JPS62284262A - イムノアツセイ方法 - Google Patents

イムノアツセイ方法

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JPS62284262A
JPS62284262A JP62064411A JP6441187A JPS62284262A JP S62284262 A JPS62284262 A JP S62284262A JP 62064411 A JP62064411 A JP 62064411A JP 6441187 A JP6441187 A JP 6441187A JP S62284262 A JPS62284262 A JP S62284262A
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analyte
ligand
galactosidase
galactoside
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JP62064411A
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ロジャー　デビッド　フィロ
ジョン アレン ジェラルド
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SEROONO DAIAGUNOSUTEIKUSU PAAT
SEROONO DAIAGUNOSUTEIKUSU PAATONAAZU
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SEROONO DAIAGUNOSUTEIKUSU PAAT
SEROONO DAIAGUNOSUTEIKUSU PAATONAAZU
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 〔産業上の利用分野〕 本発明は、抗原のイムノアッセイ方法及びそのような方
法を行なうためのキットに関する。特に、それは、単独
のサンプル中において、２種の抗原を同時に検定する、
酵素ラベルを使用するイムノアッセイ方法（この後、酵
素イムノアッセイとして言及される）に関する。
〔従来の技術〕
本明細書に使用される場合、用語“抗原”とは、不変の
抗原種（たとえば、タンパク質、ペプチドホルモン、細
菌、細菌フラグメント、細胞、細胞フラグメント及びウ
ィルス）及び適切な条件下で抗原性を表わすことができ
るハブテン（たとえば、麻酔剤、催眠剤、興奮剤、心臓
血管剤、ビタミン、非ペプチドホルモン及びその代謝産
物、抗生物質、殺虫剤及びｖＭ類を含む）の両者を含む
ことを理解すべきであろう。
単独のサンプル中において２種の異なった分析物を同時
に測定することができるラジオイムノアッセイは、ここ
数年の間、利用可能になって来た。
これらの二重分析物検定又は“コンポ（ｃｏａ＋ｂｏ）
“検定の原理は、２種の従来の検定が、異なったエネル
ギーレベルでお互いを識別することができる異なった放
射性核種ラベルを用いる２種の成分検定により、同じ反
応容器中において同時に行なわれることである。使用さ
れて来た適切な放射性核種対は、Ｉ　Ｚ　Ｓ　Ｉ／　Ｉ
　３１１及び”’Ｉ／５７Ｃｏを含む。
そのような二重ラジオイムノアッセイは、便利さ、得ら
れる結果の早さ、実験室での処理量、等の点で有意な利
点を提供し、そして単一のサンプル中における２種の分
析物（たとえば、ある貧血症の異なった診断のためのビ
タミンＢ１□及びフオレート）を測定するために日常行
なわれる領域において、広く許容されるようになって来
た。しかしながら、これらの検定は、ラベルとして短命
の放射性核種を用いるすべての検定と同じ固有の欠点を
有する。これらは、短い保存寿命、放射線への使用者の
被暴、特別な設備の必要性及び廃棄物の処理に関する問
題を含む。
非放射能ラベルの使用は、これらの問題を克服し、そし
て現在、酵素ラベルが、イムノアッセイのために最とも
普通に使用される代用物である。
