 모노클로널 및 폴리클로널 항체를 발생시킨다. 모노클로널 항체를 생성하기 위해서는, Balb/c 마우스를 펩티드 이성질체-BSA 컨쥬게이트로 면역화시키고, 비장 또는 림프절의 세포를 Ag8 골수종 세포와 융합시킨 후에 표준기술을 이용하여 하이브리도마 세포주를 제조한다. 폴리클로널 항체를 토끼 및 닭에서 생성시킨다. 카보디이미드 시약 및 당해기술분야에 공지된 방법을 사용하여 제조한 적절한 펩티드 이성질체-단백질 캐리어 컨쥬게이트로 피복된 마이크로타이터 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 항혈청 및 하이브리도마 세포의 검진을 행한다.

요 중의 3개의 펩티드 이성질체 시퀀스(α 1 (Ⅰ) C1, α 1 (Ⅰ) N1 및 α 2 (Ⅰ) N1)에 대한 검정은 하기와 같이 저지 ELISA에 수행된다.

표준품으로서 아마도 콜라겐 단편을 함유하는 요 샘플 (10∼25㎕) 또는 0.015∼15㎕ 펩티드 이성질체/㎖를 함유하는 용액을 각각 0.1% 트윈(Tween)-20 세제(PSB-T) 및 BSA 0.1%(w/v)를 함유하는 포스페이트 완충염수에 1:5,000∼1:20,000의 비율로 희석된 펩티드 이성질체에 대한 면역결합상대 75㎕에 가한다. 각각의 샘플을 적절한 펩티드 이성질체를 함유하는 펩티드 이성질체-단백질 캐리어 컨쥬게이트로 사전에 피복된 저부가 편평한 이중의 96-웰 마이크로타이터 플레이트로 제조한다. 60분후에, 플레이트를 PBS-T로 세정(3 회)하고 1차 항체 종에 대해 생성한 호오스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다아제 표지 항체로 표준기술에 의해 결합된 항체를 검출한다. 퍼옥시다아제 기질을 가하고, 1M H₃PO₄를 사용하여 효소 반응을 정지시킨 후에 자동 마이크로타이터 플레이트 리더내에서 450nm에서 발색현상을 측정한다. 분석물을 함유하는 샘플은 플레이트상의 면역성을 지닌 펩티드 이성질체에 대한 1차 항체의 결합력을 감소시켜서, 색 농도가 감소된다. 샘플내의 분석물의 양은 로그 라인 플롯을 이용하여 계측된 각 플레이트상에 포함된 표준품으로부터 사전에 확중된 곡선에 관하여 정량한다.

실시예 2:

타입 Ⅰ 콜라겐의 분해 생성물을 검출하기 위한 모노클로로널 항체를 이용한 검정

적절한 캐리어 단백질에 컨쥬게이트된 이소아스파르트산 함유 α 1(Ⅰ)C1 합성 펩티드 유사체로 쥐에게 면역성을 부여함으로써 모노클로널 항체를 발생시킨다. 표준절차에 따라 세포 융합, 클로닝 및 하이브리도마스 증식을 행한다. 검진 절차는 마이크로타이터 플레이트 상에 고정된 α 1 (Ⅰ) C1 합성 펩티드 유사체의 반응성 테스트를 포함한다.

펩티드 유사체 형태, 즉 아스파르트산으로서 이성질화 연쇄를 포함하는 타입 Ⅰ 콜라겐의 C-텔로펩티드의 상이한 중복 시퀀스를 이용한 억제 연구에 의해 항체의 특이성을 테스트한다.

이와 같은 하나의 항체 MAbA-ISO를 이용한 검정을 전개한다. 말하자면, 이소아스파르트산 함유 합성 펩티드 유사체 α 1(Ⅰ)C1를 카보디이미드 또는 글루타르알데히드를 사용하여 소 혈청 알부민에 컨쥬게이트하여, 이 컨쥬게이트를 마이크로타이터 플레이트를 피복하기 위해 사용한다. 대체물질도 사용될 수 있는데, 본질적인 특성은 시퀀스 EKAHiDGGR 시퀀스의 노출에 있다.

