DE69628713T2

DE69628713T2 - Marker und Reagenz für Diabetes mellitus und Diabetes-mellitus-Komplikationen

Info

Publication number: DE69628713T2
Application number: DE69628713T
Authority: DE
Inventors: Hisahiko Tokuyama-shi Iwamoto; Masato Tokuyama-shi Okada
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1995-10-24
Filing date: 1996-10-24
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2016-10-25
Also published as: EP0770875A2; DE69628713D1; EP0770875B1; EP0770875A3; US5811242A

Description

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen Marker und ein Reagenz für Diabetes mellitus und Diabetes mellitus-Komplikationen. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Marker für die Diagnose von Diabetes mellitus und Diabetes mellitus-Komplikationen und zur Bewertung der medizinischen Wirkung eines Arzneimittels sowie ein Reagenz für die Diagnose, Therapie oder Prophylaxe von Diabetes mellitus und Diabetes mellitus-Komplikationen.
Es ist bekannt, dass ein Protein im Blut mit Glucose nicht-enzymatisch unter Glycosylierung reagiert und zu einem glycosylierten Protein wird. Diese Glycosylierung ("glycation") wird als "Maillard-Reaktion" bezeichnet und ist in Umsetzungen einer frühen Stufe und einer späten Stufe unterteilt. Die Umsetzung der frühen Stufe wird im allgemeinen als eine Stufe definiert, bei der Seitenketten-Aminogruppen oder N-terminale Aminogruppen des Proteins mit einer Carbonylgruppe des Zuckers über eine Schiff-Base unter Bildung von gemäß Amadori umgelagerten Verbindungen reagieren. Als Reaktionsprodukt in der frühen Stufe sind Hämoglobin AlC, glycosyliertes Albumin und dergleichen bekannt. Es ist bekannt, dass diese Verbindungen als klinische Marker für Diabetes mellitus verwendet werden.
Ferner ist bekannt, dass nach der Umsetzung der frühen Stufe die durch die Amadori-Umlagerung gebildeten Verbindungen einer Veränderung in zwei Richtungen unterliegen. Eine Richtung besteht in einer Umsetzung, die von mindestens einem der Erscheinungen Fluoreszenz, Bräunung und Vernetzung im Molekül und/oder zwischen Molekülen begleitet ist (nachstehend auch als "Reaktion A der späten Stufe" bezeichnet). Bei der zweiten Richtung handelt es sich um eine oxidative Spaltungsreaktion (nachstehend auch als "Reaktion B der späten Stufe" bezeichnet), an der Sauerstoff und ein Übergangsmetall beteiligt sind.
Obgleich das Endprodukt der Maillard-Reaktion als "AGE" (Advanced Glycation End products = fortgeschrittene Glycosylierungsendprodukte) bezeichnet werden können, bezeichnet der Ausdruck "AGE" im allgemeinen das Produkt einer Umsetzung, die durch mindestens eine von drei charakteristischen Erscheinungen (Fluoreszenz, Bräunung und Vernetzung im Molekül und/oder zwischen Molekülen), die bei der vorstehenden Reaktion A der späten Stufe auftreten, begleitet ist. Man kann geteilter Meinung sein, ob die Produkte einer Reaktion, die nicht von allen drei vorstehenden Erscheinungen begleitet ist, auch als AGE bezeichnet werden sollten oder nicht. Dies bedeutet, dass es zusätzlich zur vorstehenden Definition, verschiedene Ansichten über die Definition von AGE gibt, z. B. eine Ansicht, die behauptet, dass AGE sich auf sämtliche Produkte beziehen soll, die erhalten werden, wenn Glucose und Protein 60 Tage oder mehr in vitro bei 37°C inkubiert werden (eine Modellreaktion der Maillard-Reaktion), eine Ansicht, die behauptet, dass AGE sich nur auf Produkte mit biologischer Aktivität unter Herbeiführung von Diabetes mellitus-Komplikationen beziehen soll, und dergleichen. Die akademische Welt kennt keine anerkannte Definition des genannten Ausdrucks. Um die vorstehend dargelegte Verwirrung zu vermeiden, bezieht sich der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Ausdruck "AGE" nur auf das Produkt einer Reaktion (nämlich das Produkt der Reaktion A der späten Stufe), die von mindestens einer der charakteristischen Eigenschaften Fluoreszenz, Bräunung oder Vernetzung im Molekül und/oder zwischen Molekülen bei der Maillard-Reaktion begleitet ist.
Das Produkt der vorgenannten Reaktion A der späten Stufe, d. h. AGE, wird als ein Gemisch von zahlreichen unterschiedlichen Verbindungen angesehen. Derzeit werden Pyrralin, Pentosidin, Clossline A&B, Xl und dergleichen als AGE-Strukturen ins Spiel gebracht und qualitativ und quantitativ durch die Messung der Fluoreszenzintensität oder einer Antigen-Antikörper-Reaktion bestimmt. Es wird berichtet, dass die Reaktion A der späten Stufe zur Erzeugung von AGE in vivo abläuft und mit dem Auftreten einer Komplikation auf der Basis einer vaskulären Dysfunktion verbunden ist (V. M. Monnier et al., New England Journal of Medicine, Bd. 314 (1986), S. 403). Ferner werden AGE in Zusammenhang mit dem Auftreten und dem Fortschreiten von Komplikationen bei Diabetes mellitus-Patienten gebracht. Es wird auch berichtet, dass AGE eine biologische Aktivität in Verbindung mit dem Auftreten und Fortschreiten von Diabetes mellitus-Komplikationen besitzen (Morisaki et al., "Saishin Igaku", Bd. 49 (1994), S. 248).
Mittlerweile wurde N^ε-Carboxymethyllysin (nachstehend auch als CML abgekürzt) als Produkt der anderen Reaktion der späten Stufe der Maillard-Reaktion (Reaktion B der späten Stufe) identifiziert (M. U. Ahmed et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 261 (1986), S. 4889). Es wird berichtet, dass CML in den Linsen-Proteinen und im Haut-Collagen von älteren und Diabetes mellitus-Patienten vorhanden ist (J. A. Dunn et al., Biochemistry, Bd. 30 (1991), S. 1205). Ferner wird berichtet, dass eine Substanz, bei der ein Wasserstoffatom der Seitenketten-Aminogruppen von Rinderserumalbumin (nachstehend auch als BSA abgekürzt) mit Carboxymethylgruppen substituiert ist (nachstehend auch als "carboxymethyliert" bezeichnet), in starkem Umfang eine Reaktion zwischen AGE und einem anti-AGE-Antikörper hemmt (Abstract of the 55-th US Diabetes mellitus Academic Society's Meeting, (1995), S. 115A).
Jedoch gibt es keine Berichte über die biologische Aktivität des Produkts der Reaktion B der späten Stufe. Der Unterschied in der Konzentration des Produkts der Reaktion B der späten Stufe ist für in vivo-Verhältnisse, insbesondere in einer Körperflüssigkeit, zwischen einem Fall von Diabetes mellitus oder Komplikationen davon, wie Nephropathie oder Retinopathie (nachstehend auch als "Fall von Diabetes mellitus-Komplikationen" bezeichnet) und dem Fall einer gesunden Person unbekannt, und ferner ist die Verwendbarkeit des Produkts, insbesondere als Marker für Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen nicht erkannt worden. Dies bedeutet, dass, trotz der Tatsache, dass die Verwendbarkeit von AGE als Marken für Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen ersichtlich ist, die Verwendbarkeit von carboxymethyliertem Hämoglobin als Marken für Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen nicht erkannt worden ist. Ferner ist es unbekannt, ob diese Substanzen die Ursachen für Diabetes mellitus-Komplikationen oder von Substanzen, die durch Diabetes mellitus-Komplikationen angereichert werden, sind.
