JPH0131590B2 - - Google Patents
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- JPH0131590B2 JPH0131590B2 JP56181933A JP18193381A JPH0131590B2 JP H0131590 B2 JPH0131590 B2 JP H0131590B2 JP 56181933 A JP56181933 A JP 56181933A JP 18193381 A JP18193381 A JP 18193381A JP H0131590 B2 JPH0131590 B2 JP H0131590B2
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は検体中のS−100タンパクの高感度測
定法に関するものである。S−100タンパクは近
年神経組識特異タンパクとして注目されており、
分子量約2万の酸性蛋白で大脳では白質に多く、
細胞レベルでの分布では主としてグリア細胞の細
胞質に存在するとされている。
定法に関するものである。S−100タンパクは近
年神経組識特異タンパクとして注目されており、
分子量約2万の酸性蛋白で大脳では白質に多く、
細胞レベルでの分布では主としてグリア細胞の細
胞質に存在するとされている。
S−100タンパクは神経組識の損傷によつて体
液中に漏出する。それ故これを測定すれば神経組
識損傷の有無が推定できることになる〔ジヤーナ
ル・オブ・ザ・ニユーロロジカル・サイエンシス
(Journal of the Neurological Science)44巻、
259〜263頁(1980)〕。これまでS−100タンパク
の微量を測定する方法として補体結合法
(Complement fixation法、以下略して「CF」法
という)が用いられてきたが、CF法はバイオア
ツセイ法のため、又RIA法は使用するアイソトー
プ( 125I)の半減期が短いため共に安定した測
定系を維持することが困難であつた。神経組識損
傷の有無の推定のためには高感度測定法を確立す
る必要性があり、そこで本発明者らはS−100タ
ンパクの微量測定における上記の如き問題点を克
服するために鋭意検討を試みたものである。
液中に漏出する。それ故これを測定すれば神経組
識損傷の有無が推定できることになる〔ジヤーナ
ル・オブ・ザ・ニユーロロジカル・サイエンシス
(Journal of the Neurological Science)44巻、
259〜263頁(1980)〕。これまでS−100タンパク
の微量を測定する方法として補体結合法
(Complement fixation法、以下略して「CF」法
という)が用いられてきたが、CF法はバイオア
ツセイ法のため、又RIA法は使用するアイソトー
プ( 125I)の半減期が短いため共に安定した測
定系を維持することが困難であつた。神経組識損
傷の有無の推定のためには高感度測定法を確立す
る必要性があり、そこで本発明者らはS−100タ
ンパクの微量測定における上記の如き問題点を克
服するために鋭意検討を試みたものである。
近年同じく微量測定法としてRIA法のラジオア
イソトープの代わりに酵素を標識として使う酵素
免疫測定法が開発されてきた。
イソトープの代わりに酵素を標識として使う酵素
免疫測定法が開発されてきた。
本発明者らは、S−100タンパクの微量測定に
酵素免疫測定法を応用かつ改良を加えることによ
つて検体中の数pgの微量のS−100タンパクが測
定できることを可能とし、従来報告されている
CF法、RIA法のいずれも測定量として100pgが限
度であるのに比して数十倍の高感度測定ができ、
かつ安定した測定ができることを知り本発明を完
成したものである。
酵素免疫測定法を応用かつ改良を加えることによ
つて検体中の数pgの微量のS−100タンパクが測
定できることを可能とし、従来報告されている
CF法、RIA法のいずれも測定量として100pgが限
度であるのに比して数十倍の高感度測定ができ、
かつ安定した測定ができることを知り本発明を完
成したものである。
即ち、本発明は抗S−100抗体結合固相に検体
中のS−100タンパクを反応せしめて得られる反
応物に酵素標識抗S−100抗体を作用せしめるか
又は検体中のS−100タンパクと酵素標識抗S−
100抗体を反応せしめて得られる反応物を抗S−
100抗体結合固相に作用せしめることによつて固
相に抗S−100抗体−S−100タンパク−酵素標識
抗S−100タンパク抗体の免疫複合体を形成せし
めた後、固定化固相中の該標識酵素活性を測定す
ることにより検体中のS−100タンパク量を求め
るに際して、抗原抗体反応に使用する抗S−100
抗体をプロテアーゼ処理して得られるF(ab′)2フ
ラグメント又はFab′フラグメントを用い、かつ
該抗原抗体反応時にカルシウムイオン、高濃度の