피복에 이어서, 마이크로타이터 플레이트를 요 15㎕ 및 호오스래디쉬 퍼옥시다아제에 컨쥬게이트된 MAbA-ISO 100㎕에 배양한다.

1시간 후에 플레이트를 세정하고 기질(예:TMB)을 가한다.

실시예 3 : 다른 펩티드 단편 및 항체를 기제로 한 ELISA 검정에

대한 이소아스파르트산 펩티드 유사체의 ELISA의 상관관계

본 발명의 폴리클로널 ELISA 와 HPLC로 분리된 펩티드 종, (a) 합성 및 (b) 요로부터 분리된 펩티드 종에 대해 WO95/08115에 기재된 MAbA7 ELISA의 상관관계를 평가한다. MAbA7 ELISA는 8AA 펩티드(D가 표준 아스파르트산인 EKAHDGGR)에 대해 발생된 MAbA7 모노클로널이 사용되고 마이크로타이터 트레이에 고정된 콜라겐 분해형 콜라겐이 모노클로널 항체(MAbA7)에 결합하기 위해 샘플 중의 콜라겐 단편과 경쟁하는 경쟁 검정이다.

본 실시예에 사용되는 ELISA는 하기와 같이 수행된다:

(a) 폴리클로널 ISO-ELISA

폴리클로널 ELISA는 타입 Ⅰ 콜라겐의 α 1쇄의 C-텔로펩티드 중 이성질화 부분에 특이성을 나타내는 8개의 아미노산 (8AA)(Glu-Lys-Ala-His-(Iso)Asp -Gly-Gly-Arg)의 아미노산 시퀀스를 갖는 합성 펩티드 유사체를 기제로 한다. 상기 시퀀스에 대해 반응성을 지닌 항체와 배양하는 동안에, 샘플 중의 고정 펩티드 이소 형태 유사체와 타입 Ⅰ 콜라겐 중 α 1 쇄의 분해물 사이에 경쟁이 일어난다.

간단히 말하면, 25㎕ 샘플 또는 표준물질을 일반식 1의 항원으로 피복된 마이크로플레이트의 각 웰에 가한 후, 콜라게나아제로 처리된 타입Ⅰ콜라겐에 대해 발생된 항혈청 75㎕를 가한다. 플레이트를 교반하에 실온에서 1시간 배양시키고 세정용 완충액으로 5회 세정한다. 염소 항토끼 면역글루불린 G 호오스래디쉬 퍼옥시다아제 컨쥬게이트(100㎕)를 각 웰에 가한다. 실온에서 1시간 배양한 후에, 플레이트를 종전대로 5회 세정한다. 효소 기질(100㎕/웰)을 가하고, 암흑속에서 15분간 배양한 후에 100㎕인산(1mol/ℓ)을 가하여 반응을 정지시킨다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm의 광학밀도를 측정한다. 각 샘플에 대해 이중 측정을 행하고 데이터를 표준 비색법으로 측정하여 나노그램/mol 크레아티닌(Cr)으로 나타낸다. 이러한 검정을 본 명세서에서 ISO-ELISA로서 명명한다.

MAbA7 ELISA

MAbA7은 시퀀스 EKAHDGGR, 즉 표준 아스파르트산을 갖는 펩티드에 대해 마우스내에서 상술한 바와 같이 발생된 모노클로널 항체이다.

이러한 검정 변형을 하기와 같이 3 단계로 행한다:

제1 단계에서, 정제된 콜라게나아제로 처리한 콜라겐 (CTC)으로 미리 피복된 마이크로미터 플레이트의 웰을 15㎕ 표준용액 또는 샘플 및 퍼옥시다아제로 컨쥬게이트된 모노클로널 항체액 100 ㎕를 사용하여 실온에서 1시간 배양한다.

