JPS61144573A - サンドイツチイムノアツセイ - Google Patents

サンドイツチイムノアツセイ

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JPS61144573A
JPS61144573A JP60246122A JP24612285A JPS61144573A JP S61144573 A JPS61144573 A JP S61144573A JP 60246122 A JP60246122 A JP 60246122A JP 24612285 A JP24612285 A JP 24612285A JP S61144573 A JPS61144573 A JP S61144573A
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JP
Japan
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binding substance
antibody
ligand
probe
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JP60246122A
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フレデリツク、ジエームス、プリマス
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Original Assignee
Immunomedics Inc
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Publication date
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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    • Y10S530/807—Hapten conjugated with peptide or protein

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本光凱■丘景 本発明は、液体テストサンプル中のりガントの量を決定
するための方法およびキットに関する。
液体サンプル中のりガントの定量のための不均質イムノ
アッセイは、抗体と複合した抗原を遊離抗原から分離す
るさまざまな方法を使用している。
これら方法のいくつかは、化学的溶解性、分子サイズ、
吸着性および電気泳動移動度のような抗原の物理化学的
性質を利用し、他のものはりガント特異性抗体を特異的
に結合する抗体（分離抗体）を使用する免疫学的テクニ
ックを使用する。いくつかの既知方法は、ポリスチレン
のよう′な固相への抗−抗原抗体または抗原自体の付着
を基礎としており、成分の分離は洗浄ステップによって
実施される。
そのような各種イムノアッセイの例は、例えば米国特許
第４，２２８，２３７号、第３．８７９，２６２号、第
４゜０２１．５３４号、第４．２７３，７５６号、第４
，０９８，８７６号、第４，２３０，６８３号、第４．
０４８，２８９８　、第４．２４３，７４９号、第４．
３４３．８９６号、第４，３１５，９０７号、第４．３
３２゜７８３号、第４．３２０．１９０号、第４，２９
８，６８５号、第４゜１８５．０８４号、第４，３１２
，９４４号等に見られる。これら特許の開示を参考とし
て取り入れる。これら方法のすべては有用であるが、し
がしそれらは、精製した抗原の必要性°、固相へ抗原を
結合する必要性、抗原がある物理化学的性質を有する必
要性、多数の洗浄およびインキュベーションステツブ等
のような、いくつかの制約を蒙る。
従ってこれらの不利益を回避するイムノアソセイ方法お
よびキットに対する必要性がなお存在し続ける。
本発皿立且前 本発明の一目的は、液体テストサンプル中の多価リガン
ドの量を決定するのに通したイムノアッセイ方法であっ
て、任意のリガンドに使用するのに適した固体支持体、
すなわちユニバーサル分離システムを使用できる方法を
提供することである。
