JPS5886098A - マンガン−ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼ測定用試薬 - Google Patents
マンガン−ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼ測定用試薬Info
- Publication number
- JPS5886098A JPS5886098A JP18299081A JP18299081A JPS5886098A JP S5886098 A JPS5886098 A JP S5886098A JP 18299081 A JP18299081 A JP 18299081A JP 18299081 A JP18299081 A JP 18299081A JP S5886098 A JPS5886098 A JP S5886098A
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- JP
- Japan
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- antibody
- manganese
- superoxide dismutase
- enzyme
- beads
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- Pending
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒト体液ｔたは生検組織中のマンガン−スーパ
ー、オキシドディスムターゼ（以下Ｍ ｎ−８ＯＤと称
す）Ｉｔンドウィツチ法による酵素免疫学的方法により
測定する試薬に関する。
ー、オキシドディスムターゼ（以下Ｍ ｎ−８ＯＤと称
す）Ｉｔンドウィツチ法による酵素免疫学的方法により
測定する試薬に関する。
ＳＯＤは一足の物理的、化学的、薬理学的性質の特徴あ
る組合せｔＷする金属を含有する蛋白質の一族に与えら
れた名称でＴｏ９、ヒト、高等動物、１１１子植物、酵
母、微生物など広く自然界に存在している。そして現在
までに銅、ｉｉ船−Ｓ ＯＤ （Ｃｕ、・Ｚ＋ｎ
−ＳＯＤ ） ｅ Ｍｎ −８ＯＤ ｅ
鉄−８ＯＤ （Ｆ・−８ＯＤ）が発見されている。
る組合せｔＷする金属を含有する蛋白質の一族に与えら
れた名称でＴｏ９、ヒト、高等動物、１１１子植物、酵
母、微生物など広く自然界に存在している。そして現在
までに銅、ｉｉ船−Ｓ ＯＤ （Ｃｕ、・Ｚ＋ｎ
−ＳＯＤ ） ｅ Ｍｎ −８ＯＤ ｅ
鉄−８ＯＤ （Ｆ・−８ＯＤ）が発見されている。
この内、Ｃｕ、 Ｚｎ −８０ＤＫ関しては、本発明者
らが、先にその酵素免疫学的測定法全確立し、腎疾患の
体液中のＣｕ、 Ｚｎ−８ＯＤｔが健常人のそれに比べ
特異的に上昇することを見出し、Ｃｕ、 Ｚｎ−８ＯＤ
＠足用試薬として特許出願（％ｈ昭５６−１０５０７
５）した。
らが、先にその酵素免疫学的測定法全確立し、腎疾患の
体液中のＣｕ、 Ｚｎ−８ＯＤｔが健常人のそれに比べ
特異的に上昇することを見出し、Ｃｕ、 Ｚｎ−８ＯＤ
＠足用試薬として特許出願（％ｈ昭５６−１０５０７
５）した。
今回、本発＠８者らは餉たＫＭｒｓ−８００の障素免疫
学的測定用試薬【開発し、各穆疾患にお轄るヒト体液ま
たは生検組織中のＭｎ −ＳＯＤの変動を検索したとこ
ろ、肝疾患において％異的に上昇することが判明した。
学的測定用試薬【開発し、各穆疾患にお轄るヒト体液ま
たは生検組織中のＭｎ −ＳＯＤの変動を検索したとこ
ろ、肝疾患において％異的に上昇することが判明した。
したがって、本発明物質は肝疾患の診断に有用である。
本発明の試薬は、次のように製造することが一一一一
へ できる。即ち、ヒト胎盤より精製したＮｏ−８ＯＤｔ家
兎に感作して抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体を作製し、次にこの抗
体會ポリスチレンビーズーナイロンビーズ、ガラスピー
ズなどの不溶性担体と、処理し、抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体の
結合した不溶化抗体を得る。
へ できる。即ち、ヒト胎盤より精製したＮｏ−８ＯＤｔ家
兎に感作して抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体を作製し、次にこの抗
体會ポリスチレンビーズーナイロンビーズ、ガラスピー
ズなどの不溶性担体と、処理し、抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体の
結合した不溶化抗体を得る。
一方で、先と同様に製造した抗Ｍｎ−８０Ｄ抗体に、使
用する酵素に最適な化合物（例えはβ−ガラクトシダー
ゼに対しｍ−マレインイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドエステル、パーオキシダーゼに対しグ