“コンポ”検定に使用されるべき酵素に関しては、酵素
イムノアッセイのために必要な基準（少し又はほとんど
ない酵素又は免疫学的活性の損失、すなわちサンプル又
・は検定条件、等による制限なしに反応体の１つに接合
されるべき能力）を満たすのみならず、また免疫反応の
間、ある条件下でお互い反応せず、そして同時に、別々
の基質転喚に触媒作用を及ぼし、インキュベーション期
間、それらの生産の直接のモニターリング又は基質の除
去をモニターすることによって、お互いとは無関係に測
定され得る生成物を与えることができる２種の酵素−基
質対を同定することが必要である。
■お±１Ｌ助ｙ山区■（１９８２）堕　１４６９〜１４
７３においてＢｌａｋｅなどは、酵素ラベルとしてアル
カリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ及びそれ
ぞれの基質としてフェノールフタレインモノホスフェー
ト及び０−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ｏ　−
ＮＰＢＧ）を使用して、２種々のハプテンホルモン、チ
ロキシン（Ｔ４）及びトリョードチロニン（Ｔ、）につ
いての二重分析物酵素イムノアッセイの開発を報告した
。この検定においては、まず、ラベルされていないＴ、
及びＴ４が、Ｔ、及びＴ４特異性抗体を含有する抗体試
薬への結合のために、Ｔ３−β−ガラクトシダーゼ接合
体及びＴ４−アルカリホスファターゼ接合体とそれぞれ
競争する。２種の酵素ラベルの結合画分を、第２抗体沈
殿法より分離し、そして洗浄した後、その沈殿物を、フ
ェノールフタレインモノホスフェート及び０−ニトロフ
ェニル−β−ガラクトシドを含む酵素基質溶液中に再懸
濁する。次に、２種の酵素ラベルの量を、二段階インキ
ュベーション法により引き続けて決定し、初めにβ−ガ
ラクトシダーゼの量を、４２０ｎｍで０−ニトロフェノ
ールの吸光度をモニターすることによって決定し、そし
て次にそのｐＨを上げ、５４０ｒｖで吸光度をモニター
することによってアルカリホスファターゼの量を決定す
る。２種の酵素反応が同時によりもむしろ連続的に行な
われるので、この検定は、正しい“コンポ”イムノアッ
セイではない。しかしながら、２種の酵素ラベルを用い
て、正しい“コンポ”イムノアッセイを行なうことは事
実、可能であることが見出された。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明の１つの観点によれば、単独の液体サンプル中に
おいて２種の抗原を検定するための二重分析物酵素イム
ノアッセイ　（ここで、２種の免疫反応が同時に行なわ
れ、そして続いて、２種の酵素反応が同時に起こる）が
提供される。
酵素ラベル（及び、従って間接的に抗原）を、酵素触媒
された基質転換の生成物の直接的なモニターリングによ
って定量することができる。他方、酵素ラベルは、イン
キュベーション期間、基質の除去をモニターリングする
ことによって定量され得る。
アルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼは、
従来の酵素イムノアッセイにおいてラベルとしてぜに使
用される。なぜならば、それらは、実質的な活性の損失
を伴わないで、他のタンパク質、たとえば抗体に容易に
結合され、そして着色生成物を与える反応を触媒するこ
とができるからである。ある条件下で、２種の酵素ラベ
ルとにアルカリホスファターゼ及びβ−ガラクトシダー
ゼを用いて、正しい“コンポ”酵素イムノアッセイを行
なうことが可能であることを見出した。
アルカリホスファターゼによるフェノールフタレインモ
ノホスフェートの加水分解のための最適ｐＨは、９．８
である。しかしなから、高濃度（たとえば、約１Ｍ）の
ジェタノールアミンの存在下で、そのｐＨを、活性の損
失を伴わないで８．６に下げることができる。
β−ガラクトシダーゼは、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトシド（ｐ　−ＮＰＢＧ）のために７．４の最
