JPS6373151A - アテロ−ム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積抗原のイムノアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、イムノアッセイ法およびアテローム性動脈硬
化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉＣ）の動脈内脂肪
沈積（ｐｌａｑｕｅ）の存在を検出する方法に関する。

とくに、本発明の方法は、患者の血清中のアテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原の存在を決定する方
法である。

血液と動脈組織との間に位鐙する内皮は、脈管壁中の血
液成分の蓄積に対するバリヤーとして働く。内皮におけ
るアテローム性動脈硬化症の病変の形成は、主要な冠状
血管の病気および発作に関連し、そしてこのような病変
の原因および検出は広範に研究されてきている。

内皮の損傷は、アテローム性動脈硬化症の病変の形成に
おける初期の段階であると信じられており、血行力学的
歪、過コレステロール血症および免疫複合体の病気によ
り潜在的に引き起こされる。内皮の損傷は、動脈内膜の
細胞の増殖、コレステロールのＭ積および結合組織の線
維の形成に導く、損傷した内皮細胞および非内皮化動脈
内膜の中のＩｇＧおよび補体因子Ｃ３のＭＮが示された
。血液から誘導される単核食細胞は、また、アテローム
性動脈硬化症の病変における細胞集団の一部を構成する
ことが発見された。究極の動脈内脂肪沈積の組成に導く
機構は、また、知られていない。

種々の可溶性蛋白質がヒトアテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積から抽出されてきており、それらは次のも
のを包含する：ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＢＩＣ（ｃ３
）、アルファ１−抗トリブシン、アルファ２−マクログ
ロブリン、フィブリノゲン、アルブミン、ＬＤＬ、ＨＤ
Ｌ、アルファｌ−酸糖蛋白質、ベータ２−糖蛋白質、ト
ランスフェリンおよびセルロブラスミノ。病気の動脈内
膜は、また、少量の組織結合ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＢＩ
Ｃを含有することが発見された。ホランダー（Ｈｏｌｌ
ａｎｄｅｒ）、７？０−Ａ　−％［峡（ｔＺｊｆｆｉ（
Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、３４：３９１−４
０５　（１９７９）、他の化学者はこの病変および隣接
する内皮組織中のＩｇＧを報告した。パルムス（Ｐａｒ
ｕｍｓ）、Ｄ、ら、Ｚテローム　動脈硬化症（Ａｔｈｅ
ｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉ　ｓ）、３８：２１１−２１６　
（１９８１）、ハンソン（Ｈａｎｓｓｏｎ）、Ｇ、ら、
実±工Ｖ）、３４：　２６４−２８０　（１９８１）、
ハンンン（Ｈａｎｓｓｏｎ）、Ｇ、ら、アクタ・パソロ
ジカ・マイクロバイオロジカ拳エト・イムノロシカ・ス
カンジナビ力（Ａｃｔａ　　Ｐａｔｈｏ、　　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏ１、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ。

５ｃａｎｄ、）（Ｓｅｃｔ、Ａ、）、９２：４２９−４
３５　（１９８４）、Ｌかしながら、アテローム性動脈
硬化症および関連する組織における免疫グロブリンの起
源、機能および結合の性質はなお神秘的である。抗低密
度リポ蛋白質（ａＤＬ）自己抗体は、脈管の病気患者に
おいてより高いことが報告され、それらがある方法でア
テローム性動脈硬化症の発現に関連することを示唆して
いる。しかしながら、これらの自己抗体とアテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積との間の因果関係は確立さ
れていない、スゾンディ（Ｓｚ。

ｎｄｙ）、Ｅ、ら、老化　よび発育の機構（鼠旦ｃｈａ
ｎｉｓｍ　　ｏｆ　　Ａｇｉｎｇ　　ａｎｄ　　Ｄｅｖ
ｅｌｏ　　ｍｅｎｔ）、２９：１１７−１２３（１９８
５）。

１９８６年１月　　日に提出した私の同時係属出願第８
４６．４０１号において、アテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積に結合する抗体（以後、抗動脈内脂肪沈積
抗体と呼ぶ）の存在を決定することによって、患者にお
けるアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の存在を
決定する方法を記載した。このイムノアッセイにおいて
、抗体はそれを不溶性支持体と接合することによって血
清から分離された。驚くべきことには、進行したアテロ
ーム性動脈硬化症を有するある患者の血清中において、
抗動脈内脂肪沈私抗体は不溶性化された抗体に結合しな
いであろうことが発見された。この病気の進行した段階
において、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の
抗原は血清中に放出されることができ、ここでそれは抗
動脈内脂肪沈積抗体と相互作用して複合体を形成するよ
うに思われる。

本発明の目的は、患者の血清中のアテローム性動脈硬化
症の動脈内脂肪沈積の抗原の存在を、進行したアテロー
ム性動脈硬化症の存在の指示として決定することである
。

種々の体液および組織中の広範な種類の抗原および非抗
原物質の存在および量を決定するために、広範な種類の
イムノアッセイが開発された。

合計の免疫グロブリンおよびＩｇＥのイムノアッセイは
、米国特許第３．７２０．７６０号および米国特許第４
，４４４，８７９号に記載されている。ＩｇＧアロタイ
プのイムノアッセイはロシア国特許６４９．４３３号に
記載されている。エライザ（ＥＬＩＳＡ）は、マギオ（
Ｍａｇｇｉｏ）ら、酵素のイムノアッセイ（ＥＮＺＹＭ
Ｅ−ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ）、Ｂｏｃａ　　Ｒａｔｏ
ｎ：ＣＲＣプレス、１７２−１７６ページ（１９８０）
に記載されている。

血清中の抗動脈内脂肪沈積抗原の存在を決定する本発明
の方法は、°血清を抗動脈内脂肪沈積抗体と十分な詩間
接触させて、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積
の抗原を抗動脈内脂肪沈積抗体と結合させ、そして、存
在する場合、抗動脈内脂肪沈積抗体と結合するアテロー
ム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原を決定すること
を含む。

抗動脈内脂肪沈積抗体を不溶性支持体に結合させ、血清
と接触させて、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
積の抗原を抗動脈内脂肪沈積抗体と接合させ、そして不
溶性支持体へ結合した得られたアテローム性動脈硬化症
の動脈内脂肪沈積の抗原の量を決定することができる。

あるいは、精確な量のアテローム性動脈硬化症の動脈内
脂肪沈積の抗原を不溶性支持体へ結合し、そして前もっ
て決定した過剰量の標識した抗動脈内脂肪沈桔抗体と血
清との混合物をそれと接触させることができる。不溶性
支持体へ結合したあるいは混合物中に残留する標識した
抗動脈内脂肪沈積抗体を決定することができる。

なお他の実施態様において、精確な量の抗動脈内脂肪沈
積抗体を不溶性支持体に結合し、そして前もって決定し
た量の標識した抗動脈内脂肪沈積抗体と血清との混合物
をそれと接触させることができる。不溶性支持体へ結合
したあるいは混合物中に残留する標識したアテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原を決定することがで
きる。

血清のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原
の存在を決定する本発明の方法は、共通の工程として、
血清を抗動脈内脂肪沈積抗体と十分な時間接触させて、
アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原を抗動
脈内脂肪沈積抗体と結合させ、そして、存在する場合、
抗動脈内脂肪沈積抗体と結合するアテローム性動脈硬化
症の動脈内脂肪沈積の抗原を決定することを含む。

抗動脈内脂肪沈桔抗体は、アテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積から直接誘導することできるか、あるいは
好ましくは慣用の抗血清またはモノクローナル技術によ
って、精製されたアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
沈積の抗原から誘導することができる。動脈内脂肪沈積
抗原は、ヒトアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積
を処理して、それに対して特異的な抗原を分離しかつ精
製することによって得られる。動脈内脂肪沈積は、心筋
梗塞症、心臓血管偶発症で死亡した患者のヒト動脈を処
理することによって得ることができ、あるいは外科的手
順によって得ることができる。動脈を解剖して、取囲む
組織および脂肪を除去し、そして生理的食塩水（ｓａｌ
ｉｎｅ）中で洗浄して、汚染する血液を除去する。動脈
内脂肪沈積のセグメントを分離し、そして処理する。

動脈内脂肪沈積の区域を除去し、小さい片に切り、簡単
に洗浄し、モして等張溶液、例えば、リン酸塩緩衝化生
理的食塩水（ＰＢＳ）中で均質化する。このホモジネー
トをＰＢＳ中で反復して遠心および再懸濁し、溶離液を
集める。沈降した破片は、また、クエン酸塩緩衝液、酸
性のｐＨ１で抽出し、そして溶は液を中和し、そして透
析により精製する。上澄みならびプールしたＰＢＳ溶離
液を真空透析および限外濾過により濃縮して、可溶性動
脈内脂肪沈積抗原の濃縮物を得る。

不溶性動脈内脂肪沈積抗原は、一部を異なる酵素で消化
し、消化物をＰＢＳで抽出し、そして前述のようにん溶
離液を濃縮するとによって得ることができる。使用する
酵素組成物は、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ＤＮアー
ゼ、ヒアルロニダーゼ、およびネウラミニダーゼを包含
する。各消化物を遠心し１例えば、限外濾過により濃縮
し、そして透析して、不溶性動脈内脂肪沈積抗原の濃溶
液を得る。