Dyer et al., J. Clin. Invest., Bd. 91 Nr. 6 (Juni 1993), S. 2463–2469, beschreiben die Anreicherung von Produkten der Maillard-Reaktion in Haut-Collagen bei Diabetes-Patienten und älteren Personen. Zu den untersuchten Verbindungen gehören Fructose-lysin, das anfängliche Glycosylierungsprodukt und die Glucosidierungsprodukte, N^ε-(Carboxymethyl)-lysin (CML) und Pentosidin, die während späterer Maillard-Reaktionen gebildet werden.
Reddy et al., Biochemistry, Bd. 39 (1995), 5. 10872–10878, treffen die Schlussfolgerung, dass es sich bei den fortgeschrittenen Glycosylierungs-Endprodukten weitgehend um Glycosidierungsprodukte handelt und dass N^ε-(Carboxymethyl)-lysin (CML) einhauptsächliches AGE-Produkt darstellt, das in Gewebeproteinen durch polyklonale Antikörper gegen AGE-Proteine erkannt wird.
WO 93/13921 beschreibt den immunochemischen Nachweis von in vivo AGE-Produkten.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, zu bestätigen, dass carboxymethyliertes Hämoglobin die gleiche biologische Aktivität wie AGE aufweist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, zu bestätigen, dass in vivo, insbesondere im Blut, ein signifikanter Unterschied in der Konzentration von carboxymethyliertem Hämoglobin zwischen einem Fall von Diabetes mellitus oder einem Fall von Diabetes mellitus-Komplikationen und dem Fall einer gesunden Person festgestellt wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, auf der Grundlage der vorstehenden Bestätigungen sicherzustellen, dass carboxymethyliertes Hämoglobin als Marker für Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen verwendet werden kann, d. h. carboxymethyliertes Hämoglobin als Marker für Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Reagenz zur Diagnose von Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen bereitzustellen, das mit carboxymethyliertem Hämoglobin im Blut immunologisch reagiert.
Die vorstehenden und weiteren Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung deutlicher.
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von carboxymethyliertem Hämoglobin, bei dem mindestens ein Teil der Seitenketten-Aminogruppen von Aminosäureresten, die das Hämoglobin bilden, carboxymethyliert ist, als Marker, der die Anwesenheit oder das Fortschreiten von Diabetes mellitus oder die Anwesenheit oder das Fortschreiten einer Diabetes mellitus-Komplikation anzeigt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Diagnose von Diabetes mellitus oder einer Diabetes mellitus-Komplikation, umfassend das in vitro-Kontaktieren einer Blutprobe mit einem immunologischen Reagenz, das einen Antikörper enthält; der spezifisch mit carboxymethyliertem Hämoglobin, in dem mindestens ein Teil der Seitenketten-Aminogruppen der Aminosäurereste, die das Hämoglobin bilden, carboxymethyliert ist, reagiert, und das Bestimmen des Vorliegens oder der Menge von carboxymethyliertem Hämoglobin, in dem mindestens ein Teil der Seitenketten-Aminogruppen der Aminosäurereste des Hämoglobins carboxymethyliert ist, in der Probe.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Bewertung der medizinischen Wirkung eines Arzneimittels zur Therapie oder Prophylaxe von Diabetes mellitus oder einer Diabetes mellitus-Komplikation, umfassend das in vitro-Kontaktieren einer Blutprobe mit einem immunologischen Reagenz gemäß der vorstehenden Definition und das Bestimmen des Vorliegens oder der Menge von carboxymethyliertem Hämoglobin, in dem mindestens ein Teil der Seitenketten-Aminogruppen der Aminosäurereste, die das Hämoglobin bilden, carboxymethyliert ist, in der Probe.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist ein Diagramm, das die Messergebnisse der Antigen-Spezifität eines Antikörpers gegen ein carboxymethyliertes Humanserumalbumin-Präparat mit einem kompetitiven ELISA-Test zeigt, wobei die Ordinate die Absorption bei 405 nm und die Abszisse die Menge des jeweiligen Inhibitors angeben.
2 ist ein Diagramm, das die Konzentrationen von carboxymethyliertem Hämoglobin im Blut einer gesunden Person, bei einem Fall von Diabetes mellitus und bei einem Fall von Diabetes mellitus-Komplikationen zeigt.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung näher beschrieben. Zunächst finden sich Ausführungen über einen Marker.
Das erfindungsgemäß verwendete Protein ist von Hämoglobin abgeleitet.
Als Verfahren zur Carboxymethylierung der Seitenketten-Aminogruppen von Aminosäuren, die das vorstehende Protein bilden (nachstehend auch als "Carboxymethylierung" bezeichnet), d. h. ein Verfahren zum Substituieren des Wasserstoffes der vorstehenden Aminogruppe mit der Gruppe -CH₂-COOH, können beliebige bekannte Verfahren ohne Beschränkungen herangezogen werden. Beispielsweise wird wie bei einem reduktiven Alkylierungsverfahren (beschrieben in "Shin Seikagaku Jikken Koza, Tanpakushitsu 4 (New Biochemical Experiment Lecture 1, Protein 4)", Herausgeber Japanese Biochemical Society und veröffentlicht von Tokyo Kagaku Dojin, 20. März 1991, S. 13–16) ein Verfahren bevorzugt, bei dem eine Aldehydverbindung, wie Glyoxylsäure (CHO-COOH) und ein Protein in einer wässrigen Lösung, z. B. einer Boratpufferlösung oder Phosphatpufferlösung, gelöst werden und miteinander bei einem pH-Wert von 8 bis 10 in Gegenwart eines reduzierenden Hydrierungsmittels, wie Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid, umgesetzt werden. Bei einem pH-Wert von mehr als 10 kann das Protein oder dergleichen denaturiert werden, während bei einem pH-Wert unter 8 das reduzierende Hydrierungsmittel instabil wird. Um die Reaktion spezifisch und quantitativ ablaufen zu lassen, beträgt die Reaktionstemperatur vorzugsweise 0 bis 10°C. Das auf diese Weise erhaltene carboxymethylierte Protein ist im allgemeinen wasserlöslich und fällt durch Zugabe von Aceton, Alkohol, Ammoniumsulfat, Schwermetallsalzen oder dergleichen aus. Das vorstehende carboxymethylierte Protein lässt sich durch ein bekanntes Verfahren, das von einem Verfahren zum Nachweis einer Aminogruppe abweicht, nachweisen, z. B. durch ein UV-Absorptionsverfahren, ein Farbstoffbindungsverfahren, ein Verfahren mit einem Phenolreagenz oder dergleichen. Bei den vorstehenden Verfahren lässt sich eine Substanz mit einer Aminogruppe, z. B. ein Protein, Lipid, Zucker oder dergleichen, leicht carboxymethylieren, während im Protein die Aminogruppen der Seitenkette des N-terminalen Aminosäurerestes für eine selektive Carboxymethylierung geeignet sind.
Ob carboxymethyliertes Hämoglobin als Marker für die Diagnose von Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen oder für die Bewertung einer medizinischen Wirkung eingesetzt werden kann, kann danach beurteilt werden, ob Diabetes mellitus-Komplikationen, wie Nephropathie, Retinopathie, Arteriosklerose, Neurose oder dergleichen, auftreten, wenn man das durch das vorstehende Verfahren erhaltene carboxymethylierte Hämoglobin auf einen lebenden Organismus oder eine biologische Komponente einwirken lässt. Beispielsweise lässt man carboxymethyliertes Hämoglobin auf eine Modellzelle einwirken, um ihr Koagulationsvermögen, das mit dem Verschluss von Kapillargefäßen (eine der Ursachen von Nephropathie oder Arteriosklerose) in Zusammenhang steht, ihre Durchlässigkeit, die im Zusammenhang mit dem Auftreten und Fortschreiten von Retinopathie steht, oder dergleichen zu messen (Morisaki et al., "Saishin Igaku", Bd. 49 (1994), S. 248).
