JPS6388448A - アテロ−ム性動脈硬化症の抗イデイオタイプ抗体のイムノアツセイおよび試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アテローム性動脈硬化症（ａｔｌ＋ｅｒｏｓ
ｃｌｅｒｏｔｉｃ）の動脈内脂肪沈積（ｐｌａｑｕｅ）
の存在を決定するイムノアッセイ法および試薬に関する
。とくに、本発明の方法および試薬は、患者の血清中の
アテローム性動脈硬化症のｇＪ脈回内脂肪沈積抗原と優
先的に結合する抗体の可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅｒｃ
４ｉｏｎ）または結合部位へ特異的に結合する、抗イデ
ィオタイプ抗体（ａｎｔｉ　　１ｄｉｏｔｙｐｅ　　ａ
ｎｔｉｂ。

ｃｌｉｅｓ）の存在を決定する方法および試薬である。

これらは、以下でアテローム性動脈硬化症の抗イディオ
タイプ抗体として又は単に抗イディオタイプ抗体という
。

血液と動脈組織との開に位置する内皮（ｅｎｄｏｔｈｅ
１ｉｕ＋ｍ）は、脈管壁中の血液成分の蓄積に月するバ
リヤーとして働く。内皮におけるアテローム性動脈硬化
症の病変の形成は、主要な冠状血管の病気および発作に
関連し、そしてこのような病変の原因および検出は広範
に研究されてきている。

内皮の損傷は、アテローム性動脈硬化症の病変の形成に
おける初期の段階であると（ｊしられており、血行力学
的歪、過コレステロール血症および免疫複合体の病気に
より潜在的に引き起こされる。

内皮の損傷は、動脈内膜の細胞の増殖、フレステロール
のＭ積およＶ結合組織の線維の形成に導く。

損傷した内皮細胞および非内皮化動脈内膜の中のＩｇＧ
および罰体囚子Ｃ３の蓄積が示された。血液から誘導さ
れる単核食細胞は、また、アテローム性動脈硬化症の病
変における細、泡集団の一部を構成することが発見され
た。究極の動脈内脂肪沈積の構成に導く機構は、また、
知られていない。

種々の可溶性蛋白質がヒトアテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積から抽出されてきており、それらは次のも
のを包含する：Ｉｇ’Ａ％　ＩｇＧ。

ＩｇＭ％ＢＩＣ（Ｃ３）、アル７ｙｌ−抗トリプシン、
フル７ア２−マクログロブリン、フイブリノデン、アル
ブミン、ＬＤＬ、Ｉ（ＤＬ、フル７７１−酸糖蛋白質、
ベータ２−糖蛋白質、トランスフェリンおよびセルロブ
ラスミソ。病気の動脈内膜は、また、少量の組織結合ｒ
ｇＧ、ＩｇＡおよび［３１Ｃを含有することが発見され
た。ホラング−（Ｈｏ１ｌａｎｄｅｒ）　、アテローム
性５Ｊｌ　＠　Ｑ］Ｊ　（Ａ　ｔ　ｈｅｒｏｓｃｌｅｒ
ｏｓｉｓ）　、３４：　３９１−４０５（１９７９）、
他の化学者はこのＧ！ｉ変およＶ隣接する内皮組織中の
ＩｇＧを報告した。バルムス（Ｐ　ａｒｕｍｓ）、Ｄ、
　ラ、７　ｆ　ａ−ムｖ、；ｊ’％Ｅ、ｌ−翌良（Ａ　
ｔｌ遥弧ど山二色）、３８：　２１１−２１６＜　１９
８１）、ハン７ン（Ｈａｎｓｓｏｎ）　、　Ｇ、　ラ、
−荻攻友主１分子ｔＬ！！ｉ（Ｅｘ　　ｅｒｉｍｅｎＬ
ａｌ　　　　ａｎｄ　　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　　Ｐ
ａｔ匝棧江）、３４：　２６４−２８０（１９８１）、
ハンソン（Ｈａｎｓｓｏｎ）　、Ｇ、ら、アクタ・パソ
ロシカ・マイクロバイオロシカ・ニド・イムノロッカ・
スカンジナビ力（Ａｃｔａ　　Ｐａｔｈｏ、　　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏ！、　　　　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　　　５
ｃａｎｄ、　　）　　（５ｅｃｔ、　　Ａ、　　）　　
、９２：　４２９−４３５（１９８４）、Ｌがしながら
、アテローム性動脈硬化症および関連する組織における
免疫グロブリンの起源、機能および結合の性質はなお神
秘的である。抗低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）自己抗体は
、脈管の病気患者においてより高いことが報告され、そ
れらがある方法でアテローム性動脈硬化症の発現に関連
することを示唆している。しかしながら、これらの自己
抗体とアテ　ローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積との
間の因果関係は確立されていない、スゾンディ（５ｚｏ
ｎｄｙ）　、Ｅ、　　ら、−匿且ｈＶ　　ＩｌｌＭｅｃ
ｈａｎｉｓｍ　　ｏｆ　　Ａ　　ｉｎ　　ａｎｄ　　Ｄ
ｅｖｅｌｏｗｅｎｔ）、２９：　１１７−１２３（１９
８５）。

１９８６年３月３１日に提出した私の同時係属出願第８
４６，４０１号において、アテローム性動脈硬化症の動
脈内脂肪沈積に結合する抗体（以後、抗動脈内脂肪沈積
抗体と呼ぶ）の存在を決定することによって１、の者に
おけるアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の存在
を決定する方法を記載した。このイム／アッセイにおい
て、抗体はそれを不溶性支持体と接合することによって
血清から分離された。言くべきことには、最も進行した
アテローム性動脈硬化症をａするある患者の血清中にお
いて、抗動脈内脂肪沈積抗体は不溶性化された抗体に結
合しないであろうことが発見された。免疫調節系の結果
、あるｌＬ？間に血＞＝ｉ中の利用されうる結合部位を
もつ抗動脈内ｆ’Ｍ肪沈積抗体のレベルは他の時開にお
けるより低いことがあり、これは抗動脈内Ｔ肪沈積抗体
の可変ａ域または結合部位に特異的に結合するアテロー
ム性動脈硬化症の抗イディオタイプ抗体の血清レベルに
対応するように思われる。循環する抗動脈内脂肪沈積抗
体および抗イディオタイプ抗体の両者の画定は、進行し
た場合において、アテローム性動脈硬化症の過酷さまた
は減退の１２階を決定するために必要であることが発見
された。

本発明の目的は、患者の血清中のアテローム性動ス硬化
症の抗イディオタイプ抗体の存在を、進行したアテロー
ム性動脈硬化症の存在の指示として決定することである
。

種々の体液および組織中の広範な種類の抗原および非抗
原物質の存在および量を決定するために、広範な種類の
イム／７ツセイが開発された９合ｄ１゛の免疫グロブリ
ンおよび■ｇＥのイムノアッセイは、米国特許第３ｓ　
７２０．７６０号および米国特許＃Ｓ４，４４４，８７
９号に記＄２されている。

ＩｇＧＺロタイブのイムノアッセイはロシア国特許６４
９，４３３号に記載されている。エライザ（ＥＬＩＳＡ
）は、マギオ（Ｍａｇｇｉｏ）ら、酵素のイムノアッセ
イ（ＥＮＺＹＭＥ−ＩＭＭＵＮＯＡＳＳＡＹ）　、Ｂｏ
ｃａ　　Ｒａｄｏｎ：　ＣＲＣプレス、１７２−１７６
ページ（１９８０）に記載されている。

小さいｍ胞の肺癌（ｓｍａｌｌ　　ｃｅｌｌ　　ｌｕＢ
　　ｃａｎｃｅｒ）の診断のための阻害イム／アッセイ
によって、血清中の抗イディオタイプ抗体を検出する方
法は、米国特許ｆ５６，７１７，６９２号［グーウェン
ト（Ｄｅｒｗｅｎｔ）　ＷＰ　ｒアブストラフ）Ｎｏ、
８５−３１０１１７／４９．１９８５年３月２９日に提
出された米国特許出ＭｆｊＳ７１７．Ｃｔ９２号に対応
する］に記載されている。抗イディオタイプ抗体類の調
製およびそれらのイム／アッセイにおける使用は、米国
特許ｆｆ１４，５１３，０８８号に記載されている。

抗体可変領域の特性をもつペプチド類からの抗イディオ
タイプ抗体類のｇｌは、チェノ（Ｃｈｅｎ）、？−５０
０号、ＰＴＣ出Ｎ第Ｎ第８５０２９０９号ｕ欧州４Ｌ７
Ｆ出１１（ＥＰＡ）　１１４１７８３号１：記載されて
いる。腫瘍抗体からの腫瘍抗体抗体に対するモノクロー
ナル抗イディオタイプ抗体の調、製は、米国特許第４，
５１３，０８８号に記載されている。

本発明の方法は、血清を抗動脈内脂肪沈積抗体と十分な
時間接触させて、抗動脈内脂肪沈積抗体をアテローム性
動脈硬化症の抗イディオタイプ抗体と結合（ｂｉｎｄ）
ｆｉせ、そしてこのような結合を決定することを含んで
なる。

本発明の方法の１つの実施態様は、 （ａ）試料をヒト以外の抗動脈内脂肪沈積抗体が付着し
ている不溶性支持体と十分な時間接触させて、抗イディ
オタイプ抗体を抗励脈内脂肪沈積抗体と結合させ、そし
て残留する接合しない（ｕｎｃｏｎ　、ｉｕｇａｔｅｄ
）物質を支持体から除去し、（ｂ）不溶性支持体を標識
した抗ヒト■ｇ抗体と十分な時開接触させて、抗原−抗
体の結合を起こさせ、そして接合しない物質を支持体か
ら除去し、そして （ｃ）不溶性支持体上に存在する標識を決定する、 ことを含む。

本発明の他の実施態様は、 （ａ）抗動脈内脂肪沈積抗体が付着している不溶性支持
体を試料と非過剰量の標識した抗イディオタイプ抗体と
十分な時間接触させて、抗原−抗体の結合を起こさせ、
そして接合しない物質を支持体から除去し、そして （ｂ）不溶性支持体上に存在するか又は溶液中に残存す
る標識を決定する、 ことを含む。

本発明のなお他の実施態様は、 （ａ）アテローム性動脈硬化症抗イディオタイプ抗体が
付着した不）８性支持体を試料の溶液と非過剰量の標識
したアテローム性動脈硬化症の抗動脈内脂肪沈積抗体と
十分な時間接触させて、抗原−抗体の結合を起こさせ、
そして接合しない物質を支持体から除去し、そして （ｂ）不溶性支持体上に存在するが又は溶液中に残存す
る標識を決定する、 ことを含む。

アテローム性動脈硬化症の抗イディオタイプ抗体が付着
した不溶性支持体および標識したアテローム性動脈硬化
症の抗イディオタイプ抗体は、本発明の試薬である。

本発明の方法の異なる実施態様は、共通の工程として、
血清を抗動脈内脂肪沈積抗体と十分な時間接触させて、
抗動脈内脂肪沈積抗体をアテローム性動脈硬化症の抗イ
ディオタイプ抗体と結合させ、そしてこのような結合の
程度を決定することを含む。