ルタルアルデヒドなど）、ついで酵素管順次反応させて
酵素榛皺抗Ｍｙ−８ＯＤ抗体管得る。この場合、化合物
と酵素を先に反応させて後、抗体を結合させてもよい。
用する酵素に最適な化合物（例えはβ−ガラクトシダー
ゼに対しｍ−マレインイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキ
シサクシンイミドエステル、パーオキシダーゼに対しグ
ルタルアルデヒドなど）、ついで酵素管順次反応させて
酵素榛皺抗Ｍｙ−８ＯＤ抗体管得る。この場合、化合物
と酵素を先に反応させて後、抗体を結合させてもよい。
このようにして得た抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体の結合した不溶
化担体と酵素橡識抗Ｍｕ−ＥＩＯＤ抗体を用い、サンド
ウィッチ法によシヒト体液ｔたは生検組織中のＭＩＩ−
ＢＯＤｋ測定することができろ・ なお、本発明物質の製造に際し使用するヒトＭｎ−８Ｏ
Ｄの製造は、次のように実施することかできる。即ち、
ヒト胎盤に１０ｍＭリン酸−麹漬（ＰＨ７，８Ｊ１ｉ−
加え、これをホモジナイザーで均質化彼、１０．００Ｏ
ｒｐｍで遠心し上清を分取する。この上Ｗｉｔ水浴中で
７０℃にて５分間熱処理したのち、冷却；し、１０．０
０Ｏｒｐｍで遠心し上清を得る。この上清に硫−アンモ
ニウムを加え、その３０〜８５％飽和−分の沈澱を集め
、上記緩衝液に溶解後、同級衝液に対して、４℃にて７
２時間透析管行う。次に透析内液ｔ５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムを含む１０ｍＭリン酸Ｉｌ？ＩＪ液（ＰＨ７，８）
により１１１勘化された抗ヒトＭｕ−８０Ｄ抗体結合セ
ファロース４Ｂカラムに添加し、同上緩緬液にて洗浄後
、０．２Ｍ炭醗ナトリウム溶液にてＭＩＩ−８ＯＤの溶
離１行つ。ここで得られたＭｔｌ−Ｓ ＯＤ ｔ １０
ｍＭリンｔｓａｔｍ液（ＰＨ７，５）に対して透析を打
い、透析内液を凍結乾燥しＭｕ −５ｏｎｏｓａｔ−得
、ａ。−６０℃以下にて＆存する。
化担体と酵素橡識抗Ｍｕ−ＥＩＯＤ抗体を用い、サンド
ウィッチ法によシヒト体液ｔたは生検組織中のＭＩＩ−
ＢＯＤｋ測定することができろ・ なお、本発明物質の製造に際し使用するヒトＭｎ−８Ｏ
Ｄの製造は、次のように実施することかできる。即ち、
ヒト胎盤に１０ｍＭリン酸−麹漬（ＰＨ７，８Ｊ１ｉ−
加え、これをホモジナイザーで均質化彼、１０．００Ｏ
ｒｐｍで遠心し上清を分取する。この上Ｗｉｔ水浴中で
７０℃にて５分間熱処理したのち、冷却；し、１０．０
０Ｏｒｐｍで遠心し上清を得る。この上清に硫−アンモ
ニウムを加え、その３０〜８５％飽和−分の沈澱を集め
、上記緩衝液に溶解後、同級衝液に対して、４℃にて７
２時間透析管行う。次に透析内液ｔ５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムを含む１０ｍＭリン酸Ｉｌ？ＩＪ液（ＰＨ７，８）
により１１１勘化された抗ヒトＭｕ−８０Ｄ抗体結合セ
ファロース４Ｂカラムに添加し、同上緩緬液にて洗浄後
、０．２Ｍ炭醗ナトリウム溶液にてＭＩＩ−８ＯＤの溶
離１行つ。ここで得られたＭｔｌ−Ｓ ＯＤ ｔ １０
ｍＭリンｔｓａｔｍ液（ＰＨ７，５）に対して透析を打
い、透析内液を凍結乾燥しＭｕ −５ｏｎｏｓａｔ−得
、ａ。−６０℃以下にて＆存する。
次に実施例をあけて更に詳細に説明する。
実施Ｙ１・
＋１月ルＭ ｎ −Ｓ ＯＤ抗体の作製家兎１匹に対し
てＭｎ−８ＯＤＩＩｌｆｔ含む＃ＩＶｆｌ ｄ ｋ Ｆ
ｒ＊ｕｎｄのコンプリート−フジ１ハント（ｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ） １ ｄと混合して作
製した乳剤′に′に中の皮下お裏び四肢の爪の間に注射
する。ｉｌｌ！ｌ！ｌ目の免役から２繭間稜に第１回目
と同様の乳剤を家兎の皮下に注射した。同様な操作に２
〜３回繰り返した後、家兎の頚動脈より血液を採取し、
３７℃、３０分間の加温稜、３゜０００ ｒｐｍで１５
５分間遠心行い面清全得る。
てＭｎ−８ＯＤＩＩｌｆｔ含む＃ＩＶｆｌ ｄ ｋ Ｆ
ｒ＊ｕｎｄのコンプリート−フジ１ハント（ｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ） １ ｄと混合して作
製した乳剤′に′に中の皮下お裏び四肢の爪の間に注射
する。ｉｌｌ！ｌ！ｌ目の免役から２繭間稜に第１回目
と同様の乳剤を家兎の皮下に注射した。同様な操作に２
〜３回繰り返した後、家兎の頚動脈より血液を採取し、
３７℃、３０分間の加温稜、３゜０００ ｒｐｍで１５
５分間遠心行い面清全得る。
この血清につき５６℃、３０分間の熱処理を行い１補体
の非動化を行い、２０ｍＭ ｊＪン酸＠衝液ＬＰＨ＆ｌ
ｋ血清とｌ！ＩＪ ｎ加え、きらに血清と−」量の飽和