Zur Messung des Koagulationsvermögens kann beispielsweise die Aktivität von Thrombomodulin des Endothels mit fibrinolytischer Aktivität gemessen werden. Zur Messung der vorstehenden Aktivität kann problemlos ein bekanntes Verfahren herangezogen werden, bei dem man ein carboxymethyliertes Protein auf das Endothel einwirken lässt, Thrombin und Protein C zugibt und das gebildete aktive Protein C misst.
Zur Messung der Durchlässigkeit kann die Menge des im Endothel aufgenommenen carboxymethylierten Proteins gemessen werden. Ein bekanntes Verfahren, das die Zugabe des markierten carboxymethylierten Proteins zum Endothel, das Inkubieren des Proteins und das Messen der Menge des im Endothel aufgenommenen, carboxymethyliertem Proteins umfasst, kann herangezogen werden.
Wie in den nachstehenden Beispielen dargelegt, zeigt das erfindungsgemäß verwendete carboxymethylierte Hämoglobin bei der vorstehenden Messung eine biologische Aktivität. Da ferner die Konzentration des im Körper eines Patienten mit Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen vorhandenen carboxymethylierten Hämoglobins signifikant höher als bei einer gesunden Person ist (vergl. 2) kann carboxymethyliertes Hämoglobin auf dem Gebiet der klinischen Diagnose als Marker für Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen herangezogen werden. Dies bedeutet, dass es durch Messung der Konzentration von carboxymethyliertem Hämoglobin im Blut möglich ist, eine Beurteilung darüber abzugeben, ob ein Patient von Diabetes mellitus betroffen ist, oder das Fortschreiten von Diabetes mellitus und die Möglichkeit des Auftretens von Diabetes mellitus-Komplikationen abzuschätzen.
Diabetes mellitus kann entweder von Insulin abhängig oder davon unabhängig sein. Zu Diabetes mellitus-Komplikationen gehören Nephropathie, Retinopathie, Arteriosklerose und Neurose.
Der erfindungsgemäß verwendete Ausdruck "Marker" bezeichnet einen Marker zur Diagnose sowie einen Marker zur Bewertung einer medizinischen Wirkung.
Das Verfahren zur Messung der in vivo-Konzentration von carboxymethyliertem Hämoglobin (z. B. der Konzentration eines carboxymethylierten Proteins in Blut oder Urin) ist nicht speziell beschränkt. Es können beliebige Verfahren zum Nachweis von carboxymethyliertem Hämoglobin herangezogen werden. Zu Beispielen für das Nachweisverfahren gehören ein Verfahren zum in vivo-Nachweis eines carboxymethylierten Proteins oder carboxymethylierten Peptids durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion und ein Verfahren zum Nachweis von carboxymethyliertem Hämoglobin durch Flüssigchromatographie.
Ein immunologisches Reagenz, das sich zur Diagnose von Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen oder zur Bewertung der medizinischen Wirkung eignet, umfasst einen Antikörper, der spezifisch mit carboxymethyliertem Hämoglobin, bei dem mindestens ein Teil der Seitenketten-Aminogruppen der Aminosäuren, die das Hämoglobin bilden, carboxymethyliert ist, reagiert.
Der Ausdruck "Antikörper", der spezifisch mit dem carboxymethylierten Protein reagiert, bezeichnet einen Antikörper, der spezifisch an Hämoglobin mit einer N-carboxymethylierten Seitenketten-Aminogruppe reagiert. Bei einem Antigen zur Bildung des Antikörpers, d. h. einem Immunogen, kann es sich um Hämoglobin mit einer N-carboxymethylierten Seitenketten-Aminogruppe handeln.
Der unter Verwendung eines derartigen Antigens gebildete Antikörper unterliegt keinen speziellen Beschränkungen. Ein Antiserum, Aszites oder dergleichen, die durch Immunisieren von Wirtstieren, wie Kaninchen, Ziegen, Mäusen oder Meerschweinchen, mit einem Antigen erhalten worden sind, werden direkt oder als polyklonaler Antikörper nach Reinigung durch ein herkömmliches Verfahren, wie Aussalzen, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Elektrophorese, verwendet. Ferner kann ein monoklonaler Antikörper verwendet werden, der aus einem Hybridom hergestellt worden ist, das durch Fusionieren einer Antikörper bildenden Zelle, z. B. einer Milzzelle oder eines Lymphozyten, eines mit einem Antigen immunisierten Säugetiers mit einer Myelomzelle erhalten worden ist. Ein derartiger Antikörper kann direkt oder nach Reinigung durch ein herkömmliches Verfahren, wie Aussalzen, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Elektrophorese, verwendet werden.
Der auf diese Weise erhaltene Antikörper kann als anti-CM-Antikörper verwendet werden oder es kann ein aktives Fragment (Bereich, der eine Antigen-Erkennungsstelle des Antikörpers einschließt) eines Antikörpers, der durch Behandlung des vorstehenden Antikörpers mit einem Enzym erhalten worden ist, wie Fab, Fab' oder F(ab')₂, als anti-CM-Antikörper verwendet werden.
Der Ausdruck "anti-CM-Antikörper" bezeichnet einen Antikörper, der spezifisch mit dem vorstehenden carboxymethylierten Hämoglobin reagiert.
Der erfindungsgemäß verwendete Ausdruck "immunologisches Reagenz" bezeichnet ein Immunoassay-Markierungsreagenz zum Nachweis einer Antigen-Antikörper-Reaktion, die herbeigeführt wird, indem man dafür sorgt, dass ein unlöslicher Träger einen anti-CM-Antikörper, einen Antikörper gegen eine oder mehrere biologische Komponenten oder ein Antigen in einer Probe trägt und diesen Bestandteil mit einem Antigen in der Probe oder einem anti-CM-Antikörper in Kontakt bringt, wobei man zum Nachweis eine kolorimetrische Analyse, einen Lumineszenztest, einen Fluoreszenztest oder dergleichen heranzieht. Alternativ bedeutet dieser Ausdruck ein Immunoagglutinationsreagenz zum Nachweis der Reaktion, wobei man sich der Agglutination des unlöslichen Trägers bedient.
Zu erläuternden Beispielen für ein qualitatives Reagenz gehören ein Latex-Agglutinationsreagenz, ein Mikrotiter-Agglutinationsreagenz und dergleichen, während zu erläuternden Beispielen für quantitative Reagenzien ein Radioimmunoassay-Reagenz, ein Enzymimmunoassay-Reagenz, ein Fluoreszenzimmunoassay-Reagenz, ein quantitatives Latex-Reagenz und dergleichen gehören.
Was die Form des unlöslichen Trägers betrifft, der den anti-CM-Antikörper oder den Antikörper gegen eine oder mehrere biologische Komponenten oder das Antigen in der Probe trägt, kann je nach dem Verwendungszweck eine geeignete Form gewählt werden. Beispielsweise kann er in Form eines Kügelchens, einer Testplatte, einer Scheibe oder eines Filters oder in sphärischer oder Röhrenform vorliegen. Als Materialien für den vorstehenden Antikörper oder Träger können üblicherweise als Immunoassay-Träger eingesetzte Materialien verwendet werden, wie Glas, Polysaccharid und Derivate davon, Kieselgel, poröse Keramikmaterialien, Metalloxide, Erythrozyten, synthetische Harze, wie Propylen, Styrol, Acrylamid und Acrylnitril. Diese synthetischen Harze weisen reaktive funktionelle Gruppen, z. B. eine Sulfongruppe und eine Aminogruppe, auf, die nach einem bekannten Verfahren eingeführt worden sind.
Als Verfahren zum Immobilisieren eines anti-CM-Antikörpers, eines Antikörpers gegen biologische Komponenten oder eines Antigens in einer Probe am unlöslichen Träger können ohne Beschränkungen bekannte Verfahren herangezogen werden, z. B. ein physikalisches Adsorptionsverfahren, ein kovalentes Bindungsverfahren, ein ionisches Bindungsverfahren, ein Vernetzungsverfahren und dergleichen.