제2 단계에서 세정한 후에, 웰을 100㎕ 기질 용액으로 실온에서 15분간 암흑속에서 배양한다. 최종적으로, 제 3 단계에서 100㎕ 정지액을 첨가하여 색 반응을 정지시킨다. 450nm에서의 흡광도는 2시간내에 측정한다.

실시예 3(a)

본 실시예는 합성 EKAHDGGR 또는 EKAHiDGGR에 대해 특이성을 나타내는 항체를 발생시킬 수 있음을 입증한다.

합성 EKAHDGGR과 EKAHiDGGR의 혼합물을 HPLC로 분리한다(도 1, 각각 피크 3 및 피크 2). 시퀀스 분석에 의해 피크 2가 이성질화 아스파르테이트를 함유하고 있음을 확인했다. 이것은 히스티딘 잔기 다음에 시퀀스 동작에 의해 나타난다. 피크 3은 정규 아스파르테이트를 함유하며, 시퀀스를 통상적으로 진행할 수 있다. HPLC 프로파일로부터의 분획을 수집하여 MAbA7 ELISA 및 폴리클로널 ISO-ELISA의 면역반응성을 테스트한다. 두 검정에 의해 분리된 피크를 검출하는데, 즉 피크 2는 ISO-ELISA에 의해, 피크 3은 MAbA7 ELISA에 의해 검출된다는 것을 입증한다.

결과는 도 2에 도시된다.

실시예 3(b)

본 실시예는 ISO-ELISA와 관련된 분자를 요로부터 정제하여, 이들분자를 이성질화 또는 정규 아스파르테이트를 함유하는 디펩티드계 종으로 분리할 수 있음을 논증한다.

제 1 요를 MAbA7를 사용하여 면역정제하고, MAbA7을 제조업자의 지시에 따라 CNBr 활성화 세파로즈(Sepharose)^TM에 결합시킨다. 요를 PBS 완충액 중에서 1:3(v/v)으로 희석시키고 1M NaOH를 사용하여 pH를 8.0으로 조절한다. 800㎖로 희석된 요를 0.8㎖/min의 유량으로 4℃에서 24시간동안 컬럼(14㎤) 상에서 재순환시킨다. 컬럼을 200㎖ PBS 완충액 (pH 8)으로 세정한 후에, 결합된 항원을 1% TFA (v/v)를 함유하고 -20℃에서 보관한 20㎖ 50% 포화 (NH₄)₂SO₄ 를 사용하여 희석시킨다. 용리된 항원을 1㎖ C18 Sep-Pak^TM 컬럼을 사용하여 탈염시킨다. Sep-Pak^TM 컬럼을 20㎖ 80% 메탄올(v/v)로 컨디셔닝하여, 항원을 가하기 전에 1% TFA(v/v)를 함유하는 물 20㎖로 평형시킨다. 결합된 항원을 1% TFA(v/v)를 함유하는 물 20㎖로 세정하고, 냉동건조하여 -20℃에서 보관한 0.1% TFA(v/v)를 함유하는 40% 아세토니트릴(v/v)로 용리시킨다.

상기 절차에 의해 구한 선택된 피크로부터 이온쌍으로서 트리플루오로아세트산 (TFA)을 사용하여 HPLC로 분자를 분리한다. 분획을 MAbA7 및 ISO-ELISA에서의 아미노산 조성물, 아미노산 시퀀스, 질량 분석법 및 면역반응성에 위해 분석한다.