本発明の他の一目的は、多数回の洗浄およびインキュベ
ーションステップを回避するイムノアッセイ方法を提供
することである。
本発明の別の目的は、単一液体サンプルの同時多数抗原
アッセイを実施し得るイムノアッセイ方法を提供するこ
とである。
本発明のなお他の目的は、本発明の方法を実施するため
に使用するテストキットを提供することである。
本発明の他の目的および利益は、明細書および特許請求
の範囲をさらに検討する時、当業者にもっと明瞭となる
であろう。
座虜ｌト（社）１要 これらの目的は、抗体か、もしくは抗体へ特異的に結合
し得る物質である、液体テストサンプル中の多価リガン
ドの量を決定するためのイムノアッセイ方法であって、 （ａ）　　前記リガンドを結合しない分離特異性結合物
質を結合した不溶相を用意するスナップと、（ｂ）　　
前記不溶相を、 ■前記液体テストサンプル； ■前記リガンドを特異的に結合しかつ自身前記分離特異
性結合物質によって特異的に結合される捕獲特異性結合
物質； ■前記リガンドが前記捕獲特異性結合物質へ結合される
時アクセシブルな部位において前記リガンドを特異的に
結合するプローブ特異性結合物質にして、前記分離特異
性物質によって実質上結合されず、かつ少なくとも１種
の検出操作によって検出可能なプローブ特異性結合物質 とインキエベートするステップと、 （Ｃ）　　インキュベーション後、未結合試薬および前
記テストサンプルの成分を含んでいる生成した液相から
前記不溶相を分離するステップと、（ｄ）　　前記検出
操作により、前記の分離した不溶相へ結合した前記検出
し得るプローブの量か、または前記の生成した液相中に
残っている前記検出し得るプローブの量を決定するステ
ップにして、該決定は前記テストサンプル中の前記リガ
ンドの量に関連しているステップ を含むイムノア７セイ方法を提供することによって達成
される。
本発明はさらに、上記方法を実施するために使用するイ
ムノアッセイキットを提供する。
■１星通論 本発明の方法およびキットの主要な利益は、固相へ結合
された特異性結合物質がリガンドを結合せず、その代わ
りに捕獲特異性結合物質を結合することである。このこ
とは、他のサンドインチアッセイシステムにおいては不
可能である、相当な融通性を達成可能とする。
リガンドが抗体へ特異的に結合し得る物質であるがしか
しそれ自体は抗体でない場合、すなわち該物質は該抗体
に対する特異性結合補体である場合、捕獲特異性結合物
質は、該リガンドを特異的に結合する抗体であろう。そ
の時固相へ結合された分離特異性結合物質は捕獲抗体を
特異的に結合する抗体、例えばサブタイプ特異性もしく
はスペシス特異性抗体か、または捕獲抗体へ複合された
ハプテンを特異的に結合する抗体であろう。後者の構造
の例は、例えばステロイド、螢光色素、ｐ−アゾベンゼ
ンアルガネート、ｐ−アゾトリメチルアニリニウム、ベ
ンゾイル−し−グルタミン酸、２．４．６−　トリニト
ロフェニル等のようなハプテンへ複合された捕獲抗体を
含むことができる。
ここで使用される「抗体」なる術語は、ポリクロナール
もしくはモノクロナール全免疫グロブリン、例えばＩｇ
Ｇ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等か、または免疫グロブリ
ンフラグメント、例えば、Ｆ　（ａｂ）ｚ、　　Ｆ　（
ａｂ’　）ｚ、　Ｆａｂ、　Ｆａｂ’等か、またはそれ
らの混合物を意味することが理解されるであろう。多種
類のリガンドを特異的に結合する抗体および抗体フラグ
メントは既知であり、これらの多数が参考として取り入
れた特許に開示されている。腫瘍関連マーカーを特異的
に結合する多数の抗体および抗体フラグメントは、例え
ば米国特許第４，３４８，３７６号、第４．３６１．５
４４号、第４．３３１，６４７号、第４．４６８．４５
７号、第４．４４４，７４４号、第４．４６０゜５５９
号および第４．４６０．５６１号に開示されており、そ
れらの記載を参考としてここに取り入れる。そのような
抗体および抗体フラグメントは代表的な属の例示に過ぎ
ない。
本発明のイムノアッセイ方法およびキットに有用な他の
抗体はこの分野において慣用かつ既知であるか、または
慣用の免疫学的テクニックによって製造することができ