ポリクローナル抗動脈内脂肪沈積抗体は、動物、例えば
、ウサギ、モルモット、ラットまたはヤギを濃縮した動
脈内脂肪沈積抗原で免疫化し。

免疫化した動物から血清を取り出し、そしてこの血清か
ら免疫グロブリンを、例えば、硫酸アンモニウムの沈澱
により得られる０本発明の方法において有用である主な
抗体類はＩｇＧおよびＩｇＭの抗体であるが、ＩｇＥお
よびＩｇＡの抗体を、十分な量で入手可能である場合、
使用することもできる。

モノクローナル抗動脈内脂肪沈積抗体は、グラフレ（Ｇ
ｌａｆｒｒｅ）およびマイルすティン（Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ）、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏ
１、）、７３：１　（１９８１）の方法によって得るこ
とができる。

本発明の好ましい方法において、不溶性支持体に付着す
る抗動脈内脂肪沈精抗体を患者の血清と接触させて、ア
テローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原（または
アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原を含ん
でなる免疫複合体）を抗動脈内脂肪沈積抗体を接合させ
る。患者の血清を除去し、そして不溶性支持体を標識し
た抗動脈内脂肪沈積抗体の水溶液と接触させ、こうして
アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の露出したエ
ピトープとの接合を実施する。標識した抗体の溶液を不
溶性支持体から除去し、そして不溶性支持体上に存在す
る標識を決定する。

抗動脈内脂肪沈積抗体は、慣用法によって不溶性支持体
へ結合することができる。抗体を不溶性支持体へ結合す
る手順は、例えば、米国特許第３．５５１，５５５号、
米国特許第３　、５５３　。

３１０号、米国特許第４，０４８，３１０号および最発
行２９．４７４号に記載されている。吸着による抗体の
ポリスチレンへの結合は、例えば。

米国特許第３．６４６．３４６号および米国特許第４，
０９２，４０８号に記載されている。抗原を含有する蛋
白質を種々の不溶性支持体へ結合することは、米国特許
第３，７２０，７６０号に記載されている。

種々の物質を不溶性支持体として使用することができる
。主要な考慮は、抗動脈内脂肪沈積抗体または動脈内脂
肪沈積抗原の表面への結合、抗動脈内脂肪沈積抗体およ
び動脈内脂肪沈積抗原の接合反応の妨害の不存在、ある
いは接合反応の存在および程度を決定するために使用で
きる他の反応の妨害の不存在である。天然および合成の
、有機および無機のポリマーを不溶性支持体として使用
できる。適当なポリマーの例は、次の通りである：ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリ（４−
メチルブチレン）、ブチルゴム、シラスチック（ｓｉｌ
ａｓｔｉｃ）ポリマー、ポリエステル、ポリアミド、セ
ルロースおよびセルロースＭ導体（例えば、酢酸セルロ
ース、ニトロセルロースなど）、アクリレート、メタク
リレート、ビニルポリマー（例えば、ポリ酢酸ビニル、
ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニ
ルなど）、ポリスチレンおよびスチレングラフトコポリ
マー、レーヨン、ナイロン、ポリ醋酸ビニル、ポリホル
ムアルデヒドなど、不溶性支持体として使用できる他の
物質は、前述のポリマーのラテックス、シリカゲル、ケ
イ素のウェーファー、ガラス、紙、不溶性蛋白質、金属
、メタロイド、金属酸化物、磁性材料、半導電性材料。

セラミックなどであることができる。さらに、ゲルを形
成する物質、例えば、蛋白質１例えば、ゼラチン、リボ
多糖、ケイ酸塩、アガロース、ポリアクリルアミドまた
はいくつかの水相を形成するポリマー、例えば、デキス
トラン、ポリアルキレングリコール（２〜３個の炭素原
子をもつアルキレン）または界面活性剤１例えば、両親
媒性化合物、例えば、リン脂質、長鎖（１２〜２４個の
炭素原子）アルキルアンモニウム塩などが包含される。

本発明の好ましい診断支持体は、ポリスチレン、スチレ
ンコポリマー、例えば、スチレン−７クリロニトリルコ
ポリマー：またはポリオレフィン、例えば、ポリエチレ
ンまたはポリプロピレン、およびアクリレートおよびメ
タクリレートのポリマーおよびコポリマーを含む、抗動
脈内脂肪沈積試薬の抗体または動脈内脂肪沈積抗原は、
不溶性支持体に、吸若、静電結合、または他の非共有結
合により結合させることができ、あるいはそれは不溶性
支持体へ共有結合によって結合させることができる。こ
の手順のためにとくに有利な支持体は、複数のウェルを
有するマイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅ
ｒ　　ｐｌａｔｅ）からなる、ウェルの表面またはその
中のプラスチックカップのインサートは、抗原または抗
体の支持体を構成できる。決定が蛍光の測定を必要とす
る場合、マイクロタイタープレートまたはウェルのイン
サートは有利には光に対して不透明であり、こうしてウ
ェルに適用される励起の光が取囲むウェルの内容物に到
達したりあるいは影響を及ぼしたりしないようにする。

非共有結合のための手順は米国特許第４，５２８．２６
７号に記載されている。抗体および抗原を不溶性支持体
へ共有結合する手順は、チロウ◆チバタ（Ｉｃｈｉｒｏ
　　Ｃｈｉｂａｔａ）、固定化された酵素類（ＩＭＭＯ
ＢＩＬＩＺＥＤ　　ＥＮＺＹＭＥＳ）、　ハルステッド
・プレス（Ｈａｌｓｔ　ｅ　ｄ　　Ｐ　ｒ　ｅ　ｓ　ｓ
）　　ニー、−Ｅ−り（１９７８）およびＡ、クアトレ
カサス（ｃｕａｔｒｅｃ三ユ）、２４５：３０５９　（
１９７０）（それらの内容全体をここに引用によって加
える）に記載されている。米国特許第４，２１０，４１
８号に記載される手順に従い、例えば、カップリング剤
（ｃｏｕｐｌｉｎｇ　　ａｇｅｎｔ）としてグルタルア
ルデヒドを使用して、表面を蛋白質で被覆し、そして抗
体または抗原とカップリングすることができる。なお他
の手順において、遊離イソシアネート基を有する層、例
えば、ポリエーテルイソシアネートでウェルを被覆する
ことができ、そしてそれに水溶液中の抗体または抗原を
適用すると、必要な結合が行われる。なお他の手順にお
いて、抗体または抗原はヒドロキシル化物質に、米国特
許第３，７２０，７６０号に記載されているような臭化
シアンによりカップリングすることができる。

本発明の標識動脈内脂肪沈積抗原および抗動脈内脂肪沈
積抗体は、蛋白質へ標識を取り付けるための慣用の手順
により調製することができる。標識は、化学的または物
理的な結合によって、蛋白質試薬へ結合またはカップリ
ングすることができる０本発明の抗体および動脈内脂肪
沈積抗原へ接合できる配位子および基は、試験する試料
中の化合物および物質とそれらが結合する試薬とを区別
するために使用できる物理的または化学的特性を有する
元素、化合物または生物学的物質を包含する。一般原理
として、標識を抗体と連結するために適当な方法は、標
識を動脈内脂肪沈積抗原へ連結または結合するための等
しく適する。下の手順は標識を抗体に接合することによ
って説明するが、標識を動脈内脂肪沈積抗原に接合する
ためにそれらを使用することがまた意図される。

放射線標識した動脈内脂肪沈積抗原および抗動脈内脂肪
沈積抗体は、生体外診断試験に使用することができる。

標識した抗体の比活性は、放射性標識の半減期、同位体
の純度、および標識を抗原または抗体に組込む方法に依
存する０表Ａは、いくつかの普通に使用される同位体、
それらの比活性および半減期を記載する。イムノアッセ
イ試験において、比活性が高くなればなるほど、一般に
、感度はよりすぐれる。

人Ａ 純粋な同位体の非 同位体　　　活性（キューリー　　半減期−□　乙シリ
− ＋４ｃ　　　　　６．２５Ｘ１０１　５７２０年３　Ｈ
２，９１Ｘ１０４　１２．５年 ３５Ｓ　　　　１．５　　Ｘ１０６　８７日１２５１　
　　２．１８Ｘ１０６　６０８３２Ｐ　　　　　３．１
６Ｘ１０６　１４．３日１３１　Ｉ　　　　１．６２Ｘ
１０７　　８．１日蛋白質の抗原および抗体を表Ａに記
載する放射性同位体で標識する手順は、一般にこの分野
において知られている。トリチウム標識法は、例えば、
米国特許第４，３０２，４３８号に記載されている。こ
とに抗体に適合するヨウ素化、トリチウム標識法および
３ＳＳ標識法は、ゴーディング（Ｇｏｄｉ　ｎｇ）、Ｊ
、Ｗ、モノクローナル抗体：ｊ；ｊ理およびプラ’）テ
４　ス（ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　　ＡＮＴＩＢＯＤＹ：
ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳＡＮＤ　　ＰＲＡＣＴＩ　ＣＥ）
、ニューヨーク：アカデミツク・プレス、１２４−１２
６ページ（１９８３）およびその中に引用されている文
献に記載されている。抗体をヨウ素化するための他の方
法は１次の文献に記載されている：ハナター（Ｈｕｎｔ
ｅｒ）およびグリーンウッド（Ｇ　ｒ　ｅｅｎｗｏｏｄ
）、ネイチ−？　−（Ｎａ　ｔ　ｕ　ｒ　ｅ）、１４４
：９４５　（１９６２）およびディピッド（Ｄａｖｉｄ
）ら、バイオケミストリー（Ｂｉ。

