JPS63109371A - 免疫複合体のアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、患者の血清中の免疫複合体（ｉｍｍｕｎｅｃ
ｏｍｐｌｅに）の存在を決定するイムノアッセイ法およ
び試薬にに関する１本発明の１つの実施！！様は、患者
の血清中のアテローム性動脈硬化症の（ａｔｈｅｒｏｓ
ｃｌｅｒｏｔｉｃ）動脈内脂肪性Ｍｔ（ｐｌａｑｕｅ）
の免疫複合体の存在を決定することによって、アテロー
ム性動脈硬化症を診断する方法に関する。

免疫複合体は、補体の蛋白質を抗原−抗体複合体および
／または抗原複合体との相互作用によって形成し、そし
て補体の固定はその作用を細胞膜に及ぼし、ある細胞の
溶解および他における機能的染色体異常、例えば、ヒス
タミンの解放を伴うマスト細胞の顆粒減少、多形核白血
球の支配された移動、白血球およびマクｏ７アーノによ
る食細胞の活性の増大、および溶菌を起こす。こうして
、免疫複合体の存在は免疫防御系に関連する。

こうして、抗原−抗体免疫複合体は、抗原と選択的に結
合する抗体と接合した前記抗原、抗体−抗原複合体との
補体の相互作用の生成物、および体液要素、例えば、抗
イディオタイプ抗体、Ｕ　１７ウマチ因子、フィブロネ
クチンからなる。

血液と動脈組織との間に位置する内皮は、脈管壁中の血
液成分の蓄積に対するバリヤーとして働く、内皮におけ
るアテローム性動脈硬化症の病変の形成は、主要な冠状
血管の病気および発作に関達し、そしてこのような病変
の原因および検出は広範に研究されてきている。

内皮の損傷は、アテローム性動脈硬化症の病変の形成に
おける初期の段階であると信じられており、血行力学的
歪、過コレステロール血症および免疫複合体の病気によ
り潜在的に引き起こされる。

内皮の損傷は、動脈内膜の細胞の増殖、コレステロール
のＩＦ積および結合組織の線維の形成に導く。

損傷した内皮細胞および非内皮化動脈内膜の中のＩｇＧ
および補体因子Ｃ３の蓄積が示された。血液から誘導さ
れる単核食細胞は、また、アテローム性動脈硬化症の病
変における細胞集団の！一部を構成することが発見され
た。究極の動脈内脂肪沈積の組成に導く機構は、また、
知られていない。

広範な種類のの可溶性蛋白質がヒトアテローム性動脈硬
化症の動脈内脂肪沈積から抽出されてきており、それら
は次のものを包含する：ＩｇＡ。

ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＢＩＣ（ｃ３）　、ａ、−抗トリプシ
ン、α２−マクログロブリン、フイプリノゲン、アルブ
ミン、ＬＤＬ％ＨＤＬ１α１−酸糖蛋白質、β２−糖蛋
白質、トランスフェリンおよびセルロプラスミン、病気
の動脈内膜は、また、少量の組織結合１ｇＧ、ＩｇＡお
よびＢＩＣを含有することが発見された。ホラングー（
Ｈｏ１ｌａｎｄｅｒ）　、アテローム性動脈硬化症（Ａ
ｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）　、３４：　３９１−
４０５（ａ９７９）。他の化学者はこの病変および隣接
する内皮組織中のＩｇＧを報告した。パルム入（Ｐａｒ
ｕ＋ｓｓ）　、Ｄ、ら、アテローム性動脈硬化症（ＡＬ
ｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）　、　３８　：２１１−
２１６（ａ９８１）　、ハンソン（Ｈａｎｓｓｏｎ）、
Ｇ、ら、実験的および分子ＩＮ理学（Ｅ　ｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌａｎｄ　　Ｍ　ｏｌｅｅｕｌａｒ　　Ｐ　ａ
ｔｂｏｌｏｇｙ）、３４：２６４−２８０（ａ９８１）
、ハンソン（Ｈａｎｓｓｏｎ）、Ｇ、ら、アクタ拳パソ
ロジ力・マイクロバイオロジ力・ニド・イム７０シカ・
スカンノナビ力（Ａｃｔａ　　Ｐａｔｈｏ、　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ、　　Ｉ＋ｓｍｕｎｏ１．５ｃａｎｄ、　）
（Ｓ　ｅａｔ、　　Ａ　、ン、　　９２：　　４２９−
４３５（ａ９８４）。

しかしながら、アテローム性動脈硬化症および関連する
Ｍｔ＆における免疫グロブリンの起源、８！能および結
合の性質はなお神秘的である。抗低密度リボ蛋白質（Ｌ
ＤＬ）自己抗体は、脈管の病気患者においてより高いこ
とが報告され、それらがある方法でアテローム性動脈硬
化症の発現に関連することを示唆している。しかしなが
ら、これらの自己抗体とアテローム性動脈硬化症の動脈
内脂肪沈積との間の因果関係は確立されていない。スゾ
ンディ（５ｚｏｎｄｙ）　、Ｅ、ら、老化および発育の
１ｉｖｔ（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　　ｏｆ　　Ａｇｉｎｇ
　　ａｎｄ　　Ｄｅｖｅｌｏｐａ＋ｅｎｔ）、２９：　
１１７−１２３（ａ９８５）、ワグナ−’　Ｗａｇｎｅ
ｒ）　、Ｗ、　ｒプロテオグリカンの構造およびアテロ
ーム性動脈硬化症に関係するとしての機能（Ｐ　ｒｏｔ
ｅｏｇｌｙｃａｎ　　ａｎｄ　　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　　
ａｓｒｅｌａｔｅｄｅ　　ｔｏ　　ａｔｈｅｒｏｓｃｌ
ｅｒｏｓｉｓ）　Ｊ　、アンナルス・オブ・ニューヨー
ク・アカデミ−・オプ・サイエンシズ（ＡＮＮＡＬＳ　
　ＯＦ　　ＮＥＷＹＯＲＫ　　ＡＣＡＤＥＭＹ　　ＯＦ
　　５ＣＩＥＮＣＥＳ）　、Ｖｏｌ、　　４５４、ニュ
ーヨーク・アカデミ−・オプ・サイエンシズ、５２−６
８（ａ９８５）は、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂
肪沈積中のプロテオグリカン類のある種のモノマーが隣
接する正常の大動脈中のそれらと異なるという証拠を報
告した。

アテローム性動脈硬化症は自己免疫病の特性であるか、
あるいは前記特性を包含し、アテローム性動脈硬化症の
動脈内脂肪沈積は動脈内脂肪沈積特異的抗原を含有し、
そしてこの抗原と選択的に結合する抗体はアテローム性
動脈硬化症の病気をもつ患者の血清中に存在することを
、私は発見した。１９８６年３月３１日に提出した１８
４６゜４０１号および１９８６年６月２０日に提出した
第８７１，８１１号の私の同時係属出願において、アテ
ローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積に特異・的である
抗原および抗体の血清レベルを決定するための方法およ
び試薬を私は記載した。１９８６年１０月１６日に提出
した第９１９，４４５号の私の同時係属出願において、
アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積特異的抗原お
よび抗体を含有する免疫複合体の血清レベルはしばしば
評価されかつ検出できることという私の発見を報告した
。

本願は、血清試料中の免疫複合体の血清レベルを沼定す
る改良された方法に関する。

種々の体液および組織中の広範な種類の抗原物質および
非抗原物質の存在および量を決定するために、ある数の
イムノアッセイが開発された。合計の免疫グロブリンお
よびＩｇＥのイムノアッセイは、米国特許ｊｊｌ’５３
ｇ７２０，７６０号および米国特許第４，４４４，８７
９号に記載されている。

ＩｇＧアロタイプのイムノアッセイはロシア国特許６４
９．４３３号に記載されている。エライザ（ＥＬＩＳＡ
）は、マギオ（Ｍａｇｇｉｏ）ら、酵素のイムノアッセ
イ（ＥＮＺＹＭＥ−ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ）　、Ｂｏ
ｃａ　　Ｒａｔｏｎ：　ＣＲＣブレス、１７２−１７６
ページ（ａ９８０）に記載されている。

幼児からの血清中の界面活性剤−抗界面活性剤免疫複合
体を決定する方法は、ストレイアー（Ｓｔｒａｙｅｒ）
　、Ｄ、ら、アメリカン・ジャーナル・オブ争フイジオ
ロジー（Ａ、Ｊ、Ｐ、）、１２２：３５３−３６１（ａ
９８６）に記載された。修正されたスタフイロコッキ（
Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）結合アッセイおよびウ
ェスタンプロット分析による免疫複合体中の抗原の決定
は、マクドウガル（ＭｅＤｏｕｇａｌ）　、Ｊ、ら、臨
床の免疫学および免疫病理学（ｃ１ｉｎｉｃａｌ　　Ｉ
　ｗ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉ　ｍＩＩｕｎ
ｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）　３８　：　１８４−１９７　
（ａ９８６）に記載されている。免疫複合体の可溶性は
、免疫複合体化抗体のＦｃ部分と補体Ｃ４ｂおよびＣ３
ｂとの結合によって増加する、ベターソン（Ｐｅｔｅｒ
ｓｏｎ）、■、ら、補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）　、
２　：　９７−１１０（ａ９８５）。

米゛国特許第４，３４３ｇ７３４号は、体中のカルシウ
ム沈積、例えば、アテローム性動脈硬化症、弁の石灰化
、人工器官の石灰化に関連すると思われる蛋白質の分離
を記載している。この蛋白質はγ−カルボキングルタミ
ンサン（Ｇｌａ）基を含有するとして特徴づけられ、そ
してこの基をこの特許の分離手順において監視して、そ
の蛋白質を含有する分画を同定した。この蛋白質特異的
抗体の３１製は成功せず、特許権者に利用可能な唯一の
マーカーはその分画中のＧｌａの存在であった。このア
ミノ酸は体を通じて心臓弁および大動脈中に、および循
環する蛋白質、例えば、プロトロンビン、凝固因子ＶＩ
ＬＩＸおよびＣ１プロティンＣお上りプロティンＳ中に
広く存在し、そしてそれは有用な診断アッセイ４共を提
供しない、この特許に対応する論文は取り消され、そし
てこの特許のための基礎は飢りであることが証明された
ように思われる。

ＥＰＯ出１！８５４０２３５９．５は、ウサギにおいて
人工的に誘導したアテローム性動脈硬化症様障害から発
生したモノクローナル抗体を開示しており、前記障害は
ヒトのアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の障害
と交差反応することが報告された。結合の選択性の程度
を示すデータは報告されなかった。

本発明の方法および試薬において使用するアテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原およびアテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗体は、石灰化しない段
階を包含する、すべての段階におけるアテローム性動脈
硬化症の動脈内脂肪沈積と関連し、そしてＧｌａ含有蛋
白質と選択に結合しない。

血清中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免
疫複合体の存在を決定する本発明の改良された方法は、
アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原および
抗体を含有する免疫複合体を血清から分離し、そして分
離された物質中の免疫複合化要素のレベルを決定するこ
とからなる。

本発明に従う１つの方法において、血清を抗（アテロー
ム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積抗原）試薬の抗体と十
分な時間接触させて、血清中のアテローム性動脈硬化症
の動脈内脂肪沈積の抗原を含有する免疫複合体を抗（ア
テローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積抗原）試薬の抗
体と結合させる。

免疫複合体の１つの成分である、そこに結合する病気の
抗原は、分離した物質中の１または２種以上の免疫複合
化要素の存在および／またはレベルを同定することによ
って決定される。検出される免疫複合化要素は、補体蛋
白質、フィブロネクチン、抗体、例えば、動脈内脂肪沈
積抗原結合抗体または抗イディオタイプ抗体、類リウマ
チ因子、お上びフィブロネクチンから成る群より選択さ
れ、そして好ましくはＣ３ｂおよび／またはＣ４ｂであ
る。抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積抗／
ｆＸ）試薬の抗体は不溶性支持体に結合することができ
、そして不溶性支持体は血清と接触させてアテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体の抗原を抗（
アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積抗原）試薬の
抗体と接合させることができる０次いで、不溶性支持体
に結合した免疫複合体の存在および量を決定する。好ま
しい実施態様において、分離した免疫複合体を標識抗り
４ｂ抗体および／または抗Ｃ３ｂ抗体と十分な時開゛接
触させて、接合を起こし、そして不溶性支持体と接合し
た標識を決定する。酵素の標識は、物理的に検出可能な
酵素反応生成物、例えば、発色団または蛍光団を生ずる
基質との反応によって発現することができる。

本発明の他の実施！！！様において、抗（ヒト抗体）抗
体を不溶性支持体に結合させ、そしてこの不溶性支持体
を患者の血清と接触させて、血清中のヒト抗体を不溶性
支持体に結合させる。免疫複合体中のアテローム性動脈
硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原または抗（アテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体を決定する。抗（ヒ
ト抗体）抗体を不溶性支持体に結合し、そして血清と接
触させて前記抗体を免疫複合体中のヒト抗体と結合させ
ることができる。不溶性化した複合体中のアテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原の存在は、標識した
抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体で
決定することができる。

複合体中の抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
積）抗体の存在は、抗（アテローム性動脈硬化症の動脈
内脂肪沈積）抗体の結合部位と優先的に結合する標識し
た抗イディオタイプ抗体で決定することができる。

本発明の他の実施態様において、血清を抗（免疫複合化
要素）抗体、例えば、抗補体抗体と十分な時開接触させ
て、免疫複合体を抗体と結合させることがでさる。次い
で、免疫複合体中のアテロ−ム性動脈硬化症の動脈内脂
肪沈積の抗原または抗（アテローム性動脈硬化症の動脈
内脂肪沈積）抗体の存在を決定する。抗補体抗体を不溶
性支持体に結合し、そして血清と接触させて、その抗体
を免疫複合体中の補体と結合することができる。

不溶性化複合体中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂
肪沈積の抗原の存在は、標識した抗（アテローム性動脈
硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体で決定することができる
。複合体中の抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
沈積）抗体の存在は、抗（アテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積）抗体の結合部位と優先的に結合する標識
抗イディオタイプ抗体で決定することができる。

本発明のなお他の実施５１！様において、血清をポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）で処理して免疫複合体を沈
殿させる。次いで、℃を分散溶液、例えば、ＰＢＳ緩衝
液の添加によって可溶化し、そして複合体を電気泳動ま
たはチャオトロピック剤（ｃｌ＋ａｏｔｒｏｐｉｃ　　
ａｇｅｎｔ）の使用によって解離させる。溶解した蛋白
質を結合支持体、例えば、ニトロセルロースにトランス
ブロッティング（ｔｒａｎｓｂｌｏｔｔｉｎｇ）する。

