JPS63131065A - 抗体の精製法とアイソザイムの測定法及び試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗体を用いて測定系より消去の対象となる酵
素を除去、もしくは活性を阻害して、該測定系における
他成分の検出、測定を行う九め技術分野に属し、利用面
では生体試料を使用する臨床化学領域での目的成分の分
別測定において有用な手段を提供する。

〔従来の技術〕

本分野に属する技術は、多成分を含有する生体試料を用
いる臨床化学領域において、目的成分の他成分との分割
のために有用である。特に微妙な構造、性質上の違いを
異にするだけの生体成分、とシわけアイソザイムの分割
測定については有効な手段のひとつになりうる。このよ
うな原理上広汎なしかも有用な可能性の内在にもかかわ
らず、実質上、実用に供されている例は少ない。が、そ
のいくつかは血清試料中のクレアチンキナーゼ（以下Ｃ
Ｋと略す）アイソザイムの測定において行われている。

ＣＫは、クレアチンリン酸の合成を可逆的に触媒する酵
素であり、ＣＫ−ＭＭ　（骨格筋型）、ＣＫ−ＢＢ　（
扇型）、及びＣＫ−ＭＢ　（ハイブリッド型）の３種の
アイソザイムの存在が確認されている。このうち、　Ｃ
Ｋ−ＭＢは心筋に存在し、心疾患でこのアイソザイムの
上昇が認められるために、心筋梗塞の診断的指標として
は重要である。この測定法としては、電気泳動法、イオ
ン交換クロマトグラフ法等が行われているが心筋梗塞の
診断ということを考えれば迅速性、定量性に優れた抗体
を用いる本発明の技術分野に属する方法が最適である。

即ち、血清中のＣＫ−ＭＢを特異抗体を用いて測定する
方法、具体的には、ＣＫ−ＭＭをＭサブユニットに対す
る抗体を用すて活性を阻害し、しかるのち残存するＢサ
ブユニットの活性を通常のＣＫの丸めの測定法によ〕求
めるためのものである。ＣＫ−ＭＢはＢサブユニット分
の活性としてＣＫ−ＢＢ活性と共に測定されるが通常Ｃ
Ｋ−ＢＢはＣＫ−ＭＢに比べ更に微活性のためＫこれが
、α−ＭＢのための活性値とされる。

このＭサブユニットに対する抗体を用いて、分別的にＢ
サブユニットの活性を測定しようとの試みは古く、例え
ばＩｍｍｕｎｏ　ｅｈ＠ｍｉ　ａ　ｔｒｙ、　６　、６
８１−６８７（１％９）に始まり、ＣＩ　ｉｎ、ｃｈｅ
ｍ＊Ａｃｔａ　、　ｅ５＊　２２：）ｗ２３２（１９７
５）Ｉｃはすでにほぼ同一の発想がみられる。

しかしながら、広汎に利用されうる技術的成果としては
、なお現在も限られたもので特定の困難さをともなう技
術であることにはまちがいがなく、この方面での解決が
要望されていたところである。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明に関する分野で、最終的な目的の達成の　。

ためには、目的にあう抗体を取得することが前提である
が、抗体の取得についてはそれぞれの目的にあわせ、そ
れぞれの方法で得ることができる。

例えば、上記のＣＫアイソザイムに関しては１免疫の生
化学、Ｐ１８１〜１％．１％６年、共立出版株式会社”
に記述された方法で、そのための抗体を得ることができ
る。

しかしながら、取得された抗体は充分に精製されねばな
らず、特に本発明に関する分野においては、取得された
抗体中に、目的物自身あるいは目的物の測定系を含め障
害となるわずかの夾雑物が混入すれば、系全体を台無し
にしてしまう結果となる。従りてこの方面への対処は最
も注意と労力を要す点である。なかでも抗体中に夾雑す
る酵素はごく微量で４活性画に重大な影響を及ぼす危険
性があり、アイソザイムの測定のようにそれ自身、微量
なものを微少な数値で判定するとき、使用する抗体中に
夾雑する酵素は常にほぼ完全に除くべく、繁雑な精製段
階を練る必要があシ、このことが本技術の汎用のための
大きな問題点となりていたものである。