硫酸アンモニウム溶液を加えて３３％飽和とした、析出
する沈澱ｋ １２．００Ｏｒｐｍ、 １５分間遠心し
て集め）少量の同上緩袖液に溶解後、ｌＷＩ＆２媛液愛
用いてａ＃ｒ１″行い、硫酸アンモニウムを完全に除く
。ここで得られた自分ｋ ２０ｍＭリンｌ！１１緩４Ｍ
液（ＰＨ＆Ｕ）により＊＊化場れたＤＥＡＥ−セルロー
スカラム（２，５℃ＭＸ １５ｃｍ）Ｋ添加し、カラム
に吸着せずＮ上ａｍ液により流出する一寸を集め、さら
にその蛋白ｉ１５０ｍｇに相当する知ｋ ２０ｍＭリン
ｅ１に４１！ｗ液（ＰＨ８，０） テ緩幽化されたヒ
トＭｎ−８ＯＤ結合セファロース４Ｂカラム（１，５ｃ
ｒｎＸ １０ｃｒｔｒ）に添加し、四重緩衝液にて十分
に洗浄体、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍグリ
シン−水酸化ナトリウム４１１ｍ液（ＰＨ１１，ＯＪ’
にて抗体の浴出１行う。抗体画分を集め、精製水ｅこ対
して４８時間透析し、透析内液（抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体）
ｋ分注し凍結乾燥後、−３０℃以）で保存する。
の非動化を行い、２０ｍＭ ｊＪン酸＠衝液ＬＰＨ＆ｌ
ｋ血清とｌ！ＩＪ ｎ加え、きらに血清と−」量の飽和
硫酸アンモニウム溶液を加えて３３％飽和とした、析出
する沈澱ｋ １２．００Ｏｒｐｍ、 １５分間遠心し
て集め）少量の同上緩袖液に溶解後、ｌＷＩ＆２媛液愛
用いてａ＃ｒ１″行い、硫酸アンモニウムを完全に除く
。ここで得られた自分ｋ ２０ｍＭリンｌ！１１緩４Ｍ
液（ＰＨ＆Ｕ）により＊＊化場れたＤＥＡＥ−セルロー
スカラム（２，５℃ＭＸ １５ｃｍ）Ｋ添加し、カラム
に吸着せずＮ上ａｍ液により流出する一寸を集め、さら
にその蛋白ｉ１５０ｍｇに相当する知ｋ ２０ｍＭリン
ｅ１に４１！ｗ液（ＰＨ８，０） テ緩幽化されたヒ
トＭｎ−８ＯＤ結合セファロース４Ｂカラム（１，５ｃ
ｒｎＸ １０ｃｒｔｒ）に添加し、四重緩衝液にて十分
に洗浄体、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍグリ
シン−水酸化ナトリウム４１１ｍ液（ＰＨ１１，ＯＪ’
にて抗体の浴出１行う。抗体画分を集め、精製水ｅこ対
して４８時間透析し、透析内液（抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体）
ｋ分注し凍結乾燥後、−３０℃以）で保存する。
（２）抗Ｍｎ−ｄＯＤ杭ｆ＋Ｍ合ホリステレンビーズの
１＃製 凍結１＝燥した抗体１００ηに５０ｍＭ壌化ナトＩＪｒ
７Ａｔ−含ｔｒＯ，ＩＭリン＃にナトリウム′ａＩｇ液
（ＰＨ７，０） ｌ ｌ） ＯｓｇＫ浴解し、この′＃
液液中、十分洗浄（強力な界面活性剤による） したポ
リスナレンビーズ（山径的６．５■Ｊ ｋ １．０００
〜１０゜０υ０禦４１加え、３０℃で２時間条とりする
。さらにビーズ【抗体洛液中につけて一夜放ｔＩＩｔｆ
１抗体陪敲を除き、０．１％ウシ面清アルブミンを含む
同上、Ｗ＊液でビーズを洗浄後、同緩衝鍛を加えてざら
に３０℃で２時間条とうする。再び１ｉｒｌ稙慟液で洗
浄後、アジ化ナトリウム濃慶が０．１％になるように加
え同−ａ船液中に４℃でビーズを保存する。
１＃製 凍結１＝燥した抗体１００ηに５０ｍＭ壌化ナトＩＪｒ
７Ａｔ−含ｔｒＯ，ＩＭリン＃にナトリウム′ａＩｇ液
（ＰＨ７，０） ｌ ｌ） ＯｓｇＫ浴解し、この′＃
液液中、十分洗浄（強力な界面活性剤による） したポ
リスナレンビーズ（山径的６．５■Ｊ ｋ １．０００
〜１０゜０υ０禦４１加え、３０℃で２時間条とりする
。さらにビーズ【抗体洛液中につけて一夜放ｔＩＩｔｆ
１抗体陪敲を除き、０．１％ウシ面清アルブミンを含む
同上、Ｗ＊液でビーズを洗浄後、同緩衝鍛を加えてざら
に３０℃で２時間条とうする。再び１ｉｒｌ稙慟液で洗
浄後、アジ化ナトリウム濃慶が０．１％になるように加
え同−ａ船液中に４℃でビーズを保存する。
（３〕 打ｉ Ｍ ｎ −Ｓ ＯＤ抗体結合カラスビー
ズの１１４輌カラスビーズ（ｍ径約４■）５，０００〜
１０，０００（ｔｍｔｔｏ％ｒ−アミノ７０ヒル・トリ
エトキシシランを含むトルエン浴液２００−に加え、３
０分間室温で反応板、アルキルアミン化カラスビーズ奮
乾燥し、０．２％抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体金西南する２０ｍ
Ｍリン酸ｒａ嚢液（ＰＨ７，４） ５００−中ｅこ加え
た彼、よく攪拌しなからグルタルアルデヒドを終濃度０
．１〜１％になるように加え、４℃にて１２時間振とう
反応ざゼる。ここで得られた仇Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ガ
ラスヒーズｔ Ｏ，１％ウシ血清アルブミンを含有する
０、１Ｍリン＃ナトリウム＠＠ｐ１７ （ＰＨ７，０）
Ｋ ”Ｃ十分Ｋｆ）ｃ浄饋、アジ化ナトリウムを含む
神ｊ上＠衡液５０〇−中に４℃にて保存する。