ｃｈｅｍｓｔｒｙ）、１３：１０１４−１０２１（１９
７４）、米国特許第３，８６７．５１７号および米国特
許第４，３７６．１１０号。

放射＆１！５識した抗体は、また、像形成および潜在的
に放射線療法に使用することができる。像形成において
有用な放射線標識元素は、例えば、１２３Ｉ、１３１１
．１１１１ｎおよび９９ＴＣを包含する。抗体をヨウ素
化する方法は、次の文献に記載されいるニゲリーンウッ
ド（Ｇ　ｒ　ｅ　ｅ　ｎｗｏｏｄ）、Ｆ、ら、「高い非
活性（７）１３１　Ｉ標識ヒト成長ホルモンの調製」、
バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｊ
、）、８９：１１４−１２３　（１９６３）；マーチャ
ロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ）、Ｊ、ｒ免疫グロブ
リンおよび他の蛋白質の微量ヨウ素化のための酵素的方
法」、バイオケミカル・ジャーナル（且１ｏｃｈｅｍ、
　　Ｊ、）、１１３：２９９−３０５（１９６９）；％
リソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、Ｍ、ら、「免疫化学的研
究におけるラクトペルオキシダーゼ触媒ヨウ素化の使用
Ｊ　、　免疫化工（工ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
、８：２８９−２９７（１９７１）、９９　　Ｔｃ標識
法は、次の文献に記載されている：ローデス（Ｒｈｏｄ
ｅｓ）Ｂ、ら　ｒ９９Ｔｃ標識および放射ｍ標識した抗
体および抗体断片の許容試験」、腫瘍の像形成：癌の放
射線免疫化学的検出（ＴＵＭＯＲＩＭＡＧＩＮＧ：ＴＨ
Ｅ　　　ＲＡＤＩＯＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　　
　ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ　　　０ＦＣＡＮＣＥＲ）、バー
チエル（Ｂｕｒｃｈｉｅｌ）、Ｓ、ら編、ニューヨーク
：マラソンＢ　（Ｍａ　ｓ　ｓ　ｏ　ｎ）、１１１−１
２３　（１９８２）、およびその中に引用されている文
献、抗体を１１１１ｎするために適当な方法は１次の文
献に記載されている：フナトウィッチ（Ｈｎａｔｏｗｉ
ｃｅｔｈｏｄｓ）、６５：１４７−１５７　（１９８３
）；フナトウイー／子（Ｈｎａｔ　ｏｗｉ　Ｃｈ）、Ｄ
、Ｊ、ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２０：６
１３−６１５　（１９８３）およびバックレイ（Ｂｕｃ
ｋｌｅｙ）、Ｒ，Ｇ、ら、Ｆ、Ｅ。

Ｂ、Ｓ、、１６６　：　２０２−２０４　（１９８４）
。

適当な系、カップリング手順およびそれと基質との反応
は、例えば、米国再発行３１，００６号、Ｂｌ＼３，６
５４，０９０号、４，２１４゜０４８号、４．２８９．
７４７号、４，３０３゜４３８号、４　、３１２　、９
４３号、４，２１４゜１１０号およびそれらの中に引用
された文献に記載されている。他の適当な系は、ペセ（
Ｐｅｓｃｅ）ら、クリニカル・ケミストリー（ｃＩ　ｉ
　ｎ　。

Ｃｈｅｍ、）、２０　（３）：３５３−３５９（１９７
４）およびウィズダム（Ｗｉｓｄ。

ｍ）、Ｇ、クリニカルφケミストリー（見±ユｎ、　　
Ｃｈｅｍ、）、２２：１２４３（１９７６）に記載され
ている。

適当な実施例のクラスのリストおよび各クラスの特定の
例は、次の通りである： 人工 り之ｌ　　　　　　　　酵素の例 ヒドロラーゼ類　カル　アミラーゼ類 ポヒドラーゼ類 ヌクレアーゼ類　　　　ポリヌクレオチダーゼアミダー
ゼ類　　　　　アルギナーゼ プリンデアミナーゼ類　アデナーゼ ペプチダーゼ類　　　　アミノポリペプチダーゼプロイ
テナーゼ類　　　ペプシン エステラーゼ類　　　　リパーゼ類 鉄酵素類　　　　　　　カタラーゼ 銅酵素類　　　　　　　チロシナーゼ類補酵素含有酵素
類　　　アルコールデヒドロゲナーゼ チトクローム還元性酵　コノ＼り酸デヒドロゲナーゼ類
　　　　　　　　　ゼ 黄色酵素類　　　　　　ジアホラーゼ ムターゼ類　　　　　　グリオキシラーゼデモラーゼ類
　　　　　アルドラーゼ オキシダーゼ類　　　　グルコースオキシダーゼセイヨ
ウワサビペルオキ シダーゼ 他ノ酵素類　　　　　　ベーターガラクトシダーホスフ
ァターゼ類 ホスホリラーゼ類 へキンキナーゼ類 適当な酵素類のリストは、ホーク（Ｈａｗｋ）ら、実際
生理化学（ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　　ＰＨＹＳＩＯＬＯＧ
ＩＣＡＬ　　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）、ニューヨーク、マ
クグロー−ヒル、３０６−３９７ページ（１９５４）に
記載されている。

蛍光発生酵素類（前記酵素類の存在下に、選択した基質
は蛍光生成物を生成するであろう）は。

有用な標識部分である。抗体の抗原との結合能力を損傷
しないで酵素を抗体に選択的に接合する方法は、この分
野においてよく知られている。適当な酵素類およびそれ
らを抗体類に接合する適当な手順は、例えば１次の文献
に記載されている：イチロー・チバタ（Ｉｃｈｉｒｏ　
　Ｃｈｉｂａｔａ）、ん固定化酵素（ＩＭＭＯＢＩＬＩ
ＺＥＤＥＮＺＹＭＥＳ）（ｓｕｐ　ｒ　ａ）、Ａ　、ク
アトレカサス（ｃｕａｔ　ｒｅｃａｓａｓ）、ジャーナ
ル・オブΦバイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏ１、　　Ｃｈｅｍ、）（ｓｕｐｒａ）、　　ウィ
ルソン（Ｗｉ　１ｓｏｎ）、Ｍ、ら、セイヨウワサビペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）を抗体に接合する過ヨウ素
酸塩法における最近の発展、免疫蛍光および関連する若
色技術における国際会議（ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ
　　Ｃ０ＮＦＥＲＥＮＣＥＩＮ　　ＩＭＭＵＮＯＦＬＵ
ＯＲＥＳＣＥＮＣＥＡＮＤ　　ＲＥＬＡＴＥＤ　　５Ｔ
ＡＩＮＩＮＧＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ）、Ｗ、ナツプ（Ｋ
　ｎ　ａ　ｐｐ）ら編、アムステルダム：エルセヴイー
ア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、２１５−２４４ページ（１９
７８）、スリパン（Ｓｕ　ｌ　ｌ　ｉ　ｖａｎ）　、　
Ｍ。

ら、酵素のイムノアッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｉｎｍｕ
ｎｏａｓｓａｙ）：リビュー、アナルス・オｓｔ　ｒｙ
）、１６：２２１−２４０　（１９７９）、ニグレン（
Ｎｙｇｒｅｎ）、Ｈ，ら、メディカル・バイオロジー（
Ｍｅｄｉｃａｌ　　Ｂｉｏ　ｌ　ｏｇｙ）、５７　：１
８７−１９１　（１９７９）、ガドカリ（Ｇａｄｋａｒ
ｉ）、Ｄ、ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ）、１０：２１５−２２
４（１９８５）、チジセｙ（Ｔｉ　ｊｓｓｅｎ）、Ｐ、
ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ１、
　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１３６：４５１−４５７　（
１９８４）、　　ツルタ（Ｔｕｒｕｔａ）、３３　（８
）７６７−７７７　（１９８５）、および米国特許第４
，１９０，４９６号（上に列挙した文献の内容全体をこ
こに引用によって加える）。

好ましい蛍光発生酵素類およびそれらに対応する適当な
基質類は、次のものを包含する：セイヨウワサビペルオ
キシダーゼ、これに対して適当な基質はホモバニリン酸
または４−ヒドロキシ−３−メトキシ−フェニル酢酸で
ある、ベーターガラクトシダーゼ、これに対して適当な
基質は４−メチルウンベリフェリルベーターＤ−ガラク
トシダーゼである、アルカリ性ホスファターゼ、これに
対して適当な基質は４−メチルウンベリフェリルホスフ
ェートおよび他のウンベリフェリルホスフェート、例え
ば、４−カルボキシウンベリフェリルホスフェートおよ
びウンベリフェリルホスフェート、例えば、４−カルボ
キシアルキル−エステルなどである。

