JPS63317771A - アテロ−ム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積のイムノアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、イムノ７フセイ法およびアテローム性動脈硬
化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ）の動脈内脂肪
沈積（ｐｌａｑｕｅ）の存在を検出する方法に関する。

とくに、本発明の方法は、アテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積の抗原と優先的に結合する患者の血清中の
抗体の存在を決定する血清のイムノアッセイである。

血液と動脈組繊との間に位置する内皮（ｃｎｄｏｔｈｅ
ｌｉｕｉ）は、脈管壁中の血液成分の蓄積に対するバリ
ヤーとして働く。内皮におけるアテローム性動脈硬化症
の病変の形成は、主要な冠状血管の病気および発作に関
連し、そしてこのような病変の原因および検出は広範に
研究されてきている。

内皮の＃１４Ｔ！！は、アテローム性動脈硬化症の病変
の形成における初期の段階であると信じられており、血
行力学的歪、過コレステロール面症および免疫複合体の
病気により潜在的に引き起こされる。

内皮の損傷は、動脈内膜の細胞の増殖、コレステロール
の蓄積および結合組繊の線維の形成に導く。

損傷した内皮細胞および非内皮化動脈内膜の中のＩｇＧ
および補体因子Ｃ３のＭ積が示された。血液から誘導さ
れる単核食細胞は、また、アテローム性動脈硬化症の病
変における細胞集団の一部をｖ４成することが発見され
た。究極の動脈内脂肪沈積の組成に導く槻構は、また、
知られていない。

種々の可溶性蛋白質がヒトアテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積から抽出されてきており、それらは次のも
のを包含する：　　ＩｇＡ、ＩｇＧ。

ＩｇＭ、ＢＩ　Ｃ（ｃ３）　、アルファ１−抗トリプシ
ン、アルファ２−マクログロブリン、フイブリノデン、
７ルプミン、ＬＤＬ、ＨＤＬ、７ル７７１−酸糖蛋白質
、ベータ２−糖蛋白質、トラ：ｌスフニリンおよびセル
ロプラスミン。病気の動脈内膜は、また、少量の組！結
合１ｇＧ、１．Ａお上びＢＩＣを含有することが発見さ
れた。ホラングー（Ｈｏ１ｌａｎｄｅｒ）　、アテロー
−１−血！Ｉ！ａＪＬＪＬ化荒。

Ｌ昌旦凹μ壮＝μｍ（転）−１３４：　３９１−４０５
（１９７９）。他の化学者はこの病変および隣接する内
皮組は中のＩｇＧを報告した。パルムス（Ｐａｒｕｍｓ
）　、Ｄ、ら、アテロ−ｂ　１１見皿北症（Ａｔｈｅｒ
ｏｓｃｌｅｉ、　３８：　２１１−２１６（１９８１）
、ハンソン（Ｈａｎｓｓｏｎ）　、　Ｇ、　ら、ｕＱ−
１焦↓Ｉ分子病狸学（Ｅ　ｘｐｅｒ−ｉｍｅｎｔａｌ　
　ａｎｄ　　ｈりｏｌｅｃｕｌａｒ　　Ｐ　ａｔｈｏｌ
ｏｇＹ）、３４：　　２６４−２８０（１９８１）　、
ハンソン（Ｈａｎｓｓｏｎ）　、　Ｇ、ら、アクタ・パ
ソロジ力・マイクロバイオロッカ・ニド・イムノロッカ
・スカンシナビ力（Ａ　ｅｔａ　　Ｐ　ａｔｌ＋ｏ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　　　Ｉ　　ＩＩｖ＋ｕｎｏｌ
、　　　　　５ｃａｎｄ、　）（Ｓｅｅし、　Ａ、　）
　　、　　９２：　　４２９−４３５（１９８４）　　
６しかしながら、アテローム性動脈硬化症および関連士
る組織における免疫グロブリンの起源、機能および結合
の性質はなお神秘的である。抗低密度リポ蛋白質（ＬＤ
　　Ｌ）自己抗体は、脈管の病気患者においてより高い
ことが報告され、それらがある方法でアテローム性動脈
硬化症の発現に関連することを示唆している。しかしな
がら、これらの自己抗体とアテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積との間の因果関係は確立されていない。ス
ゾンディ（５ｚｏｎｄｙ）　、　Ｅ、　　ら・１化Ｍ３
３へ［ｅｃｈａｎｉｓｍ　　ｏｒ　　Ａ　ｉｎ　　ａｎ
ｄ　　Ｄｅｖｅｌ。

ｐ市ｅｎｔ）、２９：１１７　１２３（１９８５）。

種々の体液および組織中の広範な種類の抗原１；よび非
抗原物質の存在および量を決定するために、広範な種類
のイム／アッセイが開発された。合計の免疫グロブリン
およびＩＥＥのイムノアッセイは、米国特許第３，７２
０，７６０号および米国特許第４，４４４，８７９号に
記載されている。

ＩｇＧアロタイプのイム／アッセイはロシア国特許６４
９，４３３号に記ｖＡされている。エライザ（ＥＬＩＳ
Ａ）は、マギオ（Ｍａｇヒｉｏ）ら、酵素のイム／アッ
セイ（ＥＮＺＹＭＥ−ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ）　、Ｂ
ｏｃａ　　Ｒａｔｏｎ：　ＣＲＣプレス、１７２−１７
６ベーノ（１９８０）に記１３２されている。しかしな
がら、本発明より以萌において、アテローム性動脈硬化
症の動脈内脂肪沈積の存在を決定するために適当なイム
ノアッセイは知られていなかった。

血清中の抗動脈的脂肪沈積抗体の存在を決定する本発明
の方法は、前記血清を動脈内脂肪沈積抗原と、十分な時
間接触させて、前記抗原を抗動脈的脂肪沈積抗体と結合
させ、そして、存在する場合、抗動脈的脂肪沈積抗体と
結合する抗体を決定することを含む。動脈内脂肪沈積抗
原を不溶性支持体に結合させ、血清と接触させて、抗動
脈的脂肪沈積抗体を動脈内脂肪沈積抗原と接合させ、そ
して不溶性支持体へ結合した得られた抗体の量を決定す
ることができる。あるいは、抗動脈内脂肪沈積試薬の抗
体を不溶性支持体へ結合し、そして血清と標識動脈内脂
肪沈積抗原との混合物をそれと接触させることがでおる
。次いで、不溶性支持体へ結合したあるいは混合物中に
残留する楳ｎ動脈内脂肪沈積抗原を決定することができ
る。他の実施態様において、抗原を不溶性支持体に結合
し、そして血清と標識動脈内脂肪沈積試薬の抗体との混
合物をそれと接触させることができる。次いで、不溶性
支持体へ結合したあるいは混合物中に残留する標識動脈
内脂肪沈積抗体を決定することができる。

本発明の組成物は、精製された動脈内脂肪沈積抗原、標
識動脈内脂肪沈積抗原、抗動脈内脂肪沈積抗体試薬、不
溶性支持体に結合した動脈内脂肪沈積抗原および不溶性
支持体に結合した抗動脈内謂肪沈積試薬の抗体を包含す
る。

血清中の抗動脈内ＪＮ肪沈積抗体の存在を決定する本発
明の方法は、血清を動脈内脂肪沈積抗原と、単独で、あ
るいは抗動脈内脂肪沈積試桑の抗体と一緒に接触させる
ことを含む。

動脈内脂肪沈積抗原は、ヒトアテローム性励脈硬化症の
動脈内脂肪沈積を処理して、それに刻して特異的な抗原
を分離しかつ精製することによって得られる。！！ＩＪ
脈内脂肪沈積は、心筋梗塞症、心臓血管偶発症で死亡し
た患者のヒト動脈を処理することによって得ることがで
き、あるいは外科的手順によって得ることができる。動
脈を解剖して、取囲む組織および脂肪を除去し、そして
生理的食塩水（５ａｌｉｎｅ）中で洗浄して、汚染する
血液を除去する。動脈内脂肪沈積のセグメントを分離し
、そして処理する。

動脈内脂肪沈積の区域を除去し、小さい片に切り、簡単
に洗浄し、セして等張溶液、例えば、リン酸塩緩衝化生
理的食塩水（ＰＢＳ）中で均質化する。このホモジネー
トをＰＢＳ中で反復して遠心および再ｉ１濁し、溶離液
を集める。沈降した破片は、また、クエン酸塩ｉｓ液、
酸性のｐ　Ｉ−１、で抽出し、そして溶離液を中和し、
そして透析により精製する。−り澄みならゾプールした
ＰＢＳ溶離液を真空透析および限外濾過により濃縮して
、可溶性動脈内脂肪沈積抗原の濃縮物を得る。

不溶性動脈内脂肪沈積抗原は、一部を異なる酵素で消化
し、消化物をＰＢＳで抽出し、七して前述のように溶離
液を濃縮するとによって得ることができる。使用する酵
素組成物は、コラ２ナーゼ、エラスターゼ、ＤＮアーゼ
、ヒフルロニグーゼ、およびネウラミニグーゼを包含す
る。各消化物を遠心し、例えば、限外濾過により濃縮し
、そして透析して、不溶性動脈内脂肪沈積抗原の濃溶液
を得る。

抗動脈内脂肪沈積試薬の抗体は、動物、例え　。

ば、ウサギ、モルモット、ラットまたはヤイを濃縮した
動脈内脂肪沈積抗原で免疫化し、免疫化した動物から血
清を取り出し、そしてこの血清から免疫グロブリンを、
例えば、硫酸アンモニウムの沈澱により得られる。本発
明の方法において有用である主な抗体類は１．Ｇおよび
ＩｇＭの抗体であるが、ＩｇＥおよびＩｇＡの抗体を、
十分な量で入手可能である場合、使用することもできる
。