抗動脈内脂肪沈積抗体は、アテロ−／、性勤二１硬化症
の動脈内脂肪沈積から直接誘導Ｖることできるか、ある
いは好ましくは慣用の抗血清またはモノクローナル技術
によって、精製されたアテローム性動脈硬化症の動脈内
脂肪沈積の抗原から誘導することができる。動脈内脂肪
沈積抗原は、ヒトアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
沈積を処理しで、それに対して特異的な抗原を分離しか
つ精製することによって得られる。動脈内脂肪沈積は、
心筋梗塞症、心臓血管偶発症で死亡した患者のヒト動脈
を処理することによって得ることができ、あるいは外科
的手順によって得ることができる。

動脈を解剖して、取囲む組織および脂肪を除去し、そし
て生理的食塩水（５ａｌｉｎｅ）中で洗浄して、汚染す
る血液を除去する。動脈内脂肪沈積のセグメントを分離
し、そして処理する。

動脈内脂肪沈積の区域を除去し、小さい片に切り、簡単
に洗浄し、モして等張溶液、例えば、リン酸塩緩衝化生
理的食塩水（ＰＢＳ）中で均質化する。このホモジネー
トをＰＢＳ中で反復して遠心および再懸濁し、溶Ｂ液を
集める。沈降した破片は、また、クエン酸塩緩衝液、酸
性のｐＨ１で抽出し、モして溶離液を中和し、そして透
析により精製する。上澄みならブブールしたＰ　Ｂ　Ｓ
　＠　Ｈ液を真空透析および限外濾過により濃縮して、
可溶性動脈内脂肪沈積抗原の濃縮物を得る。

不溶性動脈内脂肪沈積抗原は、一部を異なる酵素で消化
し、３１丁化物をＰＢＳで抽出し、そして前述のように
溶＃ｌ液を濃縮するとによって得ることができる。使用
する酵素組成物は、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ＤＮ
アーゼ、ヒアルロニダーゼ、およびネウラミニグーゼを
包合する。各消化物を遠心し、例えば、限外濾過により
濃縮し、そして透析して、不溶性動脈内脂肪沈積抗原の
濃溶液を得る。

ポリクローナル抗動脈内脂肪沈積抗体は、動物、例えば
、ウサギ、モルモット、ラットまたはヤギを濃縮した動
脈内脂肪沈積抗原で免疫化し、免疫化した動物から血清
を取り出し、そしてこの血清から免疫グロブリンを、例
えば、硫酸アンモニウムの沈澱により得られる。本発明
の方法において有用である主な抗体類はＩｇＧおよりＩ
ｇＭの抗体であるが、ＩｇＥおよ（ｚＩｇＡの抗体を、
十分な量で入手可能である場合、使用することもできる
。

モノクローナル抗動脈内脂肪沈積抗体は、グラフしく　
Ｇ　Ｉａｆｒｒｅ）およびマイルスティン（Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ）　、　ｐ３Ｊの　−Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　　Ｅ　
ｎｚ　ｌ１ｏ１．　）、７３：　１（１９８１）の方法
によって、精製した動脈内脂肪沈積抗体で免疫化したマ
ウスの疎水性した肺細胞から得ることができる。

ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、アテローム性
動脈硬化症の動脈内脂肪沈積抗原で免疫化することによ
って得られた動物血清を、この分野においてよく知られ
た慣用の手順によって抗動脈内脂肪沈積抗体が共有結合
しだカラムにＭＪ過させることによって１４’Ｊｌする
ことができる。慣用の方法において、洗浄して残留する
血清を除去した後、このカラムを適当な緩ｗｉ液、例え
ば、酢酸ナトリウムで溶離して、分離された抗イディオ
タイプ抗体を除去し、モして溶離液を透析によって精製
して小さい分子を除去する。

モノクローナル抗体は、抗・イディオタイプ抗体につい
てグラフしく　Ｇｌａｆｒｒｅ）　ｒ；よブマイルステ
イン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）　、ｎＬ南ｆｆ−＝一方−１
ｇ＜　％−ｃＬｈ、ｃ４４゜旦ｎｚｙｎｏｌ、　）　（
前述）の方法に従い、本発明の方法を用いて、精製した
動脈内脂肪沈積抗原または抗動脈内脂肪沈積抗体で免疫
化したマウスの疎水性した＃細胞からのクローンをスク
リーニングすることによって精製できる。マイクロウェ
ル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ）に結合した抗動脈内脂肪沈積
抗体をハイブリドーマの上澄みとともに十分な時間イン
キュベージタンして抗体−抗原の結合を起こさせ、上澄
みをウェルから除去し、七してウェルを洗浄する。次い
　で、ウェルをＩＷ素標識したヤギまたはウサギの抗Ｉ
ｇとともに十分な時間インキュベージジンして抗体−抗
原の結合を起こさせ、そして残留物をウェルがら洗浄に
より除去する。次いで、酵素の存在下に発色団または蛍
光団を生成する基質をウェルに添加し、そして発色団ま
たは蛍光団の存在をクローンの選択基準として使用する
。

本発明の好ま１２い手順において、抗動脈内脂肪沈ｆ貞
抗体または抗イディオタイプ抗体が付着した不１８性支
持体を、試料と、あるいは試料と追加の試薬との混合物
と、接触（インキュベージ９ン）する。抗動脈内脂肪沈
積抗体および抗イディオタイプ抗体は、不溶性支持体へ
、この分野においてよく知られた慣用の手順で付着また
は結合することができる。抗体は、慣用法によって不溶
性支持体へ結合することができる６抗体を不溶性支持体
へ結合する手順は、例えば、米国特許第３，５５１．５
５５号、米国特許第３，５５３，３１０号、米国特許第
４，０４８，３１０号および最発行２９．４７４号に記
載されている。吸着による抗体のポリスチレンへの結合
は、例えば、米国特許第３．６４６，３４６号および米
国特許１４，０９２．４０８号に記載されている。抗原
を含有する蛋白質を種々の不溶性支持体へ結合すること
は、米国特許第３，７２０，７６０号に記載されている
。

種々の物質を不溶性支持体として使用することができる
。主要な考慮は、抗動脈内脂肪沈積抗体または動脈内脂
肪沈積抗原の表面への結合、抗動脈内脂肪沈積抗体およ
び動脈内脂肪沈積抗原の接合反応の妨害の不存在、ある
いは接合反応の存在および程度を決定するために使用で
きる他の反応の妨害の不存在である。天然および合成の
、有機および無機のポリマーを不溶性支持体として使用
できる。適当なポリマーの例は、次の通りである：ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリ（４−
メチルブチレン）、ブチルゴム、シラスチック（５ｉｌ
ａｓＬｉｃ）ポリマー、ポリエステル１、ポリアミド、
セルロースｔ；よびセルロース誘導体（例、ｔば、酢ａ
セルロース、ニトロセルロースなど）、アクリレート、
メタクリレート、ビニルポリマー（例えば、ポリ酢酸ビ
ニル、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ７ツ
化ビニルなど）、ポリスチレンおよびスチレングラ７ト
コボリマー、レーヨン、ナイロン、ポリ酪酸ビニル、ポ
リホルムアルデヒドなど、不溶性支持体として使用でき
る他の物質は、前述のポリマーのラテックス、シリカゾ
ル、ケイ素のウェー７　ｒ　−、Ｉｆシラス紙、不溶性
蛋白質、金属、メタロイド、金属酸化物、磁性材料、半
導電性材料、セラミックなどであることができる。さら
に、デルを形成する物質、例えば、蛋白質、例えば、ゼ
ラチン、リボ多糖、ケイ酸塩、アガロース、ポリアクリ
ルアミドまたはいくつかの水相を形成するポリマー、例
えば、デキストラン、ポリ７ルキレングリフール個の炭
素原子をもつアルキレン）または界面活性剤、例えば、
両ａ媒性化合物、例えば、リン脂質、役頷（１２〜２４
個の炭素原子）フルキルアンモニウム塩などが包含され
る。

本発明の好ましい診断支持体は、ポリスチレン、スチレ
ンコポリマー、例えば、スチレン−７クリロニトリルコ
ボリマー、またはポリオレフィン、例えば、ポリエチレ
ンまたはポリプロピレン、およびアクリレートおよびメ
タクリレートのポリマーおよびコポリマーを含む。抗動
脈的脂肪沈積試薬の抗体または動脈内脂肪沈積抗原は、
不溶性支持体に、吸着、静電結合、または他の非共有結
合により結合させることができ、あるいはそれは不溶性
支持体へ共有結合によって結合させることができる。こ
の手順のためにとくに有利な支持体は、複数のウェルを
有するマイクロタイタープレート（　ｗｉｃｒｏｔｉｔ
ｅｒ　　ｐｌａｔｅ）からなる、ウェルの表面またはそ
の中のプラス　チックカップのインサートは、抗原また
は抗体の支持体をｈ１成できる．決定が蛍光の測定を必
要とする場合、マイクロタイタープレートまたはウェル
のインサートは有利には光に討して不透明であり、こう
してウェルに適用される励起の光が取囲むウェルの内容
物に到達したりあるいは影響を及ぼしたりしないように
する。

非共有結合のための手順は米国特許第４，５２８、２６
７号に記載されている。抗体および抗原を不溶性支持体
へ共有結合する手順は、チロウ・チバタ（　　Ｉ　ｃｈ
ｉｒｏ　　Ｃｈｉｂａｔａ）　、固定化された酵１［（
ｒＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤ　　ＥＮＺＹＭＥＳ）、ハルス
テッド・プレス（　ＨａｌｓＬｅｄ　　Ｐｒｅｓｓ）　
：　ニューヨーク（１９７８）およびＡ．クアトレヵサ
ス（　Ｃ　ｕａｔｒｅｅａｓａｓ）　％ノ＋ーナルφ才
ブ・７テイオａ’）Ｈクーｌし　・　ケ　ミ　ス　ト　
　リ　ー　ＬＪ　　、　　　Ｂ　　ｉｏｌ．　　　Ｃ　
　ｊ＋ｅｍ．　　　）　　　、２４５：　３０５９（　
１９７０）（それらの内容全体をここに引用によって加
える）に記載されてぃる、米国特許第４．２１０，４１
８号に記載される手順に従い、例えば、カップリング剤
（ｅｏｕｐｌｉｎｇ　　ａｇｅｎｔ）としてグルグルア
ルデヒドを使用して、表面を蛋白質で被覆し、そして抗
体または抗原とカップリングすることができる。なお他
の手順において、１１離イソシアネート基を有する層、
例えば、ポリエーテルイソシアネー）でウェルを被覆す
ることができ、そしてそれに水溶液中の抗′体または抗
原を適用すると、必要な結合が行われる。なお他の手順
において、抗体または抗原はヒドロキシル化物質に、米
国特許第３，７２０，７６０号に記ｎされているような
臭化シアンによりカップリングすることができる。

標識した抗動脈内脂肪沈積抗体および抗イディオタイプ
抗体の両者は、本発明の方法の応用において有ｍである
。標識した抗動脈内脂肪沈積抗体および抗イディオタイ
プ抗体は、蛋白質へ標識を取り付けるための慣用の手順
により’ＦＪ４’ＪＩすることができる。ｒＪ識は、化
学的または物理的な結合によって、蛋白質試薬へ結合ま
たはカップリングすることができる０本発明の抗体へ接
合できる配位子お上び基は、試験する試料中の化合物お
よび物質とそれらが結合する試薬とを区別するために使
用できる物理的または化学的特性を有する元素、化合物
または生物学的物質を包合する。一般原理として、標識
を抗体と連結するために適当な方法は、標識を動脈内脂
肪沈積抗原へ連結または結合するための等しく適する。

