DE69219451T2

DE69219451T2 - Einschätzung der Beinzerbrechlichkeit und Voraussage osteoporotischer Bruchaussicht unter Verwendung einer quantitativen Bestimmung zirkulierendes unterkarboxyliertes Osteokalzin

Info

Publication number: DE69219451T2
Application number: DE69219451T
Authority: DE
Inventors: Pierre Delmas
Original assignee: EN RHUMATOLOGIE CENTRE RECH
Current assignee: CENTRE DE RECHERCHES EN RHUMATOLOGIE LYON FR; Delmas Debra Lyn Lyon Fr
Priority date: 1992-02-27
Filing date: 1992-02-27
Publication date: 1997-10-23
Anticipated expiration: 2012-02-28
Also published as: JP3053503B2; ES2103906T3; ATE152525T1; EP0557663B1; JPH0678788A; EP0557663A1; DE69219451D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beurteilung von Knochenbrüchigkeit und Osteoporosebruchrisiko unter Einsatz einer quantitativen Bestimmung von zirkulierendem untercarboxyliertem Osteocalcin (ucOC). Die Erfindung betrifft ferner einen Kit zum Ausführen der Bestimmung und für eine Verwendung in dem Test geeignete Ahtikörper.
Osteoporose ist eine Brüchigkeit der Knochen, die oftmals bei der älteren Bevölkerungsschicht, insbesondere bei Frauen, festgestellt wird, und ist gekennzeichnet durch eine hohe Häufigkeit von "Fragilitätsbrüchen", d.h. nicht traumatischen oder geringfügig traumatischen Brüchen. Klinische Untersuchungen und eine Beurteilung des Osteoporoserisikos sind besonders schwierig, da die Abnormalitäten des Knochenmetabolismus, die den Zustand kennzeichnen, extrem komplex und subtil sind, wobei diese oftmals sehr allmählich über lange Zeitdauern auftreten.
Dementsprechend ist die Messung von Parametern der Knochenumsatzrate, d.h. des Gleichgewichts zwischen der Bildung von neuem Knochen durch Osteoblasten und der Resorption von altem Knochen durch Osteoklasten, die oftmals zur Untersuchung anderer Knochenkrankheiten eingesetzt wird, die dramatische metabolische Modifizierungen einschließen, wie Morbus Paget oder renale Osteodystrophie, bei Osteoporose nur von begrenztem Nutzen. Tatsächlich kann festgestellt werden, daß konventionelle "Marker" der Knochenbildung und Knochenresorption, beispielsweise Serum-Osteocalcin bzw. Pyridinolin im Urin, bei einigen Patienten mit Osteoporose im normalen Bereich liegen. Da Osteoporose oftmals mit einer geringen Knochenmasse verbunden ist, können Messungen der Knochenmasse unter Einsatz von Absorptiometrie in einigen Fällen nützlich sein. Jedoch ist dieses Verfahren zur Beurteilung von Knochenbrüchigkeit indirekt, teuer und liefert weder Informationen über die nachfolgende Geschwindigkeit des Knochenverlusts noch liefert es Informationen über die Qualität der Knochenstruktur.
In einem Versuch, die Beurteilung des Osteoporoserisikos zu verbessern, kombinieren die meisten derzeit eingesetzten Systeme Messungen der Knochenmasse und der Knochenumsatzrate, wobei der letztgenannte Parameter durch mehrere verschiedene Marker bestimmt und durch invasive Techniken, wie Histomorphometrie, bestätigt wird. Gegenwärtig ist kein biochemischer Marker für Knochenbrüchigkeit und dementsprechend für das Knochenbruchrisiko beschrieben worden.
Es ist ein Gegenstand der Erfindung, einen derartigen biochemischen Marker bereitzustellen.
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung durch die Erfinder, daß Konzentrationen an zirkulierendem untercarboxyliertem Osteocalcin eine Voraussage hinsichtlich des nachfolgenden Risikos von Knochenbrüchen ermöglichen.
Osteocalcin, das auch als Khochen-gla-Protein bezeichnet wird, ist ein einzigartiges, nicht kollagenartiges Protein der extrazellulären Knochenmatrix, das durch die knochenbildenden Zellen, die Osteoblasten, synthetisiert wird. Osteocalcin umfaßt 49 Aminosäuren einschließlich dreier Reste von γ-Carboxyglutaminsäure (GLA), einer Aminosäure, die aus der Vitamin K-abhängigen posttranslationalen Modifizierung von Glutaminsäureresten (GLU) innerhalb des Moleküls resultiert. Die carboxylierten GLA-Reste befinden sich an den Positionen 17, 21 und 24. Osteocalcin inhibiert die Hydroxylapatitbildung in vitro und wird durch das Calcium-regulierende Hormon 1,25-Dihydroxyvitamin D moduliert, aber seine genauen physiologischen Funktionen bleiben unklar. Osteocalcin hat chemotaktische Eigenschaften und kann eine Rolle bei der Initiation der Rekrutierung von Osteoklasten und der Knochenresorption spielen, jedoch ist dies noch Spekulation.
Da ein Teil der neu synthetisierten Osteocalcinmoleküle in den Blutkreislauf austritt, sind die Serumkonzentrationen an Osteocalcin als Index für die Knochenbildung verwendet worden. Mehrere Studien haben gezeigt, daß Serum-Osteocalcin ein empfindlicher und spezifischer Index der Rate der Knochenbildung bei verschiedenen metabolischen Knochenkrankheiten und Nierenerkrankungen ist. Serum-Osteocalcin ist auch ein nützlicher Marker für die Wirkungen einer speziellen Behandlung, die den Knochenmetabolismus und die Knochenmasse beeinflußt. Der Assay auf Serum-Osteocalcin beruht auf der Verwendung polyklonaler und/oder monoklonaler Antikörper, die die Menge von zirkulierenden Osteocalcinmolekülen quantifizieren unabhängig von ihrem Ausmaß an γ-Carboxylierung (Delmas P.D., 1990, Endocrinol. Clin. North Am. 19: 1-18). Unlängst berichteten Koyama et al. (1991, J. Immunol. Meth. 139, 17-23) über die Verwendung von für vollständig carboxyliertes Osteocalcin spezifischen monoklonalen Antikörpern in einem Osteocalcin-Assay.