、特定の製造方法はアッセイすべき特定のリガンドを考
慮して当業者の伎側の範囲内である。例えば、クレアチ
ニンキナーゼのようなキナーゼ、肝臓デヒドロゲナーゼ
のようなデヒドロゲナーゼ等のような酵素、黄体ホルモ
ン、卵胞刺激ホルモンのようなホルモン、プロゲステロ
ン、テストステロン等のようなステロイド、ビールスも
しくはビールスフラグメント、かび、バクテリア、原虫
または他の発病性もしくは疾病関連微生物に対する抗体
はすべて製造可能および／または既知であり、そして本
発明の方法°およびキットにおいて捕獲および／または
プローブ抗体として使用することができる。
ハプテンの特に魅力的なタイプは、カルポラン環系を含
んでいる基である。カルボランは血清、尿その他のよう
な天然生物学的サンプル中に存在することが知られてい
ないので、それらのハプテンとしての使用はテストサン
プルの成分との交差反応性の可能性を回避する。カルボ
ランに対する抗体は慣用のテクニックによって発生させ
ることができる。ハプテンの他の魅力的なタイプはビオ
チンであり、それは固相へ複合された分離特異性結合物
質としてアビジンと共に使用されるであろう。
どの上記タイプのハプテンの使用も、固相がリガンドま
たは捕獲特異性結合物質の本質に関係なくユニバーサル
な分離媒体として機能することを許容する。
必要とするすべては、捕獲スペシスが例えばイソタイプ
上の特徴的区域により、または捕獲物質へ複合されたハ
プテンの特徴によって分離特異性結合物質によって認識
することができる構造的特徴を含んでいることである。
例証として、もし定置すべきリガンドがガン胎児性抗原
（ＣＥＡ）であれば、捕獲特異性結合物質は、有利には
ＣＥＡを特異的に結合する抗体、例えばＣＥＡに対して
高い特異活性を有するポリクロナール抗血清か、または
ＣＥＡを特異的に結合するモノクロナール抗体である。
プローブは、有利にはＣＥＡを特異的に結合し、そして
例えばラジオアイソトープ、螢光マーカー、酵素または
類似の検出し得る成分へ複合した他の抗血清またはモノ
クロナールである。この例証目的のため、プローブはペ
ルオキシダーゼを複合したモノクロナール抗ＣＥＡ抗体
であろう。再び例証のため、捕獲物質はジアゾフェニル
カルボランを複合した同じまたは異なる抗ＣＥＡモノク
ロナール抗体である。固相はポリスチレン試験管であり
、それへ捕獲抗体へ結合されたハプテンのカルボラン環
に対するモノクロナール抗体が複合される。
アッセイは、ＣＥＡを含むと推測される液体テストサン
プル、例えば結腸直腸腫瘍の除去手術を受けた患者から
の血清の部分標本を加えることによって進められるであ
ろう。サンプルへ、適当な媒体例えばリン酸緩衝化食塩
水中の捕獲およびプローブ抗体の溶液を加え、生成する
溶液を捕獲抗体を固相へ結合し、リガンドを捕獲抗体へ
結合し、そしてプローブ抗体を結合したりガントへ結合
するのに十分な時間インキュベートされるであろう。
試薬は順番に、または一度に全部加えることができるこ
とが理解され、そしてこの添加順序は重要でないが、捕
獲抗体を最初にそしてプローブ抗体を後で加えるのがこ
れら試薬を逆の順序に加えるよりも有利である。
インキュベーション終了後、過酸化水素が０−フェニレ
ンジアミンと共に加えられ、そしてペルオキシダーゼ活
性が慣用手段によって分光分析的に決定される。この活
性は該酵素の濃度に相関させることができ、後者は慣用
手段によってテストサンプル中のＣＥＡＯ量に関連され
る。
上で例証した操作の簡単な変法は、プローブ抗体のため
の標識としてｌ−１２５を使用することができる。この
場合、試験管はインキュベーション後排液され、結合放
射性標識についてカウントされ、テストサンプル中のＣ
ＥＡＯ量に関連される。
他の簡単な変法は、捕獲抗体へ複合されたハプテンとし
てビオチンと、そして酵素またはラジオアイソトーププ
ローブ標識のどちらかを使用するであろう。固相は慣用
手段によってそれへ複合されたアビジンを有し、そして
捕獲抗体によって結合されたどのリガンドも固相ヘビオ
チンーアビジン連結によって結合され、そしてリガンド
の別にアクセシプルな部位へ結合された標識プローブに
よって検出可能とされる。
本発明の方法を同じテストサンプル中の２種以上のりガ
ントの同時定量に使用するため、同じハプテンを各リガ