ズの１１４輌カラスビーズ（ｍ径約４■）５，０００〜
１０，０００（ｔｍｔｔｏ％ｒ−アミノ７０ヒル・トリ
エトキシシランを含むトルエン浴液２００−に加え、３
０分間室温で反応板、アルキルアミン化カラスビーズ奮
乾燥し、０．２％抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体金西南する２０ｍ
Ｍリン酸ｒａ嚢液（ＰＨ７，４） ５００−中ｅこ加え
た彼、よく攪拌しなからグルタルアルデヒドを終濃度０
．１〜１％になるように加え、４℃にて１２時間振とう
反応ざゼる。ここで得られた仇Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ガ
ラスヒーズｔ Ｏ，１％ウシ血清アルブミンを含有する
０、１Ｍリン＃ナトリウム＠＠ｐ１７ （ＰＨ７，０）
Ｋ ”Ｃ十分Ｋｆ）ｃ浄饋、アジ化ナトリウムを含む
神ｊ上＠衡液５０〇−中に４℃にて保存する。
（４）Ｍ Ｍ ｎ −Ｓ ＯＤ抗体結合ナイロンビーズ
の調製ナイロンビーズ（山径的３１１１Ｊ１，０００〜
１０゜００（ｌｔ １２．５％トリエチル・オキソニウ
ム・テトラフルオロホレートを含むジクロルメタン割液
１０（Ｊ−中に加え、２５℃で１５分間反応後、水素化
カルシウムで水分１除いたジクロルメタン５０ｔ１ｍｇ
Ｋて洗浄−）る。上記０−アルキル化ナイロンヒーズを
ジアミノメタン１０〇−中に加えて家謳で２時間反応後
、０．２Ｍホウ酸４１１衝Ｐ＆（ＰＨ８，５）５００ｄ
Ｋで洗浄し、のち５％グルメをアルデヒドを含む四上Ｉ
ａ匍液１００−中に加えて室温で１５分間反応させる。
の調製ナイロンビーズ（山径的３１１１Ｊ１，０００〜
１０゜００（ｌｔ １２．５％トリエチル・オキソニウ
ム・テトラフルオロホレートを含むジクロルメタン割液
１０（Ｊ−中に加え、２５℃で１５分間反応後、水素化
カルシウムで水分１除いたジクロルメタン５０ｔ１ｍｇ
Ｋて洗浄−）る。上記０−アルキル化ナイロンヒーズを
ジアミノメタン１０〇−中に加えて家謳で２時間反応後
、０．２Ｍホウ酸４１１衝Ｐ＆（ＰＨ８，５）５００ｄ
Ｋで洗浄し、のち５％グルメをアルデヒドを含む四上Ｉ
ａ匍液１００−中に加えて室温で１５分間反応させる。
このビーズｔａら４Ｃ２０ｍＭリン醗カリウムｌ＃！Ｉ
Ｉｇ液（Ｐ）（７，（Ｊ〕５００シ＋洗浄後、ｌ ’Ｉ
ｆ／ｗｋｔ の抗体管含む同上緩＠１ｇ液５００１１
１／中に加え、４℃で一夜反応【行い、００１％ウシ血
清アルフミン、０．１％アジ化ナトリウムｔ 含む２０
ｍＭリン醗カリウム０衝液（ＰＨ７，０）で十分洗浄し
た後、同上縫ｍｅ中で４℃にて保存した。
Ｉｇ液（Ｐ）（７，（Ｊ〕５００シ＋洗浄後、ｌ ’Ｉ
ｆ／ｗｋｔ の抗体管含む同上緩＠１ｇ液５００１１
１／中に加え、４℃で一夜反応【行い、００１％ウシ血
清アルフミン、０．１％アジ化ナトリウムｔ 含む２０
ｍＭリン醗カリウム０衝液（ＰＨ７，０）で十分洗浄し
た後、同上縫ｍｅ中で４℃にて保存した。
（５１β−カラクトシダーゼ榛縁抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体の
ｊＭ製 凍結乾燥した抗体１．５ Ｔｑｋ ５０ｍＭ塩化ナトリ
リムを含も０．１Ｍリン酸ナトリウム酸伽液（ＰＨ７，
５〕 １．５ｗｔＫ治解し、ここへ２％ｍ−マレイーン
イミドベンゾイルーＮ−ヒドロキシサクシ／イミドエス
テル（ＭＢ８Ｊのジオキサン溶液１５ａＬｋ＃ＲＩえ、
３％：’Ｃで１時間反応後、１０ｍＭ場化マタネシウム
、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭすｙＩ！ｌ！
ナトリウム緩僑液（ＰＨ７，５） Ｋ Ｊ：すｌａ彼化
された七゛ファデックスＧ−２５カラム（谷軸約３０−
）により、クロマトグラフィーを付い、遊離のＭＢＳｔ
除きＭＢＳ化抗体を得る。このＭＢＳ化抗体浴液にＥ、
ｃｏ目産生の！−カフタトシターゼ１．５ＴｍＩｋ加え
、３０℃で１時間反応後、最終濃度１ｍＭＫなるように
２−メルカフトエタノールを加える。ざらにβ−ガラク
トシターゼ標識抗体ヲ０．１％ウシ血清アルブミン、０
．１％アジ化ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１
ｍＭ＃ｉ化マグネシウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩匍液（ＰＨ７，０）で緩働化されたセファロース４
Ｂカラム（１，５ｍ’Ｘ ４０ｏｚｇ）ニ添加し、Ｉ−
ガラクトシターゼ結合抗体を分離スル。！＝カラクトシ
ターゼ活性管有する抗体画分のヒータを集め、！−カラ
クトシダーゼ榛麺抗体とし、４℃で保存する０ （６） バーオキシダ−セ椰識抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体の
調製 西洋ワサビから精製されたパーオキシダーゼ１、ＰＯＤ
）４０Ｗｋ１．２５％グルタルアルデヒドを含む０．１