In 1981 zeigten Price et al., (J. Biol. Chem. 256, Nr. 24, S. 12760-12766, 1981), daß langsam verlaufende Injektionen von Warfarin, einem wirksamen Inhibitor des γ-Carboxylierungsprozesses, zu einer Untercarboxylierung von Osteocalcin führen. Die Rolle von γ- Carboxyglutaminsäure in Osteocalcin ist es, dem Protein zu ermöglichen, fest an Hydroxylapatit, den Hauptbestandteil des Knochens, zu binden. Untercarboxyliertes Osteocalcin kann dementsprechend nicht länger in die Knochenmatrix eingebaut werden und wird in den Blutkreislauf freigesetzt. Gemäß dem Verfahren von Price wird die Messung von nicht carboxyliertem Osteocalcin im Serum durch einen Standard-Radioimmunoassay nach Inkubation des Serums mit Hydroxylapatit ausgeführt. Der carboxylierte Anteil des gesamten Osteocalcins bindet an das Hydroxylapatit und der nicht carboxylierte Anteil wird in dem Überstand gemessen unter Verwendung von Antikörpern, die eine gleiche Affinität sowohl für carboxyliertes als auch für nicht carboxyliertes Osteocalcin aufweisen.
Unter Verwendung dieser Hydroxylapatit-Inkubationstechnik wurde eine Untercarboxylierung von zirkulierendem Osteocalcin bei Patienten unter Antikoagulanzientherapie nachgewiesen (Pietschmann, P., et al., J. Clin. Endocrin. Metab., 1988, 66, 5, S. 1071-1074).
Unlängst zeigten Plantalech L., et al. (J. Bone Miner. Res., 1991, 6, 11, S. 1211-1216), daß zirkulierende Konzentrationen von nicht carboxyliertem Osteocalcin bei älteren Frauen im Vergleich zu den durchschnittlichen Konzentrationen, die bei jüngeren Kontrollen gefunden werden, deutlich erhöht sind. Darüberhinaus zeigte eine signifikante Anzahl von älteren Frauen Konzentrationen an nicht carboxyliertem Osteocalcin, die höher waren als der obere Grenzwert des Normalbereichs. Es wird angenommen, daß diese erhöhten Konzentrationen eher auf eine Beeinträchtigung der Carboxylierung von neu synthetisierten Osteocalcinmolekülen als auf die Decarboxylierung eines zuvor vollständig carboxylierten Moleküls zurückzuführen sind. Konzentrationen von nicht carboxyliertem Osteocalcin wurden bei Frauen mit und ohne frühere Krankengeschichte eines Knochenbruchs verglichen und es wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt. Die Messungen von nicht carboxyliertem Osteocalcin wurden unter Einsatz des Hydroxylapatit-Bindungsassays von Price ausgeführt, der indirekt und nicht sehr empfindlich ist. Diese Dokument diskutiert nicht die Bedeutung der erhöhten Konzentrationen an untercarboxyliertem Osteocalcin und liefert keinen Hinweis darauf, daß diese in Beziehung zu verringerter Knochenmasse und erhöhter Knochenbrüchigkeit, die für Osteoporose charakteristisch sind, stehen.
Eine Erhöhung von nicht carboxyliertem Osteocalcin im Serum bei älteren Frauen, gemessen als Prozentsatz des Gesamt-OC, wurde auch von Knapen et al. (Ann. Intern. Med. 111: 1001-1005, 1989) berichtet. Wieder wurde das Hydroxylapatit-Bindungsverfahren verwendet. Die Assaybedingungen werden in dem Artikel nicht detailliert angegeben. Es wurde keine Verbindung zu Knochenbrüchigkeit hergestellt.
DE-A-4008546 offenbart Antikörper, die für carboxyliertes Osteocalcin spezifisch sind und die mit nicht carboxyliertem Osteocalcin keine Reaktion zeigen. Die Antikörper werden gegen Osteocalcin in pulverisiertem Knochen erzeugt und durchmustert, um jene Antikörper auszuwählen, die mit vollständig carboxyliertem Osteocalcin reagieren können, jedoch unfähig sind, mit untercarboxyliertem Osteocalcin zu reagieren.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beurteilung von Knochenbrüchigkeit und Knochenbruchrisiko, das die spezifische Bestimmung der Konzentrationen an zirkulierendem untercarboxyliertem Osteocalcin umfaßt. Genauer betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung von Knochenbrüchigkeit und Knochenbruchrisiko, das gekennzeichnet ist durch:
- in vitro-Messen der Konzentration von untercarboxyliertem Osteocalcin in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, wie Serum, Plasma oder Urin,
- Vergleichen der Konzentration von untercarboxyliertem Osteocalcin in der Testprobe mit der Konzentration in einer Kontrollprobe, die Konzentrationen an untercarboxyliertem Osteocalcin enthält, die für die Obergrenze des normalen Bereichs repräsentativ sind, wobei Konzentrationen über dieser Obergrenze ein erhöhtes Risiko von Knochenbrüchen anzeigen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Messung der Konzentration von untercarboxyliertem Osteocalcin mittels mindestens eines monoklonalen Antikörpers oder polyklonalen Antikörpers oder Fragmenten davon, wobei die Antikörper oder Fragmente für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifisch sind.