下の手順は標識を抗体に接合することによって説明する
が、標識を動脈内脂肪沈積抗原に接合するためにそれら
を使用することがまた意図される。

放射線標識した抗体は、生体外診断試験に使用すること
ができる。５識した抗体の比活性は、放射性標識の半減
期、同位体の純度、および標識を抗原または抗体に組込
む方法に依存する０表Ａは、いくつかの普通に使用され
る同位体、それらの比活性および半減期を記載する。イ
ムノアッセイ試験において、比活性が高くなればなるほ
ど、一般に、感度はよりすぐれろ。

老Ａ ”Ｃ６，２５Ｘ１０１　　５７２０年 プＨ２，９１Ｘ１０４　　１２，５年 コ’Ｓ　　　　　　　　１，５　　　　Ｘ１０Ｇ　　　
　　　８７　　日１２’ｒ　　　　２，１８Ｘ１０６　
　６０日”Ｐ　　　　３．１６Ｘ１０６　　１４，３日
＋３’ｌ　　　　　　１　　、６２Ｘ１０７　　　　８
．　１　　日抗体を表Ａに記載する放射性同位体ｃａ識
する手順は、一般にこの分野において知られている。

トリチウム標識法は、例えば、米国特許第４，３０２．
４３８号に記載されている。ことに抗体に適合するヨウ
素化、トリチウム標識法および３５３　Ｉｆｆ識法４、
ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）　、Ｊ。

Ｗ、モノクローナル抗本：原理およびプラクティＸ（Ｍ
ＯＮＯＣＬＯＮＡＩ−ＡＮＴ　Ｉ　ＢＯＤＹ：ＰＲＩＮ
ＣＩＰＬＥＳ　　ＡＮＤ　　ＰＲＡＣＴＩＣＥ）、ニュ
ーヨーク：アカデミツク・プレス、１２４　１２６ペー
ジ（１９８３）およびその中に引用されている文献に記
載されている。抗体をヨツ素化するための他の方法は、
次の文献に記載されている：ハナター（Ｈｕｎｔｅｒ）
およびグリーンウッド（Ｇ　ｒｅｅｎｗｏｏｄ）　、ネ
イチャー　　Ｎ　ａｔｕｒｅ）、１４４：　９４５（１
９Ｇ２）およびディピッド（Ｄａｖｉｄ）　ラ、バイオ
ケシ不）　＋７二Ｌｕ旦免回μ区ｒＬ）　、　　１３　
：　　１０１４　１０２１　（１り　７４　）、米国特
許ｔｊＳ３，８６７．５１７号および米国特許第４，３
７６．１１０号。

像形成および放射線療法のために有用な放射線標識した
抗体は、また、本発明の方法において試薬として使用す
ることができる。像形成において有用な放射線標識元素
は、例えば、１２）ｉ　、＋２１１、Ｉｌｌ　Ｉｎおよ
び”　　Ｔｅを包含する。抗体をヨウ素化する方法は、
次の文献に記載されいるニゲリーンウッド（Ｇ　ｒｅｅ
ｎｗｃｏｄ）　、Ｆ　、　ら、［高い非活性の１３１１
標識ヒト成長ホルモンの調装Ｊ　、＜エイ、を−−１主
プル・ジー１−ナル（」ユ卯１馴！□む、）、８９：１
１４−１２３（１９６３）；マーチャロニス（Ｍａｒｃ
ｈｎｌｏｎｉｓ）　、Ｊ、　ｆ　免疫グロブリンおよび
他の蛋白質の微量ヨウ素化のための酵素的方法」、バイ
オケミカル・ジャーナル　Ｗか一〇ニー、、ｊ、）。

１１３：　２９９−３０５（１９６９）；モリンン（Ｍ
ｏｒｒｉｓｏｎ）　、Ｍ、ら、「免疫化学的研究におけ
るラクトベルオキシグーゼ触媒ヨウ素化の使用」、り１
催’Ｆ’　　Ｉ　＋ａｎ＋ｕｎ虻に１畦１）　、８　：
　２８９−２９７（１９７１）、”　　Ｔｃ５ｆｉ法は
、次の文献に記載されている：ローデス（Ｒｈｏｄｅｓ
）　Ｂ、ら、　・鎗 ［酋ｓ　Ｔｃ楳識および放射線標識した抗体お上り抗体
断片の許容試験」、腫瘍の像形成：癌の放射線免疫化学
的検出（ＴＵＭＯＲＩＭＡＧＩＮＧ：ＴＨＥ　　ＲＡＤ
ＩＯＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　　ＤＥＴＥＣＴＩ
ＯＮ　　ＯＦ　　ＣＡＮＣＥＲ）、バーチエル（Ｂｕｒ
ｃｈｉｅｌ）　、Ｓ、ら偏、ニューヨーク：マラソンＢ
（Ｍａｓｓｏｎ）　、１−１１　１２３（１９８２）、
およびその中に引用されている文献。抗体をＩｌｌ　Ｉ
ｎするために適当な方法は、次の文献に記載されている
＝７ナトウイツチ（ＨｎａＬ。

ｗｉｃｈ）　、Ｄ、　　Ｊ、ら、ジャーナル・オブ・イ
ムＬロノカル・メソッズ　Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕｎｏ１
９Ｍｅｔｈｏｄｓ　。

ｆ３５：　　１４７　１５７（１９８３）：　７ナトウ
イツチ（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）　、Ｄ、　　Ｊ　、ら、
ｆ　４　、ｘ、　７　ＸＬ５ヱむμｍ）、２２０：　　
６１３−６１５（１９８３）およびバックレイ（Ｂｕｃ
ｋｌｅｙ）　、Ｒ，Ｇ、　　ら、Ｆ、Ｅ、Ｂ、Ｓ、　、
１６６：　２０２−２０４（１９８４）。

適当な系、カップリング手順およびそれと基質との反応
は、例えば、米国再発行３１．００６号、Ｂ１＼３，６
５４，０９０号、４ｔ２１４＋０４８号、４，２８９．
７４７号、４，３０３゜４３８号、４，３１２，９４３
号、４，２１４゜１１０号およびそれらの中に引用され
た文献に記載されている。イ屯の適当な系は、ベセ（Ｐ
　ｅｓｃｅ）ら、クリニカル・ケミストリー　Ｃｌ１ｎ
、　Ｃｂｃ輸、）、２０（３）：　　３５３−３５９　
　（，１９７４）およ１ウイズダム（Ｗｉｓｄｏｍ）　
、Ｇ、クリニカル・ケミ　ス　ト　リ　−Ｃｌ１ｎ、　
　Ｃｈｅｗ、　　）　　、　　２　２：　　　１　２　
４　３（１９７６）に記載されている。

適当な実施例のクラスのリストおよび各クラスの特定の
例は、次の通りである： 前二Ｌ ヒドロラーゼ類　カル　アミラーゼ類 ボヒドラーゼ類 ヌクレアーゼ類　　　　ポリヌクレオチグーゼ７ミグー
ゼ類　　　　　アルギナーゼ プリンデアミナーゼ類　アデナーゼ ベプチグーゼ類　　　　アミノボリペブチグーゼブロイ
テナーゼ類　　　ペプシン エステラーゼ類　　　　リパーゼ類 鉄酵素類　　　　　　　カタラーゼ 銅酵素類　　　　　　　チロシナーゼ類補酵素含有酵素
類　　　アルコールデヒドロデナーゼ チトクローム還元性酵　コハク酸デヒドロｒナー索類ゼ 賀色＃素類　　　　　　ジアホラーゼ ムターゼ類　　　　　　グリオキシラーゼデモラーゼ類
　　　　　アルドラーゼ オキシグーゼ類　　　　グルコースオキシグーゼセイヨ
ウワサビベルオキ シグーゼ 他の酵素類　　　　　　ベーターがラクトシグーゼ ホス７アターゼ類 ホスホリラーゼ類 へキンキナーゼ類 適当な酵素類のリストは、ホーク（Ｉ（ａｗｋ）ら、実
際生理化学（ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ　　ＰＨＹＳ　１０Ｌ
ＯＧＩＣＡＬ　　ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）、ニューヨーク
、マクグロー−ヒル、３０６−３９７ページ（１９５４
）に記載されている。

蛍光発生酵素類（前記酵素類の存在下に、選択した基質
は蛍光生成物を生成するであろう）は、有用な標識部分
である。抗体の抗原との結合能力を損傷しないで酵素を
抗体に選択的に接合する方法は、この分野においてよく
知られている。適当な酵素類およびそれらを抗体類に接
合する適当な手順は、例えば、次の文献に記載されてい
る：イチロー・チバタ（Ｉ　ｃｈｉｒｏ　　Ｃｈｉｂａ
Ｌａ）　、固定化酵素（ＩＭＭＯＢＩＬＩＺＥＤＥＮＺ
ＹＭＥＳ）（５ｕｐｒａ）、Ａ、クアトレカサス（Ｃｕ
ａｔｒｅｃａｓａｓ）、ツヤ−ル・オブ・バイオロジカ
ル−ケミストリー　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、
　）　（５ｕｐｒａ）　、ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）
　、Ｍ、ら、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ
Ｏ）を抗体に接合する過ミウ索酸塩法における最近の発
展、免疫蛍光および関連する着色技術における国際会議
（ＩＮＴＥＲＮＡＴＴＯＮＡＬ　　Ｃ０ＮＦＥＲＥＮＣ
Ｅ　　ＩＮＩＭＭＵＮＯＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ　　
ＡＮＤＲＥＬＡＴＥＤ　　５ＴＡＩＮＩＮＧ　　ＴＥＣ
ＨＮＩＱＵＥＳ）　、Ｗ、ナツプ（Ｋ　ｎａｐｐ）ら編
、アムステルダム：エルセヴイーア（Ｅ　１ｓｅｖｉｅ
ｒ）、２１５−２４４ページ（１９７Ｂ）、スリパン（
５ｕｌｌｉｖａｎ）　、Ｍ、　　ら、酵素のイム／アッ
セイ（Ｅ　ｎｚｙｍｅ　　Ｉ　Ｉｌｌｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ）　：　　リビュー、７ナル２２１−２４０（１９７
９）　、ニグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）　、Ｈ，ら、／　”
”　４　ｈ　ｎｔ　−ｔ（７仁ｔｏ！　−Ｍｃｄｉ組［
」１互ｌ江）、５７：　　１８７−１９１（１９７９）
、７ドカリ（Ｇａｄｋａｒｉ）　、Ｄ、　　ら、ノヤー
ー２２４（１９８５）、チノセン（’［’　１ｊｓｓｅ
ｎ）、Ｐ、ら、アナリティカル・バイオケミストリー←
Ａ１吐、上ユ姪舶！Ｉ１．　）　、１３６：　　４５１
−４５７（１９８４）、ツルク（ＴｕｒｕＬａ）　、Ｊ
　、　　ら、３（８）７６７−７７７（１９８５）　、
および米国特許第４，１９０．４９（３号（上に列挙し
た文献の内容全体をここに引用によって加える）。好ま
しい蛍光発生Ｗｇ素類およびそれらに対応する適当な基
質類は、次のものを包含する：セイヨウワサビペルオキ
シダーゼ、これに対して適当な基質はホモバニリン酸ま
たは４−ヒドロキシ−３−７トキシーフエニル酢酸であ
る、ベーターがラクトシグーゼ、これに対して適当な基
質は４−メチルウンベリフェリルベーターＤ−ｆｆラク
トシダーゼである、アルカリ性ホスファターゼ、これに
対して適当な基質は４−７チルウンペリ７エリルホス７
エートおよび他のウンベリフェリルホスフェート、例え
ば、４−カルポキシウンベリ７ヱリルホス７エートおよ
びウンベリフェリルホスフェート、例えば、４−カルボ
キシアルキル−エステルなどである。