Als Antikörper auf dem unlöslichen Träger wird der anti-CM-Antikörper oder der Antikörper gegen biologische Komponenten verwendet. Zu Beispielen für Antikörper gegen biologische Komponenten gehören anti-Albumin-Antikörper, anti-Hämoglobin-Antikörper, anti-γ-Globulin-Antikörper, anti-Lipoprotein geringer Dichte-Antikörper, anti-Transferrin-Antikörper, anti-Erythrozyten-Periphermembranprotein-Antikörper und dergleichen. Als Antikörper gegen biologische Komponenten können ein Antikörper nur gegen eine einzige biologische Komponente oder ein Antikörper gegen zwei oder mehr biologische Komponenten verwendet werden. Wenn ein Antikörper gegen eine biologische Komponente sich auf dem unlöslichen Träger befindet, kann er mit dem anti-CM-Antikörper in Kontakt gebracht werden, nachdem der Kontakt mit einem Antigen in einer Probe erfolgt ist. Wenn sich ein anti-CM-Antikörper auf dem unlöslichen Träger befindet, kann er mit dem anti-CM-Antikörper erneut in Kontakt gebracht werden, nachdem er in Kontakt mit einem Antigen in einer Probe gebracht worden ist.
Der grundlegende Messvorgang von carboxymethyliertem Hämoglobin mit einem markierenden Immunoassay-Reagenz kann nach einem üblichen Nachweisverfahren erfolgen, z. B. durch einen Radioimmunoassay (RIA), Enzym-Immunoassay (EIA) oder dergleichen. Der Vorgang und das Verfahren bei jedem der vorstehenden Nachweisverfahren unterscheiden sich nicht von den üblicherweise eingesetzten Vorgängen und Verfahrensweisen. Sie können sich auf ein bekanntes nicht-kompetitives Verfahren, kompetitives Verfahren, Sandwich-Verfahren oder dergleichen stützen.
Beispielsweise befindet sich der anti-CM-Antikörper oder der Antikörper gegen biologische Komponenten oder das Antigen in der Probe auf dem unlöslichen Träger in einem Anteil von 0,01 bis 1000 μg/cm² und wird zur Messung in Kontakt mit 0,001 bis 1000 μg des anti-CM-Antikörpers oder des Antigens in der Probe gebracht. Wenn der anti-CM-Antikörper oder der Antikörper gegen biologische Komponenten sich auf dem unlöslichen Träger befindet, wird er nach Kontakt mit dem Antigen in der Probe mit einem anti-CM-Antikörper in Kontakt gebracht, wie vorstehend beschrieben. Als anti-CM-Antikörper, der sich nicht auf dem unlöslichen Träger befindet, wird vorzugsweise ein mit einem Markierungsmittel markierter Antikörper verwendet.
Zu Beispielen für Markierungsmittel gehören radioaktive Substanzen, wie radioaktives Iod und radioaktiver Kohlenstoff; fluoreszierende Substanzen, wie Fluoresceinisothiocyanat und Tetramethylrhodamin; Enzyme, wie alkalische Phosphatase und Peroxidase; und dergleichen. Der gemäß dem vorstehenden Verfahren erhaltene Antigen-Antikörper-Komplex wird durch eine kolorimetrische Analyse, einen Fluoreszenztest, einen Lumineszenztest oder dergleichen nachgewiesen. Der grundlegende Messvorgang des carboxymethylierten Hämoglobins mit einem Immunoagglutinationsreagenz kann auf einem herkömmlichen Nachweisverfahren beruhen, z. B. Hämagglutination, passive Agglutination, nephelometrischer Immunoassay, turbidimetrischer Immunoassay oder dergleichen. Der Vorgang und die Verfahrensweise bei den einzelnen Nachweisverfahren können der allgemein angewandten Praxis entsprechen.
Beispielsweise können Teilchen (nachstehend als "sensibilisierte Teilchen" bezeichnet), die 0,001 bis 100 μg eines anti-CM-Antikörpers pro 1 g der Teilchen tragen, als eine wirksame Komponente eines immunologischen Reagenz verwendet werden, indem man sie in einem wässrigen Medium so dispergiert, dass sie in einer Menge von 0,001 bis 15 Gew.-% enthalten sind. Der durchschnittliche Teilchendurchmesser des unlöslichen Trägers, der den Antikörper trägt, beträgt vorzugsweise 0,05 bis 10 μm, und zwar im Hinblick auf das leichte Eintreten der Agglutination im Anschluss an die Antigen-Antikörper-Reaktion und im Hinblick auf die einfache Beurteilung der Agglutination. Die gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellten sensibilisierten Teilchen werden in Kontakt mit einem Antigen in eine Probe gebracht, um den Grad der Agglutination der sensibilisierten Teilchen zu messen. Der Agglutinationsgrad der Teilchen kann ohne Beschränkungen visuell oder durch eine bekannte optische Messung oder andere herkömmliche Verfahren gemessen werden.
Unter Anwendung der vorstehenden Immunoassay-Verfahren kann das immunologische Reagenz für Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden ist, in vorteilhafter Weise als Reagenz für die Diagnose von Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen oder als Reagenz für die Bewertung der medizinischen Wirkung bei der Therapie oder Prophylaxe von Diabetes mellitus oder bei der Therapie oder Prophylaxe von Diabetes mellitus-Komplikationen eingesetzt werden.
Wenn dieses Reagenz als diagnostisches Reagenz verwendet wird, wird der Anteil eines Antigens in einer Probe, d. h. das carboxymethylierte-Hämoglobin im Blut, unter Verwendung eines anti-CM-Antikörpers gemessen.
Wenn dieses Reagenz als Reagenz zur Bewertung einer medizinischen Wirkung verwendet wird, wird eine Verringerung des Anteils an carboxymethyliertem Hämoglobin, das in einer spezifischen biologischen Komponente enthalten ist, gemessen, indem man ein Arzneimittel zur Therapie von Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen verabreicht.
Ein Antikörper gegen carboxymethyliertes Hämoglobin wird nach einem herkömmlichen Verfahren zur Immunisierung eines Kaninchens mit Humanserumalbumin, das carboxymethyliertes Hämoglobin enthält, erhalten.
Dieser Antikörper reagiert in signifikanter Weise mit verschiedenen glycosylierten Proteinen, die in vitro hergestellt worden sind, jedoch nicht mit einem nicht-glycosylierten Protein. Ferner reagiert der Antikörper auch mit humanem Hämoglobin. Es zeigt sich, dass im Fall von Diabetes mellitus oder im Fall von Diabetes mellitus-Komplikationen die Reaktion mit dem Antikörper signifikanter als bei einer gesunden Person ist. Ein Antikörper gegen carboxymethyliertes Hämoglobin und AGE weisen eine immunologische Kreuzreaktivität auf. Aus den Ergebnissen verschiedener Untersuchungen zeigt es sich, dass im Fall von Diabetes mellitus eine höhere Sauerstoffbelastung vorliegt als bei einer gesunden Person. Durch Glycosylierung und eine Oxidationsreaktion gebildetes carboxymethyliertes Hämoglobin ist äußerst wertvoll als neuer Marker für die Diagnose des Auftretens und Fortschreitens von Diabetes mellitus-Komplikationen.