· HFBA HPLC 프로파일의 형광(3-히드록시피리디늄 가교결합) 및 흡광도는 도 3에 예시된다. 추가로 분리를 행하여 순수한 제제를 얻어서 질량 분석법 및 면역반응성(표 2)과, 아미노산 시퀀스(표 3) 및 아미노산 조성물(표 4)에 의해 테스트한다. 데이터로부터, 모두 분자량이 약 2036 킬로돌턴인 3개의 분리된 분자가 확인됨을 알 수 있다(표 2). 피크 F-24-17-10에서 히스티딘 다음에 아미노산 시퀀스가 블록되는 반해, 2개의 다른 피크(F-26-18-09 및 F-29-19-24, 표 3)에 대하여 완전한 시퀀스 EKAHDGGR가 얻어진다. 아미노산 조성물 분석(이성질화 아스파르테이트와 정규 아스파르테이트를 분리하지 않음)에 의해, 3개의 피크가 동일한 아미노산을 함유하고 있음을 확인했다.

이들 데이터로부터, 3개의 상이한 가교결합 상태의 디펩티드계 종이 요에서 확인됨을 알 수 있다. 분자는 시퀀스 EKAHDGGR에 이성질화 또는 정규 아스파르테이트를 갖는다는 점에서 서로 다르다. 피크 F-24-17-10는 시퀀스 EKAHiDGGR의 2개의 펩티드 유사체를 포함하고, F-26-18-09는 시퀀스 하나의 EKAHiDGGR 및 하나의 EKAHDGGR를 포함하며, F-29-19-24는 시퀀스 EKAHDGGR의 2개의 가교 펩티드를 포함한다.

또한, 분자량이 약 2039인 한 분자에 대해서도 유사한 관찰을 행한다. 이것은 3-히드록시피리디늄 가교결합을 포함하지 않고(형광이 존재하지 않기 때문에), 가교결합체의 특성은 측정되지 않는다.

표 2

요로부터 HPLC에 의해 분리된 펩티드계 종의 MAbA7 및 ISO-ELISA에 의한 검출

폴리클로널 검정은 이소아스파르트산 잔기를 함유하는 펩티드 유사체에, MAbA7은 정규 아스파르트산 잔기를 함유하는 펩티드에 각각 특이성을 나타내는 것으로 보여진다. 이성질화 아스파르트산 및 비이성질화 아스파르트산을 함유하는 디펩티드 유사체는 두가지 검정에 의해 검출될 것이다.

따라서, 상기 두 검정을 요 샘플에 적용하여 이소파르트산 함유 이성질화 펩티드의 레벨과 정규 형태의 레벨을 비교한 결과, 이전에 확증된 골조직이 분해되는 정도를 나타낸다.

실시예 4

비스포스포네이트, 이반드로네이트 (Ibandronate ; Boehringer Mannheim)로 처리한 전후에 취한 폐경기 여성의 혈청 샘플을 상술한 ISOELISA 폴리클로널 검정 및 MAbA7 계 ELISA 모노클로널 검정의 혈청 변형체에서 분석하여 혈청 내의 이성질화 펩티드 유사체 존재에 대한 임상 중대성을 조사한다.

혈청 중에서 타입Ⅰ 분해물의 측정을 위해 전개한 검정은 펩티드 및 펩티드 이성질체 형태로 존재하는 아미노산 시퀀스 EKAHDGGR를 갖는 고정된 합성 펩티드/펩티드 이성질체 혼합물을 기제로 한다. 2단계 카보디이미드절차를 이용하여 BSA에 컨쥬게이트된 이성질화 펩티드로 토끼를 면역화한다. 이성질화 펩티드가 아미노산 시퀀스의 펩티드보다 사용한 토끼에 대해서 실제로 훨씬 더 항원성을 지니는 경우에는, BSA에 컨쥬게이트된 펩티드/펩티드 이성질체 혼합물로 면역화시킬 수 있다. 마이크로타이터 플레이트를 피복하기 위해, 글루타르알데히드를 사용하여 티로글로불린에 펩티드를 컨쥬게이트한다. 이러한 항체와 함께 배양하는 동안에, 이성질화 펩티드 이성질체(검정시에 비활성을 지닌 고정된 펩티드)와 혈청 중의 타입 Ⅰ 콜라겐의 분해 생성물간에 경쟁이 일어난다. 용액 중의 펩티드 함량이 증가함에 따라, 고정된 펩티드 이성질체에 대한 항체의 결합력이 저하되어 광학밀도가 감소될 것이다.