支持体上のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の
抗原の存在は、標識した抗（アテローム性動脈硬化症の
動脈内脂肪沈積）抗体で決定することができる。不溶性
支持体上の抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
積）抗体の存在は、抗（アテローム性動脈硬化症の動脈
内脂肪沈積）抗体の結合部位と優先的に結合するＭ！、
、ｉ［ｌした抗イディオタイプ抗体および／または標識
したアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原で
決定することができる。

本発明のなお他の面は、血清中のアテローム性動脈硬化
症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体の存在を決定するイム
ノアッセイキットである。キットは標識した抗（免疫複
合化要素）抗体、好ましくはＣ１ｑ　　％Ｃ４ｂまたは
Ｃ３ｂ抗体、あるいは抗（アテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積）抗体の結合部位と優先的に結合する標識
した抗イディオタイプ抗体からなる。それは、また、免
疫複合体沈殿性界面活性剤、または不溶性支持体から選
択される、血清中の免疫複合体を不溶性化する手段を含
み、前記挿入に抗補体抗体、抗（アテローム性動脈硬化
症の動脈内脂肪性ｆり抗体または抗（アテローム性動脈
硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の結合部位に優先的に結
合する抗イディオタイプ抗体が結合する。

血清試料中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積
の免疫複合体の存在を決定する本発明の方法は、血清か
ら免疫複合体を分離して、アテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積の免疫複合体を選択的に分離するが、ある
いは非選択的に分離し、そしてそれらを試薬で処理して
、免疫複合体中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
沈積の抗原および／または抗体の存在を同定する。

アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体
は、進行したアテローム性動脈硬化症をもつ患者の血清
中に存在することを、私は発見した。これらの複合体は
、抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体
を接合したアテローム性動脈硬化症の！ｆｉｌ内脂肪沈
積の抗原および補体、とくに可溶化性Ｃ３ｂおよびＣ４
ｂ補体成分を含有する。Ｃ１ｑ　　を含む他の補体蛋白
質および補体断片、抗イディオタイプ抗体、類リウマチ
因子、およびフィブロネクチンが免疫複合体中に見出さ
れる。これらの複合体において、動脈内脂肪沈積抗原の
エピトープは完全に傷害し、そしてそれとの抗体の接合
は免疫複合体の構造によって完全に遮断することができ
る。

血清中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗
原の存在を決定する本発明の改良された方法は、アテロ
ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原を含有する免
疫複合体を決定物質から分離し、そして分離した物質中
の１または２以上の免疫複合化要素、例えば、補体蛋白
質Ｃ４ｂ、Ｃ１ｑ　および／またはＣ３ｂのレベルを決
定することからなる０本発明による１つの方法において
、血清を抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積
）試薬の抗体と十分な時間接触させて、血清中のアテロ
ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原を含有する免
疫複合体を抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
積）試薬の抗体と結合させる。この方法において、アテ
ローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積特異的エピトープ
を抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原
）特異的結合性抗体による選択的結合に対して暴露する
ことが必要である。免疫複合体の１成分であるそれに結
合した病気の抗原は、分離した物質中の免疫複合化要素
、例えば、ｃｉｑ　　、Ｃ４ｂおよび／またはＣ３ｂの
存在を同定することによって決定する。

アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積と選択的に結
合する抗体を、以後、抗（アテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積）抗体を呼ぶ。また、ここで定義する「抗
体」という用語の範囲内には、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ％
　ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびｒｇＥの抗体、および抗体の
断片およびハイブリッド誘導体、例えば、抗体のＦａｂ
およびＦ（ａｂ’）断片が包含される。

用語「動脈内脂肪沈積の抗原」は、以後、アテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原、すなわち、アテロ
ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積中に災質的な濃度で
独特に存在しかつ、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂
肪沈積中に特異的にあるいは増大した濃度で存在する、
１または２以上のエピトープを有する抗体を意味するた
めに使用する。この病気の自己免疫プロセスに含まれる
アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原は、こ
の用語の定義内の抗原の１つの区別する群である。

用語［アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫
複合体］および「動脈内脂肪沈積の免疫複合体」は、こ
こで使用するとき、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂
肪沈積およびそれに対する抗体に関連する抗体の補体含
有複合体を意味すると定義される。

用語「免疫複合化要素」は、ここで使用するとき、抗原
結合性抗体、補体化合物およびその断片、抗イディオタ
イプ抗体、類リウマチ因子、フィブロネクチン、および
免疫複合体中に見出される他の体液要素などをＩＬ昧す
ると定義される。

血清中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免
疫複合体の測定によるアテローム性動脈硬化症の診断の
ための本発明の方法において、アテローム性動脈硬化症
のａｖｋ内脂肪沈積の抗原含有免疫複合体を血清から分
離し、そして分離した物質中の免疫複合化要素のレベル
を決定する。この実施態様の１つの方法において、血清
な抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）試薬
の抗体と十分な時間接触させて、血清中のアテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原を抗（アテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）試薬の抗体と結合させる
。免疫複合体中の１成分であるそれに結合した動脈内脂
肪沈積の抗原は、分離した物質中のＣ４ｂ、ＣＩＱ　　
および／またはＣ３ｂの存在を同定することによって決
定する。抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積
）試薬の抗体は不溶性支持体に結合することができ、そ
して不溶性支持体を血清と接触させて、アテローム性動
脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体の抗原を抗（ア
テローム性ｗＪ脈硬化症の動脈内脂肪沈積）試薬の抗体
と接合させることができる。次いで、不溶性支持体に結
合したアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫
複合体の存在および汝を決定する。好ましい実施態様に
おいて、分離した免疫複合体を標識した抗Ｃ４ｂ、Ｃ１
ｑ　　、抗体および／または標識したＣ３ｂ抗体と十分
な時間接触させて、接合を起こさせ、そして不溶性支持
体と接合した標識を決定する。酵素の標識は、物理的に
検出可能な酵素反応生成物、例えば、発色団または蛍光
団を生ずる基質との反応によって発現させることができ
る。

本発明の他の実施態様において、免疫複合体のすべてを
血清から分離し、ここで分離は、例えば、複合体中の補
体を不溶性支持体に結合した抗補体抗体と結合させるこ
とにより、抗体を不溶性支持体に結合した抗１ｇ抗体ま
たはプロティンＡと結合させることにより、あるいは沈
澱によってｉ！成する。不溶性化複合体中のアテローム
性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原の存在は、標識し
た抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体
で決定することができる。複合体２Ｓの抗（アテローム
性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の存在は、抗（ア
テローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の結合部
位に優先的に結合する、標識した抗イディオタイプ抗体
で決定することができる。

本発明のなお他の実施態様において、抗（ヒト抗体）抗
体を不溶性支持体に結合し、そして不溶性支持体を患者
の血清と接触させて、血清中のヒト抗体を不溶性支持体
の結合させる。次いで、免疫複合体中のアテローム性動
脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原または抗（アテローム
性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の存在を決定する
。抗（ヒト抗体）抗体を不溶性支持体に結合させ、そし
て血清と接触させて、抗体を免疫複合体中のヒト抗体と
結合させることができる。不溶性化複合体中のアテロー
ム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原の存在は、標識
した抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗
体で決定することができる。複合体中の抗（アテローム
性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の存在は、抗（ア
テローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の結合部
位に優先的に結合する、標識した抗イディオタイプ抗体
で決定することができる。

本発明のなおほかの実施！！様において、血清をポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）で処理して免疫複合体を沈
殿させる６次いで、精製した複合体を１＆衝化溶液、例
えば、ＰＢＳで可溶化し、そして複合体を電気泳動およ
び／またはチャロトロピック剤の使用によって解離する
。溶解した成分を適当な結合支持体、例えば、ニトロセ
ルロースにトランスブロッティングする。支持体上のア
テローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原の存在は
、標識した抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
積）抗体で決定することができる。不溶性支持体上の抗
（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体のは
、抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体
の結合部位に優先的に結合する、標識した抗イディオタ
イプ抗体で決定できる。

抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体は
、ポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体の混合
物であることができ、これらは動物、例えば、ウサギ、
モルモット、ラットまたはヤギを濃縮した動脈内脂肪沈
積の抗原で免疫化し、免疫化した動物から血清を取り出
し、そして血清から、例えば、硫酸アンモニウムの沈殿
によって、固定化グロブリンを血清から分離することに
よって得られる０本発明の方法において有用な主な抗体
は■ｇＧおよび■ｇＭ抗体であるが、ＩｇＥおよびＩｇ
Ａ抗体を、また、十分な量で入手可能である場合、使用
することができる。あるいは、抗（アテローム性動脈硬
化症の動脈内脂肪沈積）抗体は、濃縮した動脈内脂肪沈
積の抗原で免疫化した動物、例えば、マウスまたはラッ
トの胛細胞から誘導したハイブリドーマがら得ることが
できる。このような胛ｍ胞をそれぞれの４歯類の色素＃
ｌＩ胞腫でハイブリダイゼーションし、所望の選択的か
つ高い結合エネルギーを有する抗（アテローム性動脈硬
化症の動脈内脂肪沈積）抗体を生ずるりａ−ンを選択し
、そしてクローンから抗体を生成する方法は、この分野
においてよく知られているｆ通の手順であり、そして本
発明の一部ではない。

抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪比ｆａ）抗体
および精製されたアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
沈積の抗原を得る手順は、次の私の同時係属特許出願に
記載されている：　　１９８６年３月３１提出の第８４
６，４０１号、１９８６年３月３１提出のｊ＠８７１，
４０１号、１９８６年６月２０提出の第８７６．７４１
号および１９８６年８月提出の第９１９，４４５号（こ
れらの出願の各々の全内容をここに引用によって加える
）。

抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体は
、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積から直接誘
導することでき、そして好ましくは慣用の抗血清または
モノクローナル技術によって、精！！！されたアテロー
ム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原から誘導するこ
とができる。動脈内相。

肪沈積抗原は、ヒトアテローム性動脈硬化症の動脈内脂
肪沈積を処理して、それに対して特異的な抗原を分離し
かつ精製することによって得られる。

動脈内脂肪沈積は、心筋梗塞症、心臓血管偶発症で死亡
した患者のヒト大動脈または他の特別の動脈を処理する
ことによって得ることができ、あるいは外科的手順によ
って得ることができる。動脈を解剖して、取囲むＭＬａ
および脂肪を除去し、そして生理的食塩水（５ａｌｉｎ
ｅ）中で洗浄して、汚染する血液を除去する。動脈内脂
肪沈積のセグメントを分離し、そして処理する。

動脈内脂肪沈積の区域を除去し、小さい片に切り、簡単
に洗浄し、そして等張溶液、例えば、リン酸塩ｍ衝化生
理的食塩水（ＰＢＳ）中で均質化する。このホモゾネー
トをＰＢＳ中で反復して遠心および再懸濁し、溶離液を
集める。沈降した破片は、また、クエン酸塩緩衝液、酸
性のｐＨ１で抽出し、そして上澄みを中和し、そしてさ
らに透析により精製する。上澄みを真空透析および限外
濾過により濃縮して、可溶性動脈内脂肪沈積抗原の濃縮
物を得る。

不溶性動脈内脂肪沈積抗原は、一部を異なる酵素で消化
し、消化物をＰＢＳで抽出し、そして前述のようにん溶
離液を濃縮するとによって得ることができる。使用する
酵素組成物は、フラデナーゼ、エラスターゼ、ＤＮアー
ゼ、ヒアルロニダーゼ、およびネツラミニグーゼを包含
する。各消化物を遠心し、例えば、限外濾過により濃縮
し、そして透析して、不溶性動脈内脂肪沈積抗原の濃溶
液を得る。

ポリクローナル抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂
肪沈積）抗体は、動物、例えば、ウサギ、モルモット、
ラットまたはヤギを濃縮した動脈内脂肪沈積抗原で免疫
化し、免疫化した動物から血清を取り出し、そしてこの
血清から免疫グロブリンを、例えば、硫酸アンモニウム
の沈澱により得られる０本発明の方法において有用であ
る主な抗体類はＩｇＧおよびＩｇＭの抗体であるが、■
ｇＥおよ（／ＩｇＡの抗体を、十分な量で入手可能であ
る場合、使用することもできる。

モノクローナル抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂
肪沈積）抗体は、グラフしく　Ｇｌａｆｒｒｅ）および
マイルすティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、酵素学の方法
（ＭｅｔｈｏｄＳＥｎｚｙｌｌｏｌ、　）　、７３’：
　１　（ａ９８１）の方法によって得ることができる。

本発明の１つの実施ａ様において、不溶性支持体に付着
する抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗
体を患者の血清と十分な時間接触させて、アテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体（またはアテ
ローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原からなる免
疫複合体）中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
積の抗原を抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
積）抗体と選択的に結合させる。患者の血清を除去し、
そして不溶性支持体を′Ｐｓ識した抗補体（好ましくは
抗Ｃ４ｂ、抗Ｃ１ｑ　　または抗ｃ３ｂ）抗体の水溶液
と接触させ、こうしてアテローム性動脈硬化症の動脈内
脂肪沈積の免疫複合体の露出した補体エピトープとの接
合を実施する。標識した抗補体抗体の溶液を不溶性支持
体から除去し、そして不溶性支持体上に存在する標識を
決定する。

あるいは、不溶性支持体上の試薬の抗体がヒト以外の抗
体であると仮定すると、選択的に不溶性化されたアテロ
ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体と標識
した抗（ヒト抗体）抗体との接合が起こるまで、不溶性
支持体を標識した抗（ヒト抗体）抗体の水溶液と接触さ
せることができる。適当な標識した抗（ヒト抗体）抗体
の例は、標識した抗（ヒトＩｇＧ抗体）抗体、抗（ヒト
ＩｇＭ抗体）抗体、抗（ヒトＩｇＡ抗体）抗体、または
抗（ヒトＩｇＥ抗体）抗体である。次いで、不溶性支持
体上に存在する標識を決定する。

なお他の方法において、免疫複合体中のアテローム性動
脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原の露出したエピトープ
は、接合が起こるまで、不溶性支持体を標識した抗（ア
テローム性動脈硬化症の動脈内脂肪性Ｍｔ）抗体のおよ
びと一緒にインキュベージランし、そして不溶性支持体
上に存在する標識を決定することによって決定すること
ができる。