Da es, wie vorstehend beschrieben, klar ist, dass das erfindungsgemäß verwendete carboxymethylierte Hämoglobin mit dem Auftreten und Fortschreiten von Diabetes mellitus-Komplikationen in Zusammenhang steht, ist es offensichtlich, dass carboxymethyliertes Hämoglobin als ein neuer klinischer Marker für Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen auf dem Gebiet der klinischen Diagnose eingesetzt werden kann. Dies eröffnet die Möglichkeit zur Konzeption eines neuen diagnostischen Systems, das sich des vorstehenden neuen Markers bei der Diagnose von Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen bedient und von großer gewerblicher Bedeutung ist. Ferner ermöglicht es die Verwendung des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen immunologischen Reagenz, bei dem ein Antikörper gegen carboxymethyliertes Hämoglobin (anti-CM-Antikörper) verwendet wird, Diabetes mellitus und Diabetes mellitus-Komplikationen in einer Körperflüssigkeit oder einem Gewebe als Probe in einfacher Weise zu diagnostizieren. Ferner kann ein erfindungsgemäß hergestelltes diagnostisches Reagenz für die Bewertung der medizinischen Wirkung eines Arzneimittels zur Therapie von Diabetes mellitus und eines Arzneimittels zur Therapie von Diabetes mellitus-Komplikationen herangezogen werden.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, stellen aber in keiner Weise eine Beschränkung dar.
Beispiel 1 (nicht erfindungsgemäß)
Zur Carboxymethylierung der Seitenketten-Aminogruppen eines Proteins wurde 1 ml einer Lösung von humanem Serumalbumin (Fraktion V, Produkt der Firma Sigma Co. Ltd.) mit einem pH-Wert von 9 und einer Konzentration von 1 mg/ml mit 1 ml 0,25 M Glyoxylsäure (Produkt der Firma Sigma Co. Ltd.) mit einem pH-Wert von 9 vermischt und 12 Stunden bei 0°C stehengelassen. Anschließend wurde das erhaltene Gemisch mit 1 mg Natriumcyanoborhydrid versetzt und weitere 12 Stunden stehengelassen.
Als Kontrolle wurde humanes Serumalbumin auf die gleiche Weise behandelt, mit der Ausnahme, dass keine Glyoxylsäure zugesetzt wurde.
Die Raten der Carboxymethylierung des auf die vorstehende Weise behandelten humanen Serumalbumins wurden durch Messen der nicht-umgesetzten Aminogruppen gemäß dem folgenden Verfahren unter Verwendung von Trinitrobenzolsulfonsäure (nachstehend als TNBS abgekürzt) erhalten.
Dabei wurden jeweils 0,5 ml Probe zu 0,5 ml einer 0,1 M wässrigen Natriumhydroxidlösung mit einem Gehalt an 0,1 M Natriumtetraborat gegeben. Anschließend wurden 20 μl 1,1 M TNBS, das umkristallisiert und mit verdünnter Salzsäure gewaschen worden war, zu der vorstehenden Lösung gegeben und gerührt. 30 Minuten später wurden 2 ml 98,5 mM Natriumdihydrogenphosphat mit einem Gehalt an 1,5 mM Natriumsulfid zugegeben, um die Umsetzung zu beenden. Nach 1 : 10-Verdünnung in Wasser wurde die Absorption bei 420 nm gemessen. Die Absorption von carboxymethyliertem humanem Serumalbumin betrug 0,03. Die Absorption von humanem Serumalbumin, das nicht mit Glyoxylsäure behandelt worden war, betrugt 1,25. Wurde ein System ohne humanes Serumalbumin auf die gleiche Weise gemessen, so ergab sich eine Absorption von 0,03. Somit wurde festgestellt, dass die Rate der Carboxymethylierung im carboxymethylierten humanen Serumalbumin 100% betrug.
Das gemäß dem vorstehenden Verfahren erhaltene carboxymethylierte humane Serumalbumin wurde 2 Tage bei 4°C gegen eine 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4) dialysiert, um nicht-umgesetzte Glyoxylsäure und Natriumcyanoborhydrid zu entfernen. Anschließend wurde die Aktivität von Thrombomodulin zur Prüfung der Hyperkoagulierbarkeit, d. h. des Fortschreitens von Gefäßverschlüssen, gemessen. Diese Messung wurde auf die nachstehend angegebene Weise durchgeführt.
Das vorstehende carboxymethylierte humane Serumalbumin wurde zu semikonfluenten humanen arteriellen Endothelzellen (erhalten von der Firma Dainippon Pharmaceutical Co. Ltd.) in einer Konzentration von 10 μM gegeben und 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Endothelzellen mit ausgewogener Earl-Salzlösung gewaschen. Thrombin wurde in einer Konzentration von 1 U/ml und Protein C in einer Konzentration von 1 mg/ml zugegeben. Sodann wurden die Endothelzellen 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Diese Kulturlösung mit einem Gehalt an den Endothelzellen wurde mit Antithrombin III versetzt, um die Bildung von aktivem Protein C zu beenden. Ein Substrat, nämlich Lysin-prolin-arginin-p-nitroanilid wurde in einer Konzentration von 1 mM zugegeben. Die Absorption bei 405 nm wurde 5 und 10 Minuten nach der Zugabe gemessen. Die Differenz zwischen diesen Absorptionswerten wurde gebildet. Die Absorptionsdifferenz pro 1 mg eines von den Endothelzellen abgeleiteten Proteins betrug 60% für das carboxymethylierte humane Serumalbumin, bezogen auf die im nachstehend beschriebenen Vergleichsbeispiel 1 erhaltene Absorptionsdifferenz von 100%.
Dies bedeutet, dass das carboxymethylierte humane Serumalbumin die Aktivität von Thrombomodulin um 40% verringert und seinerseits aufgrund einer Verringerung der fibrinolytischen Aktivität (d. h. Hyperkoagulierbarkeit) einen Gefäßverschluss induziert. Da die in Referenzbeispiel 1 erhaltenen AGE die Aktivität von Thrombomodulin um 80% verringern (vergl. das nachstehend beschriebene Referenzbeispiel 1), ist es offensichtlich, dass dieses carboxymethylierte humane Serumalbumin die Fähigkeit besitzt, Gefäßverschlüsse ähnlich wie AGE herbeizuführen.
Vergleichsbeispiel 1
Humanes Serumalbumin (Kontrolle), das gemäß Beispiel 1 zubereitet aber nicht mit Glyoxylsäure behandelt worden war, wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 dialysiert und einer Messung der Aktivität von Thrombomodulin unterzogen. Die Differenz der Absorptionswerte nach 5 und nach 10 Minuten betrug 0,915. Dieser Wert wurde als 100% angesetzt.
Referenzbeispiel 1
60 mg humanes Serumalbumin und 1,7 M Glucose wurden zu 1 ml einer 0,5 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4) gegeben, mit einem 0,45 μm-Filter filtriert, sterilisiert und 3 Monate bei 37°C zur Bildung von AGE stehengelassen. (Fluoreszenz, Bräunung und Vernetzung im Molekül oder zwischen Molekülen wurden beobachtet). Die Aktivität von Thrombomodulin wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gemessen, mit der Ausnahme, dass die gemäß dem vorstehenden Verfahren erhaltenen AGE an Stelle des carboxymethylierten humanen Serumalbumins verwendet wurden.
Es ergab sich ein relatives Verhältnis der Absorptionsdifferenz, bezogen auf die Thrombomodulin-Aktivität der vorstehenden AGE, zu 20%, wenn die in Vergleichsbeispiel 1 erhaltene Absorptionsdifferenz zu 100% angesetzt wurde. Dies bedeutet, dass AGE die Thrombomodulin-Aktivität um 80% verringern.
Beispiel 2 (nicht erfindungsgemäß)
Zur Carboxymethylierung der Seitenketten-Aminogruppen von humanem Transferrin (ein Protein) wurde 1 ml einer Lösung von humanem Transferrin (Produkt der Firma Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) mit einer Konzentration von 1 mg/ml und einem pH-Wert von 9 mit 1 ml 0,25 M Glyoxylsäure (Produkt der Firma Sigma Co. Ltd.) mit einem pH-Wert von 9 vermischt. Das Gemisch wurde 12 Stunden bei 0°C stehengelassen. Anschließend wurden 1 mg Natriumcyanoborhydrid zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde weitere 12 Stunden stehengelassen. Als Kontrolle wurde humanes Transferrin auf die gleiche Weise behandelt, mit der Ausnahme, dass keine Glyoxylsäure zugesetzt wurde.