抗体を酵素で標識するために適当な手順の例は、カーポ
ジイミド類、ジアルデヒド類、および二官能性カップリ
ング試薬の使用を包含する。アミド基を通す酵素類の連
結は、蛋白質を塩化チオニル、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミドまたは同様な試薬で無水溶媒、例えば、ジメチル
ホルムアミド、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、テ
トラヒドロ７ランなどの中で処理することによって達成
できる。別のカップリング試薬は、カーポジイミド類、
例えば、１−エチル−３−（３−Ｎ、Ｎ’−ツメチルア
ミ／プロピル）カーポジイミドまたは１−シクロヘキシ
ル−３−（２−モルホリノエチル）カーポジイミドメチ
ル−９−）ルエンスルホネートを包含する。

酵素の炭水化物の部分は、また、アルデヒドに酸化し、
そして免疫グロブリンのりジルアミ７基と反応させてシ
？７を期を形成することができる。

ホウ水素化ナトリウムを使用する還元は、酵素と抗体と
を安定に連結する。セイヨウワサビペルオキシダーゼお
よび抗体は、上のウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ　）の方法
によって免疫グロブリンに効率的に連結することができ
る。

蛍光標識した抗体は、この分野において既知の標準蛍光
性部分から調製できる。抗体および他の蛋白質は波長が
約３１０ｎｍまでの光を吸収するので、蛍光性部分は３
１０ｒ＋ｍより艮い波長、好ましくは４００ｎ論より長
い波長の光を＊質的に吸収するように選択すべきである
。種々の蛍光体は、スチリア−（Ｓ　ｃｒｙｅｒ）　、
サイエンス　５Ｃ１ｅｌ坦）、１Ｇ２：　５２６（１９
６８）およびブランド（Ｂｒａｎｃｌ）　、Ｌ、　ら、
「構造のための蛍光性プローブ（Ｆ　１ｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔ　　ｐｒｏｂｃｓ　　ｆｏｒ　　５ｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ）Ｊ、７ニユアル・リビユー・オプ・バイオケミスト
リ４１：　８４３−８ｆ３８（１９７２）に記載されて
いる。抗体は、例えば、米国特許第３＋９４０ｔ４７５
号、米国特許第４，２８９，７４７号および米国特許第
４，３７６．１１０号に記載されているような普通の手
順によって、蛍光性基で標識することがで終る。

ある数の前述の望ましい性質を有する蛍光体の１つの群
はキサンチン色素類であり、これらは３゜６−シヒドロ
キシー９−フェニルキサントヒトロールから誘導された
フルオレセイン類、および３゜６−ジアミツー９−フェ
ニルキサントヒドロ−７しおよびリスアミンローダミン
から誘導体されたレスアミン類およびローダミン類を包
含する。ローダミンお上び９−０−カルポキシフェニｌ
レキサントヒトロールのフルオレセイン誘導体は、９−
〇−カルボキシフェニル基を有する０反応性カップリン
グ基、例えば、アミ７基およびイソ千オシアネート基を
有するフルオレセイン化合物は、例えば、フルオレセイ
ンイソチオシアネートおよびフルオレスカミンは容易に
入手可能である。

蛍光性化合物の他の群は、アミ７基をアルファまたはベ
ータの位置に有するす７チルアミン類である。す７チル
アミ／化合物には、１−ツメチルアミツナ７チルー５−
スルホネート、１−７ニリノー８−す７タレンスルホネ
ートお上り２−ｐ−トルイノルー６一す７タレンスルホ
ネートが包含される。他の色素には、次のものが包含さ
れる：３−フェニル−７−イツシ７ナトクマリン；アク
リノン類、例えば、９−イソチオシアナト７クリノンお
よびアクリノンオレンジ；Ｎ−［ｐ（２−ベンゾキサゾ
リル）フェニル］マレイミト：ベンゾキサノオゾール類
、例えば、４−クロロ−７−ニドロベンゾー２−オキサ
−１，３−ジアゾールおよび？−（ｐ−ノドキシベンシ
ル７ミノ）−４−二トロベンゾ−２−オキサ−１，３−
ジアゾール；スチルベン類、例えば、４−ツメチルアミ
／−４゛−イソチオシアナトスチルベンお上り４−ツメ
チルアミ／−４°−マレイミドスチルベン；Ｎ、Ｎ”−
ジオクタデシクロキサカルボキシアミン−９−）ルエン
スルホネート；　ピレンＭ、例りば、８−ヒドロキシ−
１，３，６−ピレントリスルホン酸、１−ピレン酪酸、
メロシアニン５４０゜ローズベンガル、２，４−ノフェ
ニルー３（Ｈ）−７ラノン、Ｏ−７タルデヒド、ならび
に他の容易に入手できる蛍光性分子、これらの色素は活
性官能性を有するか、あるいはこのような官能性は容易
に導入することができる。

例えば、抗体は、ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、Ｊｏ
、モノクローナル抗体：原理および実際（ＭＯＮＯＣＬ
ＯＮＡＬ　　ＡＮＴ　Ｉ　ＢＯＤＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬ
ＥＳ　　ＡＮＤ　　ＰＲＡＣＴＩＣＥ）、ニューヨーク
、アカテ°ミック・プレス、２０８−２４９ベーノ（１
９８３）に記載−！−れでいる手順によって、フルオロ
クロームＪＪ［Ｔ　標ａすることができる。、フルオロ
クロームの濃度はゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）　、２
２９ページの表１こ従って選択される６例えば、ＤＭＳ
Ｏ中のフルオレセインイソシアネー）　（１、Ｏｍｇ／
　ｒａｌ）またはローグミンイソシアネー）（１０，０
−ｇ／饋ｐ）をｒＩ４製し、そして所望容量（合計の蛋
白質溶液の容量の１〜１０％）を、攪拌しながら、調製
溶液に嫡々添加する。この反応は、光を遮断して、２時
間進行させる。生成物は、０．１％のＮ　ａ　Ｎ　Ｏｓ
を含有するＰＢＳ中のセフＴセックス（Ｓ　ｅｐｂｄｅ
ｘ）　Ｇ　−２５ゲルを使用するゲル濾過によって精製
して、未反応または加水分解したフルオロクロームを除
去する。接合体の吸収を２８０ｎ輪および可視卸域にお
けるそのピーク（フルオレセイン化抗体について４９５
ｎ鶴お上りローダミン化抗体について５５０ｎｍ）にお
いて測定する。フルオロクローム対蛋白質の比を、上の
ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）　、２２４−２２５ベー
７の手順に従って計算する。接合体は、使用するまで光
から保護して、４°Ｃにおいて貯蔵する。抗体溶液の濃
度がＩＢ／ｍｆより低い場合、ＢＳＡをこの決定に１ｍ
ｇ／ＰＩの最終濃度に添加する。

本発明の抗体は、本発明の１つの実施態様において、ア
ビノンまたはビオチンに共有結合することができる、適
当な結合手順は、二官能性架橋剤を通す架橋を包含する
。適当な二官能性化合物は、ぺ一ターズ（Ｐｅｔｅｒｓ
）　、Ｋ、ら、Ａ貼よ」（慧。

Ｂ　１ｏｃｈｉ１１．４６：　５２３（１９７７）に記
載されている。アルキルイミデート類は、蛋白ｆｆ１ｌ
こよりそれらに対して提供された官能性基にうちで高度
の特異性を示す、この反応は第一アミノ基に対して特異
的である。適当なカップリングの例は、次。

のちのを包含するニアミドエステル類、例えば、ツメナ
ルマロンイミデート、アット類、例えば、イミノ基と容
易に反応してアミド結合を形成するタードリルジアジド
のアシルアット、アリールシバライド、例えば、１，５
−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、またｌ！　
４　ｔ　４　’　−１７ルオロー３，３′−ノ二トロフ
ェニルスルホン、グルタルアルデヒド、１−エチル−３
−（３−ツメチルアミノプロピル）カーポジイミド塩酸
塩、ツマレイニド、混合無水物、ｌ−マレアミドベンゾ
イルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、および他
の既知の架橋剤。

」二の試薬は本質的に不可逆の結合を提供する。

官能基をもつ二官能性試薬、例えば、ノサルファイドま
たはグリフールを使用できる。これらは、必要に応じて
、架！ｌｌｌ１又応後破壊できる結合を提供する。この
ような試薬の例は、次の通りである二ツメチル３．３゛
−ジチオビスプロピオンイミデート、スクシニミジルプ
ロピオンイミデート、Ｎ−（３−フルオロ−４，６−シ
ニトロフエニル）−シスタミン、タードリルジアジド、
タートリルノ（グリンルアジド）およびタートリルジ（
ニブシロン−アミ７カプロイルアノド）。

他の場合において、結合は試薬それら自体の間で直接形
成することができる。例えば、抗体はぞれぞれの物質上
の官能基を通してビオチンへ結合することができる。特
定の例として、ビオチンを過ヨウ素酸塩で処理し、そし
て抗体と反応させて、ビオチンの７ビジンへの結合を阻
害しないで、あるいは抗体の免疫学的活性を遮断しない
で、シッフ塩基を得ることができる。

二官能性架橋剤を使用する既知の技術は、次のものを包
含する（ａ）１工程のグルグルアルデヒドの結合、７プ
ラメアス（Ａｖｒａｍｅａｓ）　、Ｓ、　ｓ”’（Ｉｍ
ｍｕｎｏｃｈｅ＋５ｉｓｔｒ　）　、６：　４３（１９
６９）；（ｂ）２工程のグルタルアルデヒドの結合、ア
ブラメアス（Ａｖｒａａ＋ｅａｓ）　、Ｓ−、り良俗免
ＬＬ竺吐虻匝１蛙１）　、８　：　１１７５　（１９７
１）；および（ｅ）シマレイミドの結合、カド（Ｋａｔ
ｏ）　、Ｋ、ら、ユーロビアンΦツヤ−ル・オプ・バイ
オケミストリー　Ｅ　ｕｒ、　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅ
ｍ、）６２：　２８５（１９６６）。