ンドに対する捕獲抗体へ複合させることができる。例え
ば、もしＣＥＡおよび結腸特異性抗原−ｐ　（Ｃ３Ａｐ
）の両方の量を決定することを望むならば、ＣＥＡおよ
びＣ３Ａｐに対するモノクロナール抗体は各自例えばビ
オチンと、そしてＣＥＡのためのプローブへ複合させら
れ、ＣＥＡが捕獲抗体へ結合される時アクセシプルな部
位においてＣＥＡを特異的に結合する他のモノクロナー
ル抗体が例えばペルオキシダーゼへ複合され、他方Ｃ３
Ａｐに対するプローブ抗体である、Ｃ３Ａｐが捕獲抗体
へ結合される時アクセシブルな部位においてＣ３Ａｐを
特異的に結合する他のモノクロナール抗体は、例えばグ
ルコースオキシダーゼで標識される。テストサンプルは
次にアビジンへ結合された固相と、捕獲およびプローブ
抗体とインキュベートされ、その後で、例えばペルオキ
シダーゼ測定のため過酸化水素と０−フェニレンジアミ
ンにより、グルコースオキシダーゼによって順番の定量
が実施され、そして結果が標準曲線と相関される。
リガンドが抗体である場合、リガンド抗体のイソタイプ
を認識するプローブまたは捕獲抗体と組合わせて、捕獲
またはプローブ抗体として抗イデイオタイプ抗体を使用
し、それぞれを固相上の分離特異性結合物質によって結
合されることのできる機能、またはそれぞれ検出するこ
とができる機能を残して複合させることがしばしば便利
である。
これはアッセイシステムの成分として精製した抗原の使
用の必要性を回避する。例えば、もしアッセイすべきリ
ガンドが、Ｂ型肝炎表面抗原に対するヒト抗体であれば
、捕獲抗体はリガンド抗体の高可変性領域を特異的に結
合し、そしてカルボラングループのようなハプテンを複
合させたネズミモノクロナール抗イディオタイプとする
ことができ、他方プローブ抗体はｌ−１２５を検出可能
量複合させたヤギ抗ヒトＦａｂとすることができる。
分離は固体支持体へ複合させた抗カルボラン抗体によっ
て実施され、そしてアッセイは捕獲およびプローブ抗体
の存在下サンプルとインキュベーション後、固体支持体
へ結合した放射性ヨウ素の量を定量することによって実
行される。
イムノアッセイキットは、分離特異性結合物質を結合さ
せた固相、例えば抗ハブテン抗体を塗布したポリスチレ
ン試験管、マイクロタイタープレート等と、分離特異性
物質に対し相補性のハプテンを複合させた凍結乾燥した
捕獲特異性結合物質、例えばカルボラン複合化抗リガン
ド抗体等と、検出可能なマーカーで標識した凍結乾燥プ
ローブ特異性結合物質、例えば酵素、ラジオアイソトー
プ、螢光マーカー標識抗リガンド抗体等と、リガンド標
準液と、そして必要あれば標識のための発色剤とを通常
含むであろう。他の慣用の成分を含めることができ、そ
してこれらは当業者には自明であろう。
さらに考究することなく、当業者は以上の説明を用いて
、本発明をその全範囲において利用することができるも
のと信じられる。従って、以下の好ましい特定実施例は
開示の残部の限定としてでなく、単なる例証として解す
べきである。以下の実施例において、温度は未補正の℃
で述べられ、特記しない限り、すべての部およびパーセ
ントは重量による。
実施例１ 旦旦人１す工人ムヱエ立不 Ａ）米国特許第４．４６８，４５７号の方法に従ってＣ
３Ａｐに対するネズミモノクロナール抗体が製造される
。この方法は、制御された条件下トリプシン消化により
、天然Ｃ３Ａｐに関連した免疫学的特徴を有するペプチ
ドを製造し、このペプチドを抗原として使用し、そして
慣用操作を使用してネズミモノクロナール抗Ｃ３Ａｐ　
　ＩｇＧ抗体を発生させることを含む。
Ｂ）上で製造した抗体を、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ。
Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ、　７９　：　３０１１−３０１
４　　（１９８２）記載の水沢らの方法に従い、抗体へ
平均７個のカルボラン基を導入するように、ｐ−（１，
２−ジカルバクロソドデ力ボラニル）ベンゼンジアゾニ
ウムクロライドの溶液で処理する。これは免疫反応性の
有窓な損失なしに実施することができ、そして抗体の高
可変性領域を保護するため該ペプチドの存在下にカルポ