In dem Zusammenhang der Erfindung bezeichnet der Ausdruck "untercarboxyliertes Osteocalcin" (ucOC) Osteocalcin mit weniger als der normalen Anzahl von GLA-Resten. Normalerweise hat das Osteocalcinmolekül 3 GLA-Reste; dementsprechend bezeichnet "untercarboxyliert" Moleküle mit entweder 0, 1 oder 2 GLA-Resten. Für Osteocalcinmoleküle, die 1 oder 2 GLA-Reste tragen, können diese Reste sich an jeder beliebigen der Positionen 17, 21 oder 24 befinden. Die GLA-Gruppe an Position 17 fehlt häufig bei untercarboxylierten Molekülen. Untercarboxyliertes Osteocalcin wird auch als nichtcarboxyliertes Osteocalcin oder ncOC bezeichnet. Für die Zwecke dieser Erfindung werden die Ausdrücke austauschbar verwendet. Der Ausdruck ucOC sollte auch dahingehend verstanden werden, daß er Fragmente von untercarboxyliertem Osteocalcin umfaßt, die für das untercarboxylierte Molekül spezifisch sind und nicht in der vollständig carboxylierten Form von Osteocalcin vorkommen.
Entsprechend dem Verfahren der Erfindung wird die spezifische Messung der ucOC- Konzentrationen in der biologischen Probe vorzugsweise unter Verwendung von Antikörpern oder Fragmenten davon, die für die untercarboxylierte Form des Moleküls spezifisch sind, ausgeführt, wobei "spezifisch" bedeutet, daß in bei einem gegebenen Satz von Reaktionsbedingungen der gleiche Antikörper mit untercarboxyliertem Osteocalcin mit einer höheren Affinität als mit vollständig carboxyliertem Osteocalcin reagieren wird. Normalerweise wird bei den während des Tests angewendeten Bedingungen keine Kreuzreaktion mit vollständig carboxyliertem Osteocalcin beobachtet.
Die für eine Verwendung in dem Verfahren der Erfindung geeigneten Antikörper können ein für Osteocalcinmoleküle mit 0, 1 oder 2 Carboxylgruppen spezifisches polyklonales Serum sein.
Der Antikörper kann auch ein monoklonaler Antikörper sein, der ein beliebiges der für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifischen Epitope erkennt. Eine Zusammenstellung derartiger monoklonaler Antikörper kann auch verwendet werden. Es ist gemäß der Erfindung besonders bevorzugt, einen Antikörper zu verwenden, der ein Epitop erkennt, das in dem Bereich der Aminosäuren 17-24 des untercarboxylierten Osteocalcinmoleküls vorkommt.
Ein anderer Typ Antikörper, der besonders vorteilhaft ist, ist ein Konformations- Antikörper, der die mit dem γ-Carboxylierungsstatus von Osteocalcin assoziierte Tertiärstruktur erkennt. Tatsächlich haben DELMAS et al. (Biochemistry, 1984, 23, S. 4720-4725) bedeutende Konformationsänderungen von Osteocalcin gezeigt, die von dem Ausmaß der γ- Carboxylierung und der Anwesenheit oder Abwesenheit von Calcium abhängen. Ein Beispiel dieses Typs von Konformations-Antikörper ist der in der Veröffentlichung von DELMAS et al., 1984, a.a.O. beschriebene Antikörper (Serum R 102), dessen Bindung an Osteocalcin calciumabhängig ist, wenn Osteocalcin vollständig carboxyliert ist, jedoch nicht, wenn Osteocalcin nicht γ-carboxyliert ist.
Es ist gleichfalls möglich, in dem Verfahren der Erfindung Fragmente von Antikörpern zu verwenden, vorausgesetzt, daß die Spezifität für untercarboxyliertes Osteocalcin beibehalten wird. Derartige Fragmente werden durch Fab-, F(ab')&sub2;-, Fab'- oder Facb-Fragmente exemplifiziert. Von besonderem Interesse sind die Fab- und F(ab)'²-Fragmente. Diese Fragmente werden durch Papain-Verdau bzw. Pepsin-Verdau des gesamten Antikörpers hergestellt.
Die zur Erzeugung der spezifischen Antikörper verwendeten Antigene umfassen humanes, Schaf- oder Rinder-Osteocalcin, das durch thermische oder chemische Verfahren, wie das von MERLE et al., 1990, Bone and Mineral, 11, S. 207-245, beschriebene Verfahren, teilweise oder vollständig decarboxyliert worden ist. Rinder- und Schaf-Osteocalcin sind zwischen den Aminosäuren 20 und 49 bzw. 12 und 49 zu humanem Osteocalcin homolog. Es ist auch möglich, authentisches untercarboxyliertes humanes, Schaf- oder Rinder-Osteocalcin zu verwenden, das in seiner nativen Form oder als Ergebnis einer Behandlung mit Warfarin auftritt. Jedoch ist humanes Osteocalcin sehr instabil und kann schwierig aufzureinigen sein. Die Isolierung ausreichender Mengen an humanem untercarboxyliertem Osteocalcin, um eine Antikörperproduktion zu ermöglichen, ist dementsprechend beschwerlich. Um dieses Problem zu überwinden, ist es besonders bevorzugt, rekombinantes untercarboxyliertes Osteocalcin, wie jenes, das in E. coli exprimiert wird, zu verwenden. Tatsächlich ist das rekombinante ucOC frei von GLA-Resten und kann in großen Mengen hergestellt werden.
Synthetisches untercarboxyliertes Osteocalcin wie auch synthetische Peptide, die Fragmenten des ucOC entsprechen, können auch als Antigen verwendet werden, vorausgesetzt, daß diese Fragmente Epitope tragen, die für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifisch sind, oder mindestens einen Teil der Tertiärstruktur des untercarboxylierten Moleküls repräsentieren. Besonders bevorzugte Fragmente sind jene, die die Aminosäuren 17-24 umfassen. Im allgemeinen enthalten die Fragmente mindestens 8 Aminosäuren, beispielsweise 10 bis 20. Synthetisches Osteocalcin oder Fragmente davon sind besonders vorteilhaft, insoweit Moleküle, die entweder 0, 1 oder 2 GLA-Reste tragen, je nach Wunsch synthetisiert werden können, was dann die Produktion von Antikörpern ermöglicht, die spezifisch die unterschiedlichen Grade von Untercarboxylierung erkennen. Fragmente, denen die GLA-Gruppen an Position 17 fehlt, sind bei der Erzeugung von Antikörpern besonders bevorzugt. Fragmente von untercarboxyliertem Osteocalcin für eine Verwendung als Antigen zur Erzeugung der Antikörper können auch durch Spaltung des vollständigen untercarboxylierten Osteocalcinmoleküls hergestellt werden, beispielsweise durch Säurespaltung, was zu einem Fragment führt, das aus den Aminosäuren 15-48 zusammengesetzt ist, oder durch tryptische Spaltung, was zu einem Fragment 21-42 führt, oder durch V8-Proteaseverdau, was zu einem Fragment 8-31 führt.