抗体は、７ナトウイツチ（Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ）　、Ｄ
　。

３５（６）：　　５５４−５５７（１９８４）およびブ
ックレイ（Ｂｕｃｋｌｅｙ）　、Ｒ，ら、７エグレイシ
ヨン・オブ・ユーロピアン・バイオケミカル・ンサイア
テイーズ（Ｆ　ｅｄｅｒａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｅ　ｕ
ｒｏｐｉａｎＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　５ｏｃｉｅＬ
ｉｅｓ）　、１６６（１）　２０２−２０４（１９８４
年１月）に従う手順にυｔつで、金属の放射核で標識す
ることができる。この手順において、抗体は、金属放射
核とキレートを形成できるキレート剤、例えば、ジエチ
レントリアミンペンタ酢酸と接合される。ＤＴＰＡ（ジ
エチレントリアミンペンタ酢！！１りの二環式無水物の
０　、１　ｒａｇ／　ｍｌの懸濁液を、乾燥溶媒、例え
ば、クロロホルム、エーテルまたは乾燥ＤＭＳＯ中で調
製する。アリコートをＤＴＰＡ対免疫グロブリンのモル
比を１：　１とするために十分な量で取り出して清浄な
乾燥した管へ入れ、そして窒素の下に蒸発させる。生理
的食塩水中の０．０５モルの重炭酸塩の緩衝液、ｐＨ７
，０−７，５、中の使用する抗体溶液の１０〜２０マイ
クロタイターの部分を乾燥ＤＴＰＡに添加し、そして内
容物を同一緩衝液で０．２＋ｎｌに希釈し、そしてセフ
ァデックスＧ−２５デルの５ｃ輸のゲル濾過カラムで精
製し、生理的食塩水で溶離する。カップリングの効率は
、０．０５モル酢酸塩Ｈ，衝吸収ｐＨ６，０、中の「キ
レート等級」のｌｌｌＩｎの添加によって、精製前に決
定する。カップリング効率の計算のために、薄層クロマ
トグラフィーを使用して、ＤＴＰＡカッブリングした抗
体を分離する。ＤＴＰＡカップリングした抗体を、金属
放射性核、例えば、口Ｉ　Ｉｎ＋３．２１２Ｂｉ＋コお
よび”Ｇａ”との結合に必要になるまで４℃で貯蔵する
。

本発明の好ましいサンドイッチアッセイ法において、抗
動脈内脂肪沈積抗体を付着する不溶性支持体を患者の血
清と十分な時間接触させて、血清中の、存在する場合、
抗イディオタイプ抗体を、不溶性支持体上の抗動脈内脂
肪沈積抗体と接合させ、次いで患者の血清を支持体から
除去する。インキュベーン８２時間は実質的な接合を起
こさせるために十分であるべきであり、この時間は温度
に依存する。、適当なインキュベーション時間は１６〜
４０℃の範囲内お温度において２０〜２４０分であり、
好ましい接触時間は２０〜２６℃の範囲内の温度におい
て少なくとも６０分である６次いで、残留する血清をか
ら洗浄溶液の使用により除去する。普通の洗浄溶液を使
用できる。好ましい洗浄溶液は米国特許第４，５２８，
２６７号に記載されている。それは０．０００１〜０８
Ｏ５のモル濃度、ｐＨ６〜８を有し、そして０゜００１
〜０．１重量％の非イオン性界面活性剤を含有する水性
リン酸塩緩衝液である。適当な非イオン性界面活性剤は
、次のものを包含する：ポリオキシエチレンエーテル（
ＢＴＩＪ）、例えば、ラウリル、セチル、オレイル、ス
テアリル、およびトリデシルポリオキシエチレンエーテ
ル；ポリオキシエチレンソルビタン（ＴＷＥＥＮ）　、
例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
、モノパルミテート、モノステアレート、モノオレエー
ト、およびトリオレエート；および他のポリオキシエチ
レンエーテル（例えば、ＴｔＴＯＮ）、好ましい非イオ
ン性界面活性剤は、４０のエチレンオキシド単位を有す
るオクチル７二／キシポリエトキシエタノール（ＴＲＩ
ＴＯＮ　　Ｘ−４０５、ローム・７ンドφハース・カン
パニー）である。

次いで、不溶性支持体を、標識したヒト以外の抗ヒト１
Ｂ抗体と接触させ、この標識した抗体は不溶性支持体に
付着する抗イディオタイプ抗体と結合するであろう。

種々の標識を前述した。明瞭をＨ的として、この方法の
引続く工程を、酵素、好ましくは蛍光発生Ｍ、素で楳Ｒ
された抗ヒトＩＩ？抗体について説明するが、これは限
定を意味するものではない。用８ｎ「蛍光発生酵素」は
、ユニおいては、適当な基質と蛍光団生成物を生成する
であろう酵素を意味する。

酵素標識した抗ヒトＩｇ抗体を、水溶液中で不溶性支持
体に適用する。この溶液は、好ましくは、反応成分を保
存しかつ接合反応を促進するために、適当な塩類および
緩衝剤類を含有する。例えば、この溶液は、ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）　、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）、お
よび前述の洗浄溶液中に使用した穏和な界面活性剤、例
えば、ポリオキシエチレンソルビタンエーテルを含有す
ることができる。インキュベージ３ンは十分な時間続け
て、標識した抗ヒトＩｇ抗体を、存在する場合、不溶性
支持体に付着する抗イディオタイプ抗体と接合させる。

好ましいインキュベーションの時間および温度は、不溶
性支持体に結合した動脈内脂肪沈積試薬との血清のアテ
ローム性動脈硬化症の抗イディオタイプ抗体との接合に
ついて記載した通りである。

次いで、標識した抗ヒトＩｇ抗体の溶液を不溶性支持体
から除去し、そして支持体を洗浄溶液、例えば、前述の
溶液で洗浄して、残留するかも知れない接合しない標識
した物質を除去する。

本発明のサンドイツチ法の第３工程において、不溶性支
持体を基質の水溶液と接触させ、この基質は酵素の存在
下に反応して蛍光化合物を溶液中に放出する。転化され
うる適当な基質および酵素は、例えば、米国特許第４，
１９０，４９６号および米国特許第４，５２８，２６７
号に記載されている。支持体は、１０−２〜１０−１０
モル濃度の基質を含有する水溶液と接触させる。１０−
４〜１０−５モル濃度の２Ｓｉ質は好ましい６基質の７
８液中の好ましい追加の試薬および緩衝剤は、例えば、
２−アミ／−２−メチル−１−プロパツール緩衝剤およ
び塩化マグネシウムである。

この基質の溶液を不溶性支持体と一緒に十分な＋１ｉＨ
ＩＪＩインキユページタンして、蛍光団を発生する反応
を起こさせる。１８〜４０℃の温度において、５〜２４
０時間のインキュベーション時間を使用できる。好まし
くは、温度は２０〜２６゛Ｃの範囲内であり、そしてイ
ンキュベーン９２時間は３０〜９０分である。

次いで、溶液中の蛍光のレベルを測定する。基′質溶該
中の蛍光のレベルを決定する装置および手順は、この分
野において普通に使用されているものである。蛍光のレ
ベルは不溶性支持体上の＃、′Ａの濃度の関数であり、
そしてＭ、索の濃度は血清試料中の抗イディオタイプ抗
体の量の関数である。

アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗イディオ
タイプ抗体の濃度は、溶液の蛍光のレベルを、既知濃度
の抗イディオタイプ抗体を含有する対照溶液で得られた
蛍光のレベルと比較することによって決定することがで
きる。

本発明の１つの競合イム／アッセイ実施！！！様におい
て、既知の濃度の抗イディオタイプ抗体なその上に有す
る不溶性支持体を使用する。血Ｗｔ試料と既知濃度の標
識した抗動脈内脂肪沈積抗体との混合物を不溶性支持体
に十分な時間適用して、抗ヒト■８抗体を抗イディオタ
イプ抗体と接合させる。前述のサンドイッチイムノアッ
セイにおいて抗動脈内脂肪沈積抗体と抗イディオタイプ
抗体との接合について前述の時間および温度は適当であ
る。不溶性支持体から残留血清溶液を除去しかつ洗浄し
た後、不溶性支持体上または血清混合物中に残留する標
識を決定することができる。標識が蛍光発生酵素である
場合、不溶性支持体上の標識の量は、不溶性支持体を適
当な基質溶成と接触させ、溶液中に蛍光団を発生させる
反応を起こさせ、そしてサンドイッチイムノアッセイの
実ｆ！態様に関して前述したように、蛍光のレベルを測
定することによって決定することができる。

競合イムノアッセイの他の実施態様において、不溶性支
持体はそれに付着した抗動脈内脂肪沈積抗体を有する。

次いで、血清試料と標識した抗イディオタイプ抗体との
混合物を不溶性支持体とともに十分な時間インキュベー
ションして、抗動脈内脂肪沈積抗体を抗イディオタイプ
抗体と接合させる１次いで、不溶性支持体上の標識また
は血清溶液中に残留する＄２識の量を決定する。１２ｎ
が蛍光発生＃索である場合、不溶性支持体上の標識の量
は、不溶性支持体を適当な基質溶液と接触させ、溶液中
に蛍光団を発生させる反応を起こさせ、そしてサンドイ
ッチイムノアッセイの実施態様に関して前述したように
、蛍光のレベルを測定することによって決定することが
できる。

本発明を以下の特定であるが、非限定的実施例によって
さらに説明する。Ｖｆ記しないかぎり、反応はセ氏であ
り、そして百分率は重量による。実施するために構成的
に縮小した実施例は現在の意味で記載されてお９、そし
て前もって実施するために縮小した実９．室の実験を表
わす実施例は過去の意味で記載されている。

実施例１ アユローム性徴」」Ｕ旧（凸勉−脈青１μＵトλ−動脈
内ｇ（動脈内脂肪沈積）を内側層から切除し、そして０
．９Ｎの生理的食塩水でＴＩ８単に洗浄する。動脈内脂
肪沈積を小さい片（２Ｘ２ｍｍ）に切り、そしてこの組
總を０．１５モルのＰＢＳ％ｐＨ７，２、中で高速度で
４℃において３０〜６０秒間均質化した。このホモジネ
ートを４°Ｃにおいて３０分間遠心（２００ＯＸＦ１）
する。」二澄みを取ってお（ａ均質化およゾ遠心の工程
を反復し、上澄みをプールする。制菌量のアジ化ナトリ
ウムをプールした上澄みに添加し、そして上澄みを４℃
で貯蔵する。

実施例２ セファローズへの碩良へ１１ 凍結乾燥したＣＮ　Ｂｒ−セファローズ（Ｓ　ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ）４Ｂ粉末ｆフアーマシア（Ｐ　ｂａｒ＋ａａ
ｅｉａ）　１を１ミルモルのＨＣｌ中で１５分６（１ｇ
潤させる。

このデルを、焼結ガラスフィルター（多孔度Ｇ−３）上
において、デルの１８（乾燥重量）につき合計２００ｍ
１の１ミリモルのＨＣｌで洗浄する。

これはいくつかの７リコートで’＃＊１ｌ−ｉＴ＋九か
連続添加の間に吸引する。

デルの１ｍｌにつき５Ｂのカップリングすべき蛋白質を
、カップリング緩衝液（０，１モルのＮａＨＣＯ，、ｐ
Ｈ８，３，０，５モルのＮａＣ１を含有する）中に溶解
する。ゲルをカップリング緩衝液で洗浄し、過剰量を吸
引により除去し、そして蛋白質溶液をデルと混合物する
。この混合物を攪拌しないで４℃で一夜放置する９次い
で、ゲルを１　′モルのエタノールアミンを含有するブ
ロッキングａｈａ、ｐＨ８，０、中に室温において２時
間配置する。次いで、ゲルをカップリング緩衝液（０゜
１モルの酢酸ｍａｉｎ、ｐＨ４，０，０，５モルのＮａ
Ｃ１を含有する）で洗浄し、そしてカップリング緩衝液
で２回洗浄する。ここで蛋白質−セ７アローズ接合体は
使用できる状態にあり、そして４〜８℃において貯蔵す
ることができる。制菌剤として臭化シアンを緩衝液に添
加することができる。

実施例３ １麩泗−脂Ｉｔ　　上゛みからのＴｆｆＧＪ１体！Ｌ或
−艷合計約１３０Ｂの抗１．Ｇ抗体を含有する、実施例
２の手順に従い調製した抗ＩｇＧ抗体に接合したセファ
ローズデルの２５ｍ１をカラムに充填す。