動脈内脂肪沈積抗原および抗動脈内脂肪沈積試薬の抗体
は、慣用法によって不溶性支持体へ結合することができ
る。抗体を不溶性支持体へ結合する手順は、例えば、米
国特許第３．５５１，５５５号、米国特許第３，５５３
，３１０号、米国特許第４，０４８，３１０号および最
先行２９，４７４号に記載されている。吸着による抗体
のポリスチレンへの結合は、例えば、米国特許第３，６
４６．３４６号および米国特許ｆｔ′Ｓ４，０９２，４
０８号に記載されている。抗原を含有する蛋白質を種々
の不溶性支持体へ結合することは、米国特許ｆ：！Ｓ３
，７２０．７６０号に記載されている。

種々の物質を不溶性支持体として使用することができる
。主要な考慮は、抗動脈的脂肪沈積抗体または動脈内脂
肪沈積抗原の表面への結合、抗動脈的脂肪沈積抗体およ
び動脈内脂肪沈積抗原の接合反応の妨害の不存在、ある
いは接合反応の存在および程度を決定するために使用で
きる他の反応の妨害の不存在である。天然および合成の
、有機および無機のポリマーを不溶性支持体として使用
できる。適当なポリマーの例は、次の通りである：ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリ（４−
メチルブチレン）、ブチルゴム、シラスチック（５ｉｌ
ａｓｔｉｃ）ポリマー、ポリエステル、ポリアミド、セ
ルロースおよびセルロース誘導体（例えば、酢酸セルロ
ース、ニトロセルロースなど）、アクリレート、メタク
リレート、ビニルポリマー（例えば、ポリ酢酸ビニル、
ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ボリア）化ビニ
ルなど）、ポリスチレンおよびスチレングラフトコポリ
マー、レーヨン、ナイロン、ポリ酪酸ビニル、ポリホル
ムアルデヒドなど。不溶性支持体として使用できる他の
物質は、前述のポリマーのラテックス、シリカゾル、ケ
イ素のウェー７７−１〃ラス、紙、不溶性蛋白質、金属
、メタロイド、金属酸化物、磁性材料、半導電性材料、
セラミックなどであることができる。さらに、ゲルを形
成する物質、例えば、蛋白質、例えば、ゼラチン、リボ
多糖、ケイ酸塩、アガロース、ポリアクリルアミドまた
はいくつかの水相を形成するポリマー、例えば、デキス
トラン、ポリアルキレングリコール（２〜３個の炭素原
子をもつアルキレン）または界面活性剤、例えば、両親
媒性化合物、例えば、リン脂質、長ａ（１２〜２４個の
炭素原子）アルキルアンモニウム塩などが包含される。

本発明の好ましい診断支持体は、ポリスチレン、スチレ
ンコポリマー、例えば、スチレン＝７クリロニトリルコ
ボリマー、またはポリオレフィン、例えば、ポリエチレ
ンまたはポリプロピレン、およびアクリレートおよびメ
タクリレートのポリマーおよびコポリマーを含む。抗動
脈内賂肪沈積試薬の抗体または動脈内脂肪沈積抗原は、
不溶性支持体に、吸着、静電結合、または他の非共有結
合により結合させることができ、あるいはそれは不溶性
支持体へ共有結合によって結合させることができる。こ
の手順のためにとくに有利な支持体は、複数のウェル（
＋ｗｅ　ｌ　ｌ　）を有するマイクロタイタープレート
（ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　　ｐｌａｔｅ）からなる。

ウェルの表面またはその中のプラスチックカップのイン
サートは、抗原または抗体の支持体を構成できる。決定
が蛍光の測定を必要とする場合、マイクロタイタープレ
ートまたはウェルのインサートは有利には光に対して不
透明であり、こうしてウェルに適用される励起の光が取
囲むウェルの内容物に到達したりあるいは影響を及ぼし
たりしないようにする。

非共有結合のための手順は米国特許第４，５２８．２６
７号に記載されている。抗体および抗原を不溶性支持体
へ共有結合する手順は、チロウ・チパタ（Ｉ　ｃｈｉｒ
ｏ　　Ｃｈｉｂａｔａ）　、固定化された酵素類（ＩＭ
ＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　　ＥＮＺＹＭＥＳ）、ハルステッ
ド・プレス（Ｈａｌｓｔｅｃｊ　　Ｐ　ｒｅｓｓ）　：
ニューヨーク（１９７Ｂ）お上ＶＡ、クアトレカサス（
ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ）　、ジャーナル０オー１ヱヱ
（Ｌ工」−ジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｖｌ、）、２４５：　３０５９（１９７０）（それ
らの内容全体をここに引用によって加える）に記！：９
．されている。米国特許第４，２１０．４１８号に記載
される手順に従い、例えば、カップリング剤（ｃｏｕｐ
ｌｉｎｇ　　ａｇｅｎｔ）としてグルグルアルデヒドを
使用して、表面を蛋白質で被覆し、そして抗体または抗
原とカップリングすることができる。なお他の手順にお
いて、遊離インシアネート基を有する層、例えば、ポリ
エーテルイソシアネートでウェルを被覆することができ
、そしてそれに水溶液中の抗体または抗原を適用すると
、必要な結合が行われる。なお他の手順において、抗体
または抗原はヒドロキシル化物質に、米国特許第３，７
２０，７６０号に記載されているような臭化シアンによ
りカップリングすることができる。

本発明の標識動脈内詣肪沈稙抗原および抗動脈内脂肪沈
積抗体は、蛋白質へ！識を取り付けるための慣用の手順
により調製することができる６標識は、化学的または物
理的な結合によって、蛋白質試薬へ結合またはカップリ
ングすることができる。本発明の抗体および動脈内脂肪
沈積抗原へ接合できる配位子お上り基は、試験する試料
中の化合物および物質とそれらが′結合する試薬とを区
別するために使用できる物理的または化学的特性を有す
る元素、化合物または生物学的物質を包含する。一般原
理としで、標識を抗体と連結するために適当な方法は、
標識を動脈内脂肪沈積抗原へ連結または結合するための
等しく適する。下の′手順は標識を抗体に接合すること
によって説明するが、標識を動脈内脂肪沈積抗原に接合
するためにそれらを使用することがまた意図される。

放射＃ｌ標識した動脈内脂肪沈積抗原および抗動脈内脂
肪沈積抗体は、生体外診断試験に使用することができる
。標識した抗体の比活性は、放射性標識の半減期、同位
体の純度、および標識を抗原または抗体に組込む方法に
依存する。表Ａは、いくつかの普通に使用される同位体
、それらの比活性および半減期を記載する。イムノアッ
セイ試駿において、比活性が高（なればなるほど、一般
に、感度はよりすぐれる。

表Ａ 純粋な同位体の非 同位体　　　活性（キューリー　　半減期□□１モル　
　　　　　　　　　　− ”Ｃ６，２５Ｘ１０１　５７２０年 ’Ｈ２，９１Ｘ１０４　１２．５年 ”Ｓ　　　　　　１．５　　Ｘ１０６　８７日”’Ｉ　
　　　　　２．１８Ｘ１０６　６０日”Ｐ　　　　　　
３．１６Ｘ１０６　１４．３日鳥ゴ’Ｉ　　　　　　　
　　　１．　６２Ｘ１０７　　　　８．　１　　日蛋白
質の抗原および抗体を表Ａに記載する放射性同位体で標
識する手順は、一般にこの分野において知られている。

トリチウム標識法は、例えば、米国特許第４．３０２，
４３８号に記載されいる。ことに抗体に適合するヨウ素
化、トリチウム標識法および”Ｓ標識法は、ゴーディン
グ（Ｇｏｄｉｎｇ）　、Ｊ、’ｗＶ、モノクローナル抗
体：原ＲおよＵグラ９ｆイＸ（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬＡ
ＮＴ　Ｉ　ＢＯＤＹ：　ＰＲＩ　ＮＣＩ　ＰＬＥＳ　　
ＡＮＤ　　ＰＲＡＣＴＩＣＩＥ）、ニューヨーク：アカ
デミツク・プレス、１２４−１２６ページ（１９８３）
およびその中に引用されている文献に記載されている。

抗体をヨウ素化するだめの他の方法は、次の文献に記載
されている：ハナター（Ｈｕｎｔｅｒ）およびグリーン
ウッド（Ｇ　ｒｅｅｎ＋ｕｏｏｄ）　、も血土上−二（
Ｎａｔｕｒｅ）　、１４４：　９４５（１９６２）およ
びディピッド（Ｄａｖｉｄ）ら、／＜４−１−’ｆ’ｓ
ストリ二ロ旦−１ｏｃｈｅ＋ｏｓｔｒｙ）　、ｌ　３　
：　１０１４　１０２１（１９７４）、米国特許第３，
８６７．５１７号および米国特許ｆＪＳ４，３７６．１
１０号。

放射線ｖＡａｕだ抗体は、また、像形成および潜在的−
二数射線療法に使用することができる。像形成において
有用な放１１ｉ標識元素は、例えば、１２コＩ、１コ墓
■、Ｉｌｌ　Ｉｎおよび”　　Ｔｃを包含する。