Ｍリンｍｓ省液（ＰＨ７，５）０．３−に溶解し、室温
で１８時間曳応する。グルタルアルデヒドｔｅｐｏａｔ
ｏ、ｔｓ４Ｍ塩化ナトリウムで一賞化ざ“れたセファデ
ックスＧ−２５カラムＬ １．５ｍＸ ６０℃Ｍノに添
加し、遊離グルタルアルデヒドを除く。上記グルタルア
ルデヒド化ｐｏＤ＃＃に抗体１０ａｖｒ浴解し、さらに
ＩＭ炭酸緩働液（ＰＨ９，５） ０．２−會加え、４℃
で２時間反応後、０．２ＭＬ−！Ｊレジン加え、室温で
２時間反応きせる。この反応液ｔ″０．１５４ Ｍ塩化
ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，２）
により緩衝化させたセファデックスＧ−２００カラム（
１，５ｚＸ７ＬｌｃＩｍ）に添加し、Ｆｏｒ）＠議抗体
管得る。ＰＯＤ活性を有する抗体画分を集め終濃度０．
１％になるように、ウシ血清アルブミンおよびチオメル
サール會加え４℃にて悔存する。
ｊＭ製 凍結乾燥した抗体１．５ Ｔｑｋ ５０ｍＭ塩化ナトリ
リムを含も０．１Ｍリン酸ナトリウム酸伽液（ＰＨ７，
５〕 １．５ｗｔＫ治解し、ここへ２％ｍ−マレイーン
イミドベンゾイルーＮ−ヒドロキシサクシ／イミドエス
テル（ＭＢ８Ｊのジオキサン溶液１５ａＬｋ＃ＲＩえ、
３％：’Ｃで１時間反応後、１０ｍＭ場化マタネシウム
、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭすｙＩ！ｌ！
ナトリウム緩僑液（ＰＨ７，５） Ｋ Ｊ：すｌａ彼化
された七゛ファデックスＧ−２５カラム（谷軸約３０−
）により、クロマトグラフィーを付い、遊離のＭＢＳｔ
除きＭＢＳ化抗体を得る。このＭＢＳ化抗体浴液にＥ、
ｃｏ目産生の！−カフタトシターゼ１．５ＴｍＩｋ加え
、３０℃で１時間反応後、最終濃度１ｍＭＫなるように
２−メルカフトエタノールを加える。ざらにβ−ガラク
トシターゼ標識抗体ヲ０．１％ウシ血清アルブミン、０
．１％アジ化ナトリウム、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１
ｍＭ＃ｉ化マグネシウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩匍液（ＰＨ７，０）で緩働化されたセファロース４
Ｂカラム（１，５ｍ’Ｘ ４０ｏｚｇ）ニ添加し、Ｉ−
ガラクトシターゼ結合抗体を分離スル。！＝カラクトシ
ターゼ活性管有する抗体画分のヒータを集め、！−カラ
クトシダーゼ榛麺抗体とし、４℃で保存する０ （６） バーオキシダ−セ椰識抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体の
調製 西洋ワサビから精製されたパーオキシダーゼ１、ＰＯＤ
）４０Ｗｋ１．２５％グルタルアルデヒドを含む０．１
Ｍリンｍｓ省液（ＰＨ７，５）０．３−に溶解し、室温
で１８時間曳応する。グルタルアルデヒドｔｅｐｏａｔ
ｏ、ｔｓ４Ｍ塩化ナトリウムで一賞化ざ“れたセファデ
ックスＧ−２５カラムＬ １．５ｍＸ ６０℃Ｍノに添
加し、遊離グルタルアルデヒドを除く。上記グルタルア
ルデヒド化ｐｏＤ＃＃に抗体１０ａｖｒ浴解し、さらに
ＩＭ炭酸緩働液（ＰＨ９，５） ０．２−會加え、４℃
で２時間反応後、０．２ＭＬ−！Ｊレジン加え、室温で
２時間反応きせる。この反応液ｔ″０．１５４ Ｍ塩化
ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ７，２）
により緩衝化させたセファデックスＧ−２００カラム（
１，５ｚＸ７ＬｌｃＩｍ）に添加し、Ｆｏｒ）＠議抗体
管得る。ＰＯＤ活性を有する抗体画分を集め終濃度０．
１％になるように、ウシ血清アルブミンおよびチオメル
サール會加え４℃にて悔存する。
実験例１
＋１）抗Ｍｎ −８０Ｄ抗体結合ポリスチレンビーズを
用いる方法（方法ｌ） 測定対象試料１０μｔあるいは濃度既知擁準Ｍｎ−８０
０溶液（ｏ、 ０，１．０．２． へ５゜１．０．
２．０． ！４０． １０． ２０
． ５０ｍｇ／μをン１００μｊ’ｉとシ、最終′
４′ＪＩｒが３００ｐＬになむ１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ＰＨ７，０）（バッファ−Ｅ）ｋ加え、場ら
に実施例（２）で得られた抗体結合ポリスチレンビーズ
ｔそれぞれ１個加え、３７℃で１時間反応後、１．５−
のノ（ツファーＥにて２回洗浄する。Ｃ（Ｄ ヒ−、ａ
’ Ｋ ３００μｔのバッファーＥおよび実施例（５）
で得られたβ−ガラクトシターゼ榛緘抗体５μｉｆ加え
、３７℃で３時間反応させ、１．５−のノ（ツファーＥ
にて２艶１洗浄する。このビーズを別の試験管Ｖｃとり
、２００μｔの）（ツファ−Ｅｋ加え、３０℃で５分間
予備加温の後、０．３ ｍ Ｍ ４−ノナルウ／ペリフ
ェリールーβ−ガラクトシド溶液１００μｔｙｔ（加え
て３０℃で５〜２０分間反応を打い、０．１Ｍグリシン
−水酸化ナトリウム＊衡ｌｌ＆（ＰＨ１０，３） ｋ