る。このカラムを２〜３容量の１ｔｊＬ衝液（０，１５
モルのＰＢＳ％　ｐＨ７，２）と平衡化し、次いで試料
をこのカラムの適用する。溶離緩衝液（０゜１５モルの
ＰＢＳ、ｐＨ７，２）の流速は１０〜１５鍋ｌ／時間で
ある。

次いで、このカラムを１０×容量の０．１５モルのＰＢ
Ｓ％ｐＨ７，２、で洗浄する。

次いで、カラムを蒸留水で洗浄して、免疫親和結合した
ＩｇＧ抗体を脱着する。カラムを追加の蒸留水で１５〜
２０ｗ１／時間の速度で溶離し、溶離した試料を集め、
そしてピークの分画な保持する。ピークの分画な０．１
５モルのＰＩ３５％ｐＨ７，２、に討して４℃において
、多数回１１衝液を交換しながら、２４〜３６時間透析
する。

次いで、カラムを１０×体積の０．１５モルのＰＢＳ、
ｐＨ７，２、で洗浄する。

実施例４ 動Ｊ（の」ｉＩ〔−上澄みからのＩｇＧｒ体の吸礼実施
例２の手順に従って調製した抗ＩｇＡ抗体に接合したセ
ファローズデルの７．５１を充填したカラムを使用して
、実施例３の手順を反復する。溶離ＰＢＳ緩衝液の流速
は１５〜２０１／／［１？間である。

実施例５ ｇＪｌｆｆｌ−ル尤−穫上」みか６ｐＩｊ〜灸髭に４炙
」実施例２の手順に従って調製した抗ＩｇＡ抗体に接合
したセファロ−Ｘ′デルの１．Ｓ＠ｌをを充填したカラ
ムを使用して、実施例３の手順を反復する。溶離ＰＢＳ
援衝液吸収速は１５〜２０ｍ４／時間である。

実施例６ 肱員カー肺級夫劉、ｈ　’ｐ　ｊｈ　ｈ４五ｐ−レｑ粛
−帆Δ１」北実施例２の手順に従って調製した抗１ｇＭ
抗体に接合したセファローズゲルの７．５１１１１を充
填したカラムを使用して、実施例３の手順を反復する。

溶離ＰＢＳ緩衝７夜の流速（土１５〜２０＋ｎ／／瓜？
ｌｌ１１であろ− 実施例７ 肱迷潰ｍ匙■至Ａ１１一 実施例３の手順に従って得られた動脈内脂肪沈積に特異
的に結合するＩｇＧ抗体を、実施例２の手順に従ってセ
ファローズに結合して、動脈内脂肪沈積抗原に対してｖ
ｆ異的に結合する親和カラムのデルを形成する。

抗動脈的脂肪沈積ＩｇＧ抗体に接合したセファローズデ
ルの２５ｍ１をカラムに充填する。このカラムラ２〜３
　容量〕１１衝ａ（０，１５モルのＰＢＳ、ｐＨ７，２
）と平衡化し、そして実施例１に従って得られた動脈内
脂肪沈積溶液をこのカラムに１０〜１５ｍ１／分の流速
で適用する。次いで、このカラムを１０Ｘ容１の１．５
モルのＰＢＳ。

ｐＨ７，２、で洗浄する。

溶離緩衝Ｒ（０，１５モルのＰＢＳＳｐ８７゜２）の流
速は１５〜２０Ｉ１１１！／時間である。動脈内脂肪沈
積を含有する溶離した分画を、ピーク活性が消失するま
で、集めて動脈内脂肪沈積を得て、これに抗動脈的脂肪
沈積ＩｇＧ抗体は特異的に結介する。

次イテ、カラムを１０Ｘ’＄ｆｉのＰＢＳ、ｐＨ７゜２
、で洗浄する。

それぞれ、実施例４−６の手順に従って得られた抗動脈
内脂肪沈積ＩｇＡ抗体、抗動脈内脂肪沈積ＩｇＥ抗体お
よび抗動脈内脂肪沈積１ｇＭ抗体を抗動脈内脂肪沈積１
．Ｇ抗体の代わりに使用して、上の手順を反復して、抗
体が特異的に結合する対応する動脈内脂肪沈積の分画を
得る。

実施例８ ポリクロ−ル　　」１１肪ＩＬＬｆＬ 実施例７の手順に従って調製したアテローム性動脈硬化
症の動脈内脂肪沈積の抗原に対するポリクローナル抗血
清を、文献、例えば、ストラー（Ｓ　ｔｏｌｌａｒ）　
、＃　　　ｎｊ　’　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　Ｅｎｚ　ｒ
ａ口）、７０：　７０（１９８０ンに記載されている免
疫技術およびスケジュールを用いてウサギにおいて誘発
する。この抗血清を、例えば、ランデ（Ｌａｎｇｅ）ら
、クリニカル・アンＹ・イクスベリメンタルーイム／ロ
シー（Ｃｌ１ｎ、　Ｅｘｐ、　　Ｉｍｍｕｎ。

１、）、２５：　　１９１（１９７６）およびピセトス
キ−（Ｐ　１ｓｅｔｓｋｙ）ら、ジャーナル・オプ・イ
ム／ロジカルφメソッズ（Ｊ　、Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、　
Ｍｅｔｈ。

ｄｓ）　、４１：　１８７（１９８１）に記ネ又されて
いるようにして、モノクローナル抗体について使用する
ものにＭ県する固相アッセイにおいてスクリーニングす
る。初期のスクリーニングの基準は、アテローム性動脈
硬化症の動脈内脂肪沈積の抗原への結合であろう。

抗血清のＩＦＩＧ分画は、実施例３の手順に従い、動脈
内脂肪沈積抗原がその上に固定化され−Ｃいる樹脂を含
有するカラムの親和クロマトグラフィーによってさらに
精製する。

実施例９ モノクローナ７り七珈氏へ貫をｎ眉填イト−実施例７の
手順に従って調製し、精製したアテローム性動脈硬化症
の動脈内脂肪沈積の抗原を使用して、この動脈内脂肪沈
積抗原に対するモノクローナル抗体を、〃ルアしく　Ｇ
ａ１ｆｒｅ）およゾミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｏ）
、１１工Ａ方フ工Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｎｏｌ、　
）　、７３：　１（１９８１）の標準手順に従って得る
。このモノクローナル抗体を、文献、例えば、ランデ（
Ｌａｎｇｅ）ら、クリニカル・７ンド・イクスベリメン
タル会イム／ロノ−ＣＩｉｎ、　Ｅｘ、　　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、　）、２５：　１９１（１９７６）およびビセト
スキー（Ｐ　１ｓｅｔｓｋｙ）ら、ツヤ−ナル・イブ・
イム／ロジカル・メンツズ　　Ｊ、　　Ｉｍ＋ｎｕｎｏ
ｌ、　　Ｍｅｔｂｏｄｓ）　　、　４　１　：　　１　
８　７（１９８１）に記載されている技術の修正に従い
スクリーニングする。直情動脈内脂肪沈積抗原（または
その免疫複合体）のアッセイのために有用であるために
は、モノクローナル抗体は高い親和性（好ましくは、Ｋ
　　１０１’／Ｍ）をもって動脈内皿肪沈積抗原に結合
すべきである。

マウスのモノクローナル抗体を２工程の手順で精製する
。純粋な腹水を、１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、０．
１５モルのＮａＣｔ’、９Ｈ８，Ｏ，で平衡化したアフ
イーデル（Ａｆｆｉ−Ｇｅｔ）　Ｆｊｌ脂（バイオ−ラ
ド・ラボラトリーズ、カリ７オルニ７州リツチモンド）
のカラムに適用し、そして同−援衝液液で溶離する。こ
の工程はアルブミンを除去し、このアルブミンはカラム
上に保持される。精製の最終工程はデアニーセファロー
ズ（７アーマシア・ファイン・ケミカルス、ニューシャ
ーノイ州ビスカタウヱイ）への適用および１０ミリモル
のトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０、がら１０ミリモルのト
リスートＩＣＩ、１００ミリモルのＮ　ａ　ＣＩ！の直
線勾配による溶離である。これにより、血清蛋白質、例
えば、アルブミンおよびトランスフェリンに汚染されて
いない精製されたマウスのモノクローナル抗体が得られ
る。

実施例１Ｏ ポリクローナル　イーイオタイブ　−俸ユ実施例８の手
順を反復するが、ただし、免疫化因子は実施例３の手順
に従って調製した新鮮なプールしたヒト動脈内脂肪沈積
から抽出したヒト抗動脈内脂肪沈積抗体であり、そして
抗血を青は、実施例３の手順に従い、ヒト抗動脈内脂肪
沈積抗体がその上に固定化されている↑３４脂を含有す
るカラムの親和クロマトグラフィーによってさらに精製
する。溶離液はウサギ抗イディオタイプ抗体を含有する
。

実施例１１ ポリクローナル　イディオタイプ乳制 実施例８または９の手順に従って調製したアテローム性
抗動脈内脂肪沈積抗体に討するポリクローナル抗血清を
、免疫化因子としてヒト抗動脈内脂肪沈積抗体を使用し
て、そして、文献、例えば、。

ストラー（Ｓ　ｔｏｌｌａｒ）　、肌■ｏ　ｄ　５Ｅｎ
ｚＩＩｏ１．）　、７０：　７０（１９８０）に記載さ
れている免疫技術およびスケ７ュールを用いてヤギにお
いて誘発させる。この抗血清を、例えば、Ｔｍｍｕｎｏ
ｌ、）、２５：　　１９１（１９７６）および鮭屡上回
ユ）、４１：　　１８７（１９８１）に記載されている
ようにして、モノクローナル抗体について使用するもの
に類似する同相アッセイにおいてスクリーニングする。

初期のスクリーニングの基準は、アテローム性動脈硬化
症の動脈内脂肪沈積の抗原への結合であろう。

抗血清のＩｇＧ分画は、実施例３の手順に従い、抗動脈
内脂肪沈積抗体がその上に固定化されている樹脂を含有
するカラムの親和りａマドグラフィーによってさらに精
製する。

実施例１２ モノクローナル　イディオタイプ先制 実施例９の手順に従うが、ヒト抗動脈内脂肪沈積抗体に
結合する上澄みについてクローンをスクリーニングし、
抗イディオタイプ抗体を生ずるハイブリドーマを得る。

異なる抗イディオタイプ抗体を生成するいくつかのクロ
ーンは、モノクローナル抗体のカクテルの使用のために
好ましい。

実施例１３ モノクローナルＷオタイブ灯（ 実施例９の手順に従うが、実施例８の手順により得られ
たヒトポリクローナル抗動脈内脂肪沈積抗体でマウスを
免疫化し、そして抗動脈内脂肪沈積抗体に結合する上澄
みについてクローンをスクリーニングし、抗イディオタ
イプ抗体を生ずるハイプリドーマを得る。異なる抗イデ
ィオタイプ抗体を生成するいくつかのクローンは、モノ
クローナル抗体のカクテルの使用のために好ましい。

実施例１４ モノクローナル杭Δｌ工１叉Ａ−７遣！℃−本一実施例
９の手順に従うが、実施例８の手順により得られたウサ
ギまたはヤギの抗動脈内脂肪沈積抗体でマウスを免疫化
し、そして抗動脈内脂肪沈積抗体に結合する」二澄みに
ついてクローンをスクリーニングし、抗イディオタイプ
抗体を生ずるハイブリドーマを得る。異なる抗イディオ
タイプ抗体を生成するいくつかのクローンは、モノクロ
ーナル抗体のカクテルの使用のために好ましい。