抗体をヨウ素化する方法は、次の文献に記載されいるニ
ゲリーンウッド（Ｇ　ｒｅｅｎｗｏｏｄ）　、Ｆ　、ら
、［高い非活性の１３１１楳識ヒト成長ホルモンの調製
」、バイオケミカル・ジャーナル　Ｂ　１ｏｃｈｅＩ＋
１．−Ｊ、　）、８９：　１１４−１２３（１９６３）
；マーチャロニス　（ＭａｒｃｈａｌｏｎｉＳ＞　、Ｊ
、　ｒ免疫グロブリンおよび他の蛋白質の微量ヨウ素化
のだめの醇索的方法」、べ乙！ケミカル・シ゛ヤニー尤
沙−仁Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　　Ｊ、）、１１３：　２９
９−３０５（１９６９）：　モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏ
ｎ）　、Ｍ　、　　ら、［免疫化学的研究におけるラク
トペルオキシダーゼ触媒ヨウ素化の使用］、灸返」学（
Ｉ　ｍｍｕｎｏｃｈｃリ−ｓｔ＋ｙｚ）　、８：　２８
９−２９７（１９７１）。

９９”ｌ”Ｃ標識法は、次の文献に記載されて（・る：
ローデス（Ｒｈｏｄｅｓ）　Ｂ、　　ら、［ＩＩｇ　Ｔ
Ｃ標識および放射線標識した抗体および抗体断片の許容
試験」、Ｉｉ！！！瘍の像形成；癌の放射線免疫化学的
検出（ＴＵＭＯＲＩＭＡＧＩＮＧ：ＴＨＥ　　ＲＡＤＩ
ＯＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　　ＤＥＴＥＣＴＩＯ
Ｎ　　ＯＦ　　ＣＡＮＣＥＲ）、バーチエル（Ｂｕｒｃ
ｈｉｅｌ）　、Ｓ、　ら纒、ニューヨーク：マラソンＢ
（Ｍａｓｓｏｎ）、１１１−１２３（１９８２）、およ
びその中に引用されている文献。抗体を１１Ｊｎするた
めに適当な方法は、次の文献に記載されているニアナト
ウィッチ（）１　ｎａｔｏｗｉｃｈ）　、Ｄ　。

Ｊ、ら、ジャーナルΦオブ・イムノロジカル・メ７−１
５７（１９８３）：　７ナトウ（ッチ（Ｈｎａｔｏｕ＋
ｉｃｌ＋）　、Ｄ、　　Ｊ、　　ら、サイエンス（３ｃ
ｉｅｎｃｃ）、２２０：　　６１３−６１５（１９８３
）およびバックレイ（Ｂｕｃｍｌｅｙ）　、Ｒ，Ｇ、　
　ら、−Ｆ、Ｅ、Ｂ。

５エ、１６６：　　２０２−２０４（１９８４）。

酵素で標識した抗体は、例えば、１９８４年６月２０日
に提出した米国特許出願第６２２，５２５号に記載され
ているように、生体外診断試験において有用である。適
当な系、カップリング手順およびそれと基質との反応は
、例えば、米国再発行３１，００６号、Ｂ１＼３．６５
４．０９０号、４，２１４，０４８号、４，２８９，７
４７号、４，３０３，４３８号、４，３１２．９４３号
、４，２１４，１１０号およびそれらの中に引用された
文献に記載されている。他の適当な系は、ベセ（Ｐｅ５
ｃｅ）ら、クリニカル・ケミストリー（ｃｌ１ｎ、　Ｃ
ｈｅｗ、　）　、２０（３）　：　３５３−３５９（１
９７４）およびウィズダム（Ｗｉｓｄｏｍ＞、Ｇ、クリ
ニカル・ケミストリー　ＣＩ　ｉｎ、　Ｃｈｅｍ、工）
、２２：　　１２４３（１９７６）に記載されている。

適当な実施例のクラスのリストおよび各クラスの特定の
例は、次の通りである： 表Ｉ スリ」（６すｃｒ＞　（＋Ｑ ヒドロラーゼ類　カル　アミラーゼ類 ボヒドラーゼ類 ヌクレアーゼ類　　　　ポリヌクレオチダーゼアミグー
ゼ類　　　　　アルギナーゼ プリンデアミナーゼ蔑　アデナーゼ ベプチダーゼ類　　　　アミ／ポリベプチグーゼプロイ
テナーゼ類　　　ペプシン エステラーゼ類　　　　リパーゼ類 鉄醇索類　　　　　　　カタラーゼ 銅酢索類　　　　　　　チロシナーゼ類補酵素含有酵素
類　　　アルコールデヒドロゲナーゼ 千トクローム還元性酵　コハク酸デヒドロデナー索類　
　　　　　　　　ゼ 黄色酵素類　　　　　　ジアホラーゼ ムターゼ類　　　　　　グリオキシラーゼデモラーゼ類
　　　　　アルドラーゼ オキシグーゼ類　　　　グルコースオキシグーゼセイヨ
ウワサビペルオキ シグーゼ 他の酵素類　　　　　　ベーター〃ラクトシグーゼ ホス７アターゼ頚 ホスホリラーゼ類 へキンキナーゼ類 適当な＃索類のリストは、ホーク（Ｈａｕ＋ｋ）ら、実
際生理化学（ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　　ＰＨＹＳＩＯＬＯ
ＧＩＣＡＬ　　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）、ニューヨーク、
マクグロー−ヒル、３０６−３９７ページ（１９５４）
に記載されている。

蛍光発生酵素類（前記酵素類の存在下に、選択した基質
は蛍光生成物を生成するであろう）は、有用な標識部分
である。抗体の抗原との結合能力を損傷しないでＵ素を
抗体に選択的に接合する方法は、この分野においてよく
知られている。適当な酵素類およびそれらを抗体類に接
合する適当な手順は、例えば、次の文献に記載されてい
る：ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）　、Ｍ、　ら、セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）を抗体に接合す
る過ヨウ素酸塩法における最近の発展、免疫蛍光および
関連する着色技術における国際会議（ＩＮＴＥＲＮＡＴ
ＩＯＮＡＬ　　Ｃ０ＮＦＥＲＥＮＣＥＩＮ　　ＩＭＭＵ
ＮＯＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥＡＮＤ　　ＲＥＬＡＴＥ
Ｄ　　５ＴＡＩＮＩＮＧＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）　、Ｗ
、カップ（Ｋｎａｐｐ）ら編、アムステルダム：エルセ
ヴイーア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、２１５　２４４ベーノ
（１９７８）、スリパン（Ｓｕ！１ｉｖａｎ）　、Ｍ、
　　ら、酵素のイムノアッセイ（Ｅ　ｎｚｙｍｅ　　Ｔ
　ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　：　　リビュー、乙１６：
　２２１−２４０（１９７９）および米国特許第４，１
９０．４９ｓ号。好ましい蛍光発生酵素類およびそれら
に対応する適当な基質類は、次のものを包含する：セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ、これに対して適当な基質
はホモバニリン酸または４−ヒドロキシ−３−７トキシ
ーフエニル酢酸である、ベーターガラクトシダーゼ、こ
れに対して適当な基質は４−メチルウンベリフェリルベ
ーター〇−１１ラクトシグーゼである、アルカリ性ホス
ファターゼ、これに対して適当な基質は４−メチルウン
ベリフェリルホスフェートおよび池のウンベリフェリル
ホスフェート、例えば、４−カルボキシウンベリフェリ
ルホス７エートおよびウンベリフェリルホスフェート、
例えば、４−カルボキシアルキル−エステルなどである
。

抗体を酵素で標識するために適当な手順の例は、カーボ
ンイミド類、ジアルデヒド類、および二官能性カップリ
ング試薬の使用を包含する。アミド基を通す酵素類の連
結は、蛋白質を塩化チオニル、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドまたは同様な試薬で無水溶媒、例えば、ジメチル
ホルムアミド、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テ
トラヒドロ７ランなどの中で処理することによって達成
できる。別のカップリング試薬は、カーボンイミド類、
例えば、１−エチル−３−（３−Ｎ。

Ｎ゛−ツメチルアミ／プロピル）カーボノイミドまたは
１−シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチル）カ
ーポジイミドメチル−ｐ−）ルエンスルホネートを包含
する。

酵素の炭水化物の部分は、また、アルデヒドに酸化し、
そして免疫グロブリンのりジルアミ７基と反応させてシ
ッフ延期を形成することができる。ホウ水素化ナトリウ
ムを使用する還元は、酵素と抗体とを安定に連結する。

セイヨウワサビペルオキシグーゼおよび抗体は、上のウ
ィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）の方法によって免役グロブリ
ンに効率的に連結することがで詐る。

蛍光標識した抗体は、この分野において既知の標準蛍光
性部分から調製できる。抗体および飢の蛋白質は波長が
約３１Ｏｎ＋１までの光を吸収するので、蛍光性部分は
３１０ｎｍより長い波長、好ましくは４００ｎｍより長
い波長の光を実質的に吸収するように選択すべきである
。種々の蛍光体は、スチリア−（Ｓ　ｔｒｙｅｒ）　％
　ｉ（エンス　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、１６２：　５２６
（１９６８）およびブランド（Ｂｒａｎｄ）　、Ｌ、ら
、ｒ１１１３ｔｉのための蛍光性プローブ（Ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｔ　　ｐｒｏｂｅｓ　　ｆｏｒ　　５ｔｒｕ
ｃＬｕｒｅ）　Ｊ　　、４１：８４コう−８６８（１９
７２）に記載されている。抗体は、例えば、米国特許第
３，９４０゜４７５号、米国特許第４，２８９，７４７
号および米国特許第４，３７６．１１０号に記載されて
いるような普通の手順によって、蛍光性基で標識するこ
とができる。