例えば前記のＣＫアイソディムに関して言えば。

取得抗体中には通常抗ヒ）　ＣＫ−ＭＭヤギ血清が使用
されるが、この中には抗血清由来のＣＫ自身や、ミオキ
ナーゼ等の火線酵素が含まれる。ＣＫはもちろんのこと
、ミオキナーゼもま７’ｔ、ＣＫ測測定日常側われる測
定系に重大な誤差を与える。そしてこれらの酵素と抗体
の主成分であるイムノグロブリンを分離することは非常
に困難である。この理由はこれら両夾雑酵素はその蛋白
質化学的性質がイムノグロブリンと大変よく似ているた
めである。特にこのことによる製造面における障害は大
きく、精製段階の繁雑さ、要する経費、良品質の確保等
の問題を含め、この分野の技術の汎用性に関し大きな問
題となっていたところである。

〔問題点を解決するための手段〕

この問題を解決する九めの要件は、収率を落さず、大量
製造に適する簡便な方法で、夾雑する酵素を除去し、且
つ少くとも、抗体活性を低下させないことである。

本発明者らは鋭意検討の結果、意外にも、取得抗体とペ
プシンで処理することにより、本目的のすべての要件を
達成した。

ペプシンは蛋白質分解酵素であり、抗体自身にモ作用し
、イムノグロブリンを分解物フラグメントにする。しか
しながら、驚くべきこと釦、ペプシンは一方夾雑酵素を
切り活性を消失せしめたが、他方抗体分解物フラグメン
トは、上記要件の抗体としての活性を低下させなかりた
。従って、本発明は、本発明の分解に関し、目的にあう
抗体のペプシン処理を経た抗原抗体反応的に精製された
抗体活性フラグメントを用いることによりて達成される
方法で、本発明により従来より間頂とされていた上述の
諸々の困難な点が解決されたものである。

即ち、本発明は夾雑酵素を含む抗体をペプシンで処理し
て、一方夾雑酵素の活性を消失させ、他方抗体の活性を
維持せる抗体活性フラグメントを得ることを特徴とする
抗体の精製法である。

また、本発明は、夾雑酵素を含む抗体を４デシン処理し
て夾雑酵素の活性を消失させた抗体活性フラグメントを
用い、対象アイソザイムの活性を免疫反応により除去、
あるいは阻害し残存する他方のアイソザイムの活性を測
定することを特徴とするアイソザイムの測定法及び抗体
活性７ラグメントを含む試薬に関するものである。

以下に本発明を具体的に詳述する。

例えばＣＫについて、ヒト筋肉（サル筋肉でもよい。）
よりＣＫ−ＭＭを精製し、常法に↓リヤギに免疫して抗
血清を分画取得する。こうして得られた抗体をペプシン
で処理し、抗体活性フラグメントを得、種々検討を行り
たところ、抗体中に夾雑していたＣＫ及びミオキナーゼ
の活性は完全に消失し更にこのフラグメントはペプシン
処理をしなかつたもとの抗体と全く同様なヒ）　ＣＫ−
ＭＭアイソザイムに対する阻害度を示した。すなわちヒ
）　ＣＫ−＆ＩＭ活性を９９〜１００チ阻害し、と）　
ＣＫ−ＢＢは阻害せず、ヒトＣＫ−ＭＢ活性を約５０−
６０係阻害し。

ＣＫ測測定九めの基質クレアチンリン酸の存在下におい
てもこれらの阻害は充分に行われ、同様なＣＫ活性値を
得た。

ペプシン処理によりイムノグロブリンから二価のフラグ
メント、　Ｆ’（ａｂ’）２を得ることは周知である。

（免疫の生化学、Ｐ１２４〜１４５．１％６年。

共立出版株式会社）しかるに、抗原抗体反応においては
抗体の主成分であるイムノグロブリンと二価のフラグメ
ントｓ　Ｆ（ａｂつ、との間では反応性において前者の
方が強力で沈降物の形成も強いと言われているが、今回
１発明者らが行った検討によりペプシン処３１によるフ
ラグメント、もしくはＦ’（ａｂ’）　　が本発明の領
域に関しては全く遜色なく使用できることが判　したば
かりか、繁雑な精製法！ｃよる夷造のために間頂となっ
ていた夾雑酵素の除去を一挙だ行ない本発明を達成した
ものである。

