JPH0131590B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は検体中のＳ−100タンパクの高感度測
定法に関するものである。Ｓ−100タンパクは近
年神経組識特異タンパクとして注目されており、
分子量約２万の酸性蛋白で大脳では白質に多く、
細胞レベルでの分布では主としてグリア細胞の細
胞質に存在するとされている。

Ｓ−100タンパクは神経組識の損傷によつて体
液中に漏出する。それ故これを測定すれば神経組
識損傷の有無が推定できることになる〔ジヤーナ
ル・オブ・ザ・ニユーロロジカル・サイエンシス
（Journal of the Neurological Science）44巻、
259〜263頁（1980）〕。これまでＳ−100タンパク
の微量を測定する方法として補体結合法
（Complement fixation法、以下略して「CF」法
という）が用いられてきたが、CF法はバイオア
ツセイ法のため、又RIA法は使用するアイソトー
プ（ ¹²⁵I）の半減期が短いため共に安定した測
定系を維持することが困難であつた。神経組識損
傷の有無の推定のためには高感度測定法を確立す
る必要性があり、そこで本発明者らはＳ−100タ
ンパクの微量測定における上記の如き問題点を克
服するために鋭意検討を試みたものである。

近年同じく微量測定法としてRIA法のラジオア
イソトープの代わりに酵素を標識として使う酵素
免疫測定法が開発されてきた。

本発明者らは、Ｓ−100タンパクの微量測定に
酵素免疫測定法を応用かつ改良を加えることによ
つて検体中の数pgの微量のＳ−100タンパクが測
定できることを可能とし、従来報告されている
CF法、RIA法のいずれも測定量として100pgが限
度であるのに比して数十倍の高感度測定ができ、
かつ安定した測定ができることを知り本発明を完
成したものである。

即ち、本発明は抗Ｓ−100抗体結合固相に検体
中のＳ−100タンパクを反応せしめて得られる反
応物に酵素標識抗Ｓ−100抗体を作用せしめるか
又は検体中のＳ−100タンパクと酵素標識抗Ｓ−
100抗体を反応せしめて得られる反応物を抗Ｓ−
100抗体結合固相に作用せしめることによつて固
相に抗Ｓ−100抗体−Ｓ−100タンパク−酵素標識
抗Ｓ−100タンパク抗体の免疫複合体を形成せし
めた後、固定化固相中の該標識酵素活性を測定す
ることにより検体中のＳ−100タンパク量を求め
るに際して、抗原抗体反応に使用する抗Ｓ−100
抗体をプロテアーゼ処理して得られるＦ（ab′）₂フ
ラグメント又はFab′フラグメントを用い、かつ
該抗原抗体反応時にカルシウムイオン、高濃度の
塩類及び疎水性蛋白を共存させることを特徴とす
るＳ−100タンパクの高感度測定法である。

本発明に使用される標識酵素としては、β−Ｄ
−ガラクトシダーゼ、アルカリフオスフアター
ゼ、パーオキシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素等通常用いられる酵素で
あればいずれでもよいが、特にβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼが測定感度が高いので高感度測定のため
には好ましい。

酵素標識抗Ｓ−100抗体の調製に際して用いら
れる酵素と抗Ｓ−100抗体との結合法は、酵素、
抗Ｓ−100抗体の各々の活性（触媒活性、抗体結
合能）が失われないような方法であればどのよう
な方法でもよい、具体的にはグルタルアルデヒ
ト、カルボジイミド、Ｎ，N′−ｏ−フエニレン
ジマレイミド（Ｎ，N′−ｏ−Phenylene
dimaleimide）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ
−ハイドロキシサクシニミドエステル（ｍ−
Maleimidobenzoyl−Ｎ−Hydroxysuccinimide
Ester）等の既知の二官能性試薬が使用できる。