Die polyklonalen und monoklonalen Antikörper der Erfindung werden entsprechend herkömmlichen Techniken erzeugt unter Verwendung der vorstehend genannten Immunogene. Deren Spezifität für untercarboxyliertes Osteocalcin wird durch Durchmustern der erzeugten Antikörper sowohl mit carboxyliertem als auch untercarboxyliertem Osteocalcin und synthetischen Peptiden in Gegenwart und in Abwesenheit von Ca²&spplus; und Auswahl jener Antikörper, die eine viel geringere Kreuzreaktivität mit der carboxylierten als mit der untercarboxylierten Form oder überhaupt keine Kreuzreaktion zeigen, sichergestellt. Antikörper mit Spezifitäten für das Osteocalcinmolekül, das entweder 0, 1 oder 2 GLA-Moleküle trägt, können selektioniert werden, indem die Antikörper mit Molekülen in Kontakt gebracht werden, die eine Anzahl von Carboxylgruppe aufweisen, die sich von jener unterscheidet, nach deren Spezifität gesucht wird.
Es ist vorteilhaft, die Empfindlichkeit der selektionierten Antikörper zu bestätigen, um den akkuraten Nachweis von Konzentrationen an nicht carboxyliertem Osteocalcin, die typischerweise im Serum vorkommen, beispielsweise 0,5 ng/ml, sicherzustellen.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung können die Konzentrationen an untercarboxyliertem Osteocalcin als Absolutwert oder als Prozentsatz des gesamten zirkulierenden Osteocalcins gemessen werden. Beide Parameter sind ein Marker für Knochenbruchrisiko, obwohl der Absolutwert besonders bevorzugt ist. Im Falle einer Messung als Prozentsatz des gesamten zirkulierenden Osteocalcins können die Gesamtkonzentrationen unter Verwendung von Antikörpern, wie jenen früher beschriebenen, die gleiche Affinitäten gegenüber den carboxylierten und den nicht carboxylierten Molekülen aufweisen, bestimmt werden. Alternativ können die Gesamtkonzentrationen unter Verwendung eines Antikörpers, wie jenem von DELMAS et al. (Biochemistry, 1984, 23, 4720-4725) beschriebenen, bestimmt werden. In Abwesenheit zweiwertiger Metallionen sind derartige Antikörper für die untercarboxylierte Form spezifisch. Ein Zusatz von Metallionen, wie Calcium oder Magnesium, setzen den Antikörper in die Lage, auch die carboxylierte Form zu erkennen. Unter Verwendung dieses letzteren Verfahrens können sowohl das untercarboxylierte als auch das gesamte Osteocalcin schnell und bequem gemessen werden, da der gleiche Antikörper für jede Messung eingesetzt wird.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung kann die Probe einer biologischen Flüssigkeit Serum, Plasma, Urin oder Blut sein. Serum ist besonders bevorzugt. Die Proben biologischer Flüssigkeit können hinsichtlich des Volumens von ungefähr 10 bis ungefähr 250 µl, beispielsweise 50 bis 100 µl variieren.
Die Patienten, denen die Proben abgenommen werden, dürfen nicht unter Antikoagulanzientherapie unter Verwendung eines Vitamin K-Antagonisten stehen, da derartige Arzneimittel eine Erhöhung der Konzentrationen an zirkulierendem nicht carboxyliertem Osteocalcin hervorrufen und dementsprechend die Ergebnisse verfälschen würden. Am häufigsten werden die Patienten postmenopausale Frauen sein, aber die Beurteilung des Risikos bei älteren Männern ist gleichfalls wertvoll.
Beim Ausführen des Verfahrens der Erfindung werden die spezifischen Antikörper mit der Probe biologischer Flüssigkeit in Kontakt gebracht, wobei die Reaktionsbedingungen derart sind, daß der quantitative Nachweis des untercarboxylierten Osteocalcins ermöglicht wird. Sind die Konzentrationen in der Probe einmal bestimmt, werden sie mit einer Kontrollprobe verglichen, die untercarboxyliertes Osteocalcin in Konzentrationen enthält, die für die Obergrenze des normalen Bereichs bei jungen Menschen repräsentativ sind. Die Obergrenze des normalen Bereichs ist als der Mittelwert von Konzentrationen an untercarboxyliertem Osteocalcin + zwei Standardabweichungen (Mittelwert + 2 SD) definiert. Dieser Wert wird bei einer Gruppe von gesunden prämenopausalen Frauen im Alter von beispielsweise 31 ± 7 Jahren und unter Verwendung der gleichen experimentellen Bedingungen und Reagenzien wie jenen, die in dem Test verwendet werden sollen, bestimmt. Die Gruppe von prämenopausalen Frauen sollte normalerweise aus mindestens 20 Frauen bestehen. Sie sollten gesund sein ohne Krannheitsgeschichte einer metabolischen Knochenerkrankung und sollten weder Arzneimittel, die bekanntermaßen den Knochenmetabolismus beeinflussen, noch Antikoagulanzien des Vitamin K-Antagonistentyps einnehmen. Der genaue Wert der Obergrenze der normalen Konzentration variiert entsprechend den eingesetzten experimentellen Bedingungen und Reagenzien, beispielsweise dem Antikörper. Gegenwärtig wurde die Obergrenze des normalen Bereichs von untercarboxyliertem Osteocalcin unter Verwendung des Hydroxylapatit- Bindungsverfahrens als Mittelwert + 2 Standardabweichungen berechnet und beträgt ungefähr 1,65 ng/ml (16,7 % von Gesamt). Es wird betont, daß dieser Grenzwert die Obergrenze des normalen Bereichs unter Einsatz dieses Verfahrens, das einen indirekten und relativen Wert liefert, darstellt.