Das vorstehende carboxymethylierte humane Transferrin und nicht mit Glyoxylsäure behandeltes humanes Transferrin wurden jeweils mit einer wässrigen Lösung (bestehend aus 0,2 ml Bio-Lyte^R (pH-Bereich 3 bis 10, Produkt der Firma BIO-RAD Co. Ltd.), 3 ml Glycerin und 6,8 ml destilliertem Wasser auf das 5-fache verdünnt. Fraktionen von 10 μl der verdünnten Lösung wurden für die isoelektrische Fokussierungselektrophorese verwendet. Die isoelektrische Fokussierungselektrophorese wurde mit einem handelsüblichen Gel mit einem pH-Bereich von 3 bis 10 (Produkt der Firma Tefco Co., Ltd.) 30 Minuten bei 100 V, 30 Minuten bei 200 V und 60 Minuten bei 500 V durchgeführt, wobei 0,05 M Natriumhydroxid als Katholyt und 0,01 M Phosphorsäure als Anolyt verwendet wurden. Als Ergebnis dieser Elektrophorese wurde ein isoelektrischer Punkt des carboxymethylierten humanen Transferrins von 4,6 bis 4,9 und des nicht mit Glyoxylsäure behandelten humanen Transferrins von 5,2 bis 5,5 festgestellt. Dieses Ergebnis zeigt, dass durch die vorstehende Carboxymethylierung Carboxymethylgruppen in die Seitenketten-Aminogruppen von humanem Transferrin eingeführt wurden.
Das gemäß dem vorstehenden Verfahren erhaltene carboxymethylierte humane Transferrin wurde 2 Tage bei 4°C mit 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4) dialysiert, um nicht-umgesetzte Glyoxylsäure und Natriumcyanoborhydrid zu entfernen. Die von den Monozyten aufgenommene Menge wurde bestimmt, um deren Permeabilität zu messen (Zusammenhang mit dem Auftreten und Fortschreiten von Retinopathie). Die aufgenommene Menge wurde gemäß dem nachstehend angegebenen Verfahren gemessen.
2 × 10⁵ Zellen des Stammes RAW 264.7 (abgeleitet von murinen Monozyten) wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen gegeben und 18 Stunden bei 37°C in RPMI-Medium mit einem Gehalt an 10% fötalem Kälberserum inkubiert. Nach Entfernen des Kulturmediums wurden die Zellen einmal mit Phosphatpufferlösung gewaschen und in 1 ml DMEM-Medium mit einem Gehalt an 3% BSA übertragen. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurde carboxymethyliertes humanes Transferrin, das mit ¹²⁵I markiert war, in einer Konzentration von 10 μM zugesetzt. Die Zellen wurden sodann weitere 12 Stunden bei 37°C inkubiert. Das carboxymethylierte humane Transferrin, das mit ¹²⁵I markiert war, wurde hergestellt, indem man 5 μl einer wässrigen Na¹²⁵I-Lösung mit einem Gehalt an 0,5 mCi zu 10 μl einer Lösung mit einem Gehalt an 2,5 μg carboxymethyliertem humanem Transferrin gab und eine 15-minütige Umsetzung durchführte. Nach 12-stündiger Inkubation wurden die Zellen 3 mal mit einer Phosphatpufferlösung mit einem Gehalt an 1% BSA und weitere 3 mal mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen. Nach Zugabe von 1 ml einer 0,1 M Natriumhydroxidlösung und 1-stündiger Inkubation bei 37°C wurden die Zellen abgekratzt. Ihre Radioaktivität wurde mit einem Szintillationszähler gemessen. 0,4 μg carboxymethyliertes humanes Transferrin wurden von den murinen Monozyten pro 1 mg eines von den murinen Monozyten abgeleiteten Proteins aufgenommen. Wie im nachstehend beschriebenen Vergleichsbeispiel 2 dargelegt, wurde nicht-carboxymethyliertes humanes Transferrin nicht von den Monozyten aufgenommen, während das carboxymethylierte humane Transferrin von den Monozyten aufgenommen wurde. Somit ist klar ersichtlich, dass das carboxymethylierte humane Transferrin die Permeabilität der Monozyten induziert, die in Zusammenhang mit dem Auftreten und Fortschreiten von Retinopathie steht.
Aus den Ergebnissen des nachstehend aufgeführten Referenzbeispiels 2 ist es ersichtlich, dass das carboxymethylierte humane Transferrin dieses Beispiels die Permeabilität von Monozyten ähnlich wie die in Referenzbeispiel 1 erhaltenen AGE induziert.
Vergleichsbeispiel 2
Anschließend wurde das in Beispiel 2 erhaltene humane Transferrin, das nicht mit Glyoxylsäure behandelt worden war, als Kontrolle auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 dialysiert. Die Menge des von den Monozyten aufgenommenen humanen Transferrins wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 gemessen. Es wurde festgestellt, dass die Menge des aufgenommenen humanen Transferrins pro 1 mg eines von den murinen Monozyten abgeleiteten Proteins 0,05 μg oder weniger betrug.
Referenzbeispiel 2
Die aufgenommene Menge an AGE wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 gemessen, mit der Ausnahme, dass die in Referenzbeispiel 1 erhaltenen AGE an Stelle des carboxymethylierten humanen Transferrins verwendet wurden. Es ergab sich, dass die Menge der aufgenommenen AGE pro 1 mg eines von den murinen Monozyten abgeleiteten Proteins 1,0 μg betrug.
Beispiel 3
(1) Bilden eines Antikörpers gegen carboxymethyliertes Protein
Ein Kaninchen mit einem Gewicht von 2 kg oder mehr wurde mit dem in Beispiel 1 hergestellten carboxymethylierten humanen Serumalbumin als Antigen auf die folgende Weise immunisiert.
Ein Gemisch mit einem Gehalt an 0,5 ml der Antigenlösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml und 0,5 ml komplettes Freund-Adjuvans wurden in die Ohrvene eines Kaninchens injiziert. Anschließend wurde ein Gemisch mit einem Gehalt an 0,25 ml der Antigenlösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml und 0,25 ml inkomplettem Freund-Adjuvanz zusätzlich alle 2 Wochen injiziert. Während dieser Zeitspanne wurde zur Bestätigung, ob Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin gebildet worden war, Blut einmal alle 2 Wochen aus der marginalen Ohrvene des Kaninchens entnommen. Nach 6 Wochen wurde durch ein ELISA-Verfahren bestätigt, dass Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin gebildet worden war. Sodann wurde das gesamte Blut des Tiers gewonnen.
(2) Herstellung einer Affinitätsreinigungssäule
5 ml Affi-Gel^R 15 (Produkt der Firma BIO-RAD Co. Ltd.) wurden mit 75 ml 10 mM Acetatpuffer (pH-Wert 4,5) gewaschen. 62,5 ml einer Lösung von humanem Serumalbumin mit einer Konzentration von 10 mg/ml wurden zugegeben. Nach 1-stündigem mäßigem Rühren bei Raumtemperatur wurde nicht-umgesetztes humanes Serumalbumin durch Filtration entfernt. 30 ml 1 M Ethanolamin wurden zugegeben. Nach mäßigem Rühren bei Raumtemperatur wurde nicht-umgesetzter N-Hydroxysuccinimidester blockiert. Ein Träger mit immobilisiertem humanem Serumalbumin wurde in eine Säule gepackt und mit Ionenaustauscherwasser gewaschen, bis die Absorption bei 280 nm 0 betrug. Ferner wurde die Säule mit 20 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH-Wert 7,4) äquilibriert.