ある数の前述の望ましい性質を有する蛍光体の１つの群
はキサンチン色素類であり、これらは３．６−シヒドロ
キシー９−フェニルキサントヒトロールから誘導された
フルオレセイン類、および３，６−ジアミ／−９−フェ
ニルキサントヒトロールおよびリスアミンローグミンか
ら誘導体されたレスアミン類およびローグミン顕を包含
する。

ローダミンおよび９−ｏ−ｆＪルポキシフェニルキサン
トヒドロールのフルオレセイン誘導体は、９−０−カル
ボキシフェニル基を有する。反応性カップリング基、例
えば、アミン基およびインチオシアネート基を有するフ
ルオレセイン化合物は、例えば、フルオレセインイソチ
オシアネートお上ゾフルオレスカミンは容易に入手可能
である。

蛍光性化合物の他の群は、アミ７基をアルファまたはベ
ータの位置に有するす７チルアミン類である。ナフチル
アミノ化合物には、ｌ−ジメチルアミツナ７チルー５−
スルホネート、１−７ニリノー８−す７タレンスルホネ
ートおよＶ２ｐ−トルイシル−６−す７タレンスルホネ
ートが包含される。他の色素には、次のものが包含され
る；３−７二二ルー７−インシ７ナトクマリン；アクリ
ジン類、例えば、９−イソチオシアナトアクリジンおよ
びアクリジンオレンジ；Ｎ−［ｐ（２−ペンソキサソリ
ル）フェニル】マレイミド；ベンゾキサジオゾール類、
例えば、４−クロロ−７−二トロベンゾー２−オキサ−
１，３−ジアゾールおよび？−（ｐ−メトキシベンジル
アミ７）−４−二トロベンゾ−２−オキサ−１，３−ノ
アゾール；スチルベン類、例えば、４−ジメチルアミ／
−４′−イソチオシアナトスチルベンおよび４−ツメチ
ルアミノ−４゛−マレイミドスチルベン；　Ｎ、Ｎ’−
ジオクタデシクロキサカルボキシ７’ミンー９−）ルエ
ンスルホネート；　ピレン類、例えば、８−ヒドロキシ
−１，３，６−ピレン）リスルホン酸、１−ピレン酪酸
、メロシアニン５４０、ローズペンガル、２，４−ジフ
ェニル−３（Ｈ）−７ラノン、ｏ−７タルデヒド、なら
びに他の容易に入手できる蛍光性分子。これらの色素は
活性官能性を有するか、あるいはこのような官能性は容
易に導入することができる。

例えば、抗体は、ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、Ｊｏ
、モノクローナル抗体：原理およＶ実際（ＭＯＮＯＣＬ
ＯＮＡＬ　　ＡＮＴＩＢＯＤＹ：　ＰＲＩＮＣＩＰＬＥ
！ｌ；　　ＡＮＤ　　ＰＲＡＣＴＩＣＥ）、ニューヨー
ク、アカデミツク・プレス、２０Ｂ−２４９ページ（１
９８３）に記載されている手順によって、フルオロクロ
ーム類で標識することができる。フルオロクロームの濃
度はゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）　、２２９ページの
表に従って選択される。例えば、ＤＭＳＯ中のフルオレ
セインイソシアネート（１，０ωｇ／ｍｌ）またはロー
グミンイソシアネート（１０、ｏＢ／　ｍｌ）を調製し
、そして所望容量（合計の蛋白質溶液の容量の１〜１０
％）を、攪拌しながら、調製溶液に滴々添加する。

この反応は、光を遮断して、２時間進行させる。

生成物は、０．１％のＮａＮ０．を含有するＰＢＳ中の
セフ７セツクス（５ｅｐｈｄｅｘ）　Ｇ　−２５ゲルを
使用するゲル濾過によって精製して、未反応または加水
分解したフルオロクロームを除去する。接合体の吸収を
２８０ｔ＋ｍおよび可視領域におけるそのピーク（フル
オレセイン化抗体について４９５ｎｍおよびローダミン
化抗体について５５０　ｎｍ）において測定する。フル
オロクローム対蛋白質の比を、上のゴーディング（Ｇｏ
ｄｉｎｇ）　、２２４−２２５ページの手順に従って計
算する。接合体は、使用するまで光から保護して、４℃
において貯蔵する。抗体溶液の濃度が１ｍｇ／ｍｌより
低い場合、ＢＳＡをこの決定に１１１Ｉｇ／ｌの最終濃
度に添加する。

本発明の抗体は、本発明の１つの実施態様において、ア
ビジンまたはビオチンに共有結合することができる。適
当な結合手順は、二官能性架橋剤を通す架橋を包含する
。適当な二官能性化合物は、ペーターズ（Ｐｅｔｅｒｓ
）　、Ｋ、　ら、Ａ　ｏｎ、　　Ｒｑ−ｖ、　Ｂ　１ｏ
ｃｈｉｉ、４６：　５２３（１９７７）に記載されてい
る。フルキルイミデー）Ｕは、蛋白質によりそれらに対
して提供された官能性基にうちで高度の特異性を示す。

この反応は第一アミ７栽に対して特異的である。適当な
カップリングの例は、次のものを包含するニアミドエス
テル蹟、例えば、ツメチルマロンイミデート、アジド類
、例えば、イミノ基と容易に反応して７ミド結合を形成
するタードリルジアジドの７シルアノド、アリールツバ
ライド、例えば、１．５−ジフルオロ−２，４−ジニト
ロベンゼン、または４１　４　’　−シフ　ルｒロー３
．３’−ジニトロフェニルスルホン、グルタルアルデヒ
ド、１−エチル−３−（３−）メチルアミ／プロピル）
カーポジイミド塩酸塩、ツマレイニド、混合無水物、ｍ
−マレアミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル、および他の既知の架橋剤。

上の試薬は本質的に不可逆の結合を提供する。

官能基をもつ二官能性試薬、例えば、ジサルファイドま
たはグリコール−を使用できる。これらは、必要に応じ
て、架橋反応後破壊できる結合を提供する。このような
試薬の例は、次の通りである二ツメチル３，３゛−ジチ
オビスプロピオンイミデート、スクシニミジルプロピオ
ンイミデート、Ｎ−（３−フルオロ−４，６−ジ二トロ
７エ二ル）−シスタミン、タードリルノアノド、タート
リルジ（グリシルアジド）およびタートリルシ（ニブシ
ロン−アミ７カプロイルアシド）。

池の場合において、結合は試薬それら自体の間で直接形
成することができる。例えば、抗体はぞれぞれの物質上
の官能基を通してビオチンへ結合することができる。特
定の例として、ビオチンを過ヨウ素酸塩で処理し、そし
て抗体と反応させて、ビオチンの７ビジンへの結合を阻
害しないで、あるいは抗体の免疫学的活性を遮断しない
で、シッフ塩基を得ることができる。

二官能性架橋剤を使用する既知の技術は、次のものを包
含する（ａ）１工程のグルタルアルデヒドの結合、アブ
ラメアス（Ａ　ｖｒａｍｅａｓ）　、Ｓ　、、■化学（
ｒ　ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、６　：　４３
　（１９６９）；（ｂ）２工程のグルタルアルデヒドの
結合、アプラメアス（Ａｖｒａｍｅａｓ）　、　Ｓ、　
、　１ｆｆ（Ｑ字（Ｉ翌すＲ韮」−ｉリエ、Ｊ、ａ：　
１１７５（１９７１）；および（ｃ）シマレイミドの結
合、カド（Ｋａｔｏ）　、Ｋ、　ラ、ニー　ｒｙ　ヒフ
　ンニノ土二力沙ニーもプ・バイオケミストリニ仁旦ｕ
ｒ、　　Ｊ　、　Ｂ　１ｏｃｈｅ＋ｐユ）６２：　２８
５（１９６６）。

抗体は、７ナトウイツチ（Ｈｎａｔｏ＋ｕｉｃｈ）　、
Ｄ　。

５（６）：　５５４−５５７（１９８４）およびブック
レイ（Ｂｕｃｋｌｅｙ）　、Ｒ，ら、７エダレイシ３ン
・オプ・ユーロピアン・バイオケミカル・ソサイ゛アテ
イーズ（Ｆ　ｅｃ！ｅｒａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｅ　ｕ
ｒｏｐｉａｎ　　Ｂ　ｉ。

ｃｈｅｍｉｃａｌ　　５ｏｃｉｐｔｉｅｓ）　、１６６
（１）　２０２−２０４（１９８’４年１月）に従う手
順に従って、金属の放射核で標識することができる。こ
の手順において、抗体は、金λ１放射核とキレートを形
成できるキレート剤、例えば、ジエチレントリアミンペ
ンタ酢酸と接合される。Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ　（ジエチレン
トリアミンペンタ酢酸）の二環式無水物の０゜１りｇ／
＋ｎＩの懸濁液を、乾燥溶媒、例えば、クロロホルム、
エーテルまたは乾燥Ｄ　！、Ｉ　Ｓ　Ｏ中で調製する。

アリコートをＤＴＰｌｔ免疫グロブリンのモル比を１：
　１とするために十分な量で取り出して清浄な乾燥した
管へ入れ、そして窒素の下に蒸発させる。生理的食塩水
中の０．０５モルの重炭酸塩の緩衝液、ｐＨ７，０−７
，５、中の使用する抗体溶液の１０〜２０マイクロタイ
ターの部分を乾燥ＤＴＰＡに添加し、そして内容物を同
一緩衝液で０．２ｍｌに希釈し、そしてセファデックス
Ｇ−２５デルの５ｃｍのデルシン濾過カラムでｔａｉｌ
、生理的食塩水で溶離する。カップリングの効率は、０
．０５モル酢酸塩緩衝液、ＤＨ６，０，中の「キレート
等級」のＩｌｌ　Ｉｎの添加によって、精製前に決定す
る。カップリング効率の計算のために、薄層クロマトグ
ラフィーを使用して、ＤＴＰ八カへプリングした抗体を
分離する。ＤＴＰＡカップリングした抗体を、金属放射
性核、例えば、口Ｉ　Ｉ　ｎ＋３、”２Ｂｉ中３および
５８Ｇａ＋３との結合（二必要になるまで４℃で貯蔵す
る。