말하자면, 시험관 내의 50㎕ 표준물질(합성 8AA-펩티드 이성질체/펩티드 혼합물) 또는 미지 샘플을 100㎕ 검정 완충액(500mM TRIS, 0.0% Tween 20, 1.0% BSA; pH = 6.5)에 가한다. 상기 150㎕ 용액으로부터, 50㎕을 피펫으로 취하여 예비피복된 ELISA 플레이트의 적절한 웰로 옮긴다. 그 다음에, 50㎕ 항체액(검정 완충액 중에서 1+20,000으로 희석된 EKAHiDGGR의 토끼 항혈청)을 각 웰에 가하고, 플레이트를 밀폐용 테이프로 커버하여 진탕 장치에서 60분간 실온에서 배양한다. 실온에서 하기의 모든 절차를 행한다. 배양후에, 플레이트를 희석된 세정용 완충액(25 mmol/1 TRIS 및 50mmol/1 Nacl pH=7.2)로 3회 세정한다.

퍼옥시다아제와 컨쥬게이트된 항체(검정 완충액에서 1+4000로 희석된 토끼 IgG(Jackson Immunochemicals, PA)에 대한 HRP로 컨쥬게이트된 염소 항체, 100㎕/웰)를 가하고 밀폐된 웰을 진탕 장치에서 60분간 배양한다. 또 한 번의 세정 절차에 이어서, 밀폐하여 15분간 배양시킨 모든 웰에 TMB 기질용액 100㎕를 가한다. 100㎕ 정지액을 가하여 효소 반응을 15분 후에 정지시킨다. ELISA 리더로 450nm에서 광학밀도를 읽어낸다.

5개의 표준물질(25 ng/㎖∼500 ng/㎖)에 대한 평균 흡광도를 플롯함으로써 로그-선형 그래프 페이퍼상에 보정 곡선을 제작한다. 각 환자 표본의 동등한 EKAHiDGGR에 대한 농도를 보정 곡선상의 보간에 의해 측정한다.

결과는 도 4 및 도 5에 나타낸다. 도 4에서 골 재흡수율을 감소시키는 것으로 예기되는 요법으로 15개월간 치료전 후에 펩티드 시퀀스 EKAHDGGR와 반응성을 지닌 항체에 대하여 경쟁하는 분자에 대한 모노클로널 검정에서 반응성을 나타내는 분자의 혈청 레벨에 있어서 상당한 변화가 일어나지 않는다는 것을 알 수 있다. 도 5에서, 폴리크로널 혈청에서 항체에 대한 비펩티드 EKAHiDGGR와 경쟁하는 분자에 대한 폴리클로널 검정에서 반응성을 지닌 분자 레벨에서 이반드로네이트 2.5mg/day 로 6개월간 치료하면 60% 이상 저하되는데, 이는 예기된 요법처리 결과를 반영한다.

본 실시예는 미합중국 특허 제5455179호의 공보에 기재된 종류의 가교 펩티를 포함하는 시퀀스 EKAHDGGR를 통합하는 혈청 중의 펩티드와 다른 가교 결합되거나 전혀 가교결합되지 않은 것을 기제로 하는 유사한 분자의 합은 골 재흡수율의 지표가 아니라 아미노산 시퀀스에서 아스파르트산의 결합부분의 이성질화에 의해 산출된 관련된 비펩티드 분자의 지표이다는 것을 나타낸다.