抗体を酵素で標識するために適当な手順の例は、カーポ
ジイミド類、ジアルデヒド類、および二官能性カップリ
ング試薬の使用を包含する。アミド基を通す酵素類の連
結は、蛋白質を塩化チオニル、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドまたは同様な試薬で無水溶媒、例えば、ジメチル
ホルムアミド、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テ
トラヒドロフランなどの中で処理することによって達成
できる。別のカップリング試薬は、カーポジイミド類、
例えば、１−エチル−３−（３−Ｎ。

Ｎｏ−ジメチルアミノプロピル）カーポジイミドまたは
１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カ
ーポジイミドメチル−ｐ−１ルエンスルホネートを包含
する。

酵素の炭水化物の部分は、また、アルデヒドに酸化し、
そして免疫グロブリンのりシルアミノ基と反応させてシ
ッフ塩基を形成することができる。ホウ水素化ナトリウ
ムを使用する還元は、酵素と抗体とを安定に連結する。

セイヨウワサビペルオキシダーゼおよび抗体は、上のウ
ィルソン（Ｗｉ　１　ｓ　ｏ　ｎ）の方法によって免疫
グロブリンに効率的に連結することができる。

蛍光標識した抗体は、この分野において既知の標準蛍光
性部分から調製できる。抗体および他の蛋白質は波長が
約３１０ｎｍまでの光を吸収するので、蛍光性部分は３
１０ｎｍより長い波長、好ましくは４００ｎｍより長い
波長の光を実質的に吸収するように選択すべきである０
種々の蛍光体は、スチリアー（Ｓｔｒｙｅｒ）、サイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１６２：５２６　（１９６８
）およびブランド（Ｂｒａｎｄ）、Ｌ、ら、「構造のた
めの蛍光性プローブ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　　ｐｒ
ｏｂｅｓ　　ｆｏｒ　　５ｔｒｕｃｔｏｆ　　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）、４１：８４３−８６８　（１９７
２）に記載されている。抗体は、例えば、米国特許第３
，９４０，４７５号、米国特許第４．２８９．７４７号
および米国特許第４，３７６．１１０号に記載されてい
るような普通の手順によって、蛍光性基で標識すること
ができる。

ある数の前述の望ましい性質を有する蛍光体の１つの群
はキサンチン色素類であり、これらは３．６−シヒドロ
キシー９−フェニルキサントヒトロールから誘導された
フルオレセイン類、および３，６−ジアミツー９−フェ
ニルキサントヒトロールおよびリスアミンローダミンか
ら誘導体されたレスアミン類およびローダミン類を包含
する。ローダミンおよび９−０−カルボキシフェニルキ
サントヒトロールのフルオレセイン誘導体は、９−ｏ−
カルボキシフェニル基を有する０反応性カップリング基
、例えば、アミン基およびイソチオシアネ」ト基を有す
るフルオレセイン化合物は、例えば、フルオレセインイ
ンチオシアネートおよびフルオレスカミンは容易に入手
可能である。

蛍光性化合物の他の群は、アミン基をアルファまたはベ
ータの位置に有するナフチルアミン類である。ナフチル
アミノ化合物には、ｌ−ジメチルアミノナフチル−５−
スルホネート、１−７ニリノー８−ナフタレンスルホネ
ートおよび２−ｐ−トルイソルー６−ナフタレンスルホ
ネートが包含される、他の色素には、次のものが包含さ
れる＝３−フェニル−７−イソシアナトクマリン；アク
リジン類、例えば、９−イソチオシアナトアクリジンお
よびアクリジンオレンジ；Ｎ−［ｐ−（２−ペンゾキサ
ゾリル）フェニルコマレイミド；ベンゾキサジオゾール
類、例えば、４−クロロ−７−二トロベンゾー２−オキ
サ−１，３−ジアゾールおよび７−（ｐ−メトキシベン
ジルアミノ）−４−二トロベンゾ−２−オキサ−１、３
−ジアゾール；スチルベン類、例えば、４−ジメチルア
ミノ−４°−インチオシアナトスチルベンおよび４−ジ
メチルアミノ−４′−マレイミドスチルベン；Ｎ、Ｎ’
−ジオクタデシクロキサカルボキシアミン−ｐ−）ルエ
ンスルホネート；ピレン類、例えば、８−ヒドロキシ−
１，３，６−ピレントリスルホン醸、１−ピレン醋酸、
メロシアニン５４０、ローズベンガル、２，４−ジフェ
ニル−３（Ｈ）−フラノン、０−フタルデヒド、ならび
に他の容易に入手できる蛍光性分子、これらの色素は活
性官能性を有するか、あるいはこのような官能性は容易
に導入することができる。

例えば、抗体は、ゴーディング（Ｇｏｄｆｎｇ）、Ｊ、
、モノクローナル抗体：ＩＸ理および実際（ＭＯＮＯＣ
ＬＯＮＡＬ　　ＡＮＴＩＢＯＤＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥ
Ｓ　　ＡＮＤ　　ＰＲＡＣＴＩＣＥ）、ニューヨーク、
アカデミツク・プレス、２０８−２４９ページ（１９８
３）に記載されている手順によって、フルオロクローム
類で標識することができる。フルオロクロームの濃度は
ゴーディング（Ｇｏｄｉ　ｎｇ）、２２９ページの表に
従って選択される０例えば、ＤＭＳＯ中のフルオレセイ
ンイソシアネート（１，ｏｍｇ／ｍｌ）またはローダミ
ンイソシアネート（１０、ｏｍｇ／ｍｌ）を調製し、そ
して所望容量（合計の蛋白質溶液の容量の１〜１０％）
を、攪拌しながら、調製溶液に滴々添加する。この反応
は、光を遮断して、２時間進行させる。生成物は、０．
１％のＮａ　Ｎ　Ｏ３を含有するＰＢＳ中のセファセッ
クス（Ｓｅｐｈｄｅｘ）Ｇ−２５ゲルを使用するゲル濾
過によって精製して、未反応または加水分解したフルオ
ロクロームを除去する。接合体の吸収を２８０ｎｍおよ
び可視領域におけるそのピーク（フルオレセイン化抗体
について４９５ｎｍおよびローダミン化抗体について５
５０ｎｍ）において測定する。フルオロクローム対蛋白
質の比を、上のゴーディング（Ｇｏ　ｄ　ｉ　ｎｇ）　
、　２２４−２２５ページの手順に従って計算する。接
合体は。

使用するまで光から保護して、４℃において貯蔵する。

抗体溶液の濃度が１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１より低い場合
、ＢＳＡをこの決定にｌ　ｍ　ｇ　／　ｍ　１の最終濃
度に添加する。

本発明の抗体は１本発明の１つの実施態様において、ア
ビジンまたはビオチンに共有結合することができる。適
当な結合手順は、二官能性架橋剤を通す架橋を包含する
。適当な二官能性化合物は、ペーターズ（ＰｅｔｅｒＳ
）、に、ら、Δユｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉ　ｏｃｈｉｍ、４６
　：　５２３　（１９７７）に記載されている。アルキ
ルイミデート類は、蛋白質によりそれらに対して提供さ
れた官能性基にうちで高度の特異性を示す、この反応は
第一アミノ基に対して特異的である。適当なカップリン
グの例は１次のものを包含するニア１ミドエステル類１
例えば、ジメチルマロンイミデート、アジド類、例えば
、イミノ基と容易に反応してアミド結合を形成するター
ドリルジアジドの７シルアジド、アリールシバライド、
例えば、１．５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼ
ン、または４．４゛−ジフルオロ−３，３゛−ジニトロ
フェニルスルホン、グルタルアルデヒド、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カーポジイミドｋ
Ｍ酸塩、シマレイニド、混合無水物、ｍ−マレアミドベ
ンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、およ
び他の既知の架橋剤。

上の試薬は本質的に不可逆の結合を提供する。

官能基をもつ二官能性試薬１例えば、ジサルファイドま
たはグリコールを使用できる。これらは、必要に応じて
、架橋反応後破壊できる結合を提供する。このような試
薬の例は、次の通りであるニジメチル３．３゛−ジチオ
ビスプロピオンイミデート、スクシニミジルプロピオン
イミデート、Ｎ−（３−フルオロ−４，６−シニトロフ
エこル）−シスタミン、タードリルジアジド、タートリ
ルジ（グリシルアジド）およびタートリルジ（ニブシロ
ン−７ミノカプロイルアジド）。

他の場合において、結合は試薬それら自体の間で直接形
成することができる０例えば、抗体はぞれぞれの物質上
の官能基を通してビオチンへ結合することができる。４
Ｓ定の例として、ビオチンを過ヨウ素酸塩で処理し、そ
して抗体と反応させて、ビオチンの７ビジンへの結合を
阻害しないで、あるいは抗体の免疫学的活性を遮断しな
いで、シッフ塩基を得ることができる。