ラン官能の導入を実施することによってさらに改良を得
ることができ、その後でケイオトロビソク剤の使用によ
って除去される。例えば４℃において生理食塩水中複合
体を透析した後、カルポラン複合化抗体は、Ｃ３Ａｐト
リプシン分解ペプチドを結合したセファロース４Ｂ免疫
吸着剤上のアフィニティークロマトグラフィーによって
精製される。
Ｃ）カルボラングループに対するモノクロナール抗体が
、ｐ−（１，２−ジカルバクロソドデカボラニル）ベン
ゼンジアゾニウムクロライドをウシ血清アルブミンへ複
合させ、複合体をフロイント完全アジュバントと一所に
Ｂａ１ｂ／ｃマウスへ注射し、マウスへ複合体ブースタ
ーを注射し、８週後マウスをと殺することによって製造
される。マウスの肺臓が切除され、肺臓細胞が単離され
、ネズミミエローマ細胞と慣用操作によって融合され、
マイクロタイタープレートのウェルへ付着したカルボラ
ンヤギＩｇＧ複合体を使用する酵素イムノアッセイによ
って決定されるようにカルボラングループを特異的に結
合する抗体を分泌するクローンが単離される。
Ｄ）Ｃ部で製造された抗カルボラン抗体が米国特許第４
．１８５．０８４号に開示された方法に従ってポリスチ
レン試験管の内側に塗布される。
Ｅ）米国特許第４，４６８，４５７号の操作に従って製
造された他のモノクロナール抗Ｃ３Ａｐ抗体が“Ｉｍｍ
ｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔ
ｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈ−ｎｉｑｕｅｓ　”
　＋　Ｋｎａｐｐ　ｅｔ　ａｌ、＋　ｅｄｓ、、　ｐｐ
、　２１５−２２４　　（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔ
ｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓ
ｓ。
Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　）中のウィルソンおよび中板（１
９７８）の操作に従って、ペルオキシダーゼへ複合され
る。
この複合体はアッセイのためのプローブ抗体として使用
される。
Ｆ）結腸直腸ガンを持っていると推測される患者からの
液体血清サンプルが、細胞様物質を遠心によって除去さ
れた後にテストサンプルとして使用される。サンプルは
Ｄ部に従って製造されたポリスチレン試験管中へ導入さ
れ、そしてＢ部およびＥ部に従って調製された捕獲およ
びプローブ抗体の溶液がそれぞれ導入され、そして３７
℃で２時間インキュベートされる。試験管は食塩水で洗
浄される。次に０．１　Ｍリン酸塩−クエン酸塩緩衝液
ｐＨ５，０中０．０８％Ｏ−フェニレンジアミンおよび
０．０１２％過酸化水素を含有する溶液が試験管へ加え
られ、２０℃で３０分間インキエベートされる。試験管
は次に分光光度針中に導入され、４９０ｎｍにおける読
みが読み取られる。ペルオキシダーゼ活性が決定され、
Ｃ３Ａｐ　）リプシン分解ペプチドの既知濃度の希釈系
列について決定された標準曲線の使用により、サンプル
中のＣ３Ａｐ含量に相関させる。
実施例２ Ａ）ＣＥＡに対するネズミモノクロナール抗体がＰｒｉ
ｍｕｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　＋　Ｃａｎｃｅ
ｒ　Ｒｅｓ、、　４３　：６８６−６９２に従って製造
される。この方法は、結腸アデノカルチノーマの肝臓転
移からＩＮ！ｉ１したＣＥＡに対するモノクロナール抗
体の製造と、そして交差反応性抗原、非特異性交差反応
性抗原および胎便抗原との反応性による特異性特徴化と
を含む。
Ｂ）上で調製した抗体は実施例１ＯＢ部の操作に従って
カルボラングループで標識される。
Ｃ）Ａ部に記載したように製造されるが、しかしカルボ
ラングループで標識した抗ＣＥＡ抗体とは異なるエピト
ープ特異性を有する他のモノクロナール抗ＣＥＡ抗体が
実施例１のＥ部に記載したようにグルコースオキシダー
ゼへ複合される。
Ｄ）液体血清サンプルが実施例１のＤ部に従って調製さ
れたポリスチレン試験管中へ入れられる。
次にカルボラン標識した抗Ｃ３Ａｐおよび抗ＣＥＡモノ