塩類及び疎水性蛋白を共存させることを特徴とす
るS−100タンパクの高感度測定法である。
中のS−100タンパクを反応せしめて得られる反
応物に酵素標識抗S−100抗体を作用せしめるか
又は検体中のS−100タンパクと酵素標識抗S−
100抗体を反応せしめて得られる反応物を抗S−
100抗体結合固相に作用せしめることによつて固
相に抗S−100抗体−S−100タンパク−酵素標識
抗S−100タンパク抗体の免疫複合体を形成せし
めた後、固定化固相中の該標識酵素活性を測定す
ることにより検体中のS−100タンパク量を求め
るに際して、抗原抗体反応に使用する抗S−100
抗体をプロテアーゼ処理して得られるF(ab′)2フ
ラグメント又はFab′フラグメントを用い、かつ
該抗原抗体反応時にカルシウムイオン、高濃度の
塩類及び疎水性蛋白を共存させることを特徴とす
るS−100タンパクの高感度測定法である。
本発明に使用される標識酵素としては、β−D
−ガラクトシダーゼ、アルカリフオスフアター
ゼ、パーオキシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素等通常用いられる酵素で
あればいずれでもよいが、特にβ−D−ガラクト
シダーゼが測定感度が高いので高感度測定のため
には好ましい。
−ガラクトシダーゼ、アルカリフオスフアター
ゼ、パーオキシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、リンゴ酸脱水素酵素等通常用いられる酵素で
あればいずれでもよいが、特にβ−D−ガラクト
シダーゼが測定感度が高いので高感度測定のため
には好ましい。
酵素標識抗S−100抗体の調製に際して用いら
れる酵素と抗S−100抗体との結合法は、酵素、
抗S−100抗体の各々の活性(触媒活性、抗体結
合能)が失われないような方法であればどのよう
な方法でもよい、具体的にはグルタルアルデヒ
ト、カルボジイミド、N,N′−o−フエニレン
ジマレイミド(N,N′−o−Phenylene
dimaleimide)、m−マレイミドベンゾイル−N
−ハイドロキシサクシニミドエステル(m−
Maleimidobenzoyl−N−Hydroxysuccinimide
Ester)等の既知の二官能性試薬が使用できる。
れる酵素と抗S−100抗体との結合法は、酵素、
抗S−100抗体の各々の活性(触媒活性、抗体結
合能)が失われないような方法であればどのよう
な方法でもよい、具体的にはグルタルアルデヒ
ト、カルボジイミド、N,N′−o−フエニレン
ジマレイミド(N,N′−o−Phenylene
dimaleimide)、m−マレイミドベンゾイル−N
−ハイドロキシサクシニミドエステル(m−
Maleimidobenzoyl−N−Hydroxysuccinimide
Ester)等の既知の二官能性試薬が使用できる。
固相(不溶性担体)としてはアガロース、デキ
ストラン、セルロースなどの多糖類、ポリスチレ
ン等の合成樹脂、あるいはガラス、ポリアクリル
アミド等が用いられ、形態としてはビーズ状、繊
維状であることが好ましい。抗S−100抗体と固
相との結合は物理的吸着を利用してもよいが、通
常蛋白質あるいは酵素等を不溶化するのに用いら
れる方法を利用するのがよい。例えば不溶性多糖
を用いる場合があれば不溶性多糖を臭化シアン、
過沃素酸ナトリウム、エピクロルヒドリン、1,
1′−カルボニルジイミダゾール、p−トルエンス
ルフオニルクロリド等を活性化して結合を行わせ
る。
ストラン、セルロースなどの多糖類、ポリスチレ
ン等の合成樹脂、あるいはガラス、ポリアクリル
アミド等が用いられ、形態としてはビーズ状、繊
維状であることが好ましい。抗S−100抗体と固
相との結合は物理的吸着を利用してもよいが、通
常蛋白質あるいは酵素等を不溶化するのに用いら
れる方法を利用するのがよい。例えば不溶性多糖
を用いる場合があれば不溶性多糖を臭化シアン、
過沃素酸ナトリウム、エピクロルヒドリン、1,
1′−カルボニルジイミダゾール、p−トルエンス
ルフオニルクロリド等を活性化して結合を行わせ
る。
また、固相に適当なスペーサーを導入した後、
スペーサーを介して抗S−100抗体を結合させて
もよい。更に抗S−100抗体と固相の結合を可逆
的な結合、例えばS−S結合にした場合には、測
定後固相に結合した免疫反応物を固相より切断、
除去し(例えばS−S結合の場合還元剤により切
断される)、固相をくり返し使用することもでき
る。
スペーサーを介して抗S−100抗体を結合させて
もよい。更に抗S−100抗体と固相の結合を可逆
的な結合、例えばS−S結合にした場合には、測
定後固相に結合した免疫反応物を固相より切断、
除去し(例えばS−S結合の場合還元剤により切
断される)、固相をくり返し使用することもでき
る。
ここで使用される抗S−100抗体タンパクはそ
のままのものよりも、抗原結合部位のみを分離し