本発明により抗体中に夾雑するＣＫ等の除去のために従
来ニジ必要とされてきた繁雑な分離操作、すなわち抗体
の流酸アンモニウムによる塩析分画後忙必要なさまざま
な操作段階、イオン交換クロマトグラフィー、ｒルロ過
及びアフィニティークロマトグラフィーなどの複雑な過
程を解消し、高品質品を大量に製造し、安価に供給する
ことが可能となった。

ちなみに本発明によれば、抗体の塩析分画後に常法によ
シペプシンを加え、処理後、この状態ですでに本発明の
目的に使用可能であるが、必要に応じ、ｒルロ適法を次
に用いるだけでよい。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例〈よシ説明する。

なお本実施例を通してＣＫの活性測定は下記の原理によ
る。

クレアチンキナーゼ測定用試薬（株式会社ダイアセトロ
ン発売、製品番号７０１−０８２）を用い、 ＣＫ クレアチンリン酸＋ＡＤＰ−クレアチン＋ＡＴＰｌ　ｅ
ｋ ＡＴＰ＋グルコースーーーーＡＤＰ＋グルコース−６−
リ２唆Ｇ−６−ＰＤ）ｉ クルコース−６一リン％十ＮＡＤＰ　　　　　　　　　
６−ホスｔグルコン酸−１−ＮＡＤＰＨ （ここでＧｌ　ｃｋはグルコキナーゼ、　Ｇ　−６−Ｐ
ＤＨはグルコース−６−リン酸税水素酵素を表す）また
、測定法は下記に従った。

ＣＫ活性：３７℃に恒温化された反応試液５００μｔに
試料１５μｔを加え、２分後よりＮＡＤＰＨ生成を３４
０　ｎｍで速度分析。

ＣＫアイソザイム活性：試料１５μｔを適宜抗体で処理
し、同様に、５００　ｐＬの反応試液中で、残存するＣ
Ｋ活性を速度分析する。

中反応試液；上記製品納書に従い調製された。

実施例ｔヒト筋肉（サル筋肉でもよい。）由来ＣＫ−Ｍ
Ｍを常法によりヤギに免疫して得られた■抗血清、■抗
血清を硫酸アンモニウム分画して得られたγ−グロゴリ
ン分画及び■ペプシン処理後のＦ（ａｂり分画について
それぞれの過程における夾雑ＣＫの活性を測定した。

結果を表１に示す。

表１　抗体分画中に夾雑するヤギＣＫ活性ここに示され
るようにペプシン処理によりほぼ完全に抗体中より夾雑
するＣＫを除去することができる。

実施例２．下記の性能を有すヒ）　ＣＫ−ＭＭに対する
抗血清を常法により、ペプシン処理をして得られたＦ（
ａｂワ、について■ヒ）　ＣＫ−ＭＭ　＠ヒトＣＫ−Ｍ
Ｂ及び■ヒ）　ＣＫ−ＢＢへの活性阻害効果を検討した
。

欅ヒトＣＫ−腹に対し、９９．８’％、ヒトＣＫ−ＭＢ
　Ｋ対し、５８．６％、の阻害率を有し、ヒトＣＫ−Ｂ
Ｂは阻害しない。

結果を、第１．２及び３図に示す。

それぞれにおいて、ｒ（ａｂ’）２は充分な阻害効果を
示し、γ−グロブリン抗体に代り使用可能なことが示さ
れている。

実施例３．各製造ａットのヒ）　ＣＫ−ＭＭに対する抗
血清について、それぞれのｒ−グロブリン分画とペプシ
ン処理後のＦ（＾ｂ′）２についてヒトＣＫの各アイソ
ザイムに対する阻害率を検討した結果を表２に示す。

数値単位についてｍｌ、傘２の欄は、 ＣＫの活性単位Ｉｕ／ＡＬで中３の欄は阻害率係で、他
についても同様である。

ここに示されるようにそれぞれの抗体ロフトにおいても
、　　Ｆ（ａｂ　ｌ）２　’ｇＧ共各アイソザイムに対
する挙動は変らず、本発明によるＦ　（ａ　ｂ　’）　
２は有用に使用できることがわかる。