クロナール抗体が、ペルオキシダーゼ標識抗Ｃ５Ａｐお
よびグルコースオキシダーゼ標識抗ＣＥＡモノクロナー
ル抗体と共に試験管へ加えられる。試験管は３７℃で２
時間インキベートされ、次に食塩水で洗浄される。サン
プル中のＣ３Ａｐ含量は実施例１の下部に記載したよう
に、＠衝化０−フェニレンジアミンおよび過酸化水素を
使用して決定され、試験管は再度生理食塩水で一回洗浄
される。０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液ｐ　Ｈ５゜１
中１．６７％グルコース、０．００５％０−ジアニシジ
ンおよび０．０００７％ペルオキシダーゼよりなる溶液
が加えられ、グルコースオキシダーゼ反応を発生させる
ように２２℃で追加の３０分間インキュベートされる。
試験管は次に分光光度針に導入され、４９０ｎｍにおけ
る読みが読み取られる。
グルコースオキシダーゼ活性が決定され、そして精製し
たＣＥＡの既知濃度の希釈液系列について決定された標
準曲線の使用により、サンプルのＣＥＡ含量に相関され
る。
実施例３ 酵素標識した抗体の代わりに、ｌ−１２５標識抗Ｃ３Ａ
ｐおよびｌ−１３１標識抗ＣＥＡモノクロナ一ルプロー
ブ抗体が使用されることを除き、実施例２に記載のよう
に同時イムノアッセイが実施される。Ｃ３ＡｐおよびＣ
ＥＡ量は、２チャンネルガンマ−シンチレーションカウ
ンター中のｌ−１２５およびｌ−１３１放射能レベルの
差動測定によって相関される。
実施例４ 実施例２に記載した同時アッセイを実現するための典型
的キットは以下の成分を含むであろう。
−抗カルボラン抗体を塗布したポリスチレンチューブ（
乾燥）。チューブの代わりに塗布したマイクロタイター
プレートを用いることができること、または凍結乾燥し
た抗カルボラン抗体を注文用途、例えば自動化アッセイ
媒体の塗布のために供給できることが理解されるであろ
う。
−凍結乾燥したカルボラン標織抗ＣＥＡおよび抗ＣＥＡ
抗体。
一凍結乾燥したグルコースオキシダーゼ標識抗ＣＥＡお
よびペルオキシダーゼ標識抗Ｃ５Ａｐ抗体。
一凍結乾燥したＣＥＡおよびＣ３Ａｐ参照標準−例えば
ペレット形の、０−フェニレンジアミンおよび緩衝塩を
含むペルオキシダーゼ発色システム。
−例えばペレットの形の、ペルオキシダーゼ、０−ジア
ニシジン、グルコースおよび緩衝塩を含むグルコースオ
キシダーゼ発色システム。
ユーザーは通常蒸溜水、過酸化水素および食塩水洗浄液
を用意するであろう、。
特定のアッセイ方法および使用する機器に応じ、他の構
成が当業者には容易であることは理解されるであろう。
前記キットは好ましい具体例の単なる例証である。
前記実施例は、これら実施例に使用されたものに代え、
本発明の一般的または特定的に記載された反応剤および
／または作業条件を用いることにより、同様な成功度を
もって繰り返すことができる。これは、参考としてここ
に取り入れたソースに記載された酵素系、ハブテン標識
、放射性標識、螢光標識、固体支持体、抗体その他と、
その他の慣用のテクニックおよび試薬を含む。
以上の説明から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に
確かめることができ、そしてその精神および範囲を造成
することなく、本発明を各種の用途および条件に適応さ
せるため、種々の変更および修飾を加えることができる
。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）抗体か、もしくは抗体へ特異的に結合し得る物質
    である、液体テストサンプル中の多価リガンドの量を決
    定するためのイムノアッセイ方法であって、 （ａ）前記リガンドを結合しない分離特異性結合物質を
    結合した不溶相を用意するステップと、（ｂ）前記不溶
    相を、 ［１］前記液体テストサンプル； ［２］前記リガンドを特異的に結合し、かつそれ自身前
    記分離特異性結合物質によって特異的に結合される捕獲
    特異性結合物質； ［３］前記リガンドが前記捕獲特異性結合物質へ結合さ
    れる時アクセシブルな部位において前記リガンドを特異
    的に結合するプローブ特異性結合物質にして、前記分離