他の選択的分離または不溶性支持体方法において、患者
の血清をアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗
原が付着している不溶性支持体と十分な時間接触させて
、複合体中の抗（アテロ−゛ム性動脈硬化症の動脈内脂
肪沈積）抗体の有効結合部位と抗体を接合させる。次い
で、不溶性支持体上の補体または抗（アテローム性動脈
硬化症の動脈内脂肪沈ｆ（ｔ）抗体の存在を、前述のよ
うにして決定する。

非特異的分離工程を用いる本発明の他の実施態様は、不
溶性支持体に結合した他の蛋白質結合物質、例えば、抗
補体抗体、抗１ｇ（抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ＊た
はＩｇＥ）抗体またはプロティンＡを使用する。これら
の結合物質は、よく知られておりかつ商業的に入手可能
である。

前述のように、初期の不溶性化後の不溶性支持体上のア
テローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体の
存在は、標識した結合剤、好ましくはアテローム性動脈
硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体の区別的な成分を
含有する免疫複合体とのみ結合するであろう、標識した
結合剤との反応またはインキエベーシランを特徴とする
特異的結合剤は、標識したアテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積の抗原または、免疫複合体の抗（アテロー
ム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体成分の利用可能
な結合部位に特異的に結合する、標識した抗イディオタ
イプ抗体であることができる。

それは、また、免疫複合体の動脈内脂肪沈積成分の利用
可能な動脈内脂肪沈積エピトープと結合するための、標
識した抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）
抗体であることができる。

用語「抗補体抗体」は、ここで使用するとき、免疫複合
体中の抗体または抗原結合性抗体に、好ましくはＣ４ｂ
％Ｃ１ｑ　および／またはＣ３ｂの補体エピトープに、
結合したヒト補体および補体断片と結合する、ポリクロ
ーナルおよびモノクローナルの抗体を意味すると定義さ
れる。抗補体抗体は、これらのヒト補体成分のために知
られおり、そして商業的に入手可能である。Ｃ４ｂのヒ
ト補体成分に結合する抗体は、Ｃ４ｂがより安定である
ので、好ましい、Ｃ３ｂが適当な表面に結合しなかぎり
、因子ＨはＣ３ｂと急速に結合し、１Ｃ３ｂへの急速な
開裂に導く［ベターソン（Ｐ　ｅｔｅｒｓｏｎ　）、Ｉ
　、（５ｕｐｒａ、　９８ページ）］。

抗１．抗体はヒト抗体のすべてのクラスに結合する抗体
であることができるか、あるいは免疫複合体中の実質的
な部号中に存在する特別のクラスまたはサブクラス（Ｉ
ｇＧ、ＩＩ？Ｍ、ＩｇＡ、ＩｇＥなど）に結合する抗体
であることができる。好ましい抗１．Ｇ抗体は、抗体の
ＩｇＧまたはＩｇＭクラスと結合する。

抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体、
抗補体抗体、抗ヒトＩｇ抗体は、慣用法によって不溶性
支持体へ結合することができる。抗体を不溶性支持体へ
結合する手順は、例えば、米国特許第３ｇ５５１，５５
５号、米国特許ｆＩＳ３゜５５３．３１０号、米国特許
第４，０４８，３１０号および最発行２９，４７４号に
記載されている。＠、着による抗体のポリスチレンへの
結合は、例えば、米国特許第３ｇ６４６，３４６号およ
び米国特許第４，０９２，４０８号に記載されている。

抗原を含有する蛋白質を種々の不溶性支持体へ結合する
ことは、米国特許第３ｇ７２０，７６０号に記載されて
いる。

種々の物質を不溶性支持体として使用することができる
。主要な考慮は、抗体またはプロティンＡの表面への結
合、試薬の結合反応あるいは接合反応の存在および程度
を決定するために使用でさる他の反応への妨害の不存在
、あるいは接合反応の存在および程度を決定するために
使用でさる他の反応の妨害の不存在である。天然および
合成の、有機およびｐ＠機のポリマーを不溶性支持体と
して使用でさる。適当なポリマーの例は、次の通りであ
る：ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポ
リ（４−メチルブチレン）、ブチルゴム、シラスチック
（５ｉｌａｓＬｉｃ）ポリマー、ポリエステル、ポリア
ミド、セルロースおよびセルロース誘導体（例えば、酢
酸セルロース、ニトロセルロースなど）、アクリレート
、メタクリレート、ビニルポリマー（例えば、ポリ酢酸
ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ボリア
）化ビニルなど）、ポリスチレンおよびスチレングラフ
トコポリマー、レーヨン、ナイロン、ポリ酪酸ビニル、
ポリホルムアルデヒドなど。不溶性支持体とじて使用で
きる他の物質は、前述のポリマーのラテックス、シリカ
ゾル、ケイ素のウェーファー、ガラス、紙、不溶性蛋白
質、金属、メタロイド、金属酸化物、磁性材料、半導電
性材料、セラミックなどであることができる。さらに、
ゲルを形成する物質、例えば、蛋白質、例えば、ゼラチ
ン、リボ多糖、ケイ酸塩、アガロース、ポリアクリルア
ミドまたはいくつかの水相を形成するポリマー、例えば
、デキストラン、ポリアルキレングリコール（２〜３個
の炭素原子をもつアルキレン）または界面活性剤、例え
ば、両親媒性化合物、例えば、リン脂質、長鎖（ａ２〜
２４個の炭素原子）フルキルアンモニウム塩などが包含
される。

本発明の好ましい診断支持体は、ポリスチレン、スチレ
ンコポリマー、例えば、スチレンーアクリロニトリルフ
ボリマー、またはポリオレフィン、例えば、ポリエチレ
ンまたはポリプロピレン、およびアクリレートおよびメ
タクリレートのポリマーおよびコポリマーを含む。抗動
脈内脂肪沈積試薬の抗体または動脈内脂肪沈積抗原は、
不溶性支持体に、吸着、靜電結合、または他の非共有結
合により結合させることができ、あるいはそれは不溶性
支持体へ共有結合によって結合させることができる。こ
の手順のためにとくに有利な支持体は、複数のウェルを
有するマイクロタイタープレート（ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅ
ｒ　　ｐｌａＬｅ）からなる。ウェルの表面またはその
中のプラスチックカップのインサートは、抗原または抗
体の支持体を構成できる。決定が蛍光の測定を必要と釘
る場合、マイクロタイタープレートまたはウェルのイン
サートは有利には光に対して不透明であり、こうしてウ
ェルに適用される励起の光が取囲むウェルの内容物に到
達したりあるいは影響を及ぼしたりしないようにする。

非共有結合のための手順は米国特許ｐｌＳ４，５２８．
２６７号に記載されている。抗体および抗原を不溶性支
持体へ共有結合する手順は、チロウ・チパタ（Ｉ　ｃｈ
ｉｒｏ　　Ｃｈｉｂａｔａ）　、固定化された酵素類（
ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　　ＥＮＺＹＭＥＳ）、ハルス
テッド・プレス（Ｈａｌｓｔｅｄ　　Ｐｒｅｓｓ）　：
　二ｓ−ヨーク（ａ９７８）およびＡ、クアトレ力サス
（ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）　％ジャーナル０オプ帝バ
イオロジカル・ケミストリー（Ｊ　、Ｂ　ｉｏｌ、　Ｃ
ｈｅ＠、　）、２４５：　３０５９（ａ９７０）（それ
らの内容全体をここに引用によって加える）に記載され
ている。米国特許第４，２１０，４１８号に記載される
手順に従い、例えば、カップリング剤（ｃｏｕｐｌ　ｉ
ｎｇＢｅｎｔ）としてグルグルアルデヒドを使用して、
表面を蛋白質で被覆し、そして抗体または抗原とカップ
リングすることができる。なお他の手順において、遊離
インシアネート基を有する層、例えば、ポリエーテルイ
ソシアネートでウェルを被覆することができ、そしてそ
れに水溶液中の抗体または抗原を適用すると、必要な結
合が行われる。

なお他の手順において、抗体または抗原はヒドロキシル
化物質に、米国特許第３．７２０，７６０号に記載され
ているような臭化シアンによりカップリングすることが
できる。

本発明の方法において適当な多（の標識した抗補体抗体
は、また、よく知られており、酵素で標識した抗補体抗
体を包含する。

標識した抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈８
２）抗体類およびそれらを調製する方法は、１９８６年
３月３１日に提出した私の同時係属出願＠８４６．４０
１号に記載されている。一般に、標識は、標識を他の蛋
白質試薬に取付けるのと同一の方法で、抗体に取付ちれ
る。標識した抗袖体抗体は、標識を蛋白質に取付けるた
めの普通の手順によって、ポリクローナルおよびモノク
ローナルの標識しない抗体から調製することができる。

標識は、化学的または物理的な結合によって、蛋白質試
薬へ結合またはカップリングすることができる。本発明
の抗体および動脈内脂肪沈積抗原へ接合できる配位子お
上び基は、試験する試料中の化合物および物質とそれら
が結合する試薬とを区別するために使用できる物理的ま
たは化学的特性を有する元素、化合物または生物学的物
質を包含する。

放射線標識した抗補体抗体は、生体外診断試験に使用す
ることができる。標識した抗体の比活性は、放射性標識
の半減期、同位体の純度、および標識を抗原または抗体
に組込む方法に依存する。

表Ａは、いくつかの普通に使用される同位体、それらの
比活性および半減期を記載する。イムノアッセイ試験に
おいて、比活性が高くなればなるほど、一般に、感度は
よりすぐれる。

３！２Ａ 純粋な同位体の非 同位体　　　活性（キエーリー　　半減期１モル） ”Ｃ６，２５Ｘ１０１　５７２０年 コＨ２，９１Ｘ１０４　　　１２．　５　年”Ｓ　　　
　　　１．５　　Ｘ１０６　８７日１２５工　　　　２
．１８Ｘ１０６　６０日コ２Ｐ　　　　　　　　　　　
　３．１６Ｘ１０６　　　１４，３　　日１コ’Ｉ　　
　　　　　　　　１　、６２Ｘ１０７　　　　８　、１
　　日蛋白質のを表Ａに記載する放射性同位体で標識す
る手順は、一般にこの分野において知られている。

トリチウム標識法は、例えば、米国特許ｔＩＳ４．３０
２．４３８号に記載されている。ことに抗体に適合する
ヨウ素化、トリチウム標識法およびコ５ｓａｎ法は、ゴ
ーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）　、Ｊ。

Ｗ、モノクローナル抗体：原理およびプラクテイス（Ｍ
ＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　　ＡＮＴＩＢＯＤＹ：Ｐ　ＨＩ　
Ｎ　ＣＩ　Ｐ　Ｌ　Ｅ　Ｓ　　Ａ　Ｎ　Ｄ　　Ｐ　ＲＡ
　Ｃｉ”　Ｉ　ＣＥ）、ニューヨーク：アカデミツク・
プレス、１２４−１２６ページ（ａ９８３）およびその
中に引用されている文献に記載されている。抗体をヨウ
素化するための他の方法は、次の文献に記＄２されてい
る：ハナター（）（ｕｎｔｅｒ）およびグリーンウッド
（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ）　、ネイチャー　（Ｎ　ａｔｕ
ｒｅ）、１４４：　９４５（ａ９６２）およびディピッ
ド（Ｄａｖｉｄ）　ら、バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏ
ｃｈｅｍｓｔｒｙ）　、１３：　１０１４−１０２１（
ａ９７４）、米国特許第３ｇ８６７．５１７号および米
国特許第４，３７６．１１０号。適当な系、カップリン
グ手順およびそれと基質との反応は、例えば、米国再発
行３１，００６号、Ｂ１＼３．６５４，０９０号、４，
２１４，０４８号、４，２８９，７４７号、４，３０３
ｇ４３８号、４，３１２．９４３号、４，２１４，１１
０号およびそれらの中に引用された文献に記載されてい
る。他の適当な系は、ベセ（Ｐ　ｅｓｃｅ）ら、クリニ
カルφケミストリー（ｃＩｉｎ、　　　Ｃｈｅｗ、）、
２０（３）：　　３５３−３５９（ａ９７４）およびウ
ィズグム（Ｗｉｓｄｏｍ）、Ｇｏ、クリニカル・ケミス
トリー（ｃＩｉｎ、　Ｃｈｅｍ、）、２２：　　１２４
３（ａ９７６）に記載されている。

適当な実施例のクラスのリストおよび各クラスの特定の
例は、次の通りである： 表■ クラス　　　　　　　ｉ」へ鮭 ヒドロラーゼ類　カル　アミラーゼ類 ボヒドラーゼ類 ヌクレアーゼ類　　　　ポリヌクレオチグーゼアミグー
ゼ類　　　　　アルギナーゼ プリンデアミナーゼ類　アデナーゼ ペプチグーゼ類　　　　アミ／ポリベプチグーゼブロイ
テナーゼ類　　　ペプシン エステラーゼ類　　　　リパーゼ類 鉄酵素類　　　　　　　カタラーゼ ｔｉ４酵素類　　　　　　　チロシナーゼ類補酵素含有
酵素類　　　アルコールデヒドロデナーゼ チトクローム還元性酵　コハク酸デヒドロデナー素類ゼ 黄色酵素類　　　　　　ジアホラーゼ ムターゼ類　　　　　　グリオキシラーゼデモラーゼ類
　　　　　アルドラーゼ オキシグーゼ類　　　　グルコースオキ、シグーゼセイ
ヨウワサビベルオキ シグーゼ 他の酵素類　　　　　　ベーター〃ラクトシグーゼ ホス７アターゼ類 ホスホリラーゼ類 へキンキナーゼ類 適当な酵素類のリストは、ホーク（Ｈａｕ＋ｋ）ら、実
際生理化学（ＰＲＡＣｌ”ＴＣＡＬ　　ＰＨＹＳＩＯＬ
ＯＧＩＣＡＬ　　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）、ニューヨーク
、マクグロー−ヒル、３０６−３９７ページ（ａ９５４
）に記載されている。