固相（不溶性担体）としてはアガロース、デキ
ストラン、セルロースなどの多糖類、ポリスチレ
ン等の合成樹脂、あるいはガラス、ポリアクリル
アミド等が用いられ、形態としてはビーズ状、繊
維状であることが好ましい。抗Ｓ−100抗体と固
相との結合は物理的吸着を利用してもよいが、通
常蛋白質あるいは酵素等を不溶化するのに用いら
れる方法を利用するのがよい。例えば不溶性多糖
を用いる場合があれば不溶性多糖を臭化シアン、
過沃素酸ナトリウム、エピクロルヒドリン、１，
1′−カルボニルジイミダゾール、ｐ−トルエンス
ルフオニルクロリド等を活性化して結合を行わせ
る。

また、固相に適当なスペーサーを導入した後、
スペーサーを介して抗Ｓ−100抗体を結合させて
もよい。更に抗Ｓ−100抗体と固相の結合を可逆
的な結合、例えばＳ−Ｓ結合にした場合には、測
定後固相に結合した免疫反応物を固相より切断、
除去し（例えばＳ−Ｓ結合の場合還元剤により切
断される）、固相をくり返し使用することもでき
る。

ここで使用される抗Ｓ−100抗体タンパクはそ
のままのものよりも、抗原結合部位のみを分離し
たものが測定感度を向上させるために好ましい。
例えば、パパイン、ペプシンなどのプロテアーゼ
で処理して得られるFab′部分、Ｆ（ab′）₂部分など
を使用する。Fab′部分の調製法については、
Ｅ・Ishikawaらの報告がある。〔スカンジナビア
ン・ジヤーナル・オブ・ザ・イムノロジー
（Scand.J.Immunol）、８巻、43頁（1978）〕。

測定感度を向上させるためには抗原抗体反応時
にカルシウムイオンを共存させることが好まし
い。Ｓ−100タンパクはカルシウムイオン結合タ
ンパクであり、カルシウムイオンの共存はＳ−
100蛋白の抗原性の保持、免疫反応の促進及び安
定化に効果があるからである。

生体体液成分による干渉作用を抑制あるいは除
去するために用いる疎水性蛋白質としてはゼラチ
ンなど、塩類としては、食塩などが用いられる。

本発明によればこのように、測定しようとする
Ｓ−100タンパクを生体体液成分による影響も受
けず、高感度で精度の高い測定が可能となり更
に、自動測定系への応用も容易である。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ (1) 抗牛Ｓ−100タンパクの調整 牛Ｓ−100タンパクを上村らの方法
〔（JournalNeurochemistry 18巻、429〜438頁
（1971）〕により精製し、75％アクリルアミドゲ
ル電気泳動（PH8.9）で単一バンドを示す標品
を得た。こうして得られた精製Ｓ−100タンパ
クとメチル化牛血清アルブミンの混合物（１mg
毎／動物）をウサギで免疫して抗血清を作製し
た。

(2) 抗血清IgG画分、及びＦ（ab′）₂フラグメント
の調製 抗血清６mlより硫安分画を繰り返し（50、
40、33％飽和）約40mgのIgG画分を得た。この
IgG画分（40mg／２ml、PH4.5）に1.6mgのペプ
シン（ブタ腸粘膜、シグマ社製）を加え、37℃
で16時間反応後、1N NaOHを加えて中和（PH
8.0）し、セフアデツクスＧ−150カラム（PH
8.0）にかけてＦ（ab′）₂画分を分離した（20
mg）。Ｆ（ab′）₂画分の一部（10mg）をアミコン
セントリフロCF−25で濃縮（約２ml）し、透
析（0.1M酢酸ソーダ、PH5.0）して酵素標識の
ために用いた。残りのＦ（ab′）₂は0.1Mリン酸
ソーダ（PH7.0）の0.1％NaN₃に透析して抗体
結合固相調製のために用いた。

(3) 抗体Fab′−Gal複合体 抗体Ｆ（ab′）₂フラグメントを２−メルカプト
エチルアミンで還元しFab′フラグメントとし
てから、過剰のＮ，N′−ｏ−フエニレンデイ
マレイミド（Ｎ，N′−ｏ−
Phenylenedimaleimide（アルドリツヒ社製）溶
液中に加えて反応させ、マレイミド−Fab′を
得、これをβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（以下
Galと略す。ベーリンガー社）とを反応結合さ
せた。Fab′−Gal複合体量はGal活性で表し、
1unit活性＝1μmole生成物／minである。こう
して10mgのＦ（ab′）₂画分から調製された酵素標
識抗体は約15000検体分の測定に使用できるも
のであつた。