二官癒性架橋剤を使用する既知の技術は１次のものを包
合する（ａ）１工程のグルタルアルデヒドの結合、アブ
ラメアス（Ａｖｒａｍｅａｓ）。

Ｓ　、、ｆ　（■ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ　ｓｔ　ｒヱ）
、６　：　４３　（１９６９）；　　（ｂ）２工程の“
グルタルアルデヒドの結合、アブラメアス（Ａｖｒａｍ
ｅａｓ）、Ｓ、、免疫化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）、８：１１７’５　（１９７１）；および（ｃ
）シマレイミドの結合、カド（Ｋａｔｏ）、に、ら、玉
ユ上ヱズコ２ゴとＬユ九とニオブ・バイオケミストリー
（Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）６２：２８
５　（１９６６）。

抗体は、フナトウィッチ（Ｈｎａｔ　ｏｗｉ　ｃｈ）、
Ｄ、ら、ジャーナル・オブ・アプライド・５５４−５５
７　（１９８４）およびブックレイ（Ｂｕｃｋｌｅｙ）
、Ｒ，ら、フェダレイションΦオブ・ユーロピアン・バ
イオケミカル・ソサイアティーズ（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏ
ｎ　　ｏｆ　　Ｅｕｒｏｐｉａｎ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ）、１６６　（１）２０
２−２０４（１９８４年１月）に従う手順に従って、金
属の放射状で標識することができる。この手順において
、抗体は、金属放射状とキレートを形成できるキレート
剤、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸と接合さ
れる。ＤＴＰＡ　（ジエチレントリアミンペンタ酢酸）
の二環式無水物の０．１ｍｇ／ｍｌの懸濁液を、乾燥溶
媒、例えば、クロロホルム、エーテルまたは乾ｉＤＭｓ
ｏ中で調製する。アリコートをＤＴＰＡ対免疫グロブリ
ンのモル比を１：１とするために十分な量で取り出して
清浄な乾燥した管へ入れ、そして窒素の下に蒸発させる
。生理的食塩水中の０．０５モルの重炭醸塩の緩衝液、
ｐＨ７，０−７，５、中の使用する抗体溶液の１０〜２
０マイクロタイターの部分を乾燥ＤＴＰＡに添加し、そ
して内容物を同一緩衝液で０．２ｍｌに希釈し、そして
セファデックスＧ−２５ゲルの５ｃｍのゲル濾過カラム
で精製し、生理的食塩水で溶離する。カップリングの効
率は、０．０５モル酢酸塩緩衝液、ｐＨ６，０、中の「
キレート等級」のｔｔ＋１ｎの添加によって、精製前に
決定する。カップリング効率の計算のために、薄層クロ
マトグラフィーを使用して、ＤＴＰＡカップリングした
抗体を分離する。ＤＴＰＡカップリングした抗体を、金
属放射性核、例えば、１１１　Ｉｎ”　３　、２１２３
３　ｉ今３および６１Ｑａ＋３との結合に必要になるま
で４℃で貯蔵する。

本発明の好ましいサンドイッチアッセイ法において、抗
動脈内脂肪沈積抗体を付着する不溶性支持体を患者の血
清と十分な時間接触させて、抗動脈内脂肪沈積抗体を血
清中の抗原または抗原含有免疫複合体と接合させ、次い
で患者の血清を支持体から除去する。インキュベーショ
ン時間は実質的な接合を起こさせるために十分であるべ
きであり、この時間は温度に依存する。適当なインキュ
ベーション時間は１６〜４０℃の範囲内お温度において
２０〜２４０分であり、好ましい接触時間は２０〜２６
℃の範囲内の温度において少なくとも６０分である。

次いで、残留する血清をから洗浄溶液の使用により除去
する。普通の洗浄溶液を使用できる。好ましい洗浄溶液
は米国特許第４，５２８，２６７号に記載されている。

それは０．０００１〜０゜０５のモル濃度、ｐＨ６〜Ｂ
を有し、そして０゜ＯＯ１〜０．１重量％の非イオン性
界面活性剤を含有する水性リンＳ塩緩衝液である。適当
な非イオン性界面活性剤は、次のものを包含する：ポリ
オキシエチレンエーテル（ＢＴＩＪ）、例えば、ラウリ
ル、セチル、オレイル、ステアリル、およびトリデシル
ポリオキシエチレンエーテル；ポリオキシエチレンソル
ビタン（ＴＷＥＥＮ）、例えば、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノラウレート、モノパルミテート、モノステ
アレート、モノオレエート、およびトリオレエート；お
よび他のポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＴＲＩ
ＴＯＮ）、好ましい非イオン性界面活性剤は、４０のエ
チレンオキシド単位を宥するオクチルフェノキシポリエ
トキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ　　Ｘ−４０５、ロー
ム−アンド・ハース・カンパニー）である。

次いで、不溶性支持体を標識した抗体と接触させ、この
標識した抗体は不溶性支持体に接合した抗体と結合する
であろう。

種々の標識を前述した。明瞭を目的として、この方法の
引続く工程を、酵素、好ましくは蛍光発生酵素で標識さ
れた抗動脈内脂肪沈積抗体について説明するが、これは
限定を意味するものではない、用語「蛍光発生酵素」は
、ここおいては、適当な基質と蛍光団生成物を生成する
であろう酵素を意味する。

酵素標識した抗動脈内脂肪沈精抗体を、水溶液中で不溶
性支持体に適用する。この溶液は、好ましくは、反応成
分を保存しかつ接合反応を促進するために、適当な塩類
および緩衝剤類を含有する０例えば、この溶液は、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、　リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ
）、および前述の洗浄溶液中に使用した穏和な界面活性
剤。

例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエーテルを含有
することができる。インキュベーションは十分な時間続
けて、標識した抗動脈内脂肪沈積抗体を、存在する場合
、不溶性支持体に付着する免疫グロブリンと接合させる
。好ましいインキュベーションの時間および温度は、不
溶性支持体に結合した動脈内脂肪沈桔試薬との血清の抗
動脈内脂肪沈積抗体との接合について記載した通りであ
る。

次いで、標識した抗動脈内脂肋沈精抗体の溶液を不溶性
支持体から除去し、そして支持体を洗浄溶液、例えば、
前述の溶液で洗浄して、残留するかも知れない接合しな
い標識した物質を除去する。

本発明のサンドイツチ法の第３工程において、不溶性支
持体を基質の水溶液と接触させ、この基質は酵素の存在
下に反応して蛍光化合物を溶液中に放出する。転化され
うる適当な基質および酵素は、例えば、米国特許第４，
１９０，４９６号および米国特許第４，５２８，２６７
号に記載されている。支持体は、１Ｏ−２〜ＩＱ−１０
モル濃度の基質を含有する水溶液と接触させる。

１Ｏ−４〜１０−５モル濃度の基質は好ましい。

基質の溶液中の好ましい追加の試薬および緩衝剤は、例
えば、２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール緩衝
剤および塩化マグネシウムである。

この基質の溶液を不溶性支持体と一緒に十分な時間イン
キュベーションして、蛍光団を発生する反応を起こさせ
る。１８〜４０℃の温度において、５〜２４０時間のイ
ンキュベーション時間を使用できる。好ましくは、温度
は２０〜２６℃の範囲内であり、そしてインキュベーシ
ョン時間は３０〜９０分である。

次いで、溶液中の蛍光のレベルを測定する。基質溶液中
の蛍光のレベルを決定する装置および手順は、この分野
において普通に使用されているものである、蛍光のレベ
ルは不溶性支持体上の酵素の濃度の関数であり、そして
酵素の濃度は血清試料中の動脈内脂肪沈積抗原または動
脈内脂肪沈積抗原免疫複合体の量の関数である。アテロ
ーム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原の濃度は、溶
液の蛍光のレベルを、既知濃度の動脈内脂肪沈積抗原を
含有する対照溶液で得られた蛍光のレベルと比較するこ
とによって決定することができる。

本発明の他の実施態様において、血清試料中のアテロー
ム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原のレベルは競合
イムノアッセイにより得られる。

本発明の１つの実施態様において、既知の濃度の動脈内
脂肪沈積抗原を有する不溶性支持体を使用する。血清試
料と既知濃度の標識した抗動脈内脂肪沈積試薬の抗体と
の混合物を不溶性支持体に十分な時間適用して、抗動脈
内脂肪沈積抗体を動脈内脂肪沈積抗原と接合させる。抗
動脈内脂肪沈積抗体と動脈内脂肪沈積との接合について
前述の時間および温度は適当である。不溶性支持体から
残留血清溶液を除去しかつ洗浄した後、不溶性支持体上
または血清混合物中に残留する標識を決定することがで
きる。標識が蛍光発生酵素である場合、不溶性支持体上
の標識の量は、不溶性支持体を適当な基質溶液と接触さ
せ、溶液中に蛍光団を発生させる反応を起こさせ、そし
てサンドイッチイムノアッセイの実施態様に関して前述
したように、蛍光のレベルを測定することによって決定
することができる。