適ｐＨを有するが、但し、通常の基質濃度（およそ５ｍ
Ｍまで）を用いる単独の検定型においては、そのｐＨを
、活性のわずかな損失（およそ　“２０％）のみを伴っ
て、８．６に上げることができる。しかしながら、同じ
検定システム（但し、約１Ｍのジェタノールアミンを含
む）においては、β−ガラクトシダーゼの活性は、はと
んど完全になくなることが見出された。ジェタノールア
ミンによるアルカリホスファターゼの阻害の動力学は複
雑であるが、しかしその主要効果は、６６−から２１＋
Ｈに変えられた１Ｍジェタノールアミンの存在下で、ｐ
−ＮＰＢＧのためのβ−ガラクトシダーゼのミカエリス
定数（ｋｍ）に匹敵する効果である。
しかしながら、約１Ｍのジェタノールアミンの存在下で
さえ、ｐ＋＋ａ、ｅで１）−ＮＰＢＧの濃度を上昇する
ことによって、β−ガラクトシダーゼの実質的な活性を
、達成することができることがまた、見出された。β−
ガラクトシダーゼの実質的な活性はまた、同じ反応培地
が使用される場合、ｐ−ＮＰＢＧの代わりにｏ　−ＮＰ
ＢＧにより得られる。
従って、本発明のイみノアッセイの好ましい態様におい
ては、酵素／基質対のβ−ガラクトシダーゼ／ニトロフ
ェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ｐ−及び／又はｏ−）
及びアルカリホスファターゼ／フェノールフタレインモ
ノホスフェートが適切なｐＨ且つジェタノールアミンの
存在下で、酵素反応段階に使用され、そして該ニトロフ
ェニルーβ−Ｄ−ガラクトシドの濃度は、２種の酵素反
応が同時に進行するようにジェタノールアミンによるβ
−ガラクトシダーゼの阻害を実質的にオフセットするの
に十分である。
アルカリホスファターゼによるフェノールフタレインへ
のフェノールフタレインモノホスフェートの転換が、５
５４ｎｓ＋での吸光度の測定によってモニターされ、そ
してβ−ガラクトシダーゼによるｐ−ニトロフェールへ
のｐ−ＮＰＢＧ又は０−ニトロフェノールへのｏ−ＮＰ
ＢＧの転換が、４０４ｎｍでの吸光度の測定によってモ
ニターされ、修正を、この波長で、低吸光度のフェノー
ルフタレインについて行なう。
この２種の同時酵素反応の生成物は、二極管配列分光光
度計を用いて、同時にモニターされ得るが、従来の分光
光度計においては、４０４ｎｍ及び５５４ｎｓでのＯ，
Ｄ、測定は、必然的に分離されるべきである。
一般的に、同時酵素反応は、７〜１０の間のｐＨで行な
われるであろう。その酵素反応に存在するジェタノール
アミンの濃度は、ジェタノールアミン濃度を下げること
が、アルカリホスファターゼ活性を低下せしめ、そして
β−ガラクトシダーゼ活性を高め、そしてジェタノール
アミンの濃度を上げることが、反対の効果を有するであ
ろうように、２種の酵素から得られたシグナルを平衡化
するために調整され得る。一般的に、使用されるジェタ
ノールアミンの濃度は、０．２５Ｍ〜１Ｍの範囲にある
であろう。シグナルはまた、８．６よりも高いｐＨで好
ましいアルカリホスファターゼ活性又は８．６よりも低
いｐｎで好ましいβ−ガラクトシダーゼ活性のいづれか
に反応培地のｐＨを調整することによって平衡化され得
る。しかしながら、好ましくは、そのｐＨは８．５〜８
．７の間であろう。
基！濃度における小さな変化が、有意に酵素触媒反応の
速度に影響を及ぼさないように、対応する酵素のｋｍの
少なくとも５倍の基質濃度を用いて２種の酵素の活性を
見積ることが好ましい。好ましくは、約５０ｍＭの濃度
で、β−ガラクトシダーゼラベルのための基質としてｐ
−ＮＰＢＧを使用することが最とも好ましい。従って、
たとえば、分離段階において検定混合物から除去された
２種のラベルの量は、約８．６のｐｉで、まず０．２５
Ｍ〜１Ｍのジェタノールアミン、３〜１０ｍＭのフェノ
ールフタレインモノホスフェート及び約５０ａ＋Ｍのｐ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む基質緩
衝溶液の存在下でインキエベーションすることによって
便利に決定され得る。
そのようなイムノアッセイにおいては、完全な抗体を使