Die Erfinder haben gefunden, daß, wenn eine Population älterer Frauen hinsichtlich der Beurteilung von Osteoporose untersucht wird, die meisten Patientinnen höhere ncOC- Konzentrationen als der bei jungen Kontrollpersonen gefundene Durchschnittswert zeigen (beispielsweise mehr als 0,65 ng/ml). Jedoch zeigen einige Patientinnen Konzentrationen, die höher sind als die Obergrenze (beispielsweise mehr als 1,65 ng/ml). Diese letztgenannten Patientinnen sind jene mit stark erhöhtem Bruchrisiko. Das Risiko steigt in dem Maße an, wie die Konzentrationen über diesen Schwellenwert hinaus anwachsen.
Der Nachweis der Antigen/Antikörper-Reaktion wird durch Einsatz herkömmlicher Nachweistechniken ermöglicht. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Kompetitions- Radioimmunoassays, bei denen das Nachweismittel radioaktiv markiertes, nicht carboxyliertes Osteocalcin ist, beispielsweise unter Verwendung von ¹²&sup5;I. Gemäß dieser Ausführungsform wird spezifischer Antikörper an eine feste Phase gebunden und eine Mischung von Test(unmarkiert) und markiertem uncarboxyliertem Osteocalcin wird aufgebracht. Die markierten und unmarkierten Antigene kompetitieren miteinander um die Bindungsstellen der Antikörper. Je größer die Menge an vorliegendem Testantigen ist, umso weniger markiertes Antigen wird an den Antikörper binden. Kalibrierungskurven unter Verwendung bekannter Mengen an unmarkierten Antigenen werden hergestellt.
Ein anderes Nachweisverfahren ist ein kompetitiver Enzymimmunoassay unter Verwendung von enzymmarkiertem nicht carboxyliertem Osteocalcin. Geeignete Enzymmarkierungen sind von TANAKA et al. (Journal of Immunological Methods, 1984, S. 1924-1986) beschrieben worden.
Eine weitere Möglichkeit ist ein Sandwich-Enzymimmunoassay, bei dem zwei monoklonale Antikörper ausgewählt werden, die an zwei verschiedene Stellen auf dem untercarboxylierten Osteocalcinmolekül binden. Einer dieser Antikörper ist ein "Capture"-Antikörper und wird vorzugsweise auf einem festen Träger immobilisiert und der andere Antikörper ist ein "Detektor"-Antikörper. Der Detektor-Antikörper ist enzymmarkiert oder kann radioaktiv markiert sein, beispielsweise mit ¹²&sup5;I.
Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Assay beträgt vorzugsweise mindestens 0,2 ng/ml.
Ist einmal das erhöhte Risiko von Knochenbrüchigkeit, das Anzeichen von Osteoporose, diagnostiziert worden, können geeignete therapeutische Maßnahmen, die die Geschwindigkeit des Knochenverlusts verringern können und das Bruchrisiko verringern, vorgenommen werden. Die Erfinder haben gezeigt, daß die Verabreichung von Vitamin D an Patientinnen mit hohen Konzentrationen an nichtcarboxyliertem Osteocalcin die Wirkung hat, daß diese Konzentrationen teilweise korrigiert werden. Die Erfinder haben auch gezeigt, daß Konzentrationen von nicht carboxyliertem Osteocalcin ein Marker für Vitamin D-Mangel bei älteren Menschen sind. Tatsächlich ist Vitamin D-Mangel ein wohl bekannter Risikofaktor für Osteoporose. Der Test der Erfindung ermöglicht dementsprechend die gleichzeitige Beurteilung von Osteoporosebruchrisiko und Vitamin D-Status.
Die Erfindung betrifft ferner einen Kit für die Beurteilung von Knochenbrüchigkeit und Knochenbruchrisiko durch quantitative Bestimmung des zirkulierenden untercarboxylierten Osteocalcins, wobei der Kit umfaßt:
- Mittel zum Messen der Konzentration an untercarboxyliertem Osteocalcin in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, wie Serum, Plasma oder Urin,
- ein beliebiges notwendiges Nachweismittel.
Vorzugsweise enthält der Kit als Mittel zum Messen der Konzentration von ucOC mindestens einen monoklonalen Antikörper oder polyklonale Antikörper oder Fragmente davon, wobei die Antikörper oder Fragmente für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifisch sind, zusammen mit Mitteln zum Nachweisen der Antigen-Antikörper-Reaktion und gegebenenfalls zweiwertigen Metallionen, wie Ca²&spplus;.
Die Antikörper und das Nachweismittel, die in dem Kit der Erfindung enthalten sind, sind jene vorstehend beschriebenen. Die Antikörper sind vorzugsweise auf einem festen Träger, wie Membranen, Gefäßwänden oder Mikrokügelchen immobilisiert.
Der Kit der Erfindung kann ferner zweiwertige Metallionen, wie Ca²&spplus;, beispielsweise in Form von Calciumchlorid, enthalten. Das Einbringen von Calcium ist vorteilhaft, wenn die Antikörper vom Konformationstyp sind.
Der Kit kann auch ferner eine oder zwei Kontrollproben umfassen, die bekannte Konzentrationen an untercarboxyliertem Osteocalcin enthalten, die einen Vergleich der zu messenden Probe mit dem durch den Assay definierten Schwellenwert ermöglichen. Der Schwellenwert (Obergrenze des normalen Bereichs) ist wie vorstehend angegeben definiert.
Die Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen monoklonalen und polyklonalen Antikörper, die für eine Verwendung zum Ausführen der quantitativen Bestimmung der Erfindung geeignet sind. Diese Antikörper zeigen vorzugsweise eine schwache Kreuzreaktion mit carboxyliertem Osteocalcin unabhängig von den Reaktionsbedingungen, wie der Gegenwart von Metallionen. Deren Empfindlichkeit ist so, daß ein Nachweis von nicht carboxyliertem Osteocalcin in Konzentrationen von ungefähr 0,5 ng/ml und vorzugsweise 0,2 ng/ml ermöglicht wird.