２．５−加えた後、励起波長３６０ ｎｍ、ケイ光波！
に４５０ ｎｍ Ｋてケイ光一定し、Ｉ−ガラクトシダ
ーゼの酵素活性’ｔ＃定する。第１図ａは本流によるＭ
ｎ７ＳＯＤの機準曲ｌＩＭＫ−示す。 、、Ｎ （２）抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ポリスチレンビーズを用
いる方法（方法２） １０、 ２０． ５０ ｎｇ／１００μｔ） １００μ
ｔｌｌｆとり最終容量が２００μｔになるように、０．
１％ウシ血清アルブミン、０．０１％チオメルサール。
用いる方法（方法ｌ） 測定対象試料１０μｔあるいは濃度既知擁準Ｍｎ−８０
０溶液（ｏ、 ０，１．０．２． へ５゜１．０．
２．０． ！４０． １０． ２０
． ５０ｍｇ／μをン１００μｊ’ｉとシ、最終′
４′ＪＩｒが３００ｐＬになむ１０ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ＰＨ７，０）（バッファ−Ｅ）ｋ加え、場ら
に実施例（２）で得られた抗体結合ポリスチレンビーズ
ｔそれぞれ１個加え、３７℃で１時間反応後、１．５−
のノ（ツファーＥにて２回洗浄する。Ｃ（Ｄ ヒ−、ａ
’ Ｋ ３００μｔのバッファーＥおよび実施例（５）
で得られたβ−ガラクトシターゼ榛緘抗体５μｉｆ加え
、３７℃で３時間反応させ、１．５−のノ（ツファーＥ
にて２艶１洗浄する。このビーズを別の試験管Ｖｃとり
、２００μｔの）（ツファ−Ｅｋ加え、３０℃で５分間
予備加温の後、０．３ ｍ Ｍ ４−ノナルウ／ペリフ
ェリールーβ−ガラクトシド溶液１００μｔｙｔ（加え
て３０℃で５〜２０分間反応を打い、０．１Ｍグリシン
−水酸化ナトリウム＊衡ｌｌ＆（ＰＨ１０，３） ｋ
２．５−加えた後、励起波長３６０ ｎｍ、ケイ光波！
に４５０ ｎｍ Ｋてケイ光一定し、Ｉ−ガラクトシダ
ーゼの酵素活性’ｔ＃定する。第１図ａは本流によるＭ
ｎ７ＳＯＤの機準曲ｌＩＭＫ−示す。 、、Ｎ （２）抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ポリスチレンビーズを用
いる方法（方法２） １０、 ２０． ５０ ｎｇ／１００μｔ） １００μ
ｔｌｌｆとり最終容量が２００μｔになるように、０．
１％ウシ血清アルブミン、０．０１％チオメルサール。
１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリンｗＩ駿−液
（ＰＩ−１７，０７（バッファーＰ）’に加え＼さらに
実施例（２）で得られた抗体結合ホリスチレ／ビーズｔ
それぞれ１個加え、３７℃で３時間反応ざゼ、のち１．
５−のバッファーＰにて２回洗浄を行う。このビーズに
２００μＬのバッファーＰおよび実施例（６）で得られ
たＰＯＤ４Ｉ１ｇ抗体溶液５μＬ￥ｈａえ、３７℃で３
時間反発感せ、のち１．５−のバッファーＰにて２回洗
浄會りう。このビーズを別の試験管にとり、０．３％オ
ルト７二二レンジアミン塩酸塩、０．０２％過酸化水素
および０．０１％テオメルサールを含む０．１Ｍクエン
酸−リン＃Ｍ麺液Ｌ ＰＨ６，０） ０．３ ｍｇ’を
加えて３０℃で５〜２０分間反応１行い、ＩＮ塩酸２．
５ｄ ｋ １１０えた級、４９２ ｎｍで吸光度測定管
行う。
（ＰＩ−１７，０７（バッファーＰ）’に加え＼さらに
実施例（２）で得られた抗体結合ホリスチレ／ビーズｔ
それぞれ１個加え、３７℃で３時間反応ざゼ、のち１．
５−のバッファーＰにて２回洗浄を行う。このビーズに
２００μＬのバッファーＰおよび実施例（６）で得られ
たＰＯＤ４Ｉ１ｇ抗体溶液５μＬ￥ｈａえ、３７℃で３
時間反発感せ、のち１．５−のバッファーＰにて２回洗
浄會りう。このビーズを別の試験管にとり、０．３％オ
ルト７二二レンジアミン塩酸塩、０．０２％過酸化水素
および０．０１％テオメルサールを含む０．１Ｍクエン
酸−リン＃Ｍ麺液Ｌ ＰＨ６，０） ０．３ ｍｇ’を
加えて３０℃で５〜２０分間反応１行い、ＩＮ塩酸２．
５ｄ ｋ １１０えた級、４９２ ｎｍで吸光度測定管
行う。
第２１畠は本流によるＭｎ−８ＯＤの樟準曲線を示す。
実験例２
１１）抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ガラスピーズを用いろ方
法（方法ｌ） 実施例（３）で調製した抗ＭブーＳＯＤ抗体結合カラス
ビーズを使用する以外は実験ｔ１．＋ １の（」）と同
様に操作を行う０本法によるＭｎ−８ＯＤの標準曲線に
第１図すに示すｂ （２）抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合カラスビーズ′ｇｒ用い
ろ方法（方法２） 実施例に３）で調製した抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ガラス
ピーズ１ｒ使用する以外は実ｗ！？１１１の（２）と同
様に操作ｗｈう。本流によるＭｔｌ−８ＯＤの標準面−
ｔ−第２図すに示す。