競合イムノアッセイの他の実施態様において、不溶性支
持体はそれに付着した抗動脈内脂肪沈積抗体を有する０
次いで、血清試料と標識した動脈内脂肪沈積抗原との混
合物を不溶性支持体とともに十分な時間インキュベーシ
ョンして、抗動脈内脂肪沈積抗体を動脈内脂肪沈積抗原
と接合させる０次いで、不溶性支持体上の標識または血
清溶液中に残留する標識の量を決定する。標識が蛍光発
生酵素である場合、不溶性支持体上の標識の量は、不溶
性支持体を適当な基質溶液と接触させ、溶液中に蛍光団
を発生させる反応を起こさせ、そしてサンドイッチイム
ノアッセイの実施態様に関して前述したように、蛍光の
レベルを測定することによって決定することができる。

本発明を以下の特定であるが、非限定的実施例によって
さらに説明する。特記しないかぎり、反応はセ氏であり
、そして百分率は重量による。実施するために構成的に
縮小した実施例は現在の意味で記載されており、そして
前もって実施するために縮小した実験室の実験を表わす
実施例は過去の意味で記載されている。

動脈内膜（動脈内脂肪沈積）を内側層から切除し、そし
て０．９Ｎの生理的食塩水で簡単に洗浄する。動脈内脂
肪沈積を小さい片（２Ｘ２ｍｍ）に切り、そしてこの組
織を０．１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７，２、中で高速度で
４℃において３０〜６０秒間均質化した。このホモジネ
ートを４℃において３０分間遠心（２００ｏｘｇ）する
、上澄みを取っておく、均質化および遠心の工程を反復
し、上澄みをプールする。制菌量のアジ化ナトリウムを
プールした上澄みに添加し、そして上澄みを４℃で貯蔵
する。

凍結乾燥したＣＮＢｒ−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏ
ｓｅ）４Ｂ粉末［ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）
］を１ミルモルのＨＣＩ中テ１５分間膨潤させる。この
ゲルを、焼結ガラスフィルター（多孔度Ｇ−３）上にお
いて、ゲルの１ｇ（乾燥重量）につき合計２００ｍ１の
１ミリモルの）ＩＣＩで洗浄する。これはいくつかのア
リコードで実施し、上澄みを連続添加の間に吸引する。

ゲルの１ｍｌにつき５ｍｇのカップリングすべき蛋白質
を、カップリング緩衝液（０，１モルのＮａＨＣＯ３、
ｐＨ８，３，０，５モルｃ７）　Ｎ　ａ　Ｃ１を含有す
る）中に溶解する。゛ゲルをカップリング緩衝液で洗浄
し、過剰量を吸引により除去し、そして蛋白質溶液をゲ
ルと混合物する。この混合物を攪拌しないで４℃で一夜
放置する０次いで、ゲルを１モルのエタノールアミンを
含有するブロッキング緩衝液、ｐＨ８，０、中に室温に
おいて２時間配置する０次いで、ゲルをカップリング緩
衝液（０，１モルの酢酸塩緩衝液、ｐＨ４。

Ｏｌｏ、５モルのＮａＣ１を含有する）で洗浄し、そし
てカップリング緩衝液で２回洗浄する。

ここで蛋白質−セファローズ接合体は使用できる状態に
あり、そして４〜８℃において貯蔵することができる。

制菌剤として臭化シアンを緩衝液に添加することができ
る。

火施猶１ 動脈内脂肪抗精上澄みからのＩｇＧ抗体の吸看 合計的１２９ｍｇの抗ＩｇＧ抗体を含有する、実施例２
の手順に従い調製した抗ＩｇＧ抗体に接合したセファロ
ーズゲルの２５ｍ１をカラムに充填する。このカラムを
２〜３容量の緩衝液（０゜１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７，
２）と平衡化し、次いで試料をこのカラムの適用する。

溶離緩衝液（０，１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７゜２）の流
速は２５ｍ１／時間である。抗体を含有する溶離した分
画を、ピーク活性が消失するまで集める。

次いで、このカラムを１０×容量の０．１５モルのＰＢ
Ｓ、ｐＨ７，２、で洗浄する。

次いで、カラムを蒸留水で洗浄して、免疫親和結合した
ＩｇＧ抗体を脱着する。カラムを追加の蒸留水で１５〜
２０　ｍ　ｌ　７時間の速度で溶離し、溶離した試料を
集め、そしてピークの分画を保持する。ピークの分画を
０．１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７，２、に対して４℃にお
いて、多数回緩衝液を交換しながら、２４〜３６時間透
析する。

Ｘ施±１ 着 実施例２の手順に従って調製した抗ＩｇＡ抗体に接合し
たセファローズゲルの７．５ｍｌを充填しだカラムを使
用して、実施例３の手順を反復する。溶１ＳＰＢＳＷ衝
液の流速は１５〜２０ｍ１／時間である。

置 実施例２の手順に従って調製した抗ＩｇＡ抗体に接合し
たセファローズゲルの７．５ｍｌをを充填したカラムを
使用して、実施例３の手順を反復する。溶＠ＰＢＳ緩衝
液の流速は１５〜２０ｍ１／時間である。

実施例６ 動脈内脂肪沈植上澄みからのＩｇＧ抗体の吸着 実施例２の手順に従って調製した抗ＩｇＡ抗体に接合し
たセファローズゲルの７．５ｍｌをを充填したカラムを
使用して、実施例３の手順を反復する。溶＃ＰＢＳｉ衝
液の流速は１５〜２０ｍ１／時間である。

実施例７ 動脈内脂肪沈積抗原の精製 実施例３の手順に従って得られた動脈内脂肪沈積に特異
的に結合するＩｇＧ抗体を、実施例２の手順に従ってセ
ファローズに結合して、動脈内脂肪沈積抗原に対して特
異的に結合する親和カラムのゲルを形成する。

抗動脈内脂肪沈ｉＩ　ｇＧ抗体に接合したセファローズ
ゲルの２５ｍ１をカラムに充填する。このカラムを２〜
３容量の緩衝液（０，１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７，２）
と平衡化し、そして実施例１に従って得られた動脈内脂
肪沈積溶液をこのカラムに適用する０次いで、この方ラ
ムをＩＯＸ容量ＰＢＳ、ＰＨ７，２、で洗浄する。

溶＃緩衝液（０，１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７゜２）の流
速は１５〜２０ｍ１／時間である。動脈内脂肪沈積を含
有する溶離した分画を、ピーク活性が消失するまで、集
めて動脈内脂肪沈積を得て、これに抗動脈内脂助沈積Ｉ
ｇＧ抗体は特異的に結合する。

次いで、カラムを１０×容量のＰＢＳ、ｐＨ７，２，で
洗浄する。

それぞれ、実施例４〜６の手順に従って得られた抗動脈
内脂肪沈ｉＩ　ｇＡ抗体、抗動脈内脂肪沈［ＩｇＥ抗体
および抗動脈内脂肪沈積ＩｇＭ抗体を抗動脈内脂肋沈ｉ
Ｉ　ｇＧ抗体の代わりに使用して、上の手順を反復して
、抗体が特異的に結合する対応する動脈内脂肪沈積の分
画を得る。

実施例７の手順に従って調製したアテローム性動脈硬化
症の動脈内脂肪沈積の抗原に対するポリクローナル抗血
清を、文献、例えば、ストラ−（Ｓｔｏｌｌａｒ）、酵
素学の方法（Ｍｅｔｈ。

ｄｓ　　Ｅｎｚｙｍｏ１、）、７０ニア０（１９８０）
に記載されている免疫技術およびスケジュールを用いて
ウサギにおいて誘発する。この抗血清を、例えば、ラン
グ（ａ　ａ　ｎ　ｇ　ｅ）ら、クリ二カ２５　：１９１
　　（１９７６）およびビセトスキ−（Ｐｉｓｅｔｓｋ
ｙ）ら、ジャーナル拳オブ・イムノロジカル寺メンッズ
（Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎ。

１、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、４１：１８７（１９８１）
に記載されているようにして、モノクローナル抗体につ
いて使用するものに類似する固相アッセイにおいてスク
リーニングする。初期のスクリーニングの基準は、アテ
ローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原への結合で
あろう。

実施例７の手順に従って調製し、精製したアテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原を使用して、この動
脈内脂肪沈桔抗原に対する七ツクローナル抗体を、ガル
フレ（Ｇａｌｆｒｅ）およびミルスティン（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ）、酵素学の立法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚｙ
ｍｏ１、）、７３：１（１９８１）の標準手順に従って
得る。このモノクローナル抗体を、文献、例えば、ラン
グ（ａ　ａ　ｎ　ｇ　ｅ）ら、クリニカルーアンドーイ
クスペリメンタル―イムノロジー（ｃＩｉｎ、　　Ｅｘ
、　　Ｉｍｍｕｎｏ１、）、２５：１９１（１９７６）
およびビセトスキー（Ｐｆｓｅｔｓｋ互）、４１　：１
８７　（１９８１）に記載されている技術の修正に従い
スクリーニングする。血清動脈内脂肪沈積抗原（または
その免疫複合体）のアッセイのために有用であるために
は、モノクローナル抗体は高い親和性（好ましくは、Ｋ
Ｉ９１　Ｇ　／Ｍ）をもって動脈内脂肪沈積抗原に結合
すべきである。