蛍光発生酵素Ｍ（前記酵素類の存在下に、選択した基質
は蛍光生成物を生成するであろう）は、有用な標識部分
である。抗体の抗原との結合能力を損傷しないで酵素を
抗体に選択的に接合する方法は、この分野においてよく
知られている。適当な酵素類およびそれらを抗体類に接
合する適当な手順は、例えば、次の文献に記載されてい
る：ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）　、Ｍ、　ら、セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）を抗体に接合す
る過ヨウ素酸塩法における最近の発展、免疫蛍光および
関連する着色技術における国際会ｇｉ（Ｉ　ＮＴＥＲＮ
ＡＴＩＯＮＡＬ　　Ｃ０ＮＦＥＲＥＮＣＥＩＮ　　ＩＭ
ＭＵＮＯＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥＡＮＤ　　ＲＥＬＡ
ＴＥＤ　　５ＴＡＩＮＩＮＧＴＥＣＨＮ　ＩＱＵＥＳ）
　、Ｗ、カップ（Ｋｎａｐｐ）ら編、アムステルグム：
エルセヴイー７（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、２１５−２４４
ベーノ（ａ９７８）、スリパン（５ｕｌｌｉｖａｎ）　
％　Ｍ、　　ら、酵素のイムノアッセイ（Ｅ　ｎｚｙｍ
ｅ　　Ｉ　ａ＋ｅ＋ｕｎｏａｓｓａｙ）　：　　リビュ
ー、アナルス・オブφクリカル・バイオケミストリー（
Ａｎｎａｌｓ　　　ｏｆ　　　Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　　　
Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１６：　２２１−２４
０（ａ９７９）　、および米国特許第４，１９０，４９
６号。好、ましい蛍光発生酵素類およびそれらに対応す
る適当な基質類は、次のものを包含する：セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ、これに対して適当な基質はホモバ
ニリン酸または４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニ
ル酢酸である、ベーターガラクトシグーゼ、これに対し
て適当な基質は４−メチルウンベリフェリルベーターＤ
−、？ラクトシグーゼである、アルカリ性ホスファター
ゼ、これに対して適当な基質は４−メチルウンベリフェ
リルホスフェート ウンベリフェリルホスフェート、例えば、４−カルボキ
シウンベリフェリルホス７エートお上びウンベリフェリ
ルホスフェート、例えば、４−カルボキシアルキル−エ
ステルなどである。

抗体を酵素で標識するために適当な手順の例は、カーボ
ッイミド類、ジアルデヒド類、および二官能性カップリ
ング試薬の使用を包含する。アミド基を通す酵素類の連
結は、蛋白質を塩化チオニル、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドまたは同様な試薬で無水溶媒、例えば、ジメチル
ホルムアミド、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テ
トラヒドロ７ランなどの中で処理することによって達成
できる６別のカップリング試薬は、カーポジイミド類、
例えば、１−エチル−３−（　３−Ｎ，Ｎ’−ツメチル
アミノプロピル）カーボンイミドまたは１−シクロヘキ
シル−３−（２−モルホリノエチル）カーポジイミドメ
チル−ｐ−）ルエンスルホネートを包含する。

酵素の炭水化物の部分は、また、アルデヒドに酸化し、
そして免疫グロブリンのりジルアミ７基と反応させてシ
ップ塩基を形成することができる。

ホウ水素化ナトリウムを使用する還元は、酵素と抗体と
を安定に連結する。セイヨウワサビペルオキシダーゼお
よび抗体は、上のウィルソン（Ｗｉ１３ｏｎ）の方法に
よって免疫グロブリンに効率的に連結することができる
。

蛍光標識した抗体は、この分野において既知の標準蛍光
性部分からｇ製できる。抗体および他の蛋白質は波及が
約３１０ｒｖ＋までの光を吸収するので、蛍光性部分は
３１０ｎｍより氏い波及、好ましくは４００ｒｖより艮
い波及の光を実質的に吸収するように選択すべきである
．種々の蛍光体は、スチリアー（　Ｓ　ｔｒｙｅｒ）　
、サイエンス（　Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１６２：　５２６
（　１９６８）およびブランド（Ｂｒａｎｄ）　、Ｌ．
ら、「構造のための蛍光性プローブ（　Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎＬ　　ｐｒｏｂｅｓ　　ｆｏｒ　　ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ）　Ｊ、アニュアル・リビュー・オブ・バイオケ
ミストリー（　Ａｎｎｕａｌ　　Ｒｅｖｉｅｗ　　ｏｆ
　　ＢｉｏｃｈｅＩｌｉｓｔｒｙ）、４１：８４３−８
６８（　１９７２）に記＠されている．抗体は、例えば
、米国特許第３ｇ９４０。

４７５号：米国特許ＰＩＳ４，２８９，７４７号および
米国特許第４，３７６、１１０号に記載されているよう
な普通の手順によって、蛍光性基で標識することができ
る。

ある数の前述の望ましい性質を有する蛍光体の１つの群
はキサンチン色索類であり、これらは３、６−ジヒドロ
キシ−９−フエニルキサントヒドロールから誘導された
フルオレセイン類、お上び３ｇ６−ジアミツー９−フェ
ニルキサントヒトロールおよびリスアミンローダミンか
ら誘導体されたレスアミン類およびローグミン頚を包含
する。

ローダミンおよび９−０−カルボキシフェニルキサント
ヒトロールのフルオレセイン誘導体は、９−０−カルボ
キシフェニル基を有する１反応性カップリング基、例え
ば、アミ７基およびインチオシアネート基を有するフル
オレセイン化合物は、例えば、フルオレセインイソチオ
シアネートお上びフルオレスカミンは容易に入手可能で
ある。

蛍光性化合物の他の群は、アミ７基をアルファまたはベ
ータの位置に有するす７チルアミン類である。す７チル
アミ７化合物には、１−ツメチルアミ／す７チルー５−
スルホネート、１−７ニリノー８−す７タレンスルホネ
ートお上り２−ｐ−トルイジル−６−す７タレンスルホ
ネートが包含される。他の色素には、次のものが包含さ
れる：３−フェニル−７−イツシアナトクマリン；７ク
リジン類、例えば、９−インチオシアナドアクリノンお
よびアクリジンオレンジ；Ｎ−ｒｐ（２−”Ｃン’ｙＱ
サシＩＪル）フェニル】マレイミド；ベンゾキサジオゾ
ール類、例えば、４−クロロ−７−ニドロベンゾー２−
オキサ−１，３−ジアゾールお上Ｖ？−（ｐ−メトキシ
ベンジルアミ／）−４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１
，３−ノアゾール；スチルベン類、例えば、４−ツメチ
ルアミノ−４゛−イソチオシアナトスチルベンおよび４
−ノメチルアミノ−４′−マレイミドスチルベン；　Ｎ
、Ｎ’−ジオクタデシクロキサカルボキシアミン−ｐ−
）ルエンスルホネート；　ピレン１１［、例えば、８−
ヒドロキシ−１，３ｇ６−ピレントリスルホン酸、１−
ピレン酪酸、メロシアニン５４０、ローズベンガル、２
，４−ジフェニル−３（Ｈ）−７ラノン、ｏ−７タルデ
ヒド、ならびに他の容易に入手でさる蛍光性分子、これ
らの色素は活性官能性を有するが、あるいはこのような
官能性は容易に導入することができる。

例えば、抗体は、ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、Ｊｌ
、モノクローナル抗体：原理および実際（ＭＯＮＯＣＬ
ＯＮＡＬ　　ＡＮＴＩＢＯＤＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ
　　　ＡＮＤ　　ＰＲＡＣＴＩＣＥ）　　、ニューヨー
ク、アカデミツク・プレス、２０８−２４９ページ（ａ
９８３）に記載されている手順によって、フルオロクロ
ーム類で標識することができる。フルオロクロームの濃
度はゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）　、２２９ページの
表に従って選択される。例えば、ＤＭＳＯ中のフルオレ
セインイソシアネート（ａ，Ｏｍｇ／ａｔ）またはロー
ダミンイソシアネート（ａ０，Ｏｍｇ／ｍｌ）を調製し
、そして所望容量（合計の蛋白質溶液の容量の１〜１０
％）を、攪拌しながら、ｇ４製溶液に清々添加する。

この反応は、光を遮断して、２時間進行させる。

生成物は、０．１％のＮａＮＯｓを含有するＰＢＳ中の
セファセックス（５ｅｐｈｄｅｘ）　Ｇ　　２５ゲルを
使用するゲル濾過によって精製して、未反応または加水
分解したフルオロクロームを除去する。接合体の吸収を
２８０ｎｗお上り可視領域におけるそのピーク（フルオ
レセイン化抗体について４９５ｎｍおよびローダミン化
抗体について５５０ｎａ＋）において測定する。フルオ
ロクローム対蛋白質の比を、上のゴーディング（Ｇｏｄ
ｉｎｇ）　、２２４−２２５ベージの手順に従って計算
する。接合体は、使用するまで光から保護して、４℃に
おいて貯蔵する。抗体溶液の濃度が１ｍｇ／ｍｌより低
い場合、ＢＳＡをこの決定に１ｍｇ／ｍｌの最終濃度に
添加する。

本発明の方法において使用する抗補体抗体は、本発明の
１つの実施！！！！様において、アビノンまたはビオチ
ンに共有結合することができる。適当な結合手順は、二
官能性架橋剤を通す架橋を包含する。適当な二官能性化
合物は、ベーターズ（Ｐｃｔｅｒｓ）　、Ｋ、　　ら、
Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ、　　Ｂｉｏｃｈｉａ＋、　　４６
：５２３−（ａ９７７）に記載されている。アルキルイ
ミデート類は、蛋白質によりそれらに対して提供された
官能性基にうちで高度のＵ異性を示す。

この反応は第一アミ７基に対して特異的である。

適当なカップリングの例は、次のものを包含するニアミ
ドエステル類、例えば、ツメナルマロンイミデート、ア
ット類、例えば、イミノ基と容易に反応してアミド結合
を形成するタートリルノアジドのアシルアット、アリー
ルシバライド、例えば、１，５−ノ７ルオロー２，４−
ジニトロベンゼン、または４ｆ　４゛−ジフルオロ−３
ｇ３゛−ノニトロフェニルスルホン、グルタルアルデヒ
ド、１−エチル−３−（３−ツメチルアミノプロピル）
カーボンイミド塩酸塩、シマレイニド、混合無水物、Ｉ
−マレアミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル、および他の既知の架橋剤。

上の試薬は本質的に不可逆の結合を提供する。

官能基をもつ二官能性試薬、例えば、ジサルファイドま
たはグリコールを使用できる。これらは、必要に応じて
、架橋反応後破壊できる結合を提供する。このような試
薬の例は、次の通りであるニジメチル３ｆ３゛−ノチオ
ビ入プロピオンイミデート、スクシニミジルプロピオン
イミデート、Ｎ−（３−フルオロ−４，６−シニトロフ
エニル）−シスタミン、タードリルジアジド、タートリ
ルジ（グリシルアジド）およびタートリルノ（ニブシロ
ン−アミ７カプロイルアジド）。

他の場合において、結合は試薬それら自体の開で直接形
成することができる。例えば、抗体はぞれぞれの物質上
の官能基を通してビオチンへ結合することができる。特
定の例として、ビオチンを過ヨウ’Ｊ酸塩で処理し、そ
して抗体と反応させて、ビオチンの７ビノンへの結合を
阻害しないで、あるいは抗体の免疫学的活性を遮断しな
いで、シッフ塩基を得ることができる。

二官能性架橋剤を使用する既知の技術は、次のものを包
含する（ａ）１工程のグルグルアルデヒドの結合、アプ
ラメアス（Ａｖｒａｍｅａｓ）　、Ｓｏ、免疫化学（Ｉ
　ｍｍｕｎｏｅｈｅｍｉｓＬｒｙ）　、　６　：　４３
　（ａ９６９）；（ｂ）２工程のグルタルアルデヒドの
結合、アプラメアス（Ａｖｒａｍｅａｓ）　、Ｓ、　、
免疫化学（ａｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、８：　
１１７５（ａ９７１）；および（ｃ）シマレイミドの結
合、カド（Ｋａｔｏ）、Ｋ、ら、ユーロビアン・ツヤ−
ナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　　Ｊ、　
　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　）　　６２：２８５（ａ９６６）
。

抗体は、７ナトウ４　ッチ（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）　、
Ｄ　。

ら、ジャーナル・オテ・アプライド・ラジエイジ町ン（
Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｒａｄ
ｉａｔｉｏｎ）、　　３５（６）：　　５５４−５５７
（ａ９８４）お上シブツクレイ（Ｂｕｃｋｌｅｙ）　、
Ｒ，ら、７エグレイシ１ン・オブ・ユーロピアン・バイ
オケミカル・ソサイアテイーズ（Ｆ　ｅｄｅｒａＬｉｏ
ｎ　　ｏｆ　　Ｅ　ｕｒｏｐｉａｎ　　Ｂ　ｉ。

ｃｈｅｍｉｃａｌ　　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ）　、１６６
（ａ）　２０２−２０４（ａ９８４年１月）に従う手順
に従って、金属の放射核で標識することができる。この
手順において、抗体は、金属放射核とキレートを形成で
きるキレート剤、例えば、ジエチレントリアミンペンタ
酢酸と接合される。ＤＴＰＡ（ノエチレントリアミンベ
ンタ酢ｉ！りの二環式無水物の００１Ｂ／ｍｌの懸濁液
を、乾燥溶媒、例えば、クロロホルム、エーテルまたは
乾燥ＤＭＳＯ中で３１製する。アリコートをＤＴＰＡ対
免疫グロブリンのモル比を１：　１とするために十分な
量で取り出して清浄な乾燥した管へ入れ、そして窒素の
下に蒸発させる。生理的食塩水中の０．０５モルの重炭
酸塩の緩衝液、ｐＨ７，０−７，５、中の使用する抗体
溶液の１０〜２０マイクロタイターの部分な乾燥ＤＴＰ
Ａに添加し、そして内容物を同一緩衝液で０．２１に希
釈し、そしてセファデックスＧ−２５ゲルの５０−のゲ
ル濾過カラムで精製し、生理的食塩水で溶離する。カッ
プリングの効率は、０．０５モル酢酸塩緩衝液、ｐＨ６
，０、中の「キレート等級」のＩＩＩ　Ｉｎの添加によ
って、精製前に決定する。カップリング効率の計算のた
めに、薄層クロマトグラフィーを使用して、ＤＴＰＡカ
ップリングした抗体を分離する。ＤＴＰＡカップリング
した抗体を、金属放射性核、例えば、目！Ｉｎ＋３、”
２Ｂｉ＋コおよび”Ｇａ”との結合（こ必要になるまで
４℃で貯蔵する。

本発明のイムノアッセイ法の１つの実施態様において、
抗動脈内脂肪沈積抗体を付着する不溶性支持体を患者の
血清と十分な時間接触させて、抗動脈内脂肪沈積抗体を
血清中の抗原または抗原含有免疫複合体と接合させ、次
いで患者の血清を支持体から除去する。インキュベージ
シン時間は実質的な接合を起こさせるために十分である
べきであり、この時間は温度に依存する。適当なインキ
ュベーション時開け１６〜４０℃の範囲内お温度におい
て２０〜２４０分であり、好ましい接触時間は２０〜２
６℃の範囲内の温度において少なくとも６０分である。