BEISPIELE

I.- Messung von carboxyliertem (carbOC) und nicht carboxyliertem (ncOC) Osteocalcin und anderen Parametern des Knochenmetabolismus in biologischen Proben und Korrelation mit nachfolgendem Risiko von Hüftbruch:

Gesamt-OC, ncOC, Calcium, Phosphat, Parathormon (PTH), 25-Hydroxyvitamin D (25 OHD), alkalische Phosphatase und Creatinin wurden in den Seren von 195 älteren, in ein Heim eingewiesenen Frauen (70 - 101 Jahre) gemessen.
Frauen in ernster medizinischer Verfassung wurden aus der Studie herausgenommen wie auch Frauen, die Arzneimittel erhielten, die den Knochenmetabolismus beeinflußten, Vitamin D und/oder Calcium (während mehr als 1 Jahr), Natriumfluorid (während mehr als 3 Monaten) und Warfarinhomologe (zum Zeitpunkt der Rekrutierung).
Die Osteocalcinkonzentration wurde mit dem früher beschriebenen Radioimmunoassay/Hydroxylapatit-Verfahren (Merle, B. et al., 1990, Bone Miner. 11: 237-245) unter Verwendung von polyklonalem Kaninchen-Antiserum (AS 140), das die gleiche Affinität für ncOC und carbOC aufwies, gemessen. Das an Hydroxylapatit gebundene OC wurde mit einer Mischung von Schaf-anti-Kaninchen-IgG-Antiserum und Polyethylenglycol (PR CIS BIO Industrie, Frankreich) präzipitiert und zentrifugiert. Das Präzipitat wurde mit dem Assaypuffer gespült und erneut zentrifugiert. Die Empfindlichkeit dieses Assay ist 0,2 ng/ml. Das Verfahren zur Messung des nOC auf Grundlage der unterschiedlichen Affinitäten von carbOC und ncOC für Hydroxylapatit wird in der Veröffentlichung von Merle, B., et al., (a.a.O.) beschrieben. Kurz zusammengefaßt, wurden 250 µl-Proben mit 5 und 10 mg Hydroxylapatit (Calcium Phosphate Tribasic type IV, Sigma Chemicals) in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß inkubiert und 1 h bei +4ºC durch kontinuierliches Umwenden des Reaktionsgefäßes auf den Kopf und weiter in die Ausgangsposition gemischt und dann zentrifugiert. Diese Mengen an Hydroxylapatit liefern die beste Unterscheidung zwischen den Bindungsfahigkeiten von carbOC und ncOC, die in 250 µl Serum vorliegen. Die ncOC-Konzentration wurde als der Mittelwert von in beiden Überständen (mit 5 und 10 mg Hydroxylapatit) gemessenen Konzentrationen berechnet. Die ncOC-Konzentration wurde auch als der Prozentsatz der gesamten OC- Konzentration (ncOC %) ausgedrückt. Die carbOC-Konzentration wurde als die Differenz zwischen Gesamt-OC und ncOC berechnet.
Die Obergrenzen des normalen Bereichs für OC und dessen Fraktionen wurden als der Mittelwert ± 2 SD (Standardabweichung) bei 21 gesunden, prämenopausalen Frauen im Alter von 21 - 44 Jahren berechnet. Für dieses Bestimmungsverfahren sind diese Grenzwerte: 13,9 ng/ml für Gesamt-OC, 12,5 ng/ml für carbOC und 1,65 ng/ml (16,7% von Gesamt) für ncOC.
Die Konzentrationen von Calcium, anorganischem Phosphor, Gesamtprotein und Creatinin im Serum wurden unter Einsatz herkömmlicher Verfahren gemessen. Die Konzentration an intaktem Parathormon (PTH) wurde unter Verwendung des Magic Lite Intact PTH Immunoassay (CIBA CORNING) gemessen. Die 25 OHD-Konzentration wurde unter Verwendung eines Kit (Bühlmann Laboratories AG, Schweiz) bestimmt. Die alkalische Phosphatase-Aktivität wurde unter Verwendung von Automated Analysis Boehringer Mannheim gemessen.
Es wurde festgestellt, daß Serum-ncOC bei älteren Frauen (1,18 ± 0,12 ng/ml) im Vergleich zu jungen Kontrollpersonen (0,65 ± 0,11 ng/ml, p< 0,01) erhöht war. Bei 45 Frauen (23,1%) lag Serum-ncOC über der Obergrenze des normalen Bereichs für junge Frauen (d.h. > 1,65 ng/ml). NcOC war in negativer Weise mit 25OHD korreliert (r = -0,32, p< 0,001) sogar nach Ausschluß des Alterseffekts, PTH und Creatinin durch partielle Korrelation (r = -0,24, p< 0,002). Diese letztgenannte Beobachtung ist besonders interessant, da sie anzeigt, daß je höher die ncOC-Konzentrationen sind, desto geringer die Vitamin D- Konzentrationen sind. NcOC-Konzentrationen sind dementsprechend ein Marker für Vitamin D-Mangel bei älteren Menschen, ein wohlbekannter Risikofaktor für Osteoporose.
Die Frauen wurden dann vorausschauend 18 Monate beobachtet und der medizinische Zustand, Behandlung und Auftreten von Brüchen wurden alle 6 Monate aufgezeichnet. Sie wurden statistisch einer Behandlung entweder mit Ca (1,2 g/d) und Vitamin D (800 U/d) oder mit doppeltem Placebo als Teil eines prospektiven Versuchs hinsichtlich der Wirkung von Ca und Vitamin D auf das Auftreten von Hüftbrüchen zugeteilt. Wahrend der 18-monatigen Nachsorge erlitten 15 Frauen einen Hüftbruch und ihre grundlegenden biochemischen Messwerte wurden mit jenen der 180 Frauen, die keinen Bruch erlitten, verglichen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt: TABELLE 1: Vergleich von ncOC, carbOC, Gesamt-OC und herkömmlichen Calciummetabolismus-Parametern bei Frauen, die einen Hüftbruch erlitten, mit jenen bei der Gruppe ohne Brüche
NS = nicht signifikant
Diese Ergebnisse zeigen, daß bei Frauen, die nachfolgend einen Hüftbruch erlitten, ncOC höher war als bei der Gruppe ohne Brüche, was im Gegensatz steht zu keinerlei signifikanten Unterschieden hinsichtlich alkalischer Phosphatase, PTH, 25OHD, Gesamt- und carboxyliertem OC und anderen Parametern, wie Calcium, Phosphat und Creatinin im Serum. Das Risiko eines Hüftbruchs, ausgewertet unter Verwendung von Odds Ratio (O.R., berechnet entsprechend der Mantel-Haenszel-Methode), angepaßt für eine Behandlung bei der Gruppe mit Behandlung (Ca + Vitamin D/Placebo), für bekanntermaßen das Hüftbruchrisiko beeinflussende Erkrankungen und für entsprechende Arzneimittel, war bei Frauen mit erhöhter ncOC-Konzentration (> 1,65 ng/ml) : OR. 7,1, 99,9 % CI 1,1-46,3, p < 0,001, und bei jenen mit erhöhtem Prozentsatz an ncOC (> 16,7%) (O.R. = 3,9, 95 % CI 1,4-11,3, p < 0,05) erhöht. In anderen Worten neigten Frauen mit Konzentrationen an ncOC über der Obergrenze des normalen Bereichs, ausgedrückt entweder als Absolutwert oder als Prozentsatz des gesamten OC, sieben mal mehr zu einem nachfolgenden Hüftbruch als jene, die Konzentrationen aufwiesen, die geringer als die Obergrenze waren.
Die Frauen, die Brüche erlitten, waren nicht älter. Wenn grundlegende biochemische Messwerte bei beiden Gruppen verglichen wurden, waren nur ncOC (p< 0,01) und der Prozentsatz an ncOC (p< 0,01) bei den Patientinnen erhöht, die später einen Hüftbruch erlitten. Andere Parameter unterschieden sich nicht signifikant.
Folglich sind ncOC und der Prozentsatz an ncOC die einzigen Parameter, die einen Voraussagungswert bei der Beurteilung des Knochenbruchrisikos haben. Herkömmliche Calciummetabolismus-Parameter haben keinen Voraussagungswert. Serum-ncOC scheint dementsprechend Veränderungen in der Knochenmatrix, die mit erhöhter Brüchigkeit assoziiert sind, zu reflektieren.
Was die Wirkung von Ca und Vitamin D auf die Häufigkeit von Hüftbrüchen betrifft, wurde beobachtet, daß während eines Jahres einer Vitamin D/Ca-Behandlung ucOC abnahm (p< 0,05), insbesondere bei jenen mit den anfänglich erhöhten Werten (von 2,5 ± 0,41 auf 1,41 ± 0,29 ng/ml, p< 0,005) im Gegensatz zu einem Anstieg von ncOC bei der Placebogruppe (p< 0,05).
Da Vitamin K eine Hauptrolle bei der γ-Carboxylierung der GLA-enthaltenden Proteine spielt, wurden die Serumkonzentrationen von Vitamin K1 und den hauptsächlichen zirkulierenden Einheiten von Vitamin K2, Menachinon-7 (MK-7) und Menachinon-8 (MK-8) bei 51 Patienten mit Hüftbruch gemessen. Die Ergebnisse zeigten, daß K1, MK-7 und MK-8 im Serum bei Hüftbruchpatienten vemngert waren, wenn sie mit hinsichtlich Alter und Geschlecht übereinstimmenden Kontrollpersonen verglichen wurden (beispielsweise Vitamin K1: 336 ± 302 gegenüber 585 ± 490 pg/ml, p< 0,01). Diese Daten zeigen das Vorliegen eines Vitamin K-Mangels bei älteren Patienten mit Hüftbruch. Die Tatsache, daß eine Untercarboxylierung von zirkulierendem OC in gewissem Ausmaß mit Vitamin K-Mangel in Beziehung steht, wird auch durch die Tatsache unterstützt, daß niedrige Dosen von Vitamin K1 (1 mg/Tag) ucOC-Konzentrationen signifikant verringern (siehe Plantalech, L. et al., in Osteoporosis 1990, Hrsg.: C. Christiansen und K. Overgaard, S. 345-347, und Knapen MHJ et al., Ann. Int. Med. 1989, 111: 1001). Der Test der Erfindung ermöglicht dementsprechend auch eine Beurteilung des Vitamin K-Status.