(3) Affinitätsreinigung von Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin
Der auf diese Weise hergestellte Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin wurde mit 20 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH-Wert 7,4) auf eine Konzentration von 1 mg/ml verdünnt. Der verdünnte Antikörper wurde in einer Menge von etwa 100 mg auf die Affinitätsreinigungssäule aufgesetzt. Sodann ließ man die Phosphatpufferlösung mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,5 ml/min über die Säule laufen, bis die Absorption bei 280 nm 0 betrug. Der Antikörper, der nicht an der Säule gebunden worden war, wurde als Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin gewonnen. Nachdem die Absorption bei 280 nm den Wert 0 erreicht hatte, wurde die Phosphatpufferlösung gegen 0,1 M Glycinpuffer (pH-Wert 3,0) ausgetauscht. Der an die Säule gebundene Antikörper wurde eluiert. Die Säule wurde mit 20 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH-Wert 7,4) äquilibriert. Der gewonnene Antikörper wurde erneut auf dieser Säule aufgesetzt. Nicht an der Säule gebundener Antikörper wurde gewonnen. Dieser Vorgang wurde ein weiteres Mal wiederholt. Der Antikörper wurde als Antikörper zur Markierung mit Biotin verwendet.
(4) Biotin-Markierung von Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin
Biotin wurde mit dem auf diese Weise gereinigten Antikörper unter Verwendung eines Protein-Biotinylierungssystems (Testpackung der Firma Gibco Co. Ltd.) markiert.
Eine Lösung, die durch Verdünnen oder Einengen des gereinigten Antikörpers gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin mit 20 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH-Wert 7,4) auf eine Konzentration von 1,5 mg/ml hergestellt worden war, wurde mit Natriumcarbonatpuffer (pH-Wert 9,0) unter Erzielung einer Konzentration von 0,05 M versetzt. Anschließend wurden 6,7 ml dieser Antikörperlösung mit 26 μl einer CAB-NHS-Esterlösung mit einer Konzentration von 50 mg/ml, die gemäß der Gebrauchsanweisung hergestellt worden war, versetzt, und mäßig 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Zur Beendigung der Reaktion wurde ferner Ammoniumchlorid in einer Konzentration von 0,11 M zugesetzt. Anschließend wurde die Antikörperlösung in einer mit dieser Testpackung versehenen Säule entsalzt. Bei Berechnung der Molzahl des durch Avidin/HABA aus der Testpackung eingeführten Biotins wurde festgestellt, dass 14 Mol Biotin pro 1 Mol des Antikörpers gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin gebunden waren.
(5) Antigenspezifität von Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin
Die Antigenspezifität des Antikörpers gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin wurde durch einen kompetitiven ELISA-Test bestätigt.
Der Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin, der mit 10 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH-Wert 7,4) (nachstehend als PBS abgekürzt) auf eine Konzentration von 1 μg/ml verdünnt worden war, wurde mit dem hergestellten carboxymethylierten humanen Serumalbumin in Konzentrationen von 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml versetzt. Jede dieser Lösungen wurde 1 Stunde bei 37°C belassen und als Antikörperlösung, die durch das carboxymethylierte humane Serumalbumin gehemmt war, verwendet.
Aus Hämoglobin (Produkt der Firma Sigma Co. Ltd.) hergestelltes carboxymethyliertes Hämoglobin wurde auf die gleiche Weise wie das carboxymethylierte humane Serumalbumin hergestellt. Das carboxymethylierte Hämoglobin wurde zu der Lösung des Antikörpers gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin mit einer Konzentration von 1 μg/ml in der Weise zugegeben, dass sich Konzentrationen von 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml ergaben. Jede dieser Lösungen wurde 1 Stunde bei 37°C stehengelassen und als durch carboxymethyliertes Hämoglobin gehemmte Antikörperlösung verwendet.
Vor der Durchführung des kompetitiven ELISA-Tests wurde das hergestellte carboxymethylierte humane Serumalbumin mit PBS auf eine Konzentration von 1 μg/ml verdünnt. Sodann wurde die verdünnte Lösung von carboxymethyliertem humanem Serumalbumin auf eine Immunoplatte mit 96 Vertiefungen (Produkt der Firma NUNC Co. Ltd.) in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung aufgesetzt und 1 Stunde bei 37°C belassen, um das carboxymethylierte humane Serumalbumin auf der Immunoplatte zu immobilisieren. Nach 1 Stunde wurde das carboxymethylierte humane Serumalbumin, das nicht an der Immunoplatte gebunden war, entfernt. PBS mit einem Gehalt an 0,5% Gelatine wurde auf die Immunoplatte in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung aufgetragen und 1 Stunde bei 37°C belassen, um einen Teil der Immunoplatte, an dem das carboxymethylierte humane Serumalbumin nicht gebunden war, zu blockieren. Nach 1 Stunde wurde die Gelatinelösung entfernt. Die Immunoplatte wurde 3 mal mit PBS gewaschen. Sodann wurde die durch das carboxymethylierte humane Serumalbumin gehemmte Antikörperlösung mit den vorstehenden Konzentrationen oder die durch das carboxymethylierte Hämoglobin gehemmte Antikörperlösung mit den vorstehenden Konzentrationen auf die Immunoplatte in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung aufgetragen und 1 Stunde bei 37°C belassen. Sodann wurde die Immunoplatte 3 mal mit PBS gewaschen. Eine Lösung von anti-Kaninchen-IgG-Antikörper, der mit alkalischer Phosphatase markiert war, mit einer Konzentration von 1 μg/ml (Produkt der Firma Cosmobio Co. Ltd.) wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung aufgetragen und 1 Stunde bei 37°C belassen. Ferner wurde die Immunoplatte 3 mal mit PBS gewaschen. Eine gemäß der Gebrauchsanweisung einer Testpackung für alkalische Phosphatase (Produkt der Firma BIO-RAD Co. Ltd.) hergestellte Substratlösung wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung aufgetragen. Nach 5-minütigem Belassen bei Raumtemperatur wurden 100 μl einer 0,4 M Natriumhydroxidlösung zugegeben, um die Reaktion der alkalischen Phosphatase zu beenden. Die Absorption bei 405 nm wurde gemessen. Die gemessenen Absorptionswerte sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt. Den Ergebnissen lässt sich entnehmen, dass der hergestellte Antikörper gegen das carboxymethylierte humane Serumalbumin auch mit dem carboxymethylierten Hämoglobin reaktiv ist, und zwar nicht nur aufgrund einer Reaktion zwischen dem carboxymethylierten humanen Serumalbumin und dem Antikörper gegen das carboxymethylierte humane Serumalbumin, sondern auch gegen das carboxymethylierte Hämoglobin.
Tabelle 1 Messergebnisse der Antigenspezifität eines Antikörpers gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin
(6) Messung von carboxymethyliertem Hämoglobin bei Diabetes mellitus-Patienten
Rote Blutkörperchen in 50 μl Blut, das 15 Patienten mit Diabetes mellitus, die an keinen Komplikationen litten, mit einem Vakuum-Blutentnahmeröhrchen mit einem Gehalt an EDTA-2K entnommen worden war, wurden einmal mit 250 μl Kochsalzlösung gewaschen und durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser einer hypotonischen Lysis unterzogen. Auf diese Weise erhielt man eine Probe. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 55,7 Jahre.