    特異性結合物質によって実質上結合されず、かつ少なく
    とも１種の検出操作によって検出可能なプローブ特異性
    結合物質 とインキュベートするステップと、 （ｃ）インキュベーション後、未結合試薬および前記テ
    ストサンプルの成分を含んでいる生成した液相から前記
    不溶相を分離するステップと、 （ｄ）前記検出操作により、前記分離した不溶相へ結合
    した前記検出し得るプローブの量か、または前記の生成
    した液相中に残っている前記検出し得るプローブの量を
    決定するステップにして、該決定は前記テストサンプル
    中の前記リガンドの量に関連しているステップ を含む前記イムノアッセイ方法。 （２）前記リガンドは抗体であり、前記捕獲特異性結合
    物質は前記抗体に対する特異性結合補体である第１項の
    方法。 （３）前記プローブ特異性結合物質および前記捕獲特異
    性結合物質の各自は抗体よりなり、前記リガンドは前記
    抗体の両方に対する特異性結合補体である第１項の方法
    。 （４）前記捕獲特異性物質はハプテンへ複合されており
    、前記分離特異性結合物質は前記ハプテンを特異的に結
    合する抗体である第１項の方法。 （５）前記捕獲特異性物質はビオチンへ複合されており
    、前記分離特異性結合物質はアビジンである第１項の方
    法。 （６）前記ハプテンはカルボラングループを含み、前記
    分離抗体は前記カルボラングループを特異的に結合する
    第４項の方法。 （７）前記プローブ特異性結合物質は、酵素、ラジオア
    イソトープまたは螢光マーカーで標識されている第１項
    の方法。 （８）前記リガンドは腫瘍関連マーカーである第３項の
    方法。 （９）前記マーカーはガン胎児性抗原、結腸特異性抗原
    −ｐ，ヒト絨毛膜ゴナドトロフィンもしくはそのベータ
    ーサブユニット、アルファフェトタンパク、胎便抗原ま
    たは前立腺酸性フォスファターゼである第８項の方法。 （１０）液体テストサンプル中の複数の多価リガンドで
    あって、各自が抗体かもしくは抗体へ特異的に結合し得
    る前記多価リガンドの各自の量を決定するための方法で
    あって、 （ａ）前記リガンドのどれをも結合しない少なくとも１
    種の分離特異性結合物質を結合した不溶相を用意するス
    テップと、 （ｂ）前記不溶相を、 ［１］前記液体テストサンプル； ［２］前記リガンドの各自に対し、前記リガンドを特異
    的に結合し、かつそれ自身前記分離特異性物質によって
    特異的に結合される捕獲特異性結合物質； ［３］前記リガンドの各自に対し、前記リガンドが前記
    捕獲特異性結合物質へ結合される時アクセシブルな部位
    において前記リガンドを特異的に結合するプローブ特異
    性結合物質にして、前記プローブ特異性結合物質の各自
    は前記分離特異性結合物質によって実質上結合されず、
    かつ各自が少なくとも１種の検出操作によって別々に検
    出可能なプローブ特異性結合物質とインキュベートする
    ステップと、 （ｃ）前記インキュベーション後、未結合試薬および前
    記テストサンプルの成分を含んでいる生成した液相から
    前記不溶相を分離するステップと、（ｄ）前記検出操作
    により、前記の分離した不溶相へ結合した前記検出し得
    るプローブの各自の量か、または前記の生成した液相中
    に残っている前記検出し得るプローブの量を決定するス
    テップにして、該決定は前記テストサンプル中の前記リ
    ガンドの量に関連しているステップ を含む前記イムノアッセイ方法。 （２）液体テストサンプル中の多価リガンドの量を決定
    するためのイムノアッセイキットにして、（ａ）前記リ
    ガンドを結合しない分離特異性結合物質を結合した不溶
    相と、 （ｂ）前記リガンドを特異的に結合し、かつそれ自身前
    記分離特異性結合物質によって特異的に結合される捕獲
    特異性結合物質と、 （ｃ）前記リガンドが前記捕獲特異性結合物質へ結合さ
    れる時アクセシブルな部位において前記リガンドを特異
    的に結合するプローブ特異性結合物質にして、前記分離