マウスのモノクローナル抗体を２工程の手順で精製する
。純粋な腹水を、１０ミリモルのトリス−ＨＣ１、０．
１５モルのＮａＣ１、ｐＨ８。

０、で平衡化したアフィーゲル（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ）樹
脂（バイオ−ラド争ラボラトリーズ、カリフォルニア州
すッチモンド）のカラムに適用し、そして同一緩衝液液
で溶離する。この工程はアルブミンを除去し、このアル
ブミンはカラム上に保持される。精製の最終工程はデア
ニーセファ０−ス（ファーマシアーファイン壷ケミカル
ス、ニュージャーシイ州ビス力タウェイ）への適用およ
びｌＯミリモルのトリス−ＭＣＩ、ｐＨ８。

０、から１０ミリモルのトリス−ＭＣ１，１００ミリモ
ルのＮａＣＩの直線勾配による溶離である。これにより
、血清蛋白質、例えば、アルブミンおよびトランスフェ
リンに汚染されていない精製されたマウスのモノクロー
ナル抗体が得られ実施例９ 抗体を被覆したマイクロタイタープレート実施例８の手
順に従って調製した抗動脈内脂肪沈積抗体の調製した希
釈物の１００マイクロタイターを、イムロン（ＩＭＭＵ
ＬＯＮ）Ｉ　Ｉマイクロタイタープレート［ダイナチク
（Ｄｙｎａｔｅｃ）］の表面に適用する。被覆溶液の濃
度は１〜５マイクログラム／ウエルであるように選択す
るが、他の試薬および従うべきイムノアッセイ手順の選
択に依存して上下させることができる。プレートを軽く
たたき、被覆溶液が各ウェルの底を完全に覆うようにす
る。ウェルを４℃において蓋をした湿潤箱内で一夜イン
キユベーションする。

被覆溶液を廃棄し、そして２００マイクロタイター／ウ
エルのＰＢＳ中の１％のＢＳＡを添加する０次いで、ウ
ェルを湿潤箱内で室温において１時間インキュベーショ
ンし、モしてＢＳＡ溶液を除去する０次いで、ウェルを
２００マイクロタイターの洗？ＳＬ緩衝液（ＰＢＳ、０
．５％のツイーンおよび０．０２％のアジ化ナトリウム
）で洗浄し、そして湿潤箱内で４℃において使用するま
で貯蔵する。

実施例８または９の手順に従って調製した抗動脈内脂肪
沈積抗体を１Ｍ、オ°スリパン（０゛５ｕｌｌｉｖａｎ
）ら、アナリテイ力ル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ
　、　　Ｂｆｏｃｈｅｍ、）、１００：　１００　（１
９７９）（その内容全体をここに引用によって加える）
の修正手順に従い、アルカリ性ホスフγターゼと接合す
る。

セイヨウワサビペルオキシダーゼを抗動脈内脂助沈積抗
体に、次のようにして、ニグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）、Ｈ
，ら、メディカル・バイオロジー（Ｍｅｄ、　　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）、５７：１８７−１９１　（１９７９）の手
順に従い接合する。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（
ＨＲＰ、ＩＩ型またはＶＩ型、シグマ）を、０．２５％
のグルグルアルデヒド（ＧＡ、ボラロン）を含有する０
、０５モルの炭酸塩二重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，５゜中
に溶解する。室温において２時間後、過剰のＧＡをＧＡ
−ＨＲＰから、０．１５％ル（７）　Ｎ　ａ　Ｃ１を含
有するセファローズＧ−２５カラム（０゜７１２ｃｍ、
）７−マシア）で分離する。ＧＡ−ＨＲＰ複合体を、第
２工程において、０．１５モルのＮａＣ１を含有する０
、０５モルの炭酸塩二重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，５，中
で、異なるｘｇＧ：ＨＲＰ比において４℃で１６〜６４
時間、抗体と混合する０反応はリジンを０．０２モルの
最終濃度に添加することによって停止させる。

異なる濃度の実施例１０の手順に従って調製した抗動脈
内１指助沈積抗体で被覆したマイクロタイタープレート
の各々に、１００マイクロタイター／ウエルの試験する
患者の血清試料（１：１００の希釈）を適用する。プレ
ートを覆って乾燥を防止し、２時間インキュベーション
する。血清を除去し、プレートを３回洗詐緩衝液で洗浄
する。

１００マイクロタイター／ウエルの実施例１１の手順に
従って調製したアルカリ性ホスファターゼ接合抗体を各
ウェルに適用し、そしてプレートをを覆って乾燥を防止
し、２時間インキュベーションする。酵素標識した抗体
溶液を除去し、そしてプレートを３回洗浄緩衝腋で洗浄
する。

次いで、１００マイクロタイター／ウエルの４−メチル
ーウンベリフェリルホスノエートｕＨ［３Ｍ！／イアグ
ノヌチック・システムス（Ｄ　ｉ　ａｇｎｏｓｔ　ｉｃ
　　Ｓｙｓｔｅｍｓ）をウェルに適用する８次いで、マ
イクロタイタープレートを蛍光測定装置（３Ｍダイアグ
ノスチック）で、最初の４０９６の読みまたは１時；１
；１マークに到達するまで、１０分毎に読む。読みを他
の２時間の間３０分毎に続ける。

心筋高速症、心臓血管偶発発作で死亡した患者から解剖
で、あるいは外科的手順から、ヒト大動脈を得る。大動
脈を解剖して取囲む組織および脂肪を除去し、そして生
理的食塩水中↑洗浄して汚染する血液を除去する。動脈
内脂肪沈積のセグメントを分離し、そして処理する。

動脈内脂肪沈積区域を除去し、そして２×２ｍｍの小さ
い片に切断する０組織を生理的食塩水中で簡単に洗浄し
、そしてワーリングプレンダー内で等張すン醜塩緩衝化
生理的食塩水（ＰＢＳ）中で高速度でｐＨ７，０〜７．
２において均質化する。このホモジネートを４℃におい
て３０分間遠心（２０００Ｘｇ）に遠心し、そして溶離
する。

この工程および引続く工程からの溶離液を取っておき、
そして濃縮する。

沈降した破片を冷ＰＢＳ中で洗浄し、そして上澄みが透
明になりかつ化学的または免疫化学的に検出可能な蛋白
質を含有しなくなるまで、上のように反復回転する。こ
の段階で、可溶性蛋白質の９５％以上が除去されてしま
う９次いで、沈降物を蒸留水中で洗浄し、そして０．０
２モルのクエン耐塩緩衝液、ｐＨ３，２、で３７℃にお
いて２時間攪拌しながら抽出する。この溶離の手順の後
、この混合物を３０分間遠心（２０００Ｘｇ）する、上
澄みを０．５モルのＮａＯＨで中和し、そしてＰＢＳに
対して一夜透析する。上澄みならびにプールしたＰＢＳ
溶離液を真空透析および限外濾過により濃縮して、可溶
性動脈内脂肪沈積抗原の濃縮物を得る。

不溶性動脈内脂肪沈積抗原を分離するため、大動脈の動
脈内脂肪沈積の部分を異なる木質的で消化し、消化物を
ＰＢＳで抽出し、モして溶離液を前述のように濃縮する
。使用する酵素の組成物は、次のものを包含する：５ミ
リモルのＣａＣｌ２を含有する０、０５モルのトリス緩
衝液、ｐＨ７，４，中（７）コラゲナーゼ［１００単位
／ｍ１］；０．２％のＮａｃｌを含有する０、０３５モ
ルの炭酸塩緩衝液、ｐＨ８，８、中のエラスターゼ［２
０単位／ｍｌ］Ｈ２，５ミリモルのＭｇＣ１２を含有す
る０、１モルのリン酸−ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０
、中のＤＮアーゼ［５００単位／ｍｌｌ　　；０．１５
モルのＮａＣ１を含有する０、１モルのリン酸−ナトリ
ウム緩衝液、ＰＨ５，３、中のヒアルロニダーゼ［５０
単位／ｍ１１　　、および２ミリモルのＥＤＴＡを含有
する変性リンゲル（Ｒｉｎｇｅｔ）溶液、ｐＨ７，３、
中のネツロアミニダーゼ［１単位／ｍｌ］、大動脈の動
脈内脂肪沈積の１ｇにつき１０　ｍ　ｌの消化混合物を
使用する０組織−酵素の混合物の各々を、［を水浴中で
３７℃においてインキュベーションする。インキュベー
ションの期間は、コラゲナーゼおよびエラスターゼにつ
いて２時間、ヒアルロニダーゼについて１５時間、およ
ヒＤＮアーゼおよびネウラミニダーゼについて１蒔間で
ある。消化物の各々を遠心（２０００Ｘｇ）Ｌ。