次いで、残留する血清をから洗浄溶液の使用により除去
する。普通の洗浄溶液を使用できる。好ましい洗浄溶液
は米国特許第４，５２８，２６７号に記載されている。

それはｏ、ｏｏｏｉ〜０゜０５のモル濃度、ｐＨ６〜８
を有し、そして０゜００１〜０．１重量％の非イオン性
界面活性剤を含有する水性リン酸塩緩衝液である。適当
な非イオン性界面活性剤は、次のものを包含する：ポリ
オキシエチレンエーテル（ＢＴＩＪ）、例えば、ラウリ
ル、セチル、オレイル、ステアリル、およびトリデシル
ポリオキシエチレンエーテル；ポリオキシエチレンソル
ビタン（ＴＷＥＥＮ）　、例えば、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレート、モノパルミテート、モノス
テアレート、モノオレエート、およびトリオレエート；
お上り他のポリオキシエチレンエーテル（例えば、’Ｉ
’　ＲＩ　ＴＯＮ）。好ましい非イオン性界面活性剤は
、４０のエチレンオキシド単位を有するオクチルフェノ
キシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ　　Ｘ−４
０５、ローム・アンド・ハース・カンパニー）である。

次いで、不溶性支持体を、不溶性支持体上の補体に結合
するであろう、抗（ｃ４ｂ、Ｃ１ｑ　　および／または
Ｃ３ｂ）％１体抗体と接触させる。

種々の標識を前述した。明瞭を目的として、この方法の
引続く工程を、酵素、好ましくは蛍光発生酵素で標ａさ
れた抗補体抗体について説明釘るが、これは限定を意味
するものではない。用語「蛍光発生酵素」は、ユニおい
ては、適当な基質と蛍光団生成物を生成するであろう酵
素を意味する。

酵素標識した抗補体抗体を、水溶液中で不溶性支持体に
適用する。この溶液は、好ましくは、反応成分を保存し
かつ接合反応を促進するために、適当な塩類および緩衝
剤類を含有する０例えば、この溶液は、ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）　、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）　、およ
び前述の洗浄溶液中に使用した穏和な界面活性剤、例え
ば、ポリオキシエチレンソルビタンエーテルを含有する
ことができる。インキュベーションは十分な時間続けて
、標識した抗補体抗体を、存在する場合、不溶性支持体
に付着する免疫グロブリンと接合させる。

好ましいインキュページ町ンの時間および温度は、不溶
性２１試薬の抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
沈積）抗体ととの接合について記載した通りである。

次いで、ｌＸａした抗補体抗体の溶液を不溶性支持体か
ら除去し、そして支持体を洗浄溶液、例えば、前述の溶
液で洗浄して、残留するかも知れない接合しない標識し
た物質を除去する。

本発明のサンドイツチ法の第３工程において、不溶性支
持体を基質の水溶液と接触させ、この基　　１質は酵素
の存在下に反応して蛍光化合物を溶液中に放出する。転
化されうる適当な基質および酵素　　。

は、例えば、米国特許ｆｊｓ４，１９０，４９６号オｊ
よび米国特許第４，５２８，２６７号に記載されている
。支持体は、１０−２〜１０−１００モル濃の基質を含
有する水溶液と接触させる。１０−４〜１０−５モル濃
度の基質は好ましい。基質の溶液中の好ましい追加の試
薬およびｕＬｇｆｉ剤は、例えば・２−７ミノー２−メ
チル−１−プロパツール緩衝剤および塩化マグネジツム
である。

この基質の溶液を不溶性支持体と一緒に十分な時間イン
キュベーションして、蛍光団を発生する反応を起こさせ
る。、１８〜４０℃の温度において、５〜２４０時間の
インキュベーション時間を使用できる。好ましくは、温
度は２０〜２６℃の範囲内であり、そしてインキュベー
ン９フ時開は３０〜９０分である。

次いで、溶液中の蛍光のレベルを測定する。基質溶液中
の蛍光のレベルを決定する装置および手順は、この分野
において普通に使用されているものである。蛍光のレベ
ルは不溶性支持体上の酵素の濃度の関数であり、そして
酵素の濃度は血清試料中の動脈内脂肪沈積抗原または動
脈内脂肪沈積抗原免疫複合体の量の関数である。アテロ
ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原の濃度は、溶
液の蛍光のレベルを、既知濃度の動脈内脂肪沈積抗原を
含有する対照溶液で得られた蛍光のレベルと比較するこ
とによって決定することができる。　。

別な方法において、特異的アテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積の免疫複合体が接合した不溶性支持体を、
酵素標識した抗（ヒトＩｇ）抗体または酵素標識したア
テローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原と十分な
時間インキュベージタンして、接合を起こすことができ
る。好ましいインキュベージラン時間および温度は、不
溶性化した試薬抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂
肪沈積）抗体とアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
積の免疫複合体とのインキュベージシンについて上に記
載した通りである６次いで、接合生成物を、前述のよう
に、分離し、洗浄し、そして基質溶液と反応させる。

本発明の他の実施態様において、血清を、補体を含有す
るすべての免疫複合体と結合する試薬、例えば、抗補体
抗体（好ましくは抗Ｃ４ｂ、抗Ｃ１ｑ−たは抗Ｃ１抗体
）と、あるいは補体を含有しないすべての免疫複合体と
結合する試薬、例えば、抗（ヒトＩｇ）抗体と、十分な
時間接触させて、免疫複合体を抗体と結合させる。抗補
体抗体または抗Ｉｇ抗体は、好ましくは、不溶性支持体
の結合させる６次いで、患者の血清を支持体から除去す
る。インキュベージ５フ時間は、実質的な接合を起こす
ために十分であるべきであり、温度に依存する。適当な
インキュベーション時間は１６〜４０℃の範囲内の温度
において３０〜２４０分であり、好ましい接触時間は２
０〜２６℃の範囲内の温度において少なくとも６０分で
ある１次いで、残留する血清を支持体から、すすぎ溶　
液、例えば、前述のリン酸塩緩衝溶液の使用によって除
去する。

次いで、免疫複合体中のアテローム性動脈硬化症の動脈
内脂肪沈積の抗原または抗（アテローム性動脈硬化症の
動脈内脂肪沈積）抗体の存在を決定する。不溶性化複合
体中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原
の存在は、標識した抗（アテローム性動脈硬化症の動脈
内脂肪沈積）抗体で決定できる。複合体中の抗（アテロ
ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈Ｗｔ）抗体の存在は、
抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の
結合部位に優先的に結合する、ｍａした抗イディオタイ
プ抗体で決定できる。

標識した試薬を水溶液中で不溶性支持体に適用する０種
々のｔｇ、識は上に記載した。明瞭を目的としかついか
なる方法によっても限定されないが、この方法の引続く
工程は、酵素、好ましくは蛍光性醇索で標識された抗動
脈内脂肪沈積の抗体および／または抗イディオタイプ抗
体について説明する。

酵素標識した抗体を水溶液中で不溶性支持体に適用する
。この溶液は、好ましくは、反応成分を保存しかつ接合
反応を促進するために適当な塩類および緩衝剤を含有す
る。例えば、溶液はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、
リン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）、および穏和な界面活性剤
、例えば、ポリオキシエチレンンルビクンエステル（前
述のすすぎ溶液中に使用した）を含有できる。インキュ
ベーションは十分なｒＵ９問続けて、標識した抗動脈内
脂肪沈積の抗原を、存在する場合、不溶性支持体に付着
する露出した動脈内脂肪沈積抗体エピトープと接合させ
、標識した抗イディオタイプ抗体を免疫複合体中の抗（
アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の露出
した結合部位または両者と接合させる。好ましいインキ
ュベージ３ン時間および温度は、前述の抗体−抗原反応
について記載した通りである。

次いで、標識した試薬の溶液を不溶性支持体から除去し
、そして支持体をすすぎ溶液、例えば、前述の溶液です
すいで、残留する接合しない標識物質を除去する。

この実施態様の第３工程において、不溶性支持体を、酵
素の存在下に反応して蛍光性化合物を溶液中に放出する
基質、例えば、本発明のｔＡ１実施態様に関して記載し
た基質の水溶液と接触させる。

支持体を１０−２〜１０−１’モルの濃度の基質を含有
する基質の水溶液と接触させる。１０−４〜１０−５の
基質のモル濃度は好ましい。基質の溶液中の好ましい追
加の試薬および緩衝剤は、例えば、２−７ミノー２−メ
チル−１−プロパツールｃＬｇＩ剤および塩化マグネシ
ウムを包含する。

基質の溶液を不溶性支持体とともに、蛍光団を生ずる反
応を起こすために十分な時間インキュベーションする。

１８〜４０℃の温度、５〜２４０分のインキュベーン１
２時間を使用できる。好ましくは、温度は２０〜２６℃
の範囲内であり、そしてインキエベーシａン時間は３０
〜９０分である。

次いで、溶液中の蛍光のレベルを測定する。ｆｆｌ光の
レベルは不溶性支持体上の酵素の濃度の関数であり、そ
して酵素濃度は血清試料中の動脈内脂肪沈積の抗原また
は動脈内脂肪沈積の抗原の免疫複合体の量の関数である
。アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合
体の存在および濃度は、溶液の蛍光のレベルを既知濃度
の免疫複合体を含有する対照溶液の蛍光のレベルと比較
することによって決定することができる。

本発明の第３文庫態様において、血清を水溶性または水
分散性の分子ｆＩＬ５００〜１０，０００、好ましくは
１０００〜５０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）　、または同等の蛋白質沈殿性界面活性剤で処理して
免疫複合体を沈殿させる。

次いで、精製した複合体を適当な水性緩衝液で可溶化し
、そして免疫複合体を電気泳動またはチャオトロピック
剤で解離させる。溶解した蛋白質を蛋白質結合性支持体
または他の結合性支持体、例エバ、ニトロセルロースへ
トランスプロッティングする。支持体上のアテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原の存在は、標識した
抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈＃ｅｔ）抗
体で決定でき為、不溶性支持体上の抗（アテローム性動
脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体は、抗（アテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の結合部位に優先的
に結合する、標識した抗イディオタイプ抗体で決定でき
る。試薬とともに使用する標識が発色性または蛍光性の
酵素である場合、前述の手順を使用してウェスタンプロ
ット上に、所望の検出可能な生成物を生ずる基質を選択
して、物理的に検出可能な着色を発生させることができ
る。

あるいは、標識は放射性標識であることができ、この場
合において、ウェスタンプロットはウェスタンプロット
法とともに慣用されているラジオグラフ法によって発現
させ名ことができる。

本発明を以下の特定であるが、非限定的実施例によって
さらに説明する。特記しないかぎり、反応はセ氏であり
、そして百分率は重量による。実施するために構成的に
縮小した実施例は現在の意味で記載されており、そして
前もって実施するために縮小した実験室の実験を表わす
実施例は過去の意味で記載されている。

実施例１ アテローム性動脈硬化症のｖＪＪ脈内眼内脂肪沈積原の
分離 動脈内膜（動脈内脂肪沈積）を内側層から切除し、そし
て０．９Ｎの生理的食塩水で簡単に洗浄する。動脈内脂
肪沈積を小さい片（２Ｎ２ｍｍ）に切り、そしてこのＭ
Ｌｍを０．１５モルのＰＢＳ。

ｐｌ！？、２、中で高速度で４℃において３０〜６０秒
開均質化した。このホモジネートを４℃において３０分
間遠心（２０００Ｘｇ）する。上澄みを取っておく。均
質化および遠心の工程を反復し、上澄みをプールする。

制菌量のアジ化ナトリウムをプールした上澄みに添加し
、そして上澄みを４℃で貯蔵する。

実施例２ セファローズへの抗体の接合 凍結乾燥したＣ　Ｎ　Ｂ　ｒ−セファローズ（Ｓ　ｅｐ
ｈａｒｏｓｅ）４Ｂ粉末［ファーマシア（Ｐ　ｈａｒｍ
ａｃｉａ）　］を１ミルモルのＨＣＩ中で１５分間膨潤
させる。

このゲルを、焼結ガラスフィルター（多孔度Ｇ−３）上
において、ゲルのＩｇ（乾燥重量）につき合計２００１
の１ミリモルのＨＣＩで洗浄する。

これはいくつかの７リコードで実施し、」−澄みを連続
添加の間に吸引する。

ゲルの１１につき５ｍｇのカップリングすべき蛋白質を
、カップリング緩衝液（０，１モルのＮａＨＣＯ，、ｐ
Ｈ８，３ｇ０，５モルのＮａＣｌを含有する）中に溶解
する。ゲルをカップリング緩衝液で洗浄し、過剰量を吸
引により除去し、そして蛋白質溶液をゲルと混合物する
。この混合物を攪拌しないで４℃で一夜放置する。次い
で、ゲルを１モルのエタノールアミンを含有するブロッ
キング緩衝液、ｐＨ８，０、中に室温において２時間配
置する。次いで、ゲルをカップリング緩衝液（０゜１モ
ルの酢酸塩緩衝液、ｐＨ４，０，０，５モルのＮａＣ１
を含有する）で洗浄し、そしてカップリングａｍａで２
回洗浄する。ここで蛋白質−七７７０−ズ接合体は使用
できる状態にあり、そして４〜８℃において貯蔵するこ
とができる。制菌剤として臭化シアンを緩衝液に添加す
ることができる。

実施例３ 動脈内脂肪沈積の上澄みからのＩｇＧ抗体の吸着 合計約１２９ｍｇの抗ＩｇＧ抗体を含有する、実施例２
の手順に従いｍ製した抗ＩｇＧ抗体に接合したセフ７０
−ズゲルの２５＋ｍｌをカラムに充填する。このカラム
を２〜３容量のｌｔｌ衝ｅ、（０，１５モルのＰＢＳ％
　ｐＨ７，２）と平衡化し、次いで試料をこのカラムの
適用する。

溶＠ｍ衝液（０，１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７，２）の流
速は好ましくは３０〜６０ｍ１／時開である。

抗体を含有する溶離した分画を、ピーク活性が消失する
まで集める。

実施例４ 動脈内脂肪沈積の上澄みからのＩｇＧ抗体の吸着 実施例２の手順に従って調製した抗ＩｇＧ抗体に接合し
たセフ７０−ズゲルの７．５ｍｌを充填したカラムを使
用して、実施例３の手順を反復する。