II.- Beurteilung der Knochenbrüchigkeit unter Verwendung spezifischer Antikörper zur Messung von ncOC-Konzentrationen:

Antiserum gegen vollständig carboxyliertes OC wurden in Kaninchen, wie früher beschrieben (DELMAS et al., 1983, J. Clin. Invest., 71, 1316-1321), erzeugt. Das für diesen Assay ausgewählte Antiserum wurde auf Grundlage von dessen Ca²&spplus;-Abhängigkeit der Bindung ausgewählt. Ein ähnliches Serum ist detailliert in Delmas et al., 1984, Biochemistry, 23, 4720-4725, beschrieben worden.
In Gegenwart von Ca²&spplus; oder anderen zweiwertigen Metallionen, wie Mg²&spplus;, bindet das Antiserum carboxyliertes und thermisch decarboxyliertes OC mit der gleichen Affinität. Bei Entfernung von Ca²&spplus; mit Ethylendiamintetraessigsäure wird die Bindung von Antikörper an carboxyliertes OC unterbunden, während eine Bindung von Antikörper an decarboxyliertes OC beibehalten wird.
Dementsprechend wurde das durch vollständig carboxyliertes OC in Abwesenheit von Ca²&spplus; nicht präsentierte Epitop entweder durch Zugabe von Ca²&spplus; oder durch Decarboxylierung wiederhergestellt. Zusätzlich zeigten Zirkulardichroismusuntersuchungen, daß diese Ca²&spplus;- und GLA-abhängigen Veränderungen der Antikörperbindung mit Veränderungen in der Tertiärstruktur des Moleküls (ersichtliche α-Helix) verbunden waren. Zusammengenommen legen diese Daten die Existenz von Konformationsepitopen von OC nahe, die von dem Carboxylierungsstatus des Moleküls abhängen.
Dieser Typ von Antikörpern ist für eine Verwendung in dem Assay der Erfindung geeignet.