옥타펩티드의 이성질화 유사체에 대한 특이성은 MabA7 ELISA에서 반응성을 지닌 혈청에 존재하는 분자에 민감하지 못한 ISOELISA에 허용된다는 것을 알 수 있다. 이성질화도는 골 연령에 관계가 있는 것으로 추정되므로, 성숙 골의 교체에 대한 정량화 지표인자이며, 모노클로널 검정에서 방해하는 분자는 골흡수에 관계가 있는 것이 아니라, “ 어린”콜라겐 분자의 교체, 즉 골기질로 아직도 혼입되지 않거나 비골격 자리에서의 일시적인 타입Ⅰ 콜라겐의 교체시에 발생되는 세포외 콜라겐의 단백질 분해에 의해 발생될 것이다.

또한, 체가 아스파르테이트에서의 이성질화 반응에 의해 단백질 유실 보상을 위한 메카니즘을 갖고 있지만, 골에서 콜라겐은 보상 메카니즘으로부터 보호되어 이성질화 반응에 의해 골의 경우에 “ 나이 든”콜라겐의 흡수에 대해 매우 우수한 지표를 나타낸다.

본 발명이 특정 실시예에 대하여 설명되었지만, 본 발명의 범위내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 콜라겐에 대해서만이 아니라 일반적으로 아스파르트산 또는 아스파라긴 함유 단백질에 사용될 수 있다.

Claims (17)

1. 이소아스파르트산을 함유하는 콜라겐내의 아미노산 서열인

   (ⅰ) (iso)Asp-Glu-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly ;

   (ⅱ) Glu-Lys-Ala-His-(iso)Asp-Gly-Gly-Arg ;

   (ⅲ) Gln-Tyr-(iso)Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly ;

   (iv) Gly-Asp-Ile-Lys-(iso)Asp-Ile-Val ;

   (ⅴ) Glu-Lys-Gly-Pro-(iso)Asp ; 및

   (vi) (iso)Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val 중 어느 하나로부터 형성되고,

   콜라겐의 특징을 나타내는 하나 이상의 이성화된 펩티드의 양을 측정하는 것을 포함하는 체단백질의 분해율을 측정하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 체액에 존재하는 하기 일반식 2의 펩티드 유사체의 양, 또는 이소아스파르트산을 함유하는 하기 일반식 2의 펩티드 유사체내에 존재하는 에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩티드 유사체의 양을 측정하는 것을 포함하는 체단백질의 분해율을 측정하는 방법.

   

   상기 일반식 2에서, K-K-K는 자연발생되는 가교결합이고, *는 이소아스파르트산이다.
3. 제1항에 있어서, 상기 측정은 이소아스파르트산을 포함하는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 면역결합파트너(immunological binding partner)를 사용하여 수행하고, 상기 아미노산 서열은

   (ⅰ) (iso)Asp-Glu-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly ;

   (ⅱ) Glu-Lys-Ala-His-(iso)Asp-Gly-Gly-Arg ;

   (ⅲ) Gln-Tyr-(iso)Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly ;

   (iv) Gly-Asp-Ile-Lys-(iso)Asp-Ile-Val ;

   (ⅴ) Glu-Lys-Gly-Pro-(iso)Asp ; 및

   (vi) (iso)Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val 중 어느 하나인 체단백질의 분해율을 측정하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 면역결합파트너는 상기 이소아스파르트산을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 선형 펩티드에 대한 항체인 체단백질의 분해율을 측정하는 방법.
5. 이소아스파르트산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 콜라겐 단편에 특이적으로 결합하고, 상기 아미노산 서열은

   (ⅰ) (iso)Asp-Glu-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly ;

   (ⅱ) Glu-Lys-Ala-His-(iso)Asp-Gly-Gly-Arg ;

   (ⅲ) Gln-Tyr-(iso)Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly ;

   (iv) Gly-Asp-Ile-Lys-(iso)Asp-Ile-Val ;