In der Probe enthaltenes carboxymethyliertes Hämoglobin wurde durch ein Dot-Plot-Verfahren gemessen. Nach Messung der Konzentration von Hämoglobin durch ein Cyanmethämoglobin-Verfahren wurde Hämoglobin an einem PVDF-Filter (Produkt der Firma BIO-RAD Co. Ltd.) in einer Menge von 500 ng unter Verwendung einer Dot-Plot-Vorrichtung (Produkt der Firma BIO-RAD Co. Ltd.) adsorbiert. Der Filter wurde mit 10% Magermilch in PBS (pH-Wert 7,4) 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und sodann mit 1 μg/ml biotinmarkiertem Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin in PBS inkubiert. Nach 1-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Filter mit 50 ml PBS mit einem Gehalt an 0,05% Tween 20 (pH-Wert 7,4) 3 mal gewaschen. Anschließend wurde der Filter mit 5 ml eines Komplexes von Avidin und Biotin, der mit Peroxidase (Vectastin ABC Kit der Firma Funakoshi K. K.) markiert worden war, versetzt. Eine Inkubation wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt. Sodann wurde der Filter mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung mit einem Gehalt an 0,05% Tween 20 (pH-Wert 7,4) 3 mal gewaschen und mit 2 ml eines ECL-Western-Plot-Nachweisreagenz (Produkt der Firma Amersham Co. Ltd.) versetzt. Der Nachweis der Lumineszenzintensität im Filter wurde unter Verwendung eines BIO-RAD GS-363-Molecular Imager-Geräts durchgeführt.
Als Kontrolle wurde carboxymethyliertes Hämoglobin nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren unter Verwendung von handelsüblichem Hämoglobin (Produkt der Firma Sigma Co. Ltd.) als Probe gemessen. Die Messergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Lumineszenzintensität von Hämoglobin, das aus dem vorstehenden Fall von Diabetes mellitus stammt, ist in 2 aufgetragen, wobei eine Probe einem leeren Kreis entspricht. Die Lumineszenzintensität des handelsüblichen Hämoglobins beträgt 1.
Tabelle 2 Messergebnisse von carboxymethyliertem Hämoglobin in Blut von Patienten mit Diabetes mellitus
Beispiel 4
In einer Probe enthaltenes carboxymethyliertes Hämoglobin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 gemessen, mit der Ausnahme, dass Blut von 12 Patienten mit Diabetes mellitus-Komplikationen (die Patienten litten neben Diabetes mellitus an Nephropathie und Retinopathie) als Proben an Stelle des Blutes eines Patienten mit Diabetes mellitus verwendet wurde. Die Messergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 56,5 Jahre. Wie in Beispiel 3 ist die Lumineszenzintensität von Hämoglobin, das von den vorstehenden Patienten mit Diabetes mellitus-Komplikationen stammte, in 2 aufgetragen, wobei eine Probe einem leeren Kreis entspricht. Die Lumineszenzintensität von handelsüblichem Hämoglobin betrug 1.
Tabelle 3 Messergebnisse von carboxymethyliertem Hämoglobin in Blut von Patienten mit Diabetes mellitus-Komplikationen
Vergleichsbeispiel 3
In einer Probe enthaltenes carboxymethyliertes Hämoglobin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 gemessen, mit der Ausnahme, dass Blut von 47 gesunden Patienten als Probe an Stelle des Blutes von Patienten mit Diabetes mellitus verwendet wurde. Die Messergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt. Das Durchschnittsalter der Personen betrug 52,3 Jahre. Wie in Beispiel 3 ist die Lumineszenzintensität von Hämoglobin, das von den vorstehenden gesunden Personen stammte, in 2 aufgetragen. Eine Probe entspricht einem leeren Kreis. Die Lumineszenzintensität des handelsüblichen Hämoglobins betrug 1.
Tabelle 4 Messergebnisse von carboxymethyliertem Hämoglobin in Blut von gesunden Personen
Bei einem statistischen Vergleich (t-Test) der Gruppe von Patienten mit Diabetes mellitus (gemessen in Beispiel 3) mit den Werten von gesunden Personen ergab sich, dass die Lumineszenzintensitäten der Gruppe von Personen mit Diabetes mellitus wesentlich höher waren als bei gesunden Personen, und zwar mit einer signifikanten Differenz (p < 0,05). Dies bedeutet, dass Blut eines Patienten mit Diabetes mellitus wesentlich mehr carboxymethyliertes Hämoglobin als Blut eines gesunden Patienten enthält.
Bei einem Vergleich der Lumineszenzintensitäten der Gruppe von Patienten mit Diabetes mellitus-Komplikationen (Messung in Beispiel 4) mit den Werten der Gruppe von gesunden Personen mit dem t-Test ergab sich, dass die Lumineszenzintensitäten der Gruppe von Patienten mit Diabetes mellitus-Komplikationen wesentlich höher waren als die Werte der Gruppe von gesunden Personen, und zwar mit einer signifikanten Differenz (p < 0,05). Dies bedeutet, dass Blut von Patienten mit Diabetes mellitus-Komplikationen wesentlich mehr carboxymethyliertes Hämoglobin als Blut von gesunden Personen enthält.
Aus den vorstehenden Ergebnissen ist ersichtlich, dass carboxymethyliertes Hämoglobin einen wertvollen Marker für Diabetes mellitus oder Diabetes mellitus-Komplikationen darstellt.
Bei einem Vergleich der Lumineszenzintensitäten der Gruppe von Patienten mit Diabetes mellitus (Messung in Beispiel 3) mit der Gruppe von Patienten mit Diabetes mellitus-Komplikationen (Messung in Beispiel 4) durch den t-Test ergibt sich, dass die Lumineszenzintensitäten der Gruppe von Patienten mit Diabetes mellitus-Komplikationen wesentlich höher als die Werte der Gruppe mit Diabetes mellitus sind, und zwar um eine signifikante Differenz (p < 0,05) von 5%. Somit ist ersichtlich, dass sich carboxymethyliertes Hämoglobin als klinischer Marker zur Beurteilung des Fortschreitens von Diabetes mellitus und des möglichen Auftretens von Diabetes mellitus-Komplikationen eignet.

Claims

Verfahren zum Anzeigen der Anwesenheit oder des Fortschreitens von Diabetes mellitus oder der Anwesenheit oder des Fortschreitens einer Diabetes mellitus-Komplikation, wobei carboxymethyliertes Hämoglobin, bei dem mindestens ein Teil der Seitenketten-Aminogruppen der Aminosäurereste des Hämoglobins carboxymethyliert ist, als Marker verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Marker für die Diagnose oder die Bewertung einer medizinischen Wirkung verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Diabetes mellitus entweder insulinabhängig oder insulinunabhängig ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Diabetes mellitus-Komplikation um Nephropathie, Retinopathie, Arteriosklerose oder Neurose handelt.
Verfahren zur Diagnose von Diabetes mellitus oder einer Diabetes mellitus-Komplikation, umfassend das in vitro-Kontaktieren einer Blutprobe mit einem immunologischen Reagenz, das einen Antikörper enthält, der spezifisch mit carboxymethyliertem Hämoglobin, in dem mindestens ein Teil der Seitenketten-Aminogruppen der Aminosäurereste des Hämoglobins carboxymethyliert ist, reagiert, und das Bestimmen des Vorliegens oder der Menge von carboxymethyliertem Hämoglobin, in dem mindestens ein Teil der Seitenketten-Aminogruppen der Aminosäurereste des Hämoglobins carboxymethyliert ist, in der Probe.
Verfahren zur Bewertung der medizinischen Wirkung eines Arzneimittels zur Therapie oder Prophylaxe von Diabetes mellitus oder von Diabetes mellitus-Komplikationen, umfassend das in vitro-Kontaktieren einer Blutprobe mit einem immunologischen Reagenz, das einen Antikörper enthält, der spezifisch mit carboxymethyliertem Hämoglobin, in dem mindestens ein Teil der Seitenketten-Aminogruppen der Aminosäurereste des Hämoglobins carboxymethyliert ist, reagiert, und das Bestimmen des Vorliegens oder der Menge von carboxymethyliertem Hämoglobin, in dem mindestens ein Teil der Seitenketten-Aminogruppen der Aminosäurereste des Hämoglobins carboxymethyliert ist, in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei es sich bei dem immunologischen Reagenz um ein Latex-Agglutinierungsreagenz, ein Mikrotiter-Agglutinierungsreagenz, ein Radioimmunoassay-Reagenz, ein Enzymimmunoassay-Reagenz oder um ein Fluoreszenzimmunoassay-Reagenz handelt.