(4) 抗体結合固相の調製 シリコンゴム片（φ3mmのひも、サンコープ
ラスチツク社製を長さ４mmに切つた円柱）に抗
体Ｆ（ab′）₂フラグメントを物理的吸着させた。
すなわち適当に希釈した上記Ｆ（ab′）₂溶液（PH
7.0、A₂₈₀≒0.5）中に、シリコンゴム片を浸し、
４℃で一夜放置し、抗体溶液を回収した後、固
相を上記リン酸緩衝液、次いでＡ液（0.01Mリ
ン酸ソーダ、PH7.0、含0.1M NaCl、1mM
MgCl₂、0.1％牛血清アルブミン（BSA）、0.1
％NaN₃）でよく洗つて、Ａ液中４℃で２日間
以上保存後測定に用いた。抗体Ｆ（ab′）₂溶液は
反復使用が可能で、抗体結合固相は少なくとも
一ケ月は安定であつた。

(5) 測定操作 標準Ｓ−100タンパクを含むＧ液（0.01Mリ
ン酸ソーダ、PH7.0、含0.1M NaCl、1mM
MgCl₂、1mM Ca²⁺、0.1％BSA、0.5％ゼラチ
ン、0.1％NaN₃）0.5mlに抗体結合固相を一個
ずつ入れ、30℃で振盪した。５時間後に反応液
を吸収除去して、試験管内で固相を洗浄した
（Ａ液１ml×２回）。Ａ液＋1mM Ca²⁺の溶液で
希釈した酵素標識抗体（3munits／0.2ml）中に
固相を移し、４℃で一夜静置した。翌日反応液
を吸収除去し、Ａ液で固相を洗浄してから、固
相上に結合したGal活性を測定した。Gal活性
は、４−メチルウンベリフエリ−β−Ｄ−ガラ
クトサイド（４−methylumbelliferyl−β−Ｄ
−galactoside）を基質とし、生成した４−メ
チルウンベリフエロン（４−
methylumbelliferone）を蛍光光度計で測定し
たところ第１図に示す検量線を得た。本測定系
での測定感度は3pg／検体であつた。

実施例 ２ 神経系疾患等で入院加療中の患者の脳脊髄液を
検体として用い実施例１と同様に測定した。この
測定系に脳脊髄液検体の種々の容量を加えてみる
と、固相に結合するGal活性は加えた容量に比例
して増加し、少なくとも100μ添加までは検量
線と平衡な曲線が各検体ごとに得られた。すなわ
ち100μ以下の脳脊髄液検体を用いれば測定系
は干渉されることなく、正確に脳脊髄液中のＳ−
100タンパク量が測定できることがわかつた。測
定系の正確度を知るために、脳脊髄液50μを使
つた時のCV（変動係数）は10％以下であつた。す
なわち脳脊髄液中のＳ−100タンパクが6pg／ml
の微量まで測定できることがわかつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法によつて測定した場合の
牛Ｓ−100タンパクの標準曲線を示すものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 抗Ｓ−100抗体結合固相に検体中のＳ−100タ
   ンパクを反応せしめて得られる反応物に酵素標識
   抗Ｓ−100抗体を作用せしめるか又は検体中のＳ
   −100タンパクと酵素標識抗Ｓ−100抗体を反応せ
   しめて得られる反応物を抗Ｓ−100抗体結合固相
   に作用せしめることによつて固相上に抗Ｓ−100
   抗体−Ｓ−100タンパク−酵素標識抗Ｓ−100抗体
   の免疫複合体を形成せしめた後、固相に結合した
   該標識酵素活性を測定することにより検体中のＳ
   −100タンパク量を求めるに際して、抗原抗体反
   応に使用する抗Ｓ−100抗体をプロテアーゼ処理
   して得られるＦ（ab′）フラグメント又はFab′フラ
   グメントを用い、かつ該抗原抗体反応時にカルシ
   ウムイオン、高濃度の塩類及び疎水性蛋白を共存
   させることを特徴とするＳ−100タンパクの高感
   度測定法。