用することができ又は抗体試薬の少なくとも１つは、抗
原結合部位ををする抗体のフラグメントを含有すること
ができる。本明細書に使用される場合、用語“抗体゛と
は、その範囲内に下記のものを含むことが理解されるで
あろう：ａ）従来使用される動物、たとえば羊、ウサギ
、ヤギ又はマウスのいづれかに由来された、種々のクラ
ス又もよりブクラスの免疫グロブリン（たとえば、Ｉｇ
Ｇ又はＩｇＭ）； ｂ）モノクローナル抗体；及び Ｃ）モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体のフラ
グメント〔該フラグメントは、抗体の結合領域を含まな
いものであり、すなわちＦｃ部分、たとえばＦａｂ　、
　　Ｆａｂ　’又はＦ（ａｂ’）ｔを欠いているフラグ
メント又はいわゆる、完全な抗体において主要Ｈ鎖成分
を連結するジスルフィド結合の還元的分解によって得ら
れた“半分子”フラグメント〕。
抗体の抗原結合性フラグメントの調製方法は、当業界に
おいて良く知られていて、そして本明細書には記載され
ないで、あろう。モノクローナル抗体を調製するための
技法もまた良く知られている〔たとえば、Ｇａ１ｆｒｅ
　Ｇ、　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　Ｃ，（１９８１）　。
“モノクローナル抗体の調製法：方策及び方法（Ｐｒｅ
ｐ、ａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ａｎ
ｄ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、Ｍｅｔｈｏｄ　１ｎｈｕ
肚旦■７３　、１〜４６を参照のこと〕。
本発明のイムノアッセイは、生理学的サンプル、たとえ
ば、健康な又は病気の患者から得られたヒト血清サンプ
ル又は尿サンプル中に一緒に見出される抗原の対を検定
するために特に有利である。
たとえば、そのような酵素イムノアッセイは、ホルモン
の対、たとえばＴ４（チロキシン）　／Ｔ３（トリョー
ドチロニン）、ＬＨ（黄体形成ホルモン）／ＦＳＨ（卵
胞刺激ホルモン）＆びＴ、／ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモ
ン）を検定するために好ましい。
たとえば、本発明の二重分析物酵素イムノアッセイは、
好ましくは、同時係属出願のヨーロッパ特許出願第１７
７１９１号に開示された、間接的結合タイプの、２種の
同時１一部位酵素イムノメトリックアノセイ　（この後
、１一部位ｒＢＭＡとして言及される）、同時係属出願
のヨーロッパ特許出願第１０５７１４号に開示されたラ
ジオイムノメトリックアッセイに類似する、間接的結合
タイプの、２種の同時２一部位酵素イムノメトソクアッ
セイ　（この後、２一部位ＩＨＭＡとして言及される）
又は２一部位酵素イムノメトリソクアッセイと同時に存
在するｌ一部位酵素イムノメトリックアッセイを含んで
成る。β−ガラクトシダーゼ及びアルカリホスファター
ゼは、そのような二重分析物酵素イムノアッセイに使用
するために異種二官能価試薬によって抗体に便利に接合
され得る〔たとえば、Ｉｓｈｉｋａｗａなど、Ｊ、　Ｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａ　　王、　　２０９〜３２７（１９
８３）を参照のこと〕。
１一部位酵素イムノメトリックアッセイは、■又はそれ
よりも多くのエピトープを有する抗原を検定するために
適切である。従来の１一部位酵素イムノメトリックアッ
セイにおいては、検定下の抗原（この後、“リガンド”
として言及される）が、酵素によりラベルされた抗体の
ためにリガンド類似体〔すなわち、検定下のリガンドの
既知量を、その範囲内で含む、リガンドじリガンド類似
体”）と同じ複合特徴を有する試薬〕と競争し、そして
その複合反応が完結した後、結合されたラベル抗体を有
するリガンド類似体を、その検定混合物から分離する。
ラベルされた抗体と結合するリガンド類似体の量は、サ
ンプル中に存在するリガンドの量に、反比例するであろ