    特異性結合物質によって実質上結合されず、かつ少なく
    とも１種の検出操作によって検出可能なプローブ特異性
    結合物質 を含むイムノアッセイキット。 （１２）前記リガンドは抗体であり、前記捕獲特異性結
    合物質は該抗体に対する特異性結合補体である第１１項
    のキット。 （１３）前記プローブ特異性結合物質および前記捕獲特
    異性結合物質の各自はアッセイすべきリガンドを特異的
    に結合する抗体である第１１項のキット。 （１４）前記捕獲特異性結合物質はハプテンへ複合され
    ており、前記分離特異性結合物質は前記ハプテンを特異
    的に結合する抗体である第１１項のキット。 （１５）前記捕獲特異性結合物質はビオチンへ複合され
    ており、前記分離特異性結合物質はアビジンである第１
    １項のキット。 （１６）前記ハプテンはカルボラングループを含み、前
    記分離抗体は前記カルボラングループを特異的に結合す
    る第１４項のキット。 （１７）前記プローブ特異性結合物質は酵素、ラジオア
    イソトープまたは螢光マーカーで標識されている第１１
    項のキット。 （１８）腫瘍関連マーカーであるリガンドのイムノアッ
    セイに適し、前記捕獲特異性結合物質および前記プロー
    ブ特異性結合物質は各自アッセイすべき腫瘍関連マーカ
    ーを特異的に結合する抗体である第１３項のキット。 （１９）前記マーカーはガン胎児性抗原、結腸特異性抗
    原−ｐ，ヒト絨毛膜ゴナドトロフィンもしくはそのベー
    ターサブユニット、アルファフェトタンパク、胎便抗原
    または前立腺酸性フォスファターゼである第１８項のキ
    ット。 （２０）液体テストサンプル中の複数の多価リガンドで
    あって、各自が抗体かもしくは抗体へ特異的に結合し得
    る物質である前記多価リガンドの各自の量を決定するた
    めのイムノアッセイキットにして、（ａ）前記リガンド
    のどれをも結合しない少なくとも１種の分離特異性結合
    物質を結合した不溶相と、（ｂ）前記リガンドの各自に
    対し、前記リガンドを特異的に結合し、かつそれ自身前
    記分離特異性結合物質によって特異的に結合される捕獲
    特異性結合物質と、 （ｃ）前記リガンドの各自に対し、前記リガンドが前記
    捕獲特異性結合物質へ結合される時アクセシブルな部位
    において前記リガンドを特異的に結合するプローブ特異
    性結合物質にして、各自前記分離特異性結合物質によっ
    て実質上結合されず、かつ各自が少なくとも１種の検出
    操作によって別々に検出可能なプローブ特異性結合物質 を含むイムノアッセイキット。 （２１）ＣＥＡおよびＣＳＡｐの同時定量に適し、前記
    捕獲特異性結合物質の一つおよび前記プローブ特異性結
    合物質の一つはＣＥＡを特異的に結合するモノクロナー
    ル抗体であり、かつ前記捕獲特異性結合物質の一つおよ
    び前記プローブ特異性結合物質の一つはＣＳＡｐを特異
    的に結合するモノクロナール抗体である第２０項のキッ
    ト。 （２２）前記捕獲抗体の各自はカルボラングループへ複
    合されており、前記分離特異性結合物質は前記カルボラ
    ングループを特異的に結合する抗体よりなる第２１項の
    キット。 （２３）前記リガンドは感染性生物である第３項の方法
    。 （２４）前記感染性生物はビールス、バクテリア、かび
    または原虫類である第２３項の方法。 （２５）前記捕獲およびプローブ抗体は各自感染性生物
    を結合する第１３項のキット。 （２６）前記感染性生物はビールス、バクテリア、かび
    または原虫類である第２５項のキット。
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JPH04501606A (ja) * 1988-11-10 1992-03-19 フアーマシア・ビオセンソル・アクチエボラーグ センサーユニット及びバイオセンサーシステムにおけるその使用

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