本発明のサンドイッチ７ツセイ法において、動脈内脂肪
沈積抗原を付着する不溶性支持体を患者の血清と十分な
時間接触させて、抗動脈内脂肪沈　　７積抗体を動脈内
脂肪沈積抗原と接合させ、次いで患者の血清を支持体か
ら除去する。インキュベージシン時間は実質的な接合を
起こさせるために十分であるべきであり、この時間は温
度に依存する。適当なインキュベーション時間は１６〜
４０℃の範囲内お温度において２０〜２４０分であり、
好ましい接触時間は２０〜２６°Ｃの範囲内の温度にお
いて少なくとも６０分である。

次いで、残留する血清をから洗浄溶液の使用により除去
する。普通の洗浄溶液を使用できる。好ましい洗浄溶液
は米国特許第４，５２８．．２６７号１−：記ｉ１１％
レテイルｓ　Ｊ：　レバ０．０００１−０　。

Ｏ５のモル濃度、ｐＨ６〜８を有し、そして０゜００１
〜０．１重量％の非イオン性界面活性剤を含有する水性
リン酸塩緩衝液である。適当な非イオン性ｍ面活性剤は
、次のものを包含する：ポリオキシエチレンエーテル（
ＢＴＩＪ）、例えば、ラウリル、七チル、オレイル、ス
テアリル、およびトリデシルポリオキシエチレンエーテ
ル；ポリオキシエチレンソルビタン（’ｒＷＥＥＮ）　
、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモ７ラウレ−
１・、モノパルミテート、モアステアレート、モノオレ
エート、およびトリオレエート；および他のポリオキシ
エチレンエーテル（例えば、ＴＲＩＴＯＮ）。好ましい
非イオン性界面活性剤は、４０のエチレンオキシド単位
を有するオクチ９しフェノキシボリエ）キシエタノール
（’ｌ”ＲＩＴＯＮ　　Ｘ−４０５、ローム・アンＶ・
ハース・カンパニー）である。

次いで、不溶性支持体を標識した抗体と接触させ、この
標識した抗体は不溶性支持体に接合した抗体と結合する
であろう。抗動脈内脂肪沈積抗体の大部分は工ｇＧ抗体
であるので、標識した抗ＩｇＧ抗体を使用できる。■ｇ
ＡおよびＩＦＩＭのクラスの抗体の検出を望む場合、そ
れぞれの標識した抗ｒｇＡおよび抗ＩｇＧ抗体を、単独
であるいは抗１８Ｇ抗体と組み合わせて、使用すること
ができる。

種々の標識を前述した。明瞭を目的として、この方法の
引続（工程を、酵素、好ましくは蛍光発生酵素で標識さ
れた抗ＩｇＧ抗体について現明するが、これは限定を意
味するものではない。用語「蛍光発生酵素」は、二二お
いては、適当な基質と蛍光団生成物を生成するであろう
酵素を意味する。

酵素標識抗ＩｇＧ抗体を、水溶液中で不溶性支持体に適
用する。この溶液は、好ましくは、反応成分を保存しか
つ接合反応を促進するために、適当な塩類および緩衝剤
類を含有する。例えば、この溶成は、ウシ血情アルブミ
ン（ＢＳＡ）、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）　、および前
述の洗浄溶液中に使用した穏和な界面活性剤、例えば、
ポリオキジエチレンソルビタンエーテルを含有すること
ができる。インキュベーションは十分な時間続けて、標
識した抗１ｇＧ抗体を、存在する場合、不溶性支持体に
付着する免疫グロブリンと接合させる。好ましいインキ
ュベーションの時間および温度は、不溶性支持体に結合
した動脈内脂肪沈積試薬との血清の抗動脈的脂肪沈積抗
体との接合について記載した通りである。

次いで、標識した抗１．Ｇの溶液を不溶性支持体から除
去し、そして支持体を洗浄溶液、例えば、前述の溶液で
洗浄して、残留するかも知れない接合しない標識した物
質を除去する。

本発明のサンドイツチ法の第３工程において、不溶性支
持体を基質の水溶液と接触させ、この基質は酵素の存在
下に反応して蛍光化合物を溶液中に放出する。転化され
うる適当な基質および酵素は、例えば、米国特許＃Ｓ４
，１９０，４９６号および米国特許第４，５２８，２６
７号に記載されている。支持体は、１０−２〜１０−’
Ｏモル濃度の基質を含有する水溶液と接触させる。１０
″″４〜１０−５モル濃度の基質は好ましい。基質の；
８液中の好ましい追加の試薬および緩衝剤は、ＶＩＪえ
は、２−７ミ／−２−メチル−１−プロパ／−ル援衝剤
および塩化マグネシウムである。

この基質の溶液を不溶性支持体と一緒に十分な時間イン
キュベーションして、蛍光団を発生する反応を起こさせ
る。１８〜４０℃の温度において、５〜２４０時間のイ
ンキュベーション時間を使用できる。好ましくは、温度
は２０〜２６℃の範囲内であり、そしてインキュベーシ
ョン時［川は３０〜９０分である。

次いで、溶液中の蛍光のレベルを測定する。基質溶液中
の蛍光のレベルを決定する装置および手順は、この分野
において普通に使用されているものである。蛍光のレベ
ルは不溶性支持体上の正索の濃度の関数であり、そして
酵素の濃度は血清試料中の抗動脈的脂肪沈積抗体の量の
関数である。

抗動脈的脂肪沈積抗体の濃度は、溶液の蛍光のレベルを
、既知濃度の抗動脈的脂肪沈積抗体を含有する対照溶液
で得られた蛍光のレベルと比較することによって決定す
ることができる。

本発明の他の実施態様において、血清試料中の抗動脈的
脂肪沈積抗体のレベルは競合イムノアッセイにより得ら
れる。本発明の１つの実施態様において、既知の濃度の
動脈内脂肪沈積抗原を有する不溶性支持体を使用する。

血清試料と既知濃度の標識した抗動脈内脂肪沈積試薬の
抗体との混合物を不溶性支持体に十分な時間適用して、
抗動脈内脂肪沈積を動脈内脂肪沈積と接合させる。抗動
脈内脂肪沈積と動脈内脂肪沈積との接合について前述の
時間および温度は適当である。不溶性支持体から残留血
清溶液を除去しかつ洗浄した後、不溶性支持体上または
血清混合物中に残留する標識を決定することができる。

標識が蛍光発生酵素である場合、不溶性支持体上の標識
の量は、不溶性支持体を適当な基質溶液と接触させ、溶
液中に蛍光団を発生させる反応を起こさせ、そしてサン
ドイッチイムノアッセイの実施態様に関して前述したよ
うに、蛍光のレベルを測定することによって決定するこ
とができる。

競合イムノアッセイの他の実施態様において、不溶性支
持体はそれに付着した抗動脈内脂肪沈「を試薬の抗体を
有する。次いで、血清試料と標識した動脈内脂肪沈積抗
原との混合物を不溶性支持体とともに十分な時間インキ
ュベーションして、抗動脈的脂肪沈積抗体を動脈内脂肪
沈積抗原と接合させる。次いで、不溶性支持体上の標識
または血清溶液中に残留する標識の量を決定する。！５
識が蛍光発生酵素である場合、不溶性支持体との標識の
量は、不溶性支持体を適当な基質溶液と接触させ、溶液
中に蛍光団を発生上せる反応を起こさせ、そしてサンド
イッチイムノアッセイの実施態様に関して前述したよう
に、蛍光のレベルを測定することによって決定すること
ができる。

本発明を以下の特定であるが、非限定的実施例によって
さらに説明する。特記しないかぎり、反応はセ氏であり
、そして百分率は重量による。実施するために構成的に
縮小した実施例は現在の意味で記載されており、そして
前もって実施するために縮小した実験室の実験を表わす
実施例は過去の意味で記ｆ１されている。

実施例１ アテローム性動脈硬化症の！！′ｌＩＪ脈内脂肪沈積の
抗原の分離 動脈内膜（動脈内脂肪沈積）を内側層から切除し、そし
て０．９Ｎの生理的食塩水で簡単に洗浄する。動脈内脂
肪沈積を小さい片（２Ｎ２ｍｆｉ）に切り、そしてこの
ａｍを０．１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７，２、中で高速度
で４℃において３０〜６０秒間均質化した。このホモジ
ネートを４℃において３０分間遠心（２０００Ｘｇ）す
る。上澄みを取っておく。均質化および遠心の工程を反
復し、上澄みをプールする。制菌量のアジ化ナトリウム
をプールした上澄みに添加し、そして上澄みを４　”Ｃ
で貯蔵する。

実施例２ セファローズへの抗体の接合 凍結乾燥したＣＮＢｒ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）　４　Ｂ粉末［７ｙ−マシア（ＰｈａｒＩｌａｃ
ｉａ）　］を１ミルモルのＨＣＩ中で１５分間膨潤させ
る。