う。通常、そのリガンド類似体は、分離段階を促進する
ために固形支持体上に固定される。複合反応が生じた後
、検定混合物から固形支持体（リガンド類似体及び一部
のラベルされた成分と一緒に）を分離し、続いて、リガ
ンド類似体に複合した、ラベルされた成分の部分を決定
し、そしてそれによってリガンドの量を計算した。
ヨーロッパ特許出願第１７７１９１に開示されたタイプ
の改良された１一部位酵素イムノメトリックアッセイに
おいては、リガンドＷｉｌｔ（１２体は、固形支持体に
直接的に結合されていない。代わりに、そのリガンド類
似体は、リガンドＸまたとえばハブテン〔たとえばフル
オレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））により接
合され、そしてその固相は、試薬Ｘに対して特異的な結
合パートナ−をそれに接合せしめている。リガンド類似
体がＴ、　−ＦＩＴＣである、ハプテンホルモンのチロ
キシン（Ｔ４）についての１一部位ＩＨＭＡが第１図に
図的に例示されている。
成分検定が２種の１一部位ＩＨＭＡである、本発明の好
ましい二重分析物酵素イムノアッセイは、ａ）液体サン
プル（それぞれ１又はそれよりも多くのエピトープを有
する２種の分析物リガンドを含む）、 ｂ）第１の分析物リガンドに対して特異的な、ｌ又はそ
れよりも多くの群のアルカリホスファターゼ−ラベルの
抗体分子、 Ｃ）第２の分析物リガンドに対して特異的な、ｌ又はそ
れよりも多くの群のβ−ガラクトシダーゼ−ラベルの抗
体分子、 ｄ）試薬Ｘにより接合された第１の分析物リガンドのリ
ガンド類似体（前記試薬は、混合物中において遊離試薬
として存在しない）、及びｅ）前記試薬Ｘにより接合さ
れた第２の分析物リガンドのリガンド類似体から成る混
合物をインキュベートし； 適切なインキュベーション期間の後、試薬Ｘに対して特
異的な結合パートナ−を担持する固相によって前記混合
物から成分（ｄ）及び（ｅ）を含む部分を分離し；約８
．６のｐＨで、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
シド、フェノールフタレインモノホスフェート及び０．
２５Ｍ〜１Ｍのジェタノールアミンの存在下で前記固相
又はリガンド相をインキュベートしく前記ガラクトシド
の濃度は、ジェタノールアミンによるβ−ガラクトシダ
ーゼの阻害を実質的にオフセットするのに十分である）
；そしてフェノールフタレイン及びｐ−ニトロフェノー
ルの生産をモニターすることを含んで成る。
たとえば、そのような二重酵素イムノアッセイは、単独
のサンプル中において同時にＴ４及びＴ、を検定するた
めに便利に使用され得る。
従来の２一部位酵素イムノメトリックアッセイ（通常、
サンドウィッチ酵素イムノアッセイとして言及されてい
る）においては、複数のエピトープを有すべきリガンド
が、固相に接合された非ラベル抗体との反応によって不
溶化され、そしてリガンドの異なった（広く間隔をあけ
られた）エピトープに向けられた酵素ラベルの抗体によ
り反応せしめられる。複合反応によって固定化される、
ラベルされた抗体の量は、直接的に、サンプル中に存在
するリガンドの量に比例する。
間接的結合タイプの改良された２一部位酵素イムノメト
リックアッセイ　（２一部位ＩＨＭＡ）　は、リガンド
の異なったエピトープに向けられた２種の可溶性抗体試
薬（１つの可溶性抗体試薬は、酵素によりラベルされた
抗体分子を含む）を使用する。
使用される固相は、リガンドに非ラベル抗体を特異的に
、非共有結合することができる試薬に接合される。たと
えば、これらの抗体は、試薬Ｘに便利に接合され得る。
次に、分離段階は、試薬Ｘに対して特異的な結合パート
ナ−に接合された固相を用いることによって達成される
。そのような間接的結合タイプの２一部位酵素イムノメ
トリ・ノクアフセイが、第２図に図示されている。
成分検定が２種の２一部位ＩＥＭＡである、本発明の好
ましい二重分析物酵素イムノアッセイは、ａ）液体サン
プル（１よりも多くのエピトープを有する２種の分析物
リガンドを含む）、ｂ）第１の分析物リガンドに対して