そして液体部分をアミコン（ＡＭＩＣＯＮ）限外濾過膜
（ＰＭＩＯ）で０．５〜１．０に濃縮し。

０．１５モルのＰＢＳに対して２４時間透析して、不溶
性動脈内脂肪沈積抗原の濃縮溶液を得る。

実施例１３にの手順に従って得られた可溶性抽出物の一
部を処理して、それから抗抗体を分離する。濃縮物を０
．１５モルの塩化ナトリウムで希釈して、抗動脈内脂肪
沈積抗体を含む蛋白質のほぼ１５ｍｇ／ｍｌを含有する
ようにする。蛋白質を２５℃でつくった無水硫酸ナトリ
ウム（１８ｇ／　１００　ｍ　ｌ　）で沈殿させる。工
時間抜、沈殿を遠心（１０、ＯＯＯｇＸｇ、２０分、２
５℃）により集め、そして０．８容量の０．１モルのＰ
ＢＳ、ｐＨ７，５、中に溶解する。この物質を前述のよ
うに再び沈殿させる。沈降物を０．１モルのトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８，０，２０”Ｏ）中に溶解し、そし
て同一緩衝液で平衡化したデアニーセファデックス（Ｄ
ＥＡＥ−５ＥＰＨＡＤＥＸ）　Ａ　−５０（７ｙ−マシ
７）　（７）カラム（３，２Ｘ３０ｃｍ）に適用する。

この物質の溶離は、０．１モルのトリス−ＭＣＩからの
連続勾配により８．０の一定ｐＨにおいて２０”Ｏで実
施する。

ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの免疫グ
ロブリンを含有する分画を集め、そして濃縮する０次い
で、それらを０．２％のナトリウムアジドを含有する０
、１モルのトリス−ＭＣＩ、０．２モルのＮａＣ１，０
，００２モル１７）ＥＤＴＡＮａ２、ｐｌ（７，７、と
平衡化したセフアゾツー　　クス（ファーマシア）のカ
ラム（３，２Ｘ９５ｃｍ）に適用する。この物質をこの
カラムに３回通過させた（リサイクリングクロマトグラ
フィー技術）　、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよ
びＩｇＭの免疫グロブリンを含有する分画を集め、そし
て濃縮する。

実施例１５ 実施例１３の手順に従って得られた動脈内脂肪沈積抗原
を、ミシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシルギ（Ｓｈｉ
ｌｇｉ）、開胸免疫学における選択サレタ方法（ＳＥＬ
ＥＣＴＥＤ　　ＭＥＴＨＯＤＳ　　ＩＮ　　ＣＥＬＬＵ
ＬＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、サンフラシスコ：フリ
ーヤン（Ｆ　ｒ　ｅ　ｅｍａｎ）（１９８０）の手順に
従って、親和クロマトクラフィーによる精製する０イン
チオシアナトフェノキシヒドロキシプロピル基で置換さ
れた架橋したアガロースゲルを、重炭酸ナトリウムの水
溶液中に懸濁し、そしてこの溶液に、実施例２の手順に
従って得られた混合精製抗動脈内脂肪沈積抗体溶液の１
ｍｌを添加する。この混合物を３日間室温においてイン
キュページ哀ンし、その間おだやかに攪拌する０次いで
、粒子を遠心し、そして０．５モルｃ７）ＮａＨＣＯｓ
　、０．１モルの酢酸塩緩衝液、および１重量％のＢＳ
Ａを含有する０、１モルのトリス緩衝液の各々で２回洗
浄する。

抗体結合粒子を、ＰＢＳ中の実施例１に従って調製した
動脈内脂肪沈析抗原濃縮物の溶液と混合する。この混合
物を２５℃において８時間（−夜）インキュベーション
する０次いで、粒子を混合物から分離し、そしてＰＢＳ
、ＰＨ７，２、で３回洗浄して、残留する結合しない動
脈内脂肪沈積抗原を除去する０次いで、粒子を過剰量の
２゜５−ｖ−ルのＮＡｓｃＮ溶液、ｐＨ８，０、と混合
し、そして２５℃において８時間インキュベーションす
る０次いで、親和精製した動脈内脂肪沈積抗原を含有す
る溶液を減圧の透析または限外濾過により濃縮し、そし
て動脈内脂肪沈積抗原の溶液を４℃で貯蔵する。

実施例１５の手順に従って得られた動脈内脂肪沈積抗原
を動物蛋白質（ＵＳＡ）へ接合して、ポリスチレンのマ
イクロタイターウェルの表面の被覆を促進する。動脈内
脂肪沈積抗原の溶液（３ｍｇ／ｍｌ）に、５重量％のウ
シ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）溶液を添加する。添加
後、この溶液を４℃に維持し、そして５　ｍ　ｇの１−
エチル−３−（３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピル）
カーポジイミド（ＥＣＤＩ）を添加する。この混合物を
４℃でおだやかに２０分間攪拌する。ＢＳＡおよびＥＤ
ＣＩの両者の添加を３回反復する。最終混合物を４℃で
一夜放置して、ＢＳＡに結合した動脈内脂肪沈積抗原の
接合体を生成する。

動脈内脂肪沈積−ＢＳＡ接合体混合物をリン酸塩緩衝液
、ｐＨ８，５、中で希釈する。各マイクロタイターウェ
ルに、１００マイクロタイターの希釈した溶液を添加し
、そして２時間（−夜）維持する０次いで、溶液をウェ
ルから吸引し、そしてウェルをソルビトールおよびトリ
トンｘ−４０５を含有するリン酸塩洗冷緩衝液で３回（
３×２００マイクロタイター）洗浄する。

実施例１７ ポリクローナル抗動脈内脂肪沈積抗体 ０．２ｍｌの０．１５モルの塩化ナトリウム溶液および
０．８ｍｌの完全フロインドアジュバント中の実施例３
の手順によって調製した０、５ｍｇの動脈内脂肪沈積抗
原の混合物を、ウサギに筋肉内注射する。免疫化を１４
日間反復し、次いで各週３週間反復する。さらに１０日
が経過した後、血液をウサギから取り出し、そして血液
を凝固させかつ凝固物を除去することによって、抗血清
を血液から回収する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血清中のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積
   の抗原（ｐｌａｑｕｅ　ａｎｔｉｇｅｎ）の存在を決定
   する方法であって、 （ａ）血清を抗動脈内脂肪沈積抗体と十分な時間接触さ
   せて、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原
   を抗動脈内脂肪沈積抗体（ｐｌａｑｕｅ　ａｎｔｉｂｏ
   ｄｙ）と接合させ、そして （ｂ）抗動脈内脂肪沈積抗体と接合したアテローム性動
   脈硬化症の動脈内脂肪沈積（ｐｌａｑｕｅ）を決定する
   、 ことを含んでなることを特徴とする方法。 ２、（ａ）試料を抗動脈内脂肪沈積抗体が付着している
   不溶性支持体と十分な時間接触させて、動脈内脂肪沈積
   抗原を抗動脈内脂肪沈積抗体と接合させ、そして残留す
   る試料を前記支持体から除去し、 （ｂ）工程（ａ）からの不溶性支持体を標識した抗動脈
   内脂肪沈積抗体を十分な時間接触させて、抗動脈内脂肪
   沈積抗体をアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の
   抗原と接合させ、そして接合しない標識した抗動脈内脂
   肪沈積抗体を前記支持体から除去し、そして （ｃ）前記不溶性支持体上に存在する標識を決定する、 ことを含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記標識は酵素であり、そして前記不溶性支持体上
   に存在する標識は、前記不溶性支持体を基質と接触する
   ことによって決定し、前記基質は、前記酵素の存在下に
   、検出可能な発色団または蛍光団を生産する特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ４、前記酵素はセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓ
   ｈ）ペルオキシダーゼである特許請求の範囲第３項記載
   の方法。 ５、前記酵素はアルカリ性ホスファターゼである特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 ６、（ａ）前もって決定した量のアテローム性動脈硬化
   症の動脈内脂肪沈積の抗原が結合している不溶性支持体
   を、前もって決定した量の抗動脈内脂肪沈積抗体と血清
   との混合物と十分な時間接触させて、動脈内脂肪沈積抗
   原と抗動脈内脂肪沈積抗体とを接合させ、そして （ｂ）前記不溶性支持体へ結合した、あるいは前記混合
   物中に残留する標識した抗動脈内脂肪沈積抗体の量を決
   定する、 ことを含む特許請求の範囲第６項記載の方法。 ７、前記標識は酵素であり、そして前記不溶性支持体上
   に存在する標識は、前記不溶性支持体を基質と接触する
   ことによって決定し、前記基質は、前記酵素の存在下に
   、検出可能な発色団または蛍光団を生産する特許請求の
   範囲第６項記載の方法。 ８、前記酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼである
   特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前記酵素はアルカリ性ホスファターゼである特許請
   求の範囲第７項記載の方法。 １０、（ａ）前もって決定した量の抗動脈内脂肪沈積抗
   体が結合している不溶性支持体を、前もって決定した量
   の標識したアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の
   抗原と血清との混合物と十分な時間接触させて、動脈内
   脂肪沈積抗原と抗動脈内脂肪沈積抗体とを接合させ、そ
   して （ｂ）前記不溶性支持体へ結合した、あるいは前記混合
   物中に残留する標識したアテローム性動脈硬化症の動脈
   内脂肪沈積の抗原の量を決定する、 ことを含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、前記標識は酵素であり、そして前記不溶性支持体
   上に存在する標識は、前記不溶性支持体を基質と接触す
   ることによって決定し、前記基質は、前記酵素の存在下
   に、検出可能な発色団または蛍光団を生産する特許請求
   の範囲第１０項記載の方法。 １２、前記酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼであ
   る特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、前記酵素はアルカリ性ホスファターゼである特許
   請求の範囲第１１項記載の方法。