実施例１５ 髭丸隨青訓典荒Ｊ徂本二悼旦−仁２−町！エタープレー
ト 実施例８の手順に従って調製した抗動脈内脂肪沈積抗体
の調製した希釈物の１００マイクロタイターを、イムロ
ン（ＩＭＭＵＬＯＮ）Ｉ　Ｉマイクロタイタープレート
［グイナテク（Ｄｙｎａｔｅｃ）　］の表面に適用する
。被覆溶液の濃度は１〜５マイクログラム／ウエルであ
るように選択するが、他の試薬および従うべきイムノア
ッセイ手順の選択に依存して上下させることができる。

プレートを軽くたたき、被覆溶液が各ウェルの底を完全
に覆うようにする。ウェルな４°Ｃにおいて蓋をした湿
潤箱内で一夜インキユベーシタンする。

被覆溶液を廃棄し、そして２００マイクロタイター／ウ
エルのＰＢＳ中の１％のＢＳＡを添加する。次いで、ウ
ェルを湿潤箱内で室温において１時間インキュベーショ
ンし、そしてＢ　Ｓ　Ａ　ＦＪ　ｅを除去する。次いで
、ウェルを２００マイクロタイターの洗浄緩衝液ＣＰＢ
Ｓ、０．５％のツイーンおよび０．０２％のアノ化ナト
リウム）で洗浄し、そして湿潤箱内で４℃において使用
するまで貯蔵する。

実施例１６ 披／−ヱエエーＬ−仁方佐雀二豆一礁したマイクロタ血
タープレート 実施例１５の手順を反復するが、実施例１０の手順に従
って生成した抗イディオタイプ抗体を抗動脈内脂肪沈積
抗体の代わりに使用して、ポリクローナル抗イディオタ
イプ抗体で被覆したウェルをもつマイクロタイタープレ
ートを調製する。

実施例１７ ｉｌ星ゑ１孟」１１μ９］ｔＪＬ沈紅皇実施例８または
９の手順に従って調製した抗動脈内脂肪沈積抗体を、Ｍ
、オ”スリパン（０゛５ｕｌｌｉｖａｎ）　ら、アナリ
テイへ四ユニｊ４オケミスしり−（Ａ　ｎａ！、　　Ｂ
　１ｏｃｈｅ＋ａ、　）、１００：１００（１９７９）
（その内容全体をここに引用によって加える）の修正手
順に従い、アルカリ性ホスファターゼと接合する。

セイヨ・シワサビベルオキシグーゼを抗血Ｊ脈内刀■肪
沈積抗体１こ、次のようにして、ニグレン（Ｎｙｇｒｅ
ｎ）　、Ｈ，ら、乙グイカルφバイヨ（Ｅ−Ｌ：Ｌｙヱ
殻−レー抜江）、５７：　　１８７　１９１（１９７９
）の手順に従い接合する。セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ％　ＩＩ型またはＶＩ型、シグマ）を、０
．２５％のグルタルアルデヒド（ＧＡ、ボラロン）を含
有する０、０５モルの炭酸塩：ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９
，５、中に溶解する。室温において２時間後、過剰のＧ
ＡをＧ　Ａ　−１（ＲＰから、０．１５モルのＮａＣｌ
を含有するセファローズＧ−２５カラム（０，７１２ｃ
ｍ、７アーマシア）で分離する。ＧＡ−ＨＲＰ複合体を
、第２工程において、０．１５モルのＮａＣ１を含有す
る０、０５モルの炭酸塩：ｖ、炭酸塩ｉｉａ、ｐｌ−■
９，５、中で、異なるＩｇＧ：ＨＲＰ比において４°Ｃ
で１６〜６４時間、抗体と混合する０反応はリシンを０
．０２モルの最終）裏皮に添加することによって停止さ
せる。

実施例１８ １λ探ス↓ｋＡΔ−云ｌツタイブ位−１４実施例１０〜
１４の手順に従って５１．１製した抗イディオタイプ抗
体を、Ｍ、オ°スリパン（ｏ’５ｕｌｌｉｖａｎ）　ら
、入土」１彷ヒＬへ４　Ｔ−ｔ　ｐ　、ろユ１−９７９
）（その内容全体をここに引用によって加える）の修正
手順に従い、アルカリ性ホスファターゼと接合する。

セイヨウワサビペルオキシダーゼを抗イディオタイプ抗
体に、次のようにして、ニグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）　、
Ｈ，ら、ム云ヱＪルφバイも凡！：ゴ」（色ｄ、Ｂｉｏ
胆江）　、５７　：　　１８７−１９１　（１９７９）
の手順に従い接合する。セイヨウワサビペルオキシダー
ゼ（ＨＲＰ、ＩＩ型またはＶＩ型、シグマ）を、０．２
５％のグルタルアルデヒド（ＧＡ、ボラロン）を含有す
る０、０５モルの炭酸塩：重炭酸塩杖１戒、ｐＨ９，５
、中に溶解する。室温において２時間後、過剰のＧＡを
Ｇ　Ａ　−ＨＲＰから、０．１５モルのＮａＣｊ！を含
有するセファローズＧ−２５カラム（０，７１２ｃｍ、
７アーマシア）で分Ｈ，する。Ｇ　Ａ　−１４ＲＰ複合
体を、第２工程において、０．１５モルのＮａＣ１！を
含有する０゜０５モルの炭酸塩：重炭酸塩緩衝１仮、ｐ
Ｈ９，５、中で、異なるＩＥＧ：ＨＲＰ比において４　
’Ｃで１６〜６４時間、抗体と混合する。反応はリシン
を０．０２モルの最終濃度に添加することによって停止
させる。

実施例１９ 実施例１０の手順に従って、ｉ１製した異なる濃度の抗
イディオタイプ抗体で被覆したマイクロタイタープレー
トの各々に、１００マイクロタイター／ウエルの試駿す
る患者の血清試料（１：　　１００の希釈）を適用する
。プレートを覆って乾燥を防止し、２時間インキュベー
ジシンする。血清を除去し、プレートを３回洗浄緩衝液
で洗浄する。

１００マイクロタイター／ウエルのアルカリ性ホスファ
ターゼ接合抗ヒトＩｇ抗体（シグマ）を各ウェルに適用
し、そしてプレートを覆って乾燥を防止し、２時間イン
キュベージタンする。酵素標識した抗体１８液を除去し
、そしてプレートを３回洗浄緩衝液で洗浄する。

次いで、１００マイクロタイター／ウエルの４−メナル
ーウンベリ７エリルホス７エー）！Ｆ；ＮｅＬ［３Ｍダ
イアグノスチック・システムス（Ｄｉａｇｏｓｔｉｃ　
　Ｓ　ｙｓｔｅｍｓ）　］をウウニに適用する１次いで
、マイクロタイタープレートを蛍光測定装置（Ｍグイア
グノスチック）で、最初の４０９６のＨＡみまたは１時
間に到達するまで、１０分毎に読む読みを他の２時間の
間３０分毎に続ける。

実施例２０ 訪１ヱＬＵ広尤（−凹１ 心筋梗塞症、心臓血管偶発発作で死亡した店者から解剖
で、あるいは外科的手順から、ヒト大動脈を得る。大動
脈を解剖して取囲む組織および脂肪を除去し、そして生
理的食塩水中で洗浄して汚染する血液を除去する。動脈
内脂肪沈積のセグメントを分離し、そして処理する。

動脈内脂肪沈積区域を除去し、そして２×２１ｍの小さ
い片に切断する０組織を生理的食塩水中で簡単に洗浄し
、そしてワーリングブレンダー内で等張リン酸塩緩衝化
生理的食塩水（ＰＢＳ）中で高速度で、８７．０〜７．
２において均質化する。このホモジネートを４　’Ｃに
おいて３０分間遠１　　心（２０００Ｘｇ）に遠心し、
そして溶離する。

この工程および引続く工程からの溶離液を取って３　　
おき、そして濃縮する。

沈降した破片を冷ＰＢＳ中で洗浄し、そして上、　　澄
みが透明になりかつ化学的または免疫化学的に検出可能
な蛋白質を含有しな（なるまで、上のように反復回松す
る。この段階で、可溶性蛋白質の、９５％以上が除去さ
れてしまう０次いで、沈降物を蒸留水中で洗浄し、そし
て０．０２モルのりエン酸塩緩衝液、ｐＨ３，２、で３
７°Ｃ１，：オイテ２時間攪拌しながら抽出する。この
溶離の手順の後、この混合物を３０分間遠心（２０００
Ｘｇ）する。

上澄みを０．５モルのＮａＯＨで中和し、そしてＰＢＳ
に対して一夜透析する。上澄みならびにプールしたＰＢ
Ｓ溶離液を真空透析および限外濾過により濃縮して、可
溶性動脈内脂肪沈積抗原の濃縮物を得る。

不溶性動脈内脂肪沈積抗原を分離するため、大動脈の動
脈内脂肪沈積の部分を異なる本質的で消化し、消化物を
ＰＢＳで抽出し、セして溶離液を前述のように濃縮する
。使用する酵素の組成物は、次のものを包含する：５ミ
リモルのＣａＣｌ２を含有する０、０５モルのトリス緩
衝液、ｐＨ７，４、中ノフラデナーゼ［１００単位／ａ
ｌｌ　；　０．　２％のＮａＣ１ｔ−含有する０、０３
５モルのＲ酸塩緩衝液、ｐＨａ、ａ、巾のｚ−＞スター
セ［２０単位／ｍｌＪ：２．５ミリモルのＭｇＣｌ２を
含有する０、１モルのリン酸−す）　１７ウムｍ（！ｉ
ｎ、ｐＨ７，０，中のＤＮ７−ゼ［５００単位／　ｍｆ
ｆ１ｌ　：　０　、　１５　モルｆ）Ｎ　ａＣｌｔｃ含
有する０、１モルの９ン酸−ナトリウムａＨ！Ｉｎ、ｐ
）（５，３、中ノヒフルｏ＝ｊｉ−セ［５０単位／ｍｌ
Ｊ：およ１２ミリモルのＥＤＴＡを含有する変性リンデ
ル（Ｒｉｎｇｅｒ）溶液、ｐＨ７，３、中のネツロアミ
ニグーゼ［１単位１０ＩＩＪ。大動脈の動脈内脂肪沈積
の１ｇにつき１０ｍ１の消化混合物を使用する。組織−
酵素の混合物の各々を、振盪水浴中で３７°Ｃにおいて
インキュベージランする。インキュベーションの期間は
、コラゲナーゼおよびエラスターゼについて２時間、ヒ
アルロニダーゼ１こライて１５ＬｐＨｉ−＃士ｒ、’　
Ｄ　Ｎ　７−　セｔ：上びネウラミニダーゼについて１
時間である。消化物の各々を遠心（２０００Ｘｇ）Ｌ、
そして液体部分をアミコン（ＡＭＩＣＯＮ）限外ＩＪＩ
Ｌ過膜（ＰＭＩＯ）　で０．５−１．０１．：：濃縮し
、０．１５−１−ルのＰＢＳに対して２４時間透析して
、不溶性動脈内脂肪沈積抗原の濃縮溶液を得る。