実施例４．下記性能を有すヒトＣＫ−ＭＭに対する抗血
清のペプシン処理知より得たＦ（ａｂ’）ｚと精等され
たＦ’ｇＧを用い免疫阻害法により、血清試料中のＣＫ
−８サブユニツト活性を測定した。

傘ヒトＣＫ−四に対し９９．８憾、ヒトＣＫ−ＭＢに対
し５８．６％の阻害率を示し、ヒトＣＫ−ＢＢは阻害し
ない。

結果を表３に示す。

表３　ヒト血清中のＣＫ−８サブユニツト活性血清　　
　Ｆ（凰ｂ’）２ＦｇＧ Ａ　　　　　　　　５　　　　　７ Ｂ　　　　　　１４　　　　　１０ Ｃ２１ Ｄ　　　　　　　８　　　　１１ ｇ　　　　　　３９　　　　　３７ Ｆ　　　　　　８７　　　　　９１ Ｇ　　　　　　１８　　　　　１３ Ｈ３７ Ｉ　　　　　　　　５　　　　　　５ Ｊ　　　　　　　　２　　　　　４ Ｋ　　　　　　１０　　　　　１４ Ｌ　　　　　　５５　　　　　４９ （単位はＩｎＡ） ここに示されるように、血清試料に関してもペプシン処
理による抗体は充分な実用性を示している。

〔発明の効果〕

以上から明らかな如く、本発明によれば従来困難であっ
たアイソザイム酵素の測定が極めて容易且つ正確に実施
でき、そのための試薬を提供することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は、ヒトＣＫ−に’ｉ（に対する抗血清を４
デシン処理して得られたＦ（ａｂ’）２の、それぞれ■
ヒ）　ＣＫ−取■ヒトＣＫ−ＭＢ■ヒトＣＫ−ＢＢへの
活性阻害効果を表すグラフ図である。 第１図 桟体濃度（ｍ９／ｍｌ） 第２図 ｔＪＣＫ−Ｍａｌ二対４コｐ且害効果 拭イ本浪度（ｍ９／ｍｌ） 第３図 じトＣＫ−８８に２丈１すゐｐ且官タカ果字４【　イ本
　１ｋ　　／１　（ｍ＜Ｊ／ｍｌ）手続補正書 昭和６３年　２月１７日

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）夾雑酵素を含む抗体をペプシンで処理して、一方
   夾雑酵素の活性を消失させ、他方抗体の活性を維持せる
   抗体活性フラグメントを得ることを特徴とする抗体の精
   製法。
2. （２）夾雑酵素を含む抗体をペプシン処理して夾雑酵素
   の活性を消失させた抗体活性フラグメントを用い、対象
   アイソザイム活性を免疫反応により除去し、残存する他
   方のアイソザイム活性を測定することを特徴とするアイ
   ソザイムの測定法。
3. （３）抗体が対象アイソザイムの活性を充分に阻害しう
   る抗体で、免疫阻害法により、対象アイソザイムの活性
   を阻害して行うところの特許請求の範囲第２項記載の測
   定法。
4. （４）対象アイソザイムがクレアチンキナーゼＭＭであ
   るところの特許請求の範囲第２項記載の測定法。
5. （５）抗体活性フラグメントが二価の抗体フラグメント
   、Ｆ（ａｂ′）＿２であるところの特許請求の範囲第２
   項記載の測定法。
6. （６）抗体として、対象アイソザイムＣＫ−ＭＭ活性を
   ９９−１００％阻害し、他方のアイソザイムＣＫ−ＢＢ
   は阻害せず、またＣＫ−ＭＢを約５０−６０％阻害する
   抗体を用い、アイソザイムＣＫ−Ｂサブユニツトに関す
   る活性を測定するところの特許請求の範囲第３、４、及
   び５項記載のいずれかの測定法。
7. （７）夾雑酵素を含む抗体をペプシンで処理して夾雑酵
   素の活性を消失させた抗体活性フラグメントを含有せる
   ことを特徴とするアイソザイム測定用試薬。