このゲルを、焼結ガラスフィルター（多孔度Ｇ−３）上
において、ゲルのＩｇ（乾燥重址）につき合計２００＋
ｏｌの１ミリモルのＨＣＩで洗浄する。

これはいくつかの７リコードで実施し、上澄みを連続添
加の開に吸引する。

デルの１ミリにつき５１Ｉ１ｇのカップリングすべき蛋
白質を、カップリング４［ｆｉ（０，１モルのＮａＨＣ
Ｏ，、ｐＨ８，３，０，５モルのＮａＣ１を含有する）
中に溶解する。ゲルをカップリング緩衝液で洗浄し、過
剰量を吸引により除去し、そして蛋白質溶液をゲルと混
合物する。この混合物を攪拌しないで４℃で一夜放置す
る。次いで、ゲルを１モルのエタノールアミンを含有す
るブロッキング緩衝液、ｐＨ８，０、中に室温において
２時間配置する。次いで、グルをカップリング緩衝液（
０，１モルの酢酸塩ＩＩＬ衝液、ｐＨ４，０，０゜５モ
ルのＮａＣｌを含有する）で洗浄し、モして力γブリン
グ緩衝液で２回洗浄する。ここで蛋白質−七７アローズ
接合体は使用でさる状態にあり、そして４〜８°Ｃにお
いて貯蔵することができる。制菌剤として臭化シアンを
緩衝液に添加することができる。

実施例３ 動脈内脂肪沈積上澄みからのＩｇＧ抗体の吸着 合計的１３０Ｂの抗ＩｇＧ抗体を含有する、実施例２の
手順に従い調製した抗１ｇＧ抗体に接合したセファロー
ズゲルの２５１をカラムに充填する。このカラムを２〜
３容量の緩衝液（０゜１５モルのＰＢＳ、ｐ）（７，２
）と平衡化し、次いで試料をこのカラムの適用する。

溶離緩衝？ｌ１ｌ（０，１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７゜２
）の流速は２５ｍ１／時間である。抗体を含有する溶離
した分画を、ピーク活性が消失するまで集めろ。

次いで、このカラムを１０×容量の０．１５モルのＰＢ
Ｓ、ｐＨ７，２、で洗浄する。

さらに酢酸塩緩衝液、ｐＨ４，Ｏ，で２５ｍ１／時間の
流速において溶離することによって、追加の１χ着を行
う。溶離されたピークの試料を０゜１５モルのＰＢＳ％
　ｐＨ７，２、に対して４°Ｃにおいて、多数回緩衝液
を交換しながら、透析する。

次いで、カラムを蒸留水で洗浄して、免疫親和結合した
ＩｇＧ抗体を脱着する。ＨＰＬＣ等級の蒸留水をカラム
を通して空隙容量に等しい容量で充満させ、モして溶離
を６時間停止する。次いで、カラムを追加の蒸留水で１
５〜２０ｍ１／時間の速度で溶離し、溶離した試料を集
め、そしてピークの分画を保持する。ピークの分画を０
．１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７，２、に対して４℃におい
て、多数回緩衝液を交換しながら、２４〜３６時間透析
する。

実施例４ 動脈内脂肪沈積上澄みからのＩｇＧ抗体の吸着 実施例２の手順に従って７１４製した抗ＩｇＧ抗体に接
合したセファローズデルの７．５ω１を充填しだカラム
を使用して、実施例３の手順を反復する。溶＠ＰＢｓａ
衝液の流速は２５ｍ１／時間である。

実施例５ 動脈内脂肪沈積上澄みからのＩｇＧ抗体の吸着 ′　実施例２の手順に従ってｔ４製した抗ＩｇＡ抗体に
接合したセフ７０−ズグルの７．５ｍｌをを充填したカ
ラムを使用して、実施例３の手順を反復する。溶離ＰＢ
Ｓ！（！Ｉ液の流速は２５ｍ１／時間である。

実施例６ 動脈内脂肪沈積上澄みからのＩ８Ｇ抗体の吸着 実施例２の手順に従って調製した抗ＩｇＡ抗体に接合し
たセフ７０−ズデルの７．５ｍｌをを充填したカラムを
使用して、実施例３の手順を反復する。溶離ＰＢＳ緩衝
液の流速は２５＋ａｌ／時間である。

実施例７ 動脈内脂肪沈積抗原の精製 実施例３の手順に従って得られた動脈内脂肪沈積にｖＰ
異的に結合する１、Ｇ抗体を、実施例２の手順に従って
セファローズに結合して、動脈内脂肪沈積抗原に対して
Ｖｆ異的に結合する親和カラムのデルを形成する。

抗動脈内脂肪沈積ＩｇＧ抗体に接合したセファローズデ
ルの２５１をカラムに充填する。このカラムを２〜３容
量の緩衝液（０，１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７，２）と平
衡化し、そして実施例１に従って得られた動脈内脂肪沈
積溶液をこのカラムに適用する。

溶離緩衝液（ｏ、ｉｓモルのＰＢＳ、ｐＨ７゜２）の流
速は２５ｍ１／時間である。動脈内脂肪沈積を含有する
溶離した分画を、ピーク活性が消失するまで、集めて動
脈内脂肪沈積を得て、これに抗動脈内脂肪沈積ＩｇＧ抗
体は特異的に結合する。

次いで、カラムを１０×容量の０．１５モルのＰＢＳ、
　ｐＨ７，２、で洗浄する。

それぞれ、実施例４．５および６の手順に従って得られ
た抗動脈内脂肪沈積ＩｇＡ抗体、抗動脈内脂肪沈積Ｉｇ
Ｅ抗体および抗動脈内脂肪沈積工ｇＭ抗体を抗動脈内脂
肪沈積ＩｇＧ抗体の代わりに使用して、上の手順を反復
して、抗体が特異的に結合する対応する動脈内脂肪沈積
の分画を得る。

実施例８ ＢＳＡ坦体への動脈内脂肪沈積抗原の接合実施例７の手
順に従って得られた動脈内脂肪沈積抗原の０．０１モル
のＰＢＳ溶液、ｐＨ６゜８、を調製し、そして水浴中で
冷却する。１０マイクロタイターの５％のＢＳＡを抗原
溶液の１ｍｌにつき添加し、そして５ｍｇの１−エチル
−３−（３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピル）カーポ
ジイミド（ＥＣＤｒ）をこの混合物に攪拌しながら添加
し、そして４℃で２０分間インキュベージ６ンする。Ｅ
ＣＤＩの添加およびインキエベーションをさらに３回反
復する。混合物を４℃に攪拌しながら一夜維持し、そし
てこの反応混合物を０゜０１モルのＰＢＳ溶液、ｐＨ６
，８、に対して、多数回緩衝液を交換しながら、４８時
間透析する。

実施例９ 動脈内脂肪沈積抗原を被覆したマイクロタイタープレー
トの調製 実施例８の手順に従って調製した動脈内脂肪沈積抗原−
ＢＳＡ接合体溶液の調製した希釈物の１００マイクロタ
イターを、イムロン（ＩＭＭｔＪＬＯＮ）ＩＩマイクロ
タイタープレート［グイナテク（Ｄ　ｙｎａｔｅｃ）　
］の表面に適用する。被覆溶液の希釈は、１：１０．１
：　１００、ｌ　１０００および１：　　１０，０００
である。プレートをおだやかに軽くたたき、被覆溶液が
各ウェルの底を完全に覆うようにする。ウェルを４℃に
おいて蓋をした湿潤箱内で一夜インキュベーシａンする
。

被覆溶液を廃棄し、そして２００マイクロタイター／ウ
エルのＰＢＳ中の１％のＢＳＡを添加する。次いで、ウ
ェルを湿潤箱内で室温において１時間インキュベージシ
ンし、そしてＢＳＡ溶液を除去する。次いで、ウェルを
２００マイクロタイターの洗浄ｍ１Ｉｉ液（ＰＢＳ、０
．５％ノツイーンおよ１０．０２％のアジ化ナトリウム
）で洗浄し、ぞして湿潤箱内で４℃において使用するま
で貯蔵する。

実施例１０ 抗（動脈内脂肪沈積抗原）１．Ｇ抗体のための蛍光イム
ノアッセイ手順 異なる濃度の動脈内脂肪沈積抗原−ＢＳＡ接合体（動脈
内、脂肪沈積抗原を使用して？Ａｖ＆し、抗動脈的脂肪
沈積ＩｇＧ抗体と接合した親和カラムで精製した）で被
覆したマイクロタイタープレートの各々に、１００マイ
クロタイター／ウエルの親和精製したヤギ抗ＩｇＧ抗体
溶液（１：　３０００の希釈）を適用する。プレートを
覆って乾燥を防止し、２時間インキュベーションし、そ
して残留するヤギ抗ＩｇＧ抗体溶液を除去し、プレート
を３回洗浄級衝液で洗浄する。

二重反復実験において、試験する患者の血清試料の１０
０マイクロタイター／ウエルをマイクロタイターウェル
に適用する。プレートを覆って乾燥を防止し、２時間イ
ンキュベージシンする。血清を除去し、そしてプレート
を３回洗浄緩ｉＩ液で洗浄する。

１００マイクロタイター／ウエルの親和精製したヤギ抗
ＩｇＧアルカリ性ホス７γターゼ接合抗体溶液（１：　
３０００の希釈）を各ウェルに適用し、そしてプレート
をを覆って乾燥を防止し、２時間インキュベーションす
る。抗ＩｇＧ溶液を除去し、そしてプレートを３回洗浄
４１衝液で洗浄する。