法（方法ｌ） 実施例（３）で調製した抗ＭブーＳＯＤ抗体結合カラス
ビーズを使用する以外は実験ｔ１．＋ １の（」）と同
様に操作を行う０本法によるＭｎ−８ＯＤの標準曲線に
第１図すに示すｂ （２）抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合カラスビーズ′ｇｒ用い
ろ方法（方法２） 実施例に３）で調製した抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ガラス
ピーズ１ｒ使用する以外は実ｗ！？１１１の（２）と同
様に操作ｗｈう。本流によるＭｔｌ−８ＯＤの標準面−
ｔ−第２図すに示す。
実験例３
ｔｌ） 抗Ｍｎ −Ｓ ＯＤ抗体結合ナイロンビーズを
用いる方法（方法１） 実施例（４）で−一した抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ナイロ
ンヒーズを使用する以外は実験例１の（１）と同様に操
作を行う。本法によるＭｎ−８ＯＤの碑準曲線Ｔｈｉ！
１図Ｃに示す。
用いる方法（方法１） 実施例（４）で−一した抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ナイロ
ンヒーズを使用する以外は実験例１の（１）と同様に操
作を行う。本法によるＭｎ−８ＯＤの碑準曲線Ｔｈｉ！
１図Ｃに示す。
＋２１抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ナイロンビーズを用いる
方法（方法２） 実施例（４）で調製した抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ナイロ
ンビーズを使用する以外は実験ｆＡ＋ １の（２）と同
様に操作１村う。本法によるＭｎ −Ｓ ＯＤの碑準曲
＆ｌをｗＪ２図ｅＫ示す。
方法（方法２） 実施例（４）で調製した抗Ｍｎ−８ＯＤ抗体結合ナイロ
ンビーズを使用する以外は実験ｆＡ＋ １の（２）と同
様に操作１村う。本法によるＭｎ −Ｓ ＯＤの碑準曲
＆ｌをｗＪ２図ｅＫ示す。
次に、各実験例における標準Ｍ１１− Ｓ ＯＤ １血
ｔａ候体Ｗｃおける１ｉｌＪｉＩ再現性および日差変動
１第１表および第２表に示す。
ｔａ候体Ｗｃおける１ｉｌＪｉＩ再現性および日差変動
１第１表および第２表に示す。
第１表 Ｉ−ガラクトシダーゼ標識抗Ｍ ｎ −Ｓ
Ｑ Ｄ抗体を用いたＭ ｎ −ｂ ＯＤ Ｏ＃素免疫測
定法の貴視性諏２Ｉｉ ＰＯＤ＠識抗Ｍｎ−８ＯＤ抗
体ｔＪｆＩ−たＭｎ−８ＯＤの酵素免疫測定法の栴塊性
１、各検体の１ｉｆＪ鮮り視性は５抑の濃謙の異なる検
体の１０回繰り返し実験を行りた結果で番る０ ２、各検体のＨ差蕪動は５種の濃度の異なる検体に一１
０日間綽り返し夷験會行りた結果である。
Ｑ Ｄ抗体を用いたＭ ｎ −ｂ ＯＤ Ｏ＃素免疫測
定法の貴視性諏２Ｉｉ ＰＯＤ＠識抗Ｍｎ−８ＯＤ抗
体ｔＪｆＩ−たＭｎ−８ＯＤの酵素免疫測定法の栴塊性
１、各検体の１ｉｆＪ鮮り視性は５抑の濃謙の異なる検
体の１０回繰り返し実験を行りた結果で番る０ ２、各検体のＨ差蕪動は５種の濃度の異なる検体に一１
０日間綽り返し夷験會行りた結果である。
各糧疾患患苔血清中のＭｎ−８ＯＤの本拳嵩免疫ＩＩＡ
足法によるｉＩＡ定結束 各拗疾廊患６血清中のＭｕ−８０Ｄ會【纂３酩１に示し
た。この結果、血清中のＭｎ −Ｓ ＯＤ ’ＩＩは肝
疾患Ｍ！、首で％異的に上昇し、とくに肝癌での上昇は
着しく、一方肝癌以外の癌ｌｌ雀ではその−が正常へよ
り低下していた。
足法によるｉＩＡ定結束 各拗疾廊患６血清中のＭｕ−８０Ｄ會【纂３酩１に示し
た。この結果、血清中のＭｎ −Ｓ ＯＤ ’ＩＩは肝
疾患Ｍ！、首で％異的に上昇し、とくに肝癌での上昇は
着しく、一方肝癌以外の癌ｌｌ雀ではその−が正常へよ
り低下していた。
第１図はＩ−カラ名ト乏ダーゼＩＩＩ簸抗ＭＥＩ −８
ＯＤ抗体【用いた場合のＭｎ −８０Ｄ Ｏ＠準曲巌ｔ
１本発明の実験例１〜３における既知濃農゛棒準Ｍｎ
−８ＯＤ ｌを槌軸に対数で取り、酵素活性ｉ−＊軸に
取って示すグラフ、第２−はＰＯＤ椋−抗Ｍｎ−ｂＯＤ
抗体【用いた場合のＭｎ−８ＯＤの梼準曲−ｔ１本発明
の実験例１〜３における既知濃＆標準Ｍｎ −８ＯＤ
１／Ｉｋｋ ｌｉ＄ｉ軸に対数で取り、吸光度を縦軸に
取って示すグラフ、Ｉｔ！３１は本発明の試薬管用いた
各柚疾患患者および健常人の血清中のＭｎ −８ＯＤ量
を示すグラフであ゛る。 ％奸出１人 杉 ＊＊
ＯＤ抗体【用いた場合のＭｎ −８０Ｄ Ｏ＠準曲巌ｔ
１本発明の実験例１〜３における既知濃農゛棒準Ｍｎ
−８ＯＤ ｌを槌軸に対数で取り、酵素活性ｉ−＊軸に
取って示すグラフ、第２−はＰＯＤ椋−抗Ｍｎ−ｂＯＤ
抗体【用いた場合のＭｎ−８ＯＤの梼準曲−ｔ１本発明
の実験例１〜３における既知濃＆標準Ｍｎ −８ＯＤ
１／Ｉｋｋ ｌｉ＄ｉ軸に対数で取り、吸光度を縦軸に
取って示すグラフ、Ｉｔ！３１は本発明の試薬管用いた
各柚疾患患者および健常人の血清中のＭｎ −８ＯＤ量