実施例２１ 乳九益五１」】Ｊしい（覧幻１ 実施例２０にの手順に従って得られた可溶性抽出物の一
部を処理して、それから自己抗体を分離する。濃縮物を
０．１５モルの塩化ナトリウムで希釈して、抗動脈内脂
肪沈積抗体を含む蛋白質のほぼ１５　ｍｇ／　ｍｌを含
有するようにする。蛋白質を２５°Ｃでつくった無水硫
酸ナトリウム（１８ｇ／　１００　ｍｌ）で沈殿させる
。１時間後、沈殿を遠心（１０＋　０００８Ｘｇ、　２
０分、２５°Ｃ）により集め、そして０．８容量の０．
１モルのＰＢＳ。

ｐＨ７，５、中に溶解する。この物質を前述のように再
び沈殿させる。沈降物を０．１モルのトリス−ＨＣｌ緩
ｌｊ液（ｐＨ８，０，２０′ｃ）中ニ；＆紅し、そして
同一緩衝液で平衡化したデアニーセファデックス（ＤＥ
ＡＥ−８ＥＰＨＡＤＥＸ）Ａ−５０（７Ｔ−マシ７）の
カラム（３，２Ｘ３０ｃｍ）に適用する。この物質の溶
離は、０．１モルのトリス−ＨＣｌからの連続勾配によ
り８．０の一定ｐＨにおいて２０°Ｃ″Ｃｈ実施する。

ＩｇＡ、ＩｇＤ。

１、Ｅ、ＩｇＧおよびＩｇＭの免疫グロブリンを含有す
る分画を集め、そして濃縮する１次いで、それらを０．
２％のナトリウムアットを含有する０゜１モルのトリス
−ＨＣｌ、０．２モルのＮａＣ１，０，００２モルのＥ
ＤＴＡＮａ２、ｐＨ７，７、と平衡化したセファデック
ス（７アーマシア）のカラム（３，２Ｘ９５ｃｍ）に適
用する。この物質をこのカラムに３回通過させた（　リ
サイクリングクロマトグラフィー技術）。ＩｇＡ、、Ｉ
ｇＤ、ＩｇＥ、１、ＧおよびＩｇＭの免疫グロブリンを
含有する分画を集め、そして濃縮する。

実施例２２ 社翌玉し１ｕ峙℃叱弧火■七見立光九 実施例２０の手順に従って得られた動脈内脂肪沈積抗原
を、ミリェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシルギ（Ｓｈｉ
ｌｇｉ）　、細胞免疫学における選択された方法（ＳＥ
ＬＥＣＴＥＤ　　ＭＥＴＨＯＤＳ　　ＩＮＣＥＬＬＵＬ
ＡＲＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）、サン７ラシスコ＝７リー
マン（Ｆｒｅｅｍａｎ）　（１９８０）の手順に従って
、親和クロマトグラフィーによる精製する。インチオシ
アナトフェノキシヒドロキシプロピル基で置換された架
橋したアガロースデルを、重炭酸ナトリウムの水溶腹中
に懸濁し、そしてこの溶液に、実施例２の手順に従って
得られた混合精製抗動脈内脂肪沈積抗体溶液の１１１を
添加する。この混合物を３日間室温においてインキュベ
ージタンし、その間おだやかに攪拌する９次いで、粒子
を遠心し、そして０．５モルのＮａＨＣＯｓ、０．１モ
ルの酢酸塩緩衝液、および１重量％のＢ　Ｓ　Ａを含有
する０、１モルのトリス促（ｆｉ液の各々で２回洗浄す
る。

抗体結合粒子を、ＰＢＳ中の実施例１に従って、ｇ製し
た動脈内脂肪沈積抗原濃縮物の溶液と混合する。この混
合物を２５℃においで８時間（−夜）インキュベージタ
ンする。次いで、粒子を混合物から分離し、そしてＰＢ
Ｓ、ｐＨ７，２、で３回洗浄して、残留する結合しない
動脈内脂肪沈積抗原を除去する。次いで、粒子を過剰量
の２．５モルのＮＡＳＣＮ溶液、ｐＨ８，０１と混合し
、そして２５℃において８時間インキュベーションする
。次いで、親和精製した動脈内脂肪沈積抗原を含有する
溶成を減圧の透析または限外濾過により濃縮し、そして
動脈内Ｔ肪沈積抗原の溶液を４　’Ｃで貯蔵する。

実施例２３ ボコしタローカッヒル℃刀１阪ｆｌ町」ｈノ傾憤−抗」
（０，２ｍｌの０．１５モルの塩化ナトリウム溶液およ
び０．８＋＋＋Ｎの完全７０インドアジユバント中の実
施例３の手順によって調製した０、５ｍｇの動脈内脂肪
沈積抗原の混合物を、ウサギに筋肉内注射する。免疫化
を１４Ｅ１間反復し、次いで各週３週間反復する。さら
にＪＯＯ１２経過した後、血液をワサギから取り出し、
そして血液を凝固させかつ凝固物を除去することによっ
て、抗血ｊ青を血液から回収する。

実施例２４ 玖」螺鷹−堅負」Ｌ仁ｆ〕工湧ヱコヱ−Ｗ罫ユ実施例１
０の手順に従って調製した抗イディオタイプ抗体を、グ
リーンウッド（Ｇｒｅｅｎ實ｏｏｄ　）、Ｆ、ら、バイ
オケミカル・ジャーナル（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、）、８９：　１１４−１２３（１９６３）の手順に
より、＋２ｓＪ−ｒ標識する。

蒸留水中の１　、　　Ｏｌ１ｌＢ／　Ｊのクロラミン−
Ｔ溶液を調製する。１０マイクログラムの抗イディオタ
イプ抗体を、水上の細い管の中にビペ・ントで入れる。

次いで、１０マイクロリツトルの０．１モルの−ＨＣｌ
、ｐＨ８，０、を添加して、放射性ヨウ化物中に常に存
在するＮ　ａ　ＯＨを緩衝化してヨウ素への酸化を防止
する。次いで、所望体積の１２５１を添加する。１．０
〜１０マイクロリツトルのクロラミン−Ｔ溶液を添加し
、そして混合する６次いで、１０マイクロリツトルの水
中のチロシンの飽和溶液を添加して反応を停止する。次
いで、０゜１９６のＢ　Ｓ　Ａおよび１０ミリモルのＮ
ａＮ３を含有するＰＢＳ生理的食塩水の２．５１＋ｉ！
を添加する。

この混合物を使い捨てＰＤ−１０セフ７テ゛ツクスカラ
ム（フデーマシア）に移し、そして同−ｔＨＩｊ液で平
衡化する。試料を流入させ、そして流出液を廃棄する。

次いで、３．５ｍｌ！の同−級ｌＩｉ液を添加する。ヨ
ウ素化した抗イディオタイプ抗体を含有する流出液を集
め、未反応のヨウ化物を除去する。

実施例１１〜１４の手順に従って調製した抗イディオタ
イプ抗体を使用して、この手順を反復して１２５１″Ｃ
標識したそれぞれの抗イディオタイプ抗体を生成する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、血清中のアテローム性動脈硬化症の抗イディオタイ
   プ抗体の存在を決定する方法であって、 （ａ）血清を抗動脈内脂肪沈積抗体と十分な時間接触さ
   せて、アテローム性動脈硬化症の抗イディオタイプ抗体
   を抗動脈内脂肪沈積抗体と接合させ、そして （ｂ）抗動脈内脂肪沈積抗体と接合したアテローム性動
   脈硬化症の動脈内脂肪沈積を決定する、ことを含んでな
   ることを特徴とする方法。 ２、（ａ）試料をヒト以外の抗動脈内脂肪沈積抗体が付
   着している不溶性支持体と十分な時間接触させて、抗イ
   ディオタイプ抗体を抗動脈内脂肪沈積抗体と接合させ、
   そして残留する試料を前記支持体から除去し、 （ｂ）工程（ａ）からの不溶性支持体を標識した抗ヒト
   Ｉｇ抗体と十分な時間接触させて、抗ヒトＩｇ抗体をア
   テローム性動脈硬化症の抗イディオタイプ抗体と接合さ
   せ、そして接合しない標識した抗ヒトＩｇ抗体を前記支
   持体から除去し、そして （ｃ）前記不溶性支持体上に存在する標識を決定する、 ことを含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、前記標識は酵素であり、そして前記不溶性支持体上
   に存在する標識は、前記不溶性支持体を基質と接触する
   ことによって決定し、前記基質は、前記酵素の存在下に
   、検出可能な発色団または蛍光団を生成する特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ４、前記酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼである
   特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、前記酵素はアルカリ性ホスファターゼである特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 ６、（ａ）前もって決定した量のアテローム性動脈硬化
   症の抗イディオタイプ抗体が結合している不溶性支持体
   を、前もって決定した量の抗動脈内脂肪沈積抗体と血清
   との混合物と十分な時間接触させて、動脈内脂肪沈積の
   抗イディオタイプ抗体と抗動脈内脂肪沈積抗体とを接合
   させ、そして（ｂ）前記不溶性支持体へ結合した、ある
   いは前記混合物中に残留する、標識した抗動脈内脂肪沈
   積抗体の量を決定する、 ことを含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、前記標識は酵素であり、そして前記不溶性支持体上
   に存在する標識は、前記不溶性支持体を基質と接触する
   ことによって決定し、前記基質は、前記酵素の存在下に
   、検出可能な発色団または蛍光団を生産する特許請求の
   範囲第６項記載の方法。 ８、前記酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼである
   特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前記酵素はアルカリ性ホスファターゼである特許請
   求の範囲第７項記載の方法。 １０、（ａ）前もって決定した量の抗動脈内脂肪沈積抗
   体が結合している不溶性支持体を、前もって決定した量
   の標識したアテローム性動脈硬化症の抗イディオタイプ
   抗体と血清との混合物と十分な時間接触させて、抗イデ
   ィオタイプ抗体と抗動脈内脂肪沈積抗体とを接合させ、
   そして （ｂ）前記不溶性支持体へ結合した、あるいは前記混合
   物中に残留する、標識したアテローム性動脈硬化症の動
   脈内脂肪沈積の抗イディオタイプ抗体の量を決定する、 ことを含む特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、前記標識は酵素であり、そして前記不溶性支持体
   上に存在する標識は、前記不溶性支持体を基質と接触す
   ることによって決定し、前記基質は、前記酵素の存在下
   に、検出可能な発色団または蛍光団を生産する特許請求
   の範囲第１０項記載の方法。 １２、前記酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼであ
   る特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、前記酵素はアルカリ性ホスファターゼである特許
   請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、アテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の抗イ
   ディオタイプ抗体。 １５、抗体はポリクローナル抗体である特許請求の範囲
   第１４項記載のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
   積の抗イディオタイプ抗体。 １６、抗体は示差的標識へ結合されている特許請求の範
   囲第１５項記載のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
   沈積の抗イディオタイプ抗体。 １７、示差的標識は酵素標識である特許請求の範囲第１
   ６項記載のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の
   抗イディオタイプ抗体。 １８、抗体はモノクローナル抗体である特許請求の範囲
   第１４項記載のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈
   積の抗イディオタイプ抗体。 １９、抗体は示差的標識へ結合されている特許請求の範
   囲第１８項記載のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪
   沈積の抗イディオタイプ抗体。 ２０、示差的標識は酵素標識である特許請求の範囲第１
   ９項記載のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積の
   抗イディオタイプ抗体。 ２１、示差的標識は放射性標識である特許請求の範囲第
   １９項記載のアテローム性動脈硬化症の動脈内脂肪沈積
   の抗イディオタイプ抗体。