   (ⅴ) Glu-Lys-Gly-Pro-(iso)Asp ; 및

   (vi) (iso)Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val 중 어느 하나인 항체.
6. 제5항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 서열 EKAHiDGGR를 포함하는 이성화된 서열에 대하여 특이적이거나, 또는 iD를 함유하며 상기 서열내에 존재하는 에피토프에 대해 특이적이고, 상기 iD는 이소아스파르트산인 항체.
7. (ⅰ) (iso)Asp-Glu-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly ;

   (ⅱ) Glu-Lys-Ala-His-(iso)Asp-Gly-Gly-Arg ;

   (ⅲ) Gln-Tyr-(iso)Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly ;

   (iv) Gly-Asp-Ile-Lys-(iso)Asp-Ile-Val ;

   (ⅴ) Glu-Lys-Gly-Pro-(iso)Asp ; 및

   (vi) (iso)Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 이성화된 펩티드에 대한 항체.
8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항 기재 항체의 모노클로날 항체를 생산하는 세포주.
9. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 검출 가능한 표지가 결합된 항체.
10. 이소아스파르트산 잔기를 함유하는 콜라겐의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 아미노산 서열은

    (ⅰ) (iso)Asp-Glu-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly ;

    (ⅱ) Glu-Lys-Ala-His-(iso)Asp-Gly-Gly-Arg ;

    (ⅲ) Gln-Tyr-(iso)Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly ;

    (iv) Gly-Asp-Ile-Lys-(iso)Asp-Ile-Val ;

    (ⅴ) Glu-Lys-Gly-Pro-(iso)Asp ; 및

    (vi) (iso)Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val 중 어느 하나의 서열인 합성 펩티드 유사체
11. 제10항에 있어서, 글리신 잔기가 상기 이소아스파르트산 잔기에 근접한 위치에 존재하는 합성 펩티드 유사체.
12. 아스파르트산 함유 아미노산 서열을 갖는 콜라겐 단편 및 이소아스파르트산 함유 아미노산 서열을 갖는 콜라겐의 대응 단편의 상대적인 양을 측정하는 것을 포함하고,

    상기 이소아스파르트산 함유 아미노산 서열은

    (ⅰ) (iso)Asp-Glu-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly ;

    (ⅱ) Glu-Lys-Ala-His-(iso)Asp-Gly-Gly-Arg ;

    (ⅲ) Gln-Tyr-(iso)Asp-Gly-Lys-Gly-Val-Gly ;

    (iv) Gly-Asp-Ile-Lys-(iso)Asp-Ile-Val ;

    (ⅴ) Glu-Lys-Gly-Pro-(iso)Asp ; 및

    (vi) (iso)Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val 중 어느 하나의 서열을 포함하는 콜라겐 분해에 관한 정보를 얻는 방법.
13. 제10항 또는 제11항 기재의 합성 펩티드 유사체;

    항체-효소 컨쥬게이트 및 이들에 대한 기질 중 하나 이상;

    효소 컨쥬게이트-기질 반응 중지 조성물; 및

    세정액 중의 하나 이상의 물질과 조합한,

    제5항 내지 제7항 중 어느 한 항 기재의 항체 또는 이러한 항체와 동일한 특이성을 갖는 항체단편을 포함하는 제1항 및 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항 기재의 방법에 사용되는 테스트 키트.
14. 제6항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 이의 활성 단편인 항체.
15. 제14항 기재의 항체를 생산하는 세포주.
16. 제14항에 있어서, 검출 가능한 표지가 결합된 항체.
17. 제10항 또는 제11항 기재의 합성 펩티드 유사체;

    항체-효소 컨쥬게이트 및 이들에 대한 기질 중 하나 이상;

    효소 컨쥬게이트-기질 반응 중지 조성물; 및

    세정액 중의 하나 이상의 물질과 조합한,

    제14항 기재의 항체 또는 이러한 항체와 동일한 특이성을 갖는 항체단편을 포함하는 제1항 및 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항 기재의 방법에 사용되는 테스트 키트.