たものが測定感度を向上させるために好ましい。
例えば、パパイン、ペプシンなどのプロテアーゼ
で処理して得られるFab′部分、F(ab′)2部分など
を使用する。Fab′部分の調製法については、
E・Ishikawaらの報告がある。〔スカンジナビア
ン・ジヤーナル・オブ・ザ・イムノロジー
(Scand.J.Immunol)、8巻、43頁(1978)〕。
のままのものよりも、抗原結合部位のみを分離し
たものが測定感度を向上させるために好ましい。
例えば、パパイン、ペプシンなどのプロテアーゼ
で処理して得られるFab′部分、F(ab′)2部分など
を使用する。Fab′部分の調製法については、
E・Ishikawaらの報告がある。〔スカンジナビア
ン・ジヤーナル・オブ・ザ・イムノロジー
(Scand.J.Immunol)、8巻、43頁(1978)〕。
測定感度を向上させるためには抗原抗体反応時
にカルシウムイオンを共存させることが好まし
い。S−100タンパクはカルシウムイオン結合タ
ンパクであり、カルシウムイオンの共存はS−
100蛋白の抗原性の保持、免疫反応の促進及び安
定化に効果があるからである。
にカルシウムイオンを共存させることが好まし
い。S−100タンパクはカルシウムイオン結合タ
ンパクであり、カルシウムイオンの共存はS−
100蛋白の抗原性の保持、免疫反応の促進及び安
定化に効果があるからである。
生体体液成分による干渉作用を抑制あるいは除
去するために用いる疎水性蛋白質としてはゼラチ
ンなど、塩類としては、食塩などが用いられる。
去するために用いる疎水性蛋白質としてはゼラチ
ンなど、塩類としては、食塩などが用いられる。
本発明によればこのように、測定しようとする
S−100タンパクを生体体液成分による影響も受
けず、高感度で精度の高い測定が可能となり更
に、自動測定系への応用も容易である。
S−100タンパクを生体体液成分による影響も受
けず、高感度で精度の高い測定が可能となり更
に、自動測定系への応用も容易である。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 1
(1) 抗牛S−100タンパクの調整
牛S−100タンパクを上村らの方法
〔(JournalNeurochemistry 18巻、429〜438頁
(1971)〕により精製し、75%アクリルアミドゲ
ル電気泳動(PH8.9)で単一バンドを示す標品
を得た。こうして得られた精製S−100タンパ
クとメチル化牛血清アルブミンの混合物(1mg
毎/動物)をウサギで免疫して抗血清を作製し
た。
〔(JournalNeurochemistry 18巻、429〜438頁
(1971)〕により精製し、75%アクリルアミドゲ
ル電気泳動(PH8.9)で単一バンドを示す標品
を得た。こうして得られた精製S−100タンパ
クとメチル化牛血清アルブミンの混合物(1mg
毎/動物)をウサギで免疫して抗血清を作製し
た。
(2) 抗血清IgG画分、及びF(ab′)2フラグメント
の調製 抗血清6mlより硫安分画を繰り返し(50、
40、33%飽和)約40mgのIgG画分を得た。この
IgG画分(40mg/2ml、PH4.5)に1.6mgのペプ
シン(ブタ腸粘膜、シグマ社製)を加え、37℃
で16時間反応後、1N NaOHを加えて中和(PH
8.0)し、セフアデツクスG−150カラム(PH
8.0)にかけてF(ab′)2画分を分離した(20
mg)。F(ab′)2画分の一部(10mg)をアミコン
セントリフロCF−25で濃縮(約2ml)し、透
析(0.1M酢酸ソーダ、PH5.0)して酵素標識の
ために用いた。残りのF(ab′)2は0.1Mリン酸
ソーダ(PH7.0)の0.1%NaN3に透析して抗体
結合固相調製のために用いた。
の調製 抗血清6mlより硫安分画を繰り返し(50、
40、33%飽和)約40mgのIgG画分を得た。この
IgG画分(40mg/2ml、PH4.5)に1.6mgのペプ
シン(ブタ腸粘膜、シグマ社製)を加え、37℃
で16時間反応後、1N NaOHを加えて中和(PH
8.0)し、セフアデツクスG−150カラム(PH
8.0)にかけてF(ab′)2画分を分離した(20
mg)。F(ab′)2画分の一部(10mg)をアミコン
セントリフロCF−25で濃縮(約2ml)し、透
析(0.1M酢酸ソーダ、PH5.0)して酵素標識の
ために用いた。残りのF(ab′)2は0.1Mリン酸
ソーダ(PH7.0)の0.1%NaN3に透析して抗体
結合固相調製のために用いた。
(3) 抗体Fab′−Gal複合体
抗体F(ab′)2フラグメントを2−メルカプト
エチルアミンで還元しFab′フラグメントとし
てから、過剰のN,N′−o−フエニレンデイ
マレイミド(N,N′−o−
Phenylenedimaleimide(アルドリツヒ社製)溶
液中に加えて反応させ、マレイミド−Fab′を
得、これをβ−D−ガラクトシダーゼ(以下
Galと略す。ベーリンガー社)とを反応結合さ