溶離ＰＢＳａＴｌｌｊ液の流速は２０〜６０、好ましく
は３７．５ｓ＋ｌ／時間である。

実施例５ 動脈内脂肪沈積の上澄みからのＩｇＧ抗体の吸着 実施例２の手順に従って調製した抗１ｇＡ抗体に接合し
たセフ７０−ズゲルの７□　５１１１１をを充填したカ
ラムを使用して、実施例３の手順を反復する。溶離ＰＢ
Ｓ緩ｌｌｉ液の流速は２０〜６０、好ましくは３７．５
ｍｌ／時間である。

実施例６ 動脈内脂肪沈積の上澄みからのＩｇＧ抗体の吸着 実施例２の手順に従って調製した抗１ｇＭ抗体に接合し
たセファローズゲルの７．５ｍｌをを充填したカラムを
使用して、実施例３の手順を反復する。溶離ＰＢＳ緩衝
液の流速は２０〜６０、好ましくは５０ｍ１／時間であ
る５ 実施例７ 動脈内脂肪沈積抗原の精製 実施例３の手順に従って得られた動脈内脂肪沈積に特異
的に結合するＩｇＧ抗体を、実施例２の手順に従ってセ
ファローズに結合して、動脈内脂肪沈積抗原に対して特
異的に結合する親和カラムのゲルを形成する。

抗動脈内脂肪沈積ＩｇＧ抗体に接合したセフ７０−ズゲ
ルの２５ｍ１をカラムに充填する。このカラムを８〜１
０容量の緩衝液（ｏ、ｉｓモルのＰＢＳ、ｐｌ−Ｉ？、
２）と平衡化し、そして実施例１に従って得られた動脈
内脂肪沈積溶液をこのカラムに適用する。

溶離緩衝液（０，１モルの酢酸、０．１５モルのＮａＣ
１、ｐＨ７，２）の流速は好ましくは２０〜６０ｍ１／
時間である。動脈内脂肪沈積を含有する溶離した分画を
、ピーク活性が消失するまで、集めて動脈内脂肪沈積を
得て、これに抗動脈内脂肪沈積ＩｇＧ抗体は特異的に結
合する。

次いで、カラムを８×１０容量のｌ＆衝液（０゜１５モ
ルのＰＢＳ、ｐＨ７，２）で洗浄し、そして抗原の溶ａ
液をＰＢＳに対して４０℃において２４〜３６時間緩衝
液を多数回交換して透析する。

する。

それぞれ、実施例４〜６の手順に従って得られた抗動脈
内脂肪沈積■ｇＡ抗体、抗動脈内脂肪沈積ＩｇＥ抗体お
よび抗動脈内脂肪沈積ＩｇＭ抗体を抗動脈内脂肪沈積Ｉ
ｇＧ抗体の代わりに使用して、」二の手順を反復して、
抗体が特異的に結合する討る対応する動脈内脂肪沈積の
分画を得る。

実施例８ ポリクローナル抗動脈内脂肪沈積抗体 実施例７の手順に従って調製したアテローム性動脈硬化
症の動脈内脂肪沈積の抗原に対するポリクローナル抗血
清を、文献、例えば、ストラー（Ｓ　ｔｏｌｌａｒ）　
、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
）、７０：　７０（ａ９８０）に記載されている免疫技
術およびスケジュールを用いてウサイにおいて誘発する
。この抗血清を、例えば、ランデ（Ｌａｎｇｅ）ら、ク
リニカル・アンド・イクスベリメンタルφイムノロノー
（ｃｌ１ｎ、　　Ｅｘｐ、　　　Ｉｓｍｕｎｏ　Ｉ、）
、２５：　　１９１（ａ９７６）およびピセトスキー（
Ｐ　１ｓｅｔｓｋｙ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロ
ジカル・メソッズ（Ｊ、Ｉ＋ｏ＋ｏｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ）　、４１：　１８７（ａ９８１）に記
載されているようにして、モノクローナル抗体について
使用するものに類似する固相アッセイにおいてスクリー
ニングする。初期のスクリーニングの基準は、アテロー
ム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原への結合であろ
う。

抗血清のＩｇＧ分画を、実施例３の手順に従い、アテロ
ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原が固定化され
ている樹脂を含有する親和クロマトグラフィーによって
、さらに精製する。

実施例９ 高度に特異的な抗体の抽出 有意のフィブロ−脂肪のアテローム性動脈硬化症の動脈
内脂肪沈積を含有するヒト大動脈切片を、死亡してから
６以内のオードブシーによって収穫し、そして−８０℃
で急速に凍結した。処理の時に、動脈の試料を室温で融
解し、０．０１モルのＰＢＳで３回洗浄し、０．０２％
のＮ　ａＮ　３（Ｐ　ＢＳ）で洗浄して血液および他の
粒子を除去した。

アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積を取囲む正常
に見える動脈から注意して切除し、そして動脈を廃棄し
た。有の石灰化を切除した。残るフィブロ−脂肪状動脈
内脂肪沈積を２■の編に切断し、そして５μモルのプロ
テアーゼ阻害剤のフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド（ＰＭＳＦ）を含有する。２体積の冷ＰＢＳのに添加
した。この懸濁液を水上でビルチス（ＶＩＲＴＩＳ）ホ
モジナイザーで２分間均質化した。均質化した懸濁液を
２Ｊηのゆるいメツシュのガーゼに通過させて大きい粒
子を除去した６次いで、それを２０．００Ｏｒｐｍで３
０分間６℃で遠心した１次いで、動脈内脂肪沈積の上澄
みを注意して取り出し、そして沈殿を廃棄した。動脈内
脂肪沈積の上澄みの蛋白質含量を分光光度計の分析によ
って決定した。

アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積に対して高度
に特異的な抗原を有する分子の分画を分離しかつ同定す
るために、２０ミリモルのＮａＨ２Ｐ　Ｏ＝／　Ｎ　ａ
２ＨＰ　Ｏ４リン酸塩緩衝液（ＰＢ）と平衡化した高圧
液体クロマトグラフィーによって、５５Ｘ２００ｍｍの
ＢＩＯ−ＧＥＬ　　ＴＳＫ　　ＤＥＡＥ−５−ＰＷ　　
アニオン交換カラム［バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
　、ＣＡ］に動脈内脂肪沈積の上澄みを通すことによっ
て、それを分画した。アニオン交換カラム上に装入した
動脈内脂肪沈積の上澄みの量は、５００＋ｓｇの合計の
蛋白質を装入するために十分であった０次いで、アニオ
ン交換カラムへ固定した分子の構成成分は、Ｉ）　Ｂ溶
液をＰＢＢＯ２５モルのＮａＣｌの増加する勾配（０〜
１００％のＰＢＢＯ３０５モルのＮａＣ１の４時間の展
［）で６１／分の流速で通過させることによって分画し
た。６ｃｃの収集をほぼ２４０本の試験管の各々におい
て実施した。

どの試験管が高度に特異的なエピトープをもつ分子を含
有するかを決定するために、各試験管からの１００、μ
ｍを、黒色のＩＭＭＵＬＯＮ　　ＩＩマイクロタイター
プレート［グイナテク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）　、バージ
ニア州チャントリイ１中の２つのウェルへ適用した。次
の朝、プレートにカバーをし、そして４℃で一夜インキ
ユベーションした。

次いで、プレートをＰＢＳ＋０．１％のトリトン−Ｘ−
１００（オクチル７エ／キシポリエトキシエタノール、
シグマ、セントルイス）および０゜０５％のウィーン２
０（ポリオキシレンソルビタンモノ＝オレ二一ト、シグ
マ）の溶液で洗浄（２００μｌ／ウエルＸ２）した。各
試験管の分画に対応するウェルの各々に、重いアテロー
ム性動脈硬化症の病気をもつ患者の８０〜１００人から
プールした、ＰＢＳ中の５％のＢＳＡでｉ：　ｉｏ。

に希釈した、血清の１００μｍを添加した。他のウェル
に、年令が２０才以下の８０〜１００人の若い男性およ
び女性からプールした血清の１：１００の希釈物を添加
した。これらの希釈した血清を２時間インキュベーショ
ンし、そしてプレートを洗浄緩衝液で４回洗浄した。次
いで、各ウェルに、０．０２％のＮａＮ、を含む０．０
２モルのトリス／ＮａＣＩｔｌ衝液中の５％のＢＳＡ中
で１：２０００に希釈した、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−アルカ
リ性ホスファターゼ接合体［タボ（Ｔａｇｏ）　、カリ
ホルニア州バーリンゲイム１を、２時間、１００μ／ウ
エルで添加した。

次いで、ウェルを洗浄緩衝液で４回洗浄し、そして１０
０μｍの４−メチルランベリフェリホスフェート基質溶
液［３Ｍ　　グイ７グノスチクス（Ｄ　ｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ）　、カリホルニア州すンタクララ１を各ウェル
に適用した。プレートをＦＬＵＯＲＯ１’ＡｓＴ　　９
６　　ウェルのフルオロメーター（３Ｍ　ダイアグノス
チクス）で５分の間隔で読んだ。

各試験管の分画に対応するウェルの各対を、プールした
アテローム性動脈硬化症の患者の血清とインキュベーシ
ョンしたウェルと、若い無償構成の患者からのプールし
た血清とインキュベーションしたウェルとの間の蛍光シ
グナルの比について評価した。

１つのみの管の束は３：１より大きいシグナル比につい
て陽性であった。これらの管の内容物をプールし、３５
００グルトンのＳ　Ｐ　Ｅ　ＣＴ　ＲＡ　ＰＨＯＲ透析
管［スペクトラム・メディカル・インダストリーズ（Ｓ
　ｐｅｃｔｒｕｍ　　Ｍｅｄｉｃａｌ　　Ｉ　ｎｄｕｓ
ｔｒｉｅｓ）　、カリホルニア州ロサンゼルス］を使用
してＰＢ浴溶液対して透析し、そして上のアニオン交換
カラムを通過させて分離し、そして抗原同定手順によっ
て、より純粋な抗原分画を得た。４：１またはそれより
大きいシグナル比を与える、内容物が抗原活性を有する
管を保持し、そしてそれらの内容物をプールした。プー
ルした溶液をＰＭＳＦを含むＰＢＳに対して透析し、次
いで１０００グルトンのフィルターを有するＤＡＦＬＯ
濃縮システム［アミコン・ディビシラン（Ａ　ｍ１ｃｏ
ｎ　Ｄ　ｉｖ、　）、マサチュセッツ州デンバー］中で
濃縮して、１μｇ／ｍｌの蛋白質含量を獲得し、そして
十号なナトリツムアジドを添加して０．０３％の濃度を
生成した。この溶液を４℃で貯蔵した。

実施例１０ 抗動脈内脂肪沈積モノクローナル抗体 Ｂａ１ｂ／Ｃマウス、生後７週、をアテローム性動脈硬
化症の動脈内脂肪沈積の抗原で免疫化した６第１日に、
それらに完全７０イン−アジュバント中の動脈内脂肪沈
積の抗原を皮下注射した。第１６日に、それらに再び完
全７０インドアジユバント中の動脈内脂肪沈積の抗原を
皮下注射した。

第２３日に、マウスを試験出血させ、免疫化抗原に対し
て最も高い抗体力価をもつマウスを融合のＴめに選択し
た。ｔＩＩＪ４０日に、マウスを抗原の静脈内注射によ
って促進した。第４４日に、マウスを殺した。

免疫化したマウスからの膵臓を、２枚のガラススライド
の凍結した端を使用して血液の懸濁液にした。細胞の合
計の数は約１．９７Ｘ１０”であった、血液を沈殿させ
、そして６０ｍ１のグルベツコの変性イーグル培地（高
いグルコース）（Ｄ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　）［２０μｇ／ｍｌ
のリポポリサツカリド（ＬＰＳ）、５％の胎児子牛血清
（Ｆｅ２）を含む］中に懸濁させた０次いで、２　Ｘ　
１０　’／ａｌｌのｐＩ細胞を６ウエルの培養プレート
中にプレイトアラ）　（ｐｌａｔｅｏｕｔ）　Ｉ、た、
ＬＰＳの２４時間の刺激後、細胞を融合した。ＳＰ２ｍ
胞系を融合紡に培養で増殖し、そして細胞を増殖期にお
いて使用した。ＬＰＳ刺激りンバ球を５０ｍ１のコニカ
ル遠心管に移し、細胞を１１０００ｒｐで５分間遠心に
よって沈殿させ、そして１本の管中で５０Ｘ１０’５Ｐ
２Ｊｉ胞と一緒にした。

細胞をＤＭＥＭで２回洗浄した６最後の遠心後、２ｍｌ
のｌ）　Ｅ　Ｇ　（ポリエチレングリコール、Ｂ　ａｋ
ｅｒ１４５０、ペイカー〇ケミカル（Ｂａｋｅｒ　　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ）　］　、４０％を添加し、そしてＩａ
ｌｌを再懸濁し、そして３００　ｒｐｍで２分間、６０
０　ｒｐｍで２分間セして１１０００ｒｐで３分間遠心
した。上澄みを除去し、そして細胞を蛋白質を含まない
５ｍｌのＤＭＥＭ中に再懸濁した。懸濁液を１１０００
ｒｐで７分間遠心した。

次いで、細胞を２４０ｍ１のＤＭＥＭ（高いグルツース
、１５ミリモルのヘベス、ｉｏ−’ハイポキサンチンお
よび２μｇ／ｍｌのアゾゼリンおよび２０％のＦｅ２を
含む）中に再懸濁した。平らな底の組織培養の９６ウエ
ルのプレートを、前もって１５０μ／ウエルの同一培地
を充填した。

１００λの融合懸濁液を各ウェルに添加した。

プレートを７％のＣＯ２中で３７℃で湿ったインキュベ
ーター内でインキュベーションした。プレートの合計の
数は２４であった。ハイブリッドを第５日および第１３
日に検出した。１５０人の使用済みの培養上澄みを、増
殖するハイブリッドを有するウェルから集めた。この融
合物をプレイドアウトして、増殖するハイブリッドをも
つウェルの２０％より多くが得られ、特異的ハイブリッ
ドのより容易な検出が最初に可能となった。ノ１イブリ
ッドを完全培地中で増殖させつづけ、２週後に７ゾゼリ
ンを除去した。ハイブリッドを選択したので、それらは
７ラスフの中に広げ、次いで液体水素中で凍結した。

増殖するハイプリドーマをもつウェルから集めた上澄み
を、実施例３のＥＬ　Ｉ　ＳＡ法および実施例４の免疫
蛍光組織学的方法によってスクリーニングして、探求す
る特異的をもつ抗体を生ずるハイプリドーマを得た。