次いで、１００マイクロタイターンウエルの４−メチル
ーウンベリフェリルホス７エート溶液（３Ｍダイアグノ
スチック・システムス（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　　Ｓ　
ｙｓｔｅｌｌｓ）をウェルに適用する。次いで、マイク
ロタイタープレートを蛍光測定装置（３Ｍダイアグノス
チック）で、最初の４０９６の読みまたは１時間マーク
に到達するまで、１０分毎に読む。読みを他の２時間の
開３０分毎に続ける。

実施例１１ 抗（！！！ｌＳ脈内脂肪坑内脂肪沈積抗原抗体のための
蛍光イムノアッセイ手順 異なる濃度の動脈内脂肪沈積抗原−ＢＳＡ接合体（ｔ！
！Ｊｊ脈内脂肪坑内脂肪沈積抗原てｉ製し、抗動脈的脂
肪沈積ＩｇＭ抗体と接合した親和カラムで精製した）で
被覆したマイクロタイタープレートの各々に、１００マ
イクロタイター／ウエルの親和精製したヤギ抗１．Ｍ抗
体溶液（１：　３０００の希釈）を適用する。プレート
を覆って乾燥を防止し、２時間インキュベーションし、
そして残留するヤギ抗ＩｇＭ抗体溶液を除去し、プレー
トを３回洗浄緩衝液で洗浄する。

二重反復実験において、試験する患者の血清試料の１０
０マイクロタイター／ウエルをマイクロタイターウェル
に適用する。プレートを覆って乾燥を防止し、２時間イ
ンキュベーションする。血清を除去し、そしてプレート
を３回洗浄緩衝液で洗浄する６ １００マイクロタイター／ウエルの親和精製したヤギ抗
ＩｇＭアルカリ性ホスファターゼ接合抗体溶液（１：　
３０００の希釈）を各ウェルに適用し、そしてプレート
をを覆って乾燥を防止し、２時間インキュベージタンす
る。抗ＴｇＭ：ｆ＃液を除去し、そしてプレートを３回
洗浄４１衝液で洗浄する。

次いで、１００マイクロタイター／ウエルの４−メチル
−ウンベリフェリルホスフェート溶液（３Ｍダイアグノ
スチフク・システムス（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　　Ｓ　
ｙｓｔｅｓｓ）をウェルに適用する。次いで、マイクロ
タイタープレートを蛍光測定装置（３Ｍダイアグノスチ
７り）で、最初の４０９６の読みまたは１時間マークに
到達するまで、１０分毎に読む。読みを他の２１１！間
の開３０分毎に続ける。

実施例１２ 抗（動脈内脂肪沈積抗原）ＩｇＡ抗体のための蛍光イム
ノアッセイ手順 異なる濃度の動脈内脂肪沈積抗原−ＢＳＡ接合体（動脈
内脂肪沈積抗原を使用して調製し、抗動脈的脂肪沈積Ｉ
ｇＭ抗体と接合した親和カラムで精製した）で被覆した
マイクロタイタープレートの各々に、１００マイクロタ
イター／ウエルの親和精製したヤギ抗ＩｇＡ抗体溶液（
１：　３０００の希釈）を適用する。プレートを覆って
乾燥を防＋Ｌ　Ｌ、２時間インキュベーションし、そし
て残留するヤギ抗ＩｇＡ抗体溶液を除去し、プレートを
３回洗浄緩衝液で洗浄する。

二重反復実験において、試験する患者の血清試料の１０
０マイクロタイター／ウエルをマイクロタイターウェル
に適用する。プレートを覆って乾燥を防止し、２時間イ
ンキュベーションする。血清を除去し、そしてプレート
を３回洗浄緩衝液で洗浄する。

１００マイクロタイター／ウエルの親和精製したヤギ抗
ＩｇＡアルカリ性ホスファターゼ接合抗体溶液（１：　
３０００の希釈）を各ウェルに適用し、そしてプレート
をを覆って乾燥を防止し、２時間インキュベーションす
る。抗ＩｇＡ溶液を除去し、そしてプレートを３回洗浄
緩衝液で洗浄する。

次いで、１００マイクロタイター／ウエルの４−メチル
−ウンベリフェリルホスフェート溶液［３Ｍダイアグノ
スチック・システムス（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　　Ｓ　
ｙｓｔｅｎ＋ｓ）をウェルに適用する。次いで、マイク
ロタイタープレートを蛍光測定装置（３Ｍダイアグノス
チック）で、最初の４０９６の読みまたは１時間マーク
に到達するまで、１０分毎に読む。読みを他の２時間の
間３０分毎に続ける。

実施例１３ 抗（動脈内脂肪沈積抗原）ＩｇＥ抗体のための蛍光イム
ノアッセイ手順 異なる濃度の動脈内脂肪沈積抗原−ＢＳＡ接合体（動脈
内脂肪沈積抗原を使用して調製し、抗動脈内脂肪沈積１
ｇＥ抗体と接合した親和カラムで精製した）で被覆した
マイクロタイタープレートの各々に、１００マイクロタ
イター／ウヱルの親和精製したヤギ抗ＩｇＥ抗体溶液（
１：　３０００の希釈）を適用する６プレートを覆って
乾燥を防止し、２時間インキュベーションし、そして残
留するヤギ抗ＩｇＥ抗体溶液を除去し、プレートを３回
洗浄緩衝液で洗浄する。

二重反復実験において、試験する患者の血清試料の１０
０マイクロタイター／ウエルをマイクロタイターウェル
に適用する。プレートを覆って乾燥を防止し、２時間イ
ンキュベーションする。血清を除去し、そしてプレート
を３回洗浄緩衝液で洗浄する。

１００マイクロタイター／ウエルの親和精製したヤギ抗
ＩｇＥアルカリ性ホスファターゼ接合抗体溶液（１：　
３０００の希釈）を各ウェルに適用し、そしてプレート
をを覆って乾燥を防止し、２時間インキュベージシンす
る。抗ＩｇＡ溶液を除去し、そしてプレートを３回洗浄
緩衝液で洗浄する。

次いで、１００マイクロタイター／ウエルの４−メチル
−ウンベリフェリルホス７ヱート溶液（３Ｍダイアグ／
スチック・システムス（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　　Ｓ　
ｙｓｔｅｎｓ）をつｌルに適用する。次いで、マイクロ
タイタープレートを蛍光測定装置（３Ｍダイアグノスチ
ック）で、最初の４０９６の読みまたは１時間マークに
到達するまで、１０分毎に読む。読みを他の２時間の間
３０分毎に続ける。

実施例１４ 動脈内脂肪沈積抗原の分離 心筋高速症、心臓血管偶発発作で死亡した患者から解剖
で、あるいは外科的手順から、ヒト大動脈を得る。大動
脈を解剖して取囲む組織およびＪＮ肪を除去し、そして
生理的食塩水中で洗浄して汚染する血液を除去する。動
脈内脂肪沈積のセグメントを分離し、そして処理する。

動脈内脂肪沈積区域を除去し、そして２Ｘ２１の小さい
片に切断する９組織を生理的食塩水中で簡単に洗浄し、
そしてワーリングプレングー内で等張リン酸塩緩衝化生
理的食塩水（ＰＢＳ）中で高速度でｐＨ７，０〜７．２
において均質化する。このホモジネートを４℃において
３０分間遠心（２０００Ｘｇ）に遠心し、そしてｆ８離
する。

この工程および引続く工程からの溶離液を取っておき、
そして濃縮する。

沈降した破片を冷ＰＢＳ中で洗浄し、そしてと澄みが透
明になりかつ化学的または免疫化学的に検出可能な蛋白
質を含有しなくなるまで、上のように反復回転する。こ
の段階で、可溶性蛋白質の９５％以上が除去されてしま
う６次いで、沈降物を蒸留水中で洗浄し、そして０．０
２モルのクエン酸塩緩衝液、ｐＨ３，２、で３７℃にお
いて２時間攪拌しながら抽出する。この溶離の手順の後
、この混合物を３０分間遠心（２０００Ｘ［？）する。

上澄みを０．５モルのＮａＯＨで中和し、そしてＰＢＳ
に対して一夜透析する。上澄みならびにプールしたＰＢ
Ｓ溶離液を真空透析および限外濾過により濃縮して、可
溶性動脈内脂肪沈積抗原の濃縮物を得る。

不溶性動脈内脂肪沈積抗原を分離するため、大動脈の動
脈内脂肪沈積の部分を異なる本質的で消化し、消化物を
ＰＢＳで抽出し、モして溶離液を前述のように濃縮する
。使用する酵素の組成物は、次のものを包含する：５ミ
リモルのＣａＣｌ２を含有する０、０５モルのトリス緩
衝液、ｐＨ７゜４、中のコラゲナーゼ［１００単位／ｉ
ｌｌ；０゜２％のＮａＣｌを含有する０、０３５モルの
炭酸塩ａＳ液−ｐＨ８，８、中のエラスターゼ［２Ｏ−
Ｉｌｌ泣／ｌｌｌ１ｌ　；　２．　５ミリモルのＭｇＣ
，１２を含有する０、１モルのリン酸−ナトリウム緩衝
）α、ｐＨ７゜０１中のＤＮアーゼ〔５００単位／ｍｌ
］　；　０．１５モルのＮａＣ１を含有する０、１モル
のリンａ−ナトリツム緩衝液、ｐＨ５，３、中のヒアル
ロニダーゼ［５０単位／ｍｌｌ；およＶ２ミリモルのＥ
ＤＴＡを含有する変性リンデル（Ｒ１Ｂｅｒ）溶液、ｐ
Ｈ７，３、中のネツロアミニグーゼ［１単位／論１１゜
大動脈の動脈内脂肪沈積の１ｇにつき１０ｍ１の消化混
合物を使用する０組織−酵素の混合物の各々を、振盪水
浴中で３７℃においてインキユベーションする。インキ
ユベーションの期間は、コラゲナーゼおよびエラスター
ゼについて２時間、ヒアルロニダーゼについて１５時間
、およびＤＮアーゼおよびネウラミニグーゼについて１
時間である。消化物の各々を遠心（２０００Ｘｇ）　し
、そして液体部分をアミコン（ＡＭＩＣＯＮ）限外濾過
膜（ＰＭＩＯ）で０．５〜．１．０に濃縮し、０．１５
モルのＰＢＳに対して２４時間透析して、不溶性動脈内
脂肪沈積抗原の濃縮溶液を得る。