せた。Fab′−Gal複合体量はGal活性で表し、
1unit活性=1μmole生成物/minである。こう
して10mgのF(ab′)2画分から調製された酵素標
識抗体は約15000検体分の測定に使用できるも
のであつた。
エチルアミンで還元しFab′フラグメントとし
てから、過剰のN,N′−o−フエニレンデイ
マレイミド(N,N′−o−
Phenylenedimaleimide(アルドリツヒ社製)溶
液中に加えて反応させ、マレイミド−Fab′を
得、これをβ−D−ガラクトシダーゼ(以下
Galと略す。ベーリンガー社)とを反応結合さ
せた。Fab′−Gal複合体量はGal活性で表し、
1unit活性=1μmole生成物/minである。こう
して10mgのF(ab′)2画分から調製された酵素標
識抗体は約15000検体分の測定に使用できるも
のであつた。
(4) 抗体結合固相の調製
シリコンゴム片(φ3mmのひも、サンコープ
ラスチツク社製を長さ4mmに切つた円柱)に抗
体F(ab′)2フラグメントを物理的吸着させた。
すなわち適当に希釈した上記F(ab′)2溶液(PH
7.0、A280≒0.5)中に、シリコンゴム片を浸し、
4℃で一夜放置し、抗体溶液を回収した後、固
相を上記リン酸緩衝液、次いでA液(0.01Mリ
ン酸ソーダ、PH7.0、含0.1M NaCl、1mM
MgCl2、0.1%牛血清アルブミン(BSA)、0.1
%NaN3)でよく洗つて、A液中4℃で2日間
以上保存後測定に用いた。抗体F(ab′)2溶液は
反復使用が可能で、抗体結合固相は少なくとも
一ケ月は安定であつた。
ラスチツク社製を長さ4mmに切つた円柱)に抗
体F(ab′)2フラグメントを物理的吸着させた。
すなわち適当に希釈した上記F(ab′)2溶液(PH
7.0、A280≒0.5)中に、シリコンゴム片を浸し、
4℃で一夜放置し、抗体溶液を回収した後、固
相を上記リン酸緩衝液、次いでA液(0.01Mリ
ン酸ソーダ、PH7.0、含0.1M NaCl、1mM
MgCl2、0.1%牛血清アルブミン(BSA)、0.1
%NaN3)でよく洗つて、A液中4℃で2日間
以上保存後測定に用いた。抗体F(ab′)2溶液は
反復使用が可能で、抗体結合固相は少なくとも
一ケ月は安定であつた。
(5) 測定操作
標準S−100タンパクを含むG液(0.01Mリ
ン酸ソーダ、PH7.0、含0.1M NaCl、1mM
MgCl2、1mM Ca2+、0.1%BSA、0.5%ゼラチ
ン、0.1%NaN3)0.5mlに抗体結合固相を一個
ずつ入れ、30℃で振盪した。5時間後に反応液
を吸収除去して、試験管内で固相を洗浄した
(A液1ml×2回)。A液+1mM Ca2+の溶液で
希釈した酵素標識抗体(3munits/0.2ml)中に
固相を移し、4℃で一夜静置した。翌日反応液
を吸収除去し、A液で固相を洗浄してから、固
相上に結合したGal活性を測定した。Gal活性
は、4−メチルウンベリフエリ−β−D−ガラ
クトサイド(4−methylumbelliferyl−β−D
−galactoside)を基質とし、生成した4−メ
チルウンベリフエロン(4−
methylumbelliferone)を蛍光光度計で測定し
たところ第1図に示す検量線を得た。本測定系
での測定感度は3pg/検体であつた。
ン酸ソーダ、PH7.0、含0.1M NaCl、1mM
MgCl2、1mM Ca2+、0.1%BSA、0.5%ゼラチ
ン、0.1%NaN3)0.5mlに抗体結合固相を一個
ずつ入れ、30℃で振盪した。5時間後に反応液
を吸収除去して、試験管内で固相を洗浄した
(A液1ml×2回)。A液+1mM Ca2+の溶液で
希釈した酵素標識抗体(3munits/0.2ml)中に
固相を移し、4℃で一夜静置した。翌日反応液
を吸収除去し、A液で固相を洗浄してから、固
相上に結合したGal活性を測定した。Gal活性
は、4−メチルウンベリフエリ−β−D−ガラ
クトサイド(4−methylumbelliferyl−β−D
−galactoside)を基質とし、生成した4−メ
チルウンベリフエロン(4−
methylumbelliferone)を蛍光光度計で測定し
たところ第1図に示す検量線を得た。本測定系
での測定感度は3pg/検体であつた。
実施例 2
神経系疾患等で入院加療中の患者の脳脊髄液を
検体として用い実施例1と同様に測定した。この
測定系に脳脊髄液検体の種々の容量を加えてみる
と、固相に結合するGal活性は加えた容量に比例
して増加し、少なくとも100μ添加までは検量
線と平衡な曲線が各検体ごとに得られた。すなわ
ち100μ以下の脳脊髄液検体を用いれば測定系
は干渉されることなく、正確に脳脊髄液中のS−
100タンパク量が測定できることがわかつた。測
定系の正確度を知るために、脳脊髄液50μを使
つた時のCV(変動係数)は10%以下であつた。す
なわち脳脊髄液中のS−100タンパクが6pg/ml