実施例１１ ＥＬＩＳＡハイブリドーマ選択 モノクローナル抗体のスクリーニング 黒色のＩＭＭＵＬＯＮ　　ＩＩ　　マイクロタイタープ
レートを、実施例９の手順に従って実施したＨＰＬＣの
実験から誘導され、１００μｍのＡ　Ｉ）ＢＳ、ｐＨ８
，５、中で希釈した、０．１μｇの動脈内脂肪沈積の抗
原の分画で被覆した。プレートを４℃で１２〜１８時開
インキエベーシジンし、次いでＰＢＳ中の１％のＰＢＳ
で１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳ洗浄緩衝
液で４回洗浄し、次いで各ハイブリドーマ含有ウェルか
らの１００μｍの上澄みをＩＭＭＵＬＯＮ　　ＩＩプレ
ート上の個々のウェルに添加した。これらを２時間イン
キュベーションし、そして標準の洗浄４１衝液で４回洗
浄した。洗浄緩衝液は、次の濃縮物を５０容量部の蒸留
水または脱イオン水／１容量部の濃縮物で使用して調製
することができる。Ｐｔｉ縮物は０．５重量％のＢＳＡ
、０．１重量％の非イオン性界面活性剤（トリトン　Ｘ
−４０５）、１７重量％の塩化ナトリウム、２重量％の
ナトリツムアジド、ｏ、ｏｏｓモルのリン酸ナトリウム
であり、ｐＨを７．４の調節する０次いで、５％のＢＳ
Ａを含む０．０２モルのトリス／　Ｎ　ａＣＩ中で希釈
したヤギ抗マウスＩｇＧ／アルカリ性ホスファターゼ接
合体（タボ、カリホルニア州バーリンデイム）の１００
μｍを添加し、そして２時間インキュベーションした。

プレートを４回洗浄し、そして１００μｍの４　　ＭＵ
Ｐ基質溶液（メチルウンベリフェリルホスフェート、３
Ｍ　　ダイアグノスチクス、カリ７オルニア州サンタク
ララ）を添加した。プレートをＦ　Ｌ　Ｕ　ＯＲＯＦ　
Ａ　Ｓ　’「９６ウエルフルオロメーター（’３Ｍ　　
グイ７グノスチクス）で間隔を置いて読んだ。このアッ
セイにおいて陽性を示すハイプリドーマを広げ、そして
再試験した。

次いで、陽性にとどまるモノクローナル抗体を、ヒト中
の抗体が反応するアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
沈積中の抗原を捕獲する能力についてスクリーニングし
た。これは次のように実施した。ＨＰＬＣサイソング（
ｓｉｚｉｎｇ）カラム、ＢＩＯ−３ＩＬ　　ＴＳＫ−４
００（バイオ−ラド、カリ７オルニア州リツチモンド）
を使用するＥＬＩＳＡスクリーンにおいて陽性に反応す
る各モノクローナル抗体を精製し、そして種々の大きさ
の分画を０．１モルのＫ　Ｈ２Ｐ　Ｏ＜　／　Ｋ　２Ｈ
Ｐ　Ｏ４、ｐＨ７，０、で２　ｍ１７分の流速で溶離し
た。各モノクローナル抗体を含有するプールした分画を
ＰＢＳに対して透析した。特異的抗原を捕捉する抗体を
決定するために、ＰＢＳｐＨ８，５、中で希釈した各抗
体の１μｇ／ウェルを黒色ＩＭＭＵＬＯＮＩＩプレート
に適用し、そして−夜インキユベーションした。次いで
、プレートをＰＢＳ中の１％のＢＳＡで１時間ブロッキ
ングし、次いでＰＢＳ洗浄緩衝液で４回洗浄した。各プ
レートに、ＨＰＬＣの実験で使用した粗ｇＪ１動脈内脂
肪沈積懸濁液の１００μｌ／ウエルを添加した。これを
２時間インキュベーションした。プレートを４回洗浄し
た０次いで、７テａ−ム性動脈硬化症の患者のプールし
た血清の５％のＢ　Ｓ　Ａ／ｌ’　Ｂ　Ｓ中の１：２．
１：４．１：８．１：１６．１：３２．１：６４．１：
　２５６．１：５１２および１：　１０２４の希釈物の
１００μｍを反復実験のウェルに適用し、そして非症候
症の若い患者からのプールした対照血清の同様な希釈物
を反復実験の組のウェルに添加した。それらを２時間イ
ンキュベーションし、４回洗浄し、次いで５％のＢＳＡ
／）リス中に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧアルカリ性ホス
ファターゼの１００μＩを各ウェルに添加した。２時間
インキュベージシンした後、プレートを４回洗浄し、そ
して１００μｍの４−ＭＵＰを各ウェルに添加した。プ
レートをマイクロタイタープレートのフルオロメーター
で読んだ。アテローム性動脈硬化症陽性の血清の種々の
希釈物のスコアをプロットした（Ｒ袖、ヒトＩｇＧ濃度
、水平軸、血清の希釈）とき、１つの抗体の蛍光のシグ
ナルの順序は抗原−抗体の相互作用を示す古典的なＳ状
曲線を表示したので、その抗体は抗原を捕捉したように
思われた。これはアテローム性動脈硬化症陽性患者の血
清によって記録されたシグナル（高い）対正常の患者血
清のそれ（低い）の差によって確証された。

実施例１２ 抗体を被覆したマイクロタイタープレート実施例８（ま
たは実施例１０）の手順に従って調製した抗（アテロー
ム性動脈硬化症の動脈内脂肪性８２）抗体のＴＩ４製し
た希釈物の１００マイクロタイターを、イムロン（ＩＭ
ＭＵＬＯＮ）Ｉ　Ｉマイクロタイタープレート［グイナ
テク（Ｄ　ｙｎａｔｅｃ）］の表面に適用する。被覆溶
液の濃度は１〜５マイクログラム／ウエルであるように
選択するが、他の試薬および従うべきイムノアッセイ手
順の選択に依存して上下させることができる。プレート
を軽くたたき、被覆溶液が各ウェルの底を完全に覆うよ
うにする。ウェルを４℃において蓋をした湿潤箱内で一
夜インキユベーションする。

被覆溶液を廃棄し、そして２００μｌ／ウエルのＰＢＳ
中の１％のＢＳＡを添加する。次いで、ワエルを湿潤箱
内で室温において１時間インキュベージタンし、そして
ＢＳＡ溶液を除去する。次いで、ウェルな２００マイク
ロタイターの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．５％のツイーン
およ１０．０２％のアノ化ナトリウム）で洗浄し、そし
て湿潤箱内で４°Ｃにおいて使用するまで貯蔵する。

実施例１３ 酵素′！ｇ、識補体抗体 ヒト補体Ｃ４ｂ（シグマ）に結合する抗補体抗体を、０
゛スリパン（５ｕｌｌｉｖａｎ）　＊　Ｍ、　　ら、ア
ナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１００：　　１００（ａ９７９）（
その全開示を引用によってここに加える）の修正手順に
従って・アルカリ性ホスファターゼと接合する。

同様な方法において、Ｃ３ｂ、　Ｃ３ｂｉ、　Ｃ３ｄ、
Ｃ３ｇおよびＣＩＱと特異的に結合するアルカリ性ホス
ファターゼ標識抗（ヒト補体）抗体を調製する。

実施例１４ アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体
のための蛍光イムノアッセイ手順異なる濃度の実施例１
３の手順に従って調製した抗（アテローム性動脈硬化症
の動脈内脂肪沈積）抗体で被覆したマイクロタイタープ
レートの各々に、１００μｌ／ウエルの試験する患者の
血清試料（ａ１００の希釈）を適用する。プレートを覆
って乾燥を防止し、２時間インキュベーションする。血
清を除去し、プレートを３回洗浄緩使液で洗浄する。

１００μｌ／ウエルの実施例１３の手順に従って調製し
たアルカリ性ホスファターゼと接合した抗（ヒト補体Ｃ
４ｂ、　Ｃ３ｂ、　Ｃ３ｄ、　Ｃ３ｇ、　Ｃｌｑおよび
／または３　Ｃｂｉ）抗体を各ウェルに適用し、そして
プレートをを覆って乾燥を防止し、２時間インキュベー
ションする。酵素標識した抗体溶液を除去し、そしてプ
レートを３回洗浄４１衝液で洗浄する。

次いで、１００μｍ／ウェルの４−メチル−ウンベリフ
ェリルホスフェート溶液［３Ｍダイアグノスチック・シ
ステムス（Ｄ　ｉａｇｎｏｓｔｉｃ　　Ｓ　ｙｓｔｅ＠
Ｓ）をウェルに適用する１次いで、マイクロタイタープ
レートを蛍光測定装置（３Ｍグイアグノスナック）で、
最初の４０９６の読みまたは１時間に到達するまで、１
０分毎に読む。読みを他の２時間の開３０分毎に続ける
。

実施例１５ 酵素で標識したアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
積 実施例８または１０の手順に従って調製した抗　、（ア
テローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体を、Ｍ、
オ゛スリパン（０’　Ｓ　ｕｌｌｉｖａｎ）ら、アナリ
ティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１００：　　１００（ａ９７９）
（その内容全体をここに引用によって加える）の修正手
順に従い、アルカリ性ホスファターゼと接合する。

セイヨウワサビペルオキシダーゼを抗（アテローム性動
脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体に、次のようにして、
ニグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）　、Ｈ，ら、メディカル・バ
イオロジー（Ｍｅｄ、　Ｂ　１ｏｌｏＨｙ）、５７：　
１８７−１９１（ａ９７９）の手順に従い接合する。セ
イヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＩＩ型または
ＶＩ型、シグマ）を、０．２５％のグルタルアルデヒド
（ＧＡ、ボラロン）を含有する０、０５モルの炭酸塩：
重炭酸塩４１衝液、ｐＨ９，５、中に溶解する。室温に
おいて２時間後、過剰のＧＡをＧＡ−ＨＲＰから、０．
１５モルのＮａＣｌを含有するセファローズＧ−２５カ
ラム（０，７１２ｃ餉、７アーマシア）で分離する。

Ｇ　Ａ　−ＨＲＰ複合体を、第２工程においで、０゜１
５モルのＮａＣ１を含有する０、０５モルの炭酸塩：重
炭酸塩ａ漬液、ｐＨ９，５、中で、異なるＩｇＧ：ＨＲ
Ｐ比において４℃で１６〜６４時間、抗体と混合する１
反応はリジンを０．０２モルの最終濃度に添加すること
によって停止★せる。

実施例１６ 酵素標識抗イディオタイプ抗体 抗イディオタイプ抗体を、０　’　Ｓ　ｕｌｌｉｖｖａ
ｎ、　Ｍ。

ら、５ｕｐｒａ、　　１００　：　　１００　（ａ９７
９）　（その全内容をここに引用によって加える）の修
正手順に従って、アルカリ性ホスファターゼと接合させ
る。

セイヨウワサビのペルオキシダーゼを、Ｎ　ｙｌｉｉｒ
ｅｎｖＨｏら、　５ｕｐｒａ、の手順に従って、アルカ
リ性ホスファターゼと接合させる。セイヨウワサビのペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ％　ＩＩ型またはＶＩ型、シグ
マ）を、０．２５％のグルグルアルデヒド（ＧＡ　ＳＰ
　ｏｌａｒｏｎ）を含有する０、０５モルの炭酸塩：重
炭酸塩の緩衝液、ｐＨ９，５、中に溶解する。

室温において２時間後、過剰のＧＡを０．１５モルのＮ
ａＣ１と平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（０
，７１２ｃｏ＋、　７フーマシア）でＧＡ−ＨＲＰから
分離する。ＧＡ−ＨＲＰ複合体は、第２工程において、
０．１５モルのＮｎＣｌを含有する０、０５モルの炭酸
塩二重炭酸塩の！ａ衝漬液ｐＨ９，５、中で抗体と、異
なるＩｇＧ：ＨＲＰの比で１６〜６４時間混合する。こ
の反応をリジンを０．０２モルの最終濃度に添加するこ
とによって停止する。

実施例１７ 抗補抗体体被覆マイクロタイタープレート抗（アテロー
ム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の代わりに、免
疫複合体中のヒト補体Ｃ４ｂおよｕｃ３ｂ残留物と特異
的に結合する等部の抗補体抗体の混合物を使用して、実
施例１２の手順を反復する。

実施例１８ アテローム性動脈硬化症の免疫複合体のための蛍光イム
ノアッセイ手順 実施例１７の手順に従って調製した抗補体抗体で被覆し
たマイクロタイタープレートの各々に、１：　１〜１：
　１０００に希釈した、試験する患者の血清試料の１０
０μｍ／ウェルを適用する。プレートをカバーして乾燥
を防止し、そして２時間インキュベーションする。血清
を除去し、そしてプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄する
。

実施例１６の手順に従って調製したアルカリ性ホスファ
ターゼ接合抗動脈内脂肪沈積の抗体または実施例１７の
手順に従って調製したアルカリ性ホスファターゼ接合抗
イディオタイプ抗体の１０・０μｍ／ウェルを各ウェル
に適用し、そしてプレートをカバーして乾燥を防止し、
そして２時間インキュベーションする。酵素標識した抗
体溶液を除去し、そしてプレートを洗浄緩衝液で３回洗
浄する。

次いで、１００μｌ／ウエルの４−メチルウンベリフェ
リルホスフェート溶［（３Ｍ　　ダイアグノチクス・シ
ステムズ）をウェルに適用する１次いで、マイクロタイ
タープレートを、最初の４０９６の読みまたは１時間に
到達するまで、フルオロメーター（３Ｍ　　ダイアグノ
チクス）で２０分毎に読む、読みを、さらに、２時間３
０分毎に続ける。

別の手順として、実施例１６の手順に従って調製したア
ルカリ性ホスファターゼ接合抗動脈内脂肪沈積の抗体お
よび実施例１６の手順に従って調製したアルカリ性ホス
ファターゼ接合抗イディオタイプ抗体の１：１混合物の
１００μｍ／ウェルを、各ウェルに適用し、そして上の
手順を反復する。