を示すグラフであ゛る。 ％奸出１人 杉 ＊＊
Claims (1)
- Ｌ 精製したヒトのマンガン−スーパーオキシドディス
ムターゼを抗原として得られる抗マンガンースーパーオ
キシドデイスムターセ抗体を酵素と共有結合により結合
した酵素樟識抗体と、該抗マンガンースーパーオキシト
チ法によるヒト体液ｔたは生検組織中のマンガン−スー
パーオキシドディスムターゼ測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18299081A JPS5886098A (ja) | 1981-11-17 | 1981-11-17 | マンガン−ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼ測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18299081A JPS5886098A (ja) | 1981-11-17 | 1981-11-17 | マンガン−ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼ測定用試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5886098A true JPS5886098A (ja) | 1983-05-23 |
Family
ID=16127821
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18299081A Pending JPS5886098A (ja) | 1981-11-17 | 1981-11-17 | マンガン−ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼ測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5886098A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4910133A (en) * | 1985-08-29 | 1990-03-20 | Ube Industries, Limited | Diagnostic test drug comprising monoclonal antibody to human copper.zinc-superoxide dismutase and diagnostic test method using the same |
| US5147783A (en) * | 1988-05-27 | 1992-09-15 | Ube Industries, Ltd. | Methods to screen for ovarian cancer and myocardial infarction |
| EP0691401A1 (en) * | 1987-03-27 | 1996-01-10 | Bio-Technology General Corporation | Human manganese superoxide dismutase analogs, pharmaceutical compositions containing them, and use thereof |
-
1981
- 1981-11-17 JP JP18299081A patent/JPS5886098A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4910133A (en) * | 1985-08-29 | 1990-03-20 | Ube Industries, Limited | Diagnostic test drug comprising monoclonal antibody to human copper.zinc-superoxide dismutase and diagnostic test method using the same |
| EP0691401A1 (en) * | 1987-03-27 | 1996-01-10 | Bio-Technology General Corporation | Human manganese superoxide dismutase analogs, pharmaceutical compositions containing them, and use thereof |
| US5147783A (en) * | 1988-05-27 | 1992-09-15 | Ube Industries, Ltd. | Methods to screen for ovarian cancer and myocardial infarction |
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