の微量まで測定できることがわかつた。
検体として用い実施例1と同様に測定した。この
測定系に脳脊髄液検体の種々の容量を加えてみる
と、固相に結合するGal活性は加えた容量に比例
して増加し、少なくとも100μ添加までは検量
線と平衡な曲線が各検体ごとに得られた。すなわ
ち100μ以下の脳脊髄液検体を用いれば測定系
は干渉されることなく、正確に脳脊髄液中のS−
100タンパク量が測定できることがわかつた。測
定系の正確度を知るために、脳脊髄液50μを使
つた時のCV(変動係数)は10%以下であつた。す
なわち脳脊髄液中のS−100タンパクが6pg/ml
の微量まで測定できることがわかつた。
第1図は本発明の方法によつて測定した場合の
牛S−100タンパクの標準曲線を示すものである。
牛S−100タンパクの標準曲線を示すものである。
Claims (1)
- 1 抗S−100抗体結合固相に検体中のS−100タ
ンパクを反応せしめて得られる反応物に酵素標識
抗S−100抗体を作用せしめるか又は検体中のS
−100タンパクと酵素標識抗S−100抗体を反応せ
しめて得られる反応物を抗S−100抗体結合固相
に作用せしめることによつて固相上に抗S−100
抗体−S−100タンパク−酵素標識抗S−100抗体
の免疫複合体を形成せしめた後、固相に結合した
該標識酵素活性を測定することにより検体中のS
−100タンパク量を求めるに際して、抗原抗体反
応に使用する抗S−100抗体をプロテアーゼ処理
して得られるF(ab′)フラグメント又はFab′フラ
グメントを用い、かつ該抗原抗体反応時にカルシ
ウムイオン、高濃度の塩類及び疎水性蛋白を共存
させることを特徴とするS−100タンパクの高感
度測定法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18193381A JPS58144747A (ja) | 1981-11-12 | 1981-11-12 | S―100タンパクの高感度測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18193381A JPS58144747A (ja) | 1981-11-12 | 1981-11-12 | S―100タンパクの高感度測定法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS58144747A JPS58144747A (ja) | 1983-08-29 |
JPH0131590B2 true JPH0131590B2 (ja) | 1989-06-27 |
Family
ID=16109427
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18193381A Granted JPS58144747A (ja) | 1981-11-12 | 1981-11-12 | S―100タンパクの高感度測定法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS58144747A (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63131065A (ja) * | 1986-11-20 | 1988-06-03 | Yatoron:Kk | 抗体の精製法とアイソザイムの測定法及び試薬 |
US4983529A (en) * | 1988-06-10 | 1991-01-08 | Abbott Laboratories | Immunoassay for HIV-I antigens using F(AB')2 fragments as probe |
CN103604931B (zh) * | 2013-11-15 | 2016-01-06 | 陆上苏 | 一种人s100蛋白检测试剂及制备方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5347518A (en) * | 1976-10-07 | 1978-04-28 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
-
1981
- 1981-11-12 JP JP18193381A patent/JPS58144747A/ja active Granted
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5347518A (en) * | 1976-10-07 | 1978-04-28 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS58144747A (ja) | 1983-08-29 |
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