実施例１９ ウェスタンプロット法 従った手順は、マクドウガル（ＭｃＤｏｕｇａｌ）　？
Ｊ、ら、臨床の免疫学および免疫病理学（ｃ１ｉｎｉｃ
ａｌ　　　　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　　　ａｎｄ　　
　Ｉ　　ｗ＋ｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）　　３　８
：　１８４−１９７（ａ９８６）に記載される分離手順
の適用である。５０μｍの試験血清、１５０μｍのＥＤ
ＴＡ緩衝液、および１，０Ｌｌｌｌの６．０％のＰＥＧ
（５％の最終ＰＥＧ濃度）を１０×７５ｍａｒのプラス
管に添加する。４℃で一夜インキユベーシシンした後、
管を１０００．で２０分間遠心する。上澄みを吸引し、
そして沈殿を５％のＰＥＧ中に懸濁し、そして再び遠心
する。上澄みを完全に吸引し、そして沈殿を２００μｍ
のＰＢＳ中に懸濁し、そして攪拌しながら１５〜２０分
間または沈殿が溶解するまで室温に放置する。上澄みを
ウェスタンプロット分析のため、１０％（Ｖ／Ｖ）のグ
リセロールおよびブロモフェノールブルー（５％ｖ／ｖ
の０．５ｍｇ／ａ＋ｌ溶液）を添加することによって調
製し、そして試料を６５℃で３０分間加熱する。チャオ
トロビック剤を使用して不安定な抗原を保護することが
できる。

ＳＤＳ解離した蛋白質を不連続な勾配５ＤＳ−ＰＡＧＥ
系［ネビレ（Ｎｅｖｉｌｌｅ）およびグロスマン（Ｇ　
Ｉｏｓｓｍａｎ）　、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、　）　、Ｓ、　７レイシＡ−−
（Ｆ　１ｅｉｓｅｈｅｒ）およびり、パフカー（Ｐａｃ
ｋｅｔ）　！ｉ％Ｖｏ１．３２、ニューヨーク：アカデ
ミツク・プレス、９２ベーノ］によって溶解し、トウビ
ン（Ｔｏｗｂｉｎ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナ
シヨナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ　ｒｏ
ｅ、　Ｎ　ａｔｌ、　Ａ　ｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７６：　４３５０（ａ９７９）の方
法によりニトロセルロースに電気泳動的に移し、そして
ツサング（Ｔ　ｓａｎｇ）ら、６ｙｉ学の方法（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）　、Ｊ、ラ
ンボン（Ｌ　ａｎｇｏｎｅ）およびＨ，パン・ブナキス
（ｖａｎＶ　ｕｎａｋｉｓ）　ｌｉ、Ｖｏｌ、９２、ニ
ューヨーク：アカデミツク・プレス、３７７ページ（ａ
９８３）の手順に従い、酵素結合抗体で検出する。３．
３〜２０％の勾配のアクリルアミドゲルで５μの試料に
ついて、電気泳動を実施した。ＰＡＧＥ溶解した蛋白質
をニトロセルロースに′１ｊＬｔＡ泳動的に移す（６０
Ｖ１３時間、４℃）。シートを４５℃で、０．３％（Ｖ
／Ｖ）のポリオキシエチレンンルビタンモノラウレート
（ツイーン−２０、シグマ）を含有する予備加温したＰ
ＢＳで３回洗浄する。次いで、シートを水平に回転する
プラットフォーム上で４℃において一夜、実施例１６に
従ってｙ４製したセイヨウワサビのペルオキシダーゼ接
合抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体
とともにインキュベーションし、そして他のシートを同
様に実施例１８に従って調製したセイヨウヮサビのペル
オキシダーゼ接合抗イディオタイプ抗体とともに一夜イ
ンキユベーションする。各インキュベーションにおいて
、標識した抗体をＰＢＳ−０，３％（ｖ／ｖ）ツイーン
−２０中に希釈する。

シートを室温においてＰＢＳ−ツイーン−２０で３回洗
浄する０色の反応を３ｇ３°−ジアミノベンジジンおよ
び８．０２で発現する。間接の着色を望む場合、シート
を室温において２時間ＨＰＯ−Ｉｇとともにインキュベ
ーションし、そして再び洗浄した後、色の反応を発現す
る。

色素接合蛋白質（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
）を分子のマーカーとして使用できる。

色素接合マーカーの前縁を接合しないマーカーで目盛定
めし、そしてプロットの側面に示される分子量を目盛定
めの結果から誘導する。帯を、試薬抗（アテローム性動
脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体および試薬精製アテロ
ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原で調製した同
様なシートの帝と比較する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血清試料中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
   沈積の免疫複合体（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃｐ
   ｌａｑｕｅ　ｉｍｍｕｎｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ）の存在を
   決定する方法であって、 （ａ）血清試料をアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
   沈積の免疫複合体特異的結合試薬（ｉｍｍｕｎｅｃｏｍ
   ｐｌｅｘ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｒｅａ
   ｇｅｎｔ）と十分な時間接触させて、アテローム性動脈
   硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体をアテローム性動
   脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体特異的結合試薬
   と接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させ、そして（ｂ）アテ
   ローム性動脈硬化症の免疫複合体特異的結合試薬と接合
   したアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複
   合体を決定する、ことを含んでなることを特徴とする前
   記方法。 ２、（ａ）血清試料を抗（アテローム性動脈硬化症の動
   脈内脂肪沈積）抗体が付着している不溶性支持体と十分
   な時間接触させて、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂
   肪沈積免疫複合体を抗（アテローム性動脈硬化症の動脈
   内脂肪沈積）抗体と接合させて、露出した動脈内脂肪沈
   積特異的エピトープを有するアテローム性動脈硬化症の
   動脈内脂肪沈積の抗原を結合し、そして残留する試料を
   前記支持体から除去し、 （ｂ）工程（ａ）からの不溶性支持体を、標識した免疫
   複合体結合試薬と十分な時間接触させて、標識した免疫
   複合体結合試薬を不溶性支持体上に存在する免疫複合体
   と接合させ、前記免疫複合体結合試薬は標識した抗補体
   抗体、標識した抗（ヒトＩｇ）抗体および抗フィブロネ
   クチン抗体から成る群より選択されかつ前記抗（ヒトＩ
   ｇ）抗体は抗（ヒトＩｇＧ）抗体、抗（ヒトＩｇＭ）抗
   体、抗（ヒトＩｇＡ）抗体および抗（ヒトＩｇＥ）抗体
   から成る群より選択され、そして接合しない標識した免
   疫複合体結合試薬を前記支持体から除去し、そして （ｃ）前記不溶性支持体上に存在する標識を決定する、 ことを含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、標識は酵素であり、不溶性支持体上に存在する標識
   は不溶性支持体を基質と接触させることによって決定し
   、前記基質は、酵素の存在下に、物理的に検出可能な生
   成物を生成する特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、抗補体抗体は抗（ヒト補体）抗体である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ５、抗補体抗体は補体Ｃ４ｂ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄまたはＣ
   ３ｇと優先的に結合する特許請求の範囲第４項記載の方
   法。 ６、抗補体抗体は補体Ｃ４ｂと優先的に結合する特許請
   求の範囲第５項記載の方法。 ７、標識した免疫複合体結合試薬は、抗（ヒトＩｇＧ）
   抗体および抗（ヒトＩｇＭ）抗体から成る群より選択さ
   れる標識した抗（ヒトＩｇ）抗体である特許請求の範囲
   第２項記載の方法。 ８、血清試料中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
   沈積の免疫複合体の存在を決定する方法であって、 （ａ）免疫複合体を血清試料から分離し、そして （ｂ）免疫複合体中のアテローム性動脈硬化症の動脈内
   脂肪沈積の抗原または抗（アテローム性動脈硬化症の動
   脈内脂肪沈積）抗体の存在を決定する、 ことを含んでなることを特徴とする前記方法。 ９、血清試料を抗補体抗体または抗（ヒトＩｇ）抗体か
   ら選択される非特異的免疫複合体結合剤と十分な時間接
   触させて、前記免疫複合体結合剤を免疫複合体と結合さ
   せる特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、（ａ）血清試料を非特異的免疫複合体結合性剤が
   結合している不溶性支持体と接触させ、そして残留する
   試料を前記支持体から除去し、 （ｂ）前記不溶性支持体を、標識したアテローム性動脈
   硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体結合薬と十分な時
   間接触させて、標識したアテローム性動脈硬化症の動脈
   内脂肪沈積の免疫複合体結合剤と免疫複合体との接合を
   起こさせ、前記免疫複合体結合剤は抗（アテローム性動
   脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体、アテローム性動脈硬
   化症の動脈内脂肪沈積の抗原、および抗（アテローム性
   動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の結合部位と優先的
   に結合する標識した抗イディオタイプ抗体から成る群よ
   り選択され、そして残留する接合しない標識したアテロ
   ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体結合性
   剤を不溶性支持体から分離し、そして （ｃ）前記不溶性支持体上に存在する標識を決定する、 ことを含む特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、標識は酵素であり、不溶性支持体上に存在する標
   識は不溶性支持体を基質と接触させることによって決定
   し、前記基質は、酵素の存在下に、物理的に検出可能な
   生成物を生成する特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、非特異的免疫複合体結合剤は抗補体抗体である特
   許請求の範囲第９項記載の方法。 １３、抗補体抗体は補体Ｃ４ｂ、Ｃ３ｂ、Ｃ３ｄまたは
   Ｃ３ｇと優先的に結合する特許請求の範囲第１２項記載
   の方法。 １４、（ａ）免疫複合体を血清成分から分離し、 （ｂ）前記免疫複合体を解離して、存在するかも知れな
   い抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体
   またはアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原
   を他の免疫複合体成分から解放し、 （ｃ）解離した免疫複合体成分をゲルの電気泳動によっ
   て分離し、そしてその一部分を結合支持体に結合し、 （ｄ）前記結合支持体を、標識した特異的アテローム性
   動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体結合剤と十分
   な時間接触させて、抗原−抗体の結合を起こさせ、前記
   免疫複合体結合剤は抗（アテローム性動脈硬化症の動脈
   内脂肪沈積）抗体、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂
   肪沈積の抗原、および抗（アテローム性動脈硬化症の動
   脈内脂肪沈積）抗体の結合部位と優先的に結合する標識
   した抗イディオタイプ抗体から成る群より選択され、そ
   して残留する接合しない標識した抗体を前記蛋白質結合
   支持体から分離し、そして （ｅ）前記蛋白質結合支持体上に存在する標識を決定す
   る、 ことを含む特許請求の範囲第８項記載の方法。 １５、標識は酵素であり、前記蛋白質結合支持体上に存
   在する標識は前記不溶性支持体を基質と接触させること
   によって決定し、前記基質は、酵素の存在下に、物理的
   に検出可能な生成物を生成する特許請求の範囲第１４項
   記載の方法。 １６、標識は放射性標識である特許請求の範囲第１５項
   記載の方法。 １７、血清中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
   積の免疫複合体の存在を決定するイムノアッセイキット
   であって、 （ａ）標識した特異的免疫複合体結合剤、前記免疫複合
   体結合剤は、抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
   沈積）抗体、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積
   の抗原、および抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂
   肪沈積）抗体の結合部位と優先的に結合する抗イディオ
   タイプ抗体から成る群より選択される、および （ｂ）血清中の免疫複合体を不溶性化する手段、前記手
   段は、免疫複合体沈殿界面活性剤、または免疫複合体結
   合剤が付着する不溶性支持体から選択され、前記免疫複
   合体結合剤は、抗補体抗体、プロテインＡ、抗（ヒトＩ
   ｇ）抗体、抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
   積）抗体、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の
   抗原、および抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
   沈積）抗体の結合部位と優先的に結合する抗イディオタ
   イプ抗体から成る群より選択される、 を含んでなることを特徴とする前記イムノアッセイキッ
   ト。 １８、免疫複合体沈殿界面活性剤は、５００〜１０，０
   ００の分子量を有する水分散性ポリエチレングリコール
   である特許請求の範囲第１７項記載のイムノアッセイキ
   ット。 １９、血清中の免疫複合体結合剤を不溶性化する手段は
   、免疫複合体結合剤が付着する不溶性支持体である特許
   請求の範囲第１７項記載のイムノアッセイキット。 ２０、免疫複合体結合剤はそれに結合した抗（ヒト補体
   ）抗体である特許請求の範囲第１９項記載のイムノアッ
   セイキット。 ２１、抗（ヒト補体）抗体は補体Ｃ４ｂ、Ｃ３ｂ、Ｃ３
   ｄまたはＣ３ｇと優先的に結合する特許請求の範囲第２
   ０項記載のイムノアッセイキット。 ２２、抗（ヒト補体）抗体は補体Ｃ４ｂと優先的に結合
   する特許請求の範囲第２１項載のイムノアッセイキット
   。 ２３、免疫複合体結合剤は抗（ヒトＩｇ）抗体である特
   許請求の範囲第１９項載のイムノアッセイキット。 ２４、標識した抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂
   肪沈積）抗体または標識した抗イディオタイプ抗体は酵
   素の標識を有し、そしてキットは、さらに、標識の存在
   下に物理的に検出可能な生成物を生成する基質を含む特
   許請求の範囲第１７項載のイムノアッセイキット。 ２５、血清中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
   積の免疫複合体の存在を決定するイムノアッセイキット
   であって、 （ａ）アテローム性動脈硬化症の免疫複合体と特異的に
   結合する第１結合剤、前記結合剤は、抗（アテローム性
   動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体、アテローム性動脈
   硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原、および抗（アテローム
   性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗体の結合部位と優先
   的に結合する抗イディオタイプ抗体から成る群より選択
   される、および （ｂ）抗（ヒト）補体抗体、抗（ヒトＩｇ）抗体、およ
   び第２結合剤から成る群より選択される標識した免疫複
   合体結合剤、前記第２結合剤は、アテローム性動脈硬化
   症の動脈内脂肪沈積の免疫複合体に特異性に結合し、該
   動脈内脂肪沈積の免疫複合体は抗（アテローム性動脈硬
   化症の動脈内脂肪沈積）抗体、アテローム性動脈硬化症
   の動脈内脂肪沈積の抗原および抗イディオタイプ抗体か
   ら成る群より選択され、そして前記抗イディオタイプ抗
   体は抗（アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積）抗
   体の結合部位に優先的に結合し、ここで第２結合剤は前
   記結合剤と同一ではない、 を含んでなることを特徴とする前記イムノアッセイキッ
   ト。 ２６、第２結合剤は抗（ヒト）補体抗体である特許請求
   の範囲第２５項記載のイムノアッセイキット。 ２７、抗（ヒト）補体抗体は補体Ｃ４ｂ、Ｃ３ｂ、Ｃ３
   ｄまたはＣ３ｇと優先的に結合する特許請求の範囲第２
   ６項記載のイムノアッセイキット。 ２８、抗（ヒト）補体抗体は補体Ｃ４ｂと優先的に結合
   する特許請求の範囲第２７項載のイムノアッセイキット
   。