実施例１５ 抗動脈的脂肪沈積抗体の分離 実施例１にの手順に従って得られた可溶性抽出物の一部
を処理して、それから抗抗体を分離する。濃縮物を０．
１５モルの塩化ナトリウムで希釈して、抗動脈的脂肪沈
積抗体を含む蛋白質のほぼ１５ｍｇ／ｗ＋Ｉを含有する
ようにする。蛋白質を２５℃でつくった無水硫酸ナトリ
ウム（１８ｇ／１００ｍ１）で沈殿させる。１時間後、
沈殿を遠心（１０，０００ｇＸｇ、２０分、２５℃）に
より集め、そして０．８容量の０．１モルのＰＢＳ、ｐ
Ｈ７，５、中に溶解する。この物質を前述のように再び
沈殿させる。沈降物を０．１モルのトリス−ＨＣｌ緩衝
液（ｐＨ８，０，２０℃）中に溶解し、そして同一緩衝
液で平衡化したデアニーセファデックス（Ｄ　Ｅ　Ａ　
Ｅ　　Ｓ　Ｅ　Ｐ　ＨＡ　Ｄ　Ｅ　Ｘ　）　Ａ　　５０
（７アーマシア）のカラム（３，２Ｘ３０ｃｍ）に適用
する。この物質の溶離は、０．１モルのトリス−ＨＣｌ
からの連続勾配により８．０の一定ｐＨにおいて２０℃
で実施する。ＩｇＡ、ＩｇＤ、　　、ＩｇＥ、ｒｇａお
よびＩｇＭの免疫グロブリンを含有する分画を集め、そ
して濃縮する。次いで、それらを０．２％のナトリウム
アジドを含有する０゜１モルのトリス−ＨＣｌ、０．２
モルのＮａＣ１，０，００２モルのＥＤＴＡＮ％ｐＨ７
，７、と平衡化したセフ７デツクス（７フーマシア）の
カラム（３，２Ｘ９５ｃｍ）に適用する。この物質をこ
のカラムに３回通過させた（リサイクリングクロマトグ
ラフィー技術）。ＩｇＡ％　ＩｇＤ％　ｒ８Ｅ。

ＩｇＧおよびＩｇＭの免疫グロブリンを含有する分画を
集め、そして濃縮する。

実施例１６ 精製した動脈内脂肪沈積抗原の分離 実施例２の手順に従って得られた動脈内脂肪沈積抗原を
、ミシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシルギ（Ｓｈｉｌ
ｇｉ）、細胞免疫学における選択された方法（５ＥＬＥ
ＣＴＥＤ　　ＭＥＴＨＯＩ）ＳＩＮ　　ＣＥＬＬＵＬＡ
ＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、サン７ラシスコ：７リーマ
ン（Ｆ　ｒｅｅｍａｎ　）（１９８０）の手順に従って
、親和クロマトグラフィーによる精製する。インチオシ
７ナトフエノキシヒドロキシブロビル基で置換された架
橋したアガロースゲルを、重炭酸ナトリウムの水溶液中
に懸濁し、そしてこの溶液に、実施例２の手順に従って
得られた混合精製抗動脈内脂肪沈積抗体溶液の１ｍｌを
添加する。この混合物を３日間室温においてインキュベ
ージ１ンし、その間おだやかに攪拌する０次いで、粒子
を遠心し、そして０．５モルのＮ　ａ　ＨＣＯ＝、０．
１モルの酢ｆ！！２塩緩衝液、および１重量％のＢＳＡ
を含有する０、１モルのトリス緩衝液の各々で２回洗浄
する。

抗体結合粒子を、ＰＢＳ中の実施例１に従って調製した
動脈内脂肪沈積抗原濃縮物の溶液と混合する。この混合
物を２５℃において８時間（−夜）インキュベージ１ン
する。次いで、粒子を混合物から分離し、そしてＰＢＳ
ＳｐＨ７，２、で３回洗浄して、残留する結合しない動
脈内脂肪沈積抗原を除去する０次いで、粒子を過剰量の
２゜５モルのＮＡＳＣＮ溶液、ｐＨ８，０、と混合し、
そして２５℃において８時間インキュベーションする。

次いで、親和精製した動脈内脂肪沈積抗原を含有する溶
液を減圧の透析または限外濾過により濃縮し、そして動
脈内脂肪沈積抗原の′ｆ４液を４℃で貯蔵する。

実施例１７ ポリクローナル抗動脈内脂肪沈積試薬の抗体の調製 ０．２ｍｌの０．１５モルの塩化ナトリウム溶液および
０．８ａ＋１の完全７０インドアツユバント中の実施例
３の手順によって調製した０、５ｍｇの動脈内脂肪沈積
抗原の混合物を、ウサギに筋肉内注射する。免疫化を１
４日間反復し、次いで各週３週問反獲する。さらに１０
日が経過した後、血液をウサギから取り出し、そして血
液を凝固させかつ凝固物を除去することによって、抗血
清を血液から回収する。

実施例１８ 酵素標識した抗動脈内脂肪沈積試薬の抗体実施例５の手
順に従って′ｉＲ製した抗動脈内脂肪沈積試薬の抗体を
、Ｍ、オ゛スリパン（０’　５ｕ１１ｉｖａｎ）ら、７
ナリテイカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉ
ｏｃｂｅｍ、　）　、１００：　１００（１９７９Ｎそ
の内容全体をここに引用によって加える）の修正手順に
従い、アルカリ性ホスファターゼと接合する。

実施例１９ 酵素標識した動脈内脂肪沈積抗原 実施例６の手順を反復するが、その抗体試薬の代わりに
実施例３の手順に従って得られた動脈内脂肪沈積抗原を
使用して、アルカリ性ホスファターゼ標識された動脈内
脂肪沈積抗原を得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、不純物を実質的に含有しないことを特徴とするアテ
   ローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原。 ２、示差的な標識と接合している特許請求の範囲第１項
   記載のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原
   。 ３、標識は酵素、放射性標識、蛍光団、発色団または金
   属である特許請求の範囲第２項記載のアテローム性動脈
   硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原。 ４、標識は酵素である特許請求の範囲第３項記載のアテ
   ローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原。 ５、標識はアルカリ性ホスファターゼである特許請求の
   範囲第３項記載のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
   沈積の抗原。 ６、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原に
   優先的に結合する抗体であって、前記抗体は不純物を実
   質的に含有しないことを特徴とする抗体。 ７、示差的な標識と接合している特許請求の範囲第７項
   記載の抗体。 ８、標識は酵素、放射性標識、蛍光団、発色団または金
   属である特許請求の範囲第７項記載の抗体。 ９、標識は酵素である特許請求の範囲第８項記載の抗体
   。 １０、標識はアルカリ性ホスファターゼである特許請求
   の範囲第９項記載の抗体。 １１、特許請求の範囲第１項記載のアテローム性動脈硬
   化症の動脈内脂肪沈積の抗原を付着して有することを特
   徴とする不溶性支持体。 １２、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原
   に優先的に結合する特許請求の範囲第６項記載のアテロ
   ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原を付着して有
   することを特徴とする不溶性支持体。 １３、不溶性支持体はマイクロウェルである特許請求の
   範囲第１２項記載の不溶性支持体。 １４、血清試料中の抗（アテローム性動脈硬化症の動脈
   内脂肪沈積の抗原）抗体の存在を決定する方法であって
   、 （ａ）前記試料をアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
   沈積の抗原が付着している不溶性支持体と十分な時間接
   触させて、前記動脈内脂肪沈積の抗原を抗（アテローム
   性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原）抗体と接合させ
   、 （ｂ）工程（ａ）からの不溶性支持体を抗（アテローム
   性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原）抗体と結合する
   であろう一次抗体と十分な時間接触させて、それらの間
   で接合を起こさせ、そして（ｃ）前記不溶性支持体に接
   合した前記一次抗体を決定する、 ことを含んでなることを特徴とする方法。 １５、一次抗体は抗（ヒトＩｇＧ）抗体である特許請求
   の範囲第１４項記載の方法。 １６、一次抗体は抗（ヒトＩｇＡ）抗体である特許請求
   の範囲第１４項記載の方法。 １７、一次抗体は抗（ヒトＩｇＭ）抗体である特許請求
   の範囲第１４項記載の方法。 １８、一次抗体は抗（ヒトＩｇＥ）抗体である特許請求
   の範囲第１４項記載の方法。 １９、一次抗体は示差的標識を有し、そして工程（ｃ）
   は前記不溶性支持体に結合した標識を決定することを含
   む特許請求の範囲第１４項記載の方法。 ２０、標識は酵素である特許請求の範囲第１７項記載の
   方法。 ２１、工程（ｃ）は前記不溶性支持体を基質と接触する
   ことを含み、前記基質は、酵素の存在下に、検出可能な
   発色団または蛍光団を生成する特許請求の範囲第１８項
   記載の方法。 ２２、酵素アルカリ性ホスファターゼである特許請求の
   範囲第１９項記載の方法。