Claims

1. Verfahren zur Beurteilung von Knochenbrüchigkeit und Osteoporosebruchrisiko, gekennzeichnet durch

- in vitro-Messen der Konzentration von untercarboxyliertem Osteocalcin in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, wie Serum, Plasma oder Urin,

- Vergleichen der Konzentration von untercarboxyliertem Osteocalcin in der Testprobe mit der Konzentration in einer Kontrollprobe, die Konzentrationen an untercarboxyliertem Osteocalcin enthält, die für die Obergrenze des normalen Bereichs, die als der Mittelwert von Konzentrationen an untercarboxyliertem Osteocalcin + zwei Standardabweichungen definiert ist, repräsentativ sind, wobei Konzentrationen über dieser Obergrenze ein erhöhtes Risiko von Knochenbrüchen anzeigen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Konzentration an untercarboxyliertem Osteocalcin mittels mindestens eines monoklonalen Antikörpers oder mittels polyklonaler Antikörper oder Fragmenten davon bewirkt wird, wobei die Antikörper oder Fragmente für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifisch sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in dem die Konzentration an untercarboxyliertem Osteocalcin als Absolutwert oder als Prozentsatz des gesamten zirkulierenden Osteocalcins gemessen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, in dem die Antikörper ein polyklonales Serum sind, das für Osteocalcinmoleküle, die 0, 1 oder 2 Carboxylgruppen tragen, spezifisch ist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, in dem der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der ein beliebiges der für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifischen Epitope erkennt, oder eine Zusammenstellung solcher monoklonalen Antikörper ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, in dem der Antikörper ein Epitop erkennt, das in dem Bereich der Aminosäuren 17-24 des untercarboxylierten Osteocalcinmoleküls auftritt, oder ein konformationsspezifischer Antikörper ist, der die mit untercarboxyliertem Osteocalcin assoziierte Tertiärstruktur erkennt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, in dem der Antikörper ein konformationsspezifischer Antikörper ist, dessen Spezifität für untercarboxyliertes Osteocalcin von der Abwesenheit zweiwertiger Metallionen, wie Ca²&spplus;, abhängt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, in dem die Antikörperfragmente Fab-, F(ab')&sub2;-, Fab'- oder Facb-Fragmente sind.

9. Verfahren nach Anspruch 2, in dem die spezifischen Antikörper gegen natives oder warfarin-induziertes untercarboxyliertes Osteocalcin von Mensch, Schaf oder Rind, gegen natives Osteocalcin von Mensch, Schaf oder Rind, das beispielsweise durch thermische oder chemische Verfahren decarboxyliert wurde, gegen rekombinantes untercarboxyliertes Osteocalcin, gegen synthetisches untercarboxyliertes Osteocalcin oder gegen Fragmente von jedem beliebigen der vorstehend genannten erzeugt werden, wobei die Fragmente für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifische Epitope tragen.

10. Kit zur Beurteilung von Knochenbrüchigkeit und Knochenbruchrisiko durch quantitative Bestimmung von zirkulierendem untercarboxyliertem Osteocalcin, wobei der Kit umfaßt:

- Mittel zum spezifischen Messen der Konzentration von untercarboxyliertem Osteocalcin in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, wie Serum, Plasma oder Urin, wobei dieses Mittel mindestens einen monoklonalen Antikörper oder polyklonale Antikörper oder Fragmente davon umfaßt und die Antikörper oder Fragmente für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifisch sind,

- jedes beliebige erforderliche Mittel zum Nachweisen der Antigen-Antikörper-Reaktion;

- gegebenenfalls zweiwertige Metallionen, wie Ca²&spplus;.

11. Kit nach Anspruch 10, in dem die Antikörper ein für Osteocalcinmoleküle, die 0, 1 oder 2 Carboxylgruppen tragen, spezifisches polyklonales Serum sind.

12. Kit nach Anspruch 10, in dem der Antikörper ein monoklonaler Antikörper, der ein beliebiges der für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifischen Epitope erkennt, oder eine Zusammenstellung solcher monoklonalen Antikörper ist.

13. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 12, in dem der Antikörper ein Epitop erkennt, das in dem Bereich der Aminosäuren 17-24 des untercarboxylierten Osteocalcinmolekuls auftritt, oder ein konformationsspezifischer Antikörper ist, der die mit untercarboxyliertem Osteocalcin assoziierte Tertiärstruktur erkennt.

14. Kit nach Anspruch 13, in dem der Antikörper ein konformationsspezifischer Antikörper ist, dessen Spezifität für untercarboxyliertes Osteocalcin von der Abwesenheit zweiwertiger Metallionen, wie Ca²&spplus;, abhängt.

15. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 14, in dem die Antikörperfragmente Fab-, F(ab')&sub2;-, Fab'- oder Facb-Fragmente sind.

16. Kit nach Anspruch 10, in dem die spezifischen Antikörper gegen natives untercarboxyliertes Osteocalcin von Mensch oder Rind, gegen natives Osteocalcin von Mensch oder Rind, das beispielsweise durch thermische oder chemische Verfahren decarboxyliert wurde, gegen rekombinantes untercarboxyliertes Osteocalcin, gegen synthetisches untercarboxyliertes Osteocalcin oder gegen Fragmente von jedem beliebigen der vorstehend genannten erzeugt werden, wobei die Fragmente für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifische Epitope tragen.

17. Kit nach einem der Ansprüche 10 bis 16, in dem das Nachweismittel aus der Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus radioaktiv markiertem, nicht carboxyliertem Osteocalcin, enzymmarkiertem, nicht carboxyliertem Osteocalcin und enzymmarkierten Antikörpern, die ein Epitop von nicht carboxyliertem Osteocalcin erkennen, das von demjenigen verschieden ist, das durch den Antikörper, der als Capture-Antikörper für das nicht carboxylierte Osteocalcin verwendet wird, erkannt wird.

18. Kit nach einem der Anspruche 10 bis 17, in dem die Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert sind.

19. Monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Fragmente davon, die für eine Verwendung in dem Verfahren der Ansprüche 1 bis 9 geeignet und für untercarboxyliertes Osteocalcin spezifisch sind.

20. Antikörper oder Fragmente davon nach Anspruch 19, die Osteocalcin, das 0, 1 oder 2 Carboxylgruppen trägt, spezifisch erkennen.

21. Antikörper oder Fragmente davon nach Anspruch 20, die ein Epitop erkennen, das in dem Bereich der Aminosäuren 17-24 des untercarboxylierten Osteocalcinmoleküls auftritt, oder die die mit untercarboxyliertem Osteocalcin assoziierte Tertiärstruktur erkennen.

22. Antikörper nach den Ansprüchen 19-21 für eine Verwendung in einem diagnostischen Test zum Vorhersagen von Knochenbrüchigkeit.

23. Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 10 bis 18 für eine in vitro-Diagnose von Osteoporosebruchrisiko und Knochenbrüchigkeit und gegebenenfalls eine gleichzeitige Beurteilung des Vitamin D-Status.