特異的な、１又はそれよりも多くの群のアルカリホ゛ス
ファターゼーラベルの抗体分子、 Ｃ）第２の分析物リガンドに対して特異的な、１又はそ
れよりも多くの群のβ−ガラクトシダーゼ〜ラベルの抗
体分子、 ｄ）試薬Ｘにより接合された第１の分析物リガンドに対
する抗体を含んで成る試薬（前記試薬は、混合物中にお
いて遊離試薬として存在しない）、ｅ）前記試薬Ｘに接
合された第２の分析物リガンドに対する抗体を含んで成
る試薬、及び（ｆ）非共有結合によって試薬Ｘに結合す
ることができるが、しかし成分（ａ）又は成分（ｂ）及
び（ｃ）のいづれかに直接的に結合することはできない
試薬（前記試薬（ｆ）は、固相支持体に結合されている
）から成る混合物をインキュベートし；適切なインキュ
ベージジン期間の後、液体画分から固形画分を分離し；
約８．６のｐｔｔで、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガ
ラクトシド、フェールフタレインモノホスフェート及び
０．２５　Ｍ〜１Ｍのジェタノールアミンの存在下で前
記分離された固相又は液相をインキュベートしく前記ｐ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドの濃度がジェ
タノールアミンによるβ−ガラクトシダーゼの阻害を実
質的にオフセットするのに十分である）；そしてフェノ
ールフタレイン及びｐ−ニトロフェノールの生産をモニ
ターすることを含んで成る。
本発明の二重分析物酵素イムノアッセイが特に所望され
るためのリガンドの対の例は、ホルモンＬＨ（黄体形成
ホルモン）及びＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）である。
あるリガンドの対、たとえばＴ４及びＴＳＨに関しては
、２一部位ＩＨＭＡと同時に存在する１一部位ＩＥＭＡ
から成る、本発明の二重分析物酵素イムノアッセイを得
ることが特に所望される。このタイプの好ましい二重分
析物酵素イムノアッセイは、ａ）液体サンプル（２種の
分析物リガンドを含み、少なくとも１つの分析物リガン
ドが１よりも多くのエピトープを有する）、 ｂ＞　　１つの分析物リガンドに対して特異的な、１又
はそれよりも多くの群のアルカリホスファタ−ゼーラベ
ルの抗体分子、 Ｃ）第２の分析物リガンドに対して特異的な、ｌ又はそ
れよりも多くの群のβ−ガラクトシダーゼ−ラベルの抗
体分子、 ｄ）試薬Ｘに接合された分析物リガンドの１つのリガン
ド類似体（前記試薬は、混合物中において遊離試薬とし
て存在しない）、 ｅ）成分（ｄ）が前記試薬Ｘにより接合されたリガンド
類似体でない分析物リガンドに対する抗体を含んで成る
試薬（この試薬（ｅ）が特異的である分析物リガンドが
、１つよりも多くのエピトープを有する）、及び ｆ）非共有結合によって試薬Ｘに結合することができる
が、しかし成分（ａ）又は成分（ｂ）及び（ｃ）に直接
的に結合することはできない試薬〔前記試薬（ｆ）は、
同相支持体に結合されている〕から成る混合物をインキ
ュベートし；適切なインキュベーション期間の後、液体
画分から固形画分を分離し；そして前記のようにして、
前記画分の１つに、２種の酵素ラベルの量を決定するこ
とを含んで成る。
本明細書に使用される場合、用語“非共有結合”とは、
抗体：抗原又は抗体：ハプテン結合におけるような免疫
学的結合又は非免疫学的結合〔たとえば特異的結合タン
パク質とそのリガンドとの間の結合、たとえばプロティ
ンＡと抗体のＦｃ部分との間の相互反応又はアビジンと
ビオチンとの間の相互反応〕を意味する。
成分検定が２種の１一部位ＩＨＭＡ、２種の２一部位Ｉ
ＨＭＡ又は１つの１一部位ＩＥＭＡ及び１つの２一部位
ＩＢＭ＾である、本発明の好ましい２重分折物酵素イム
ノアッセイにおいては、試薬Ｘが、たとえばフルオレセ
イン誘導体（たとえば、フルオレセインイソチオシアネ
ート）、ロダミ・ンイソチオシアネート、２．４−ジニ
トロフルオロベンゼン、フェニルイソチオシアネート及
びダンシルクロリドから選択されたハプテンであり、そ
して固相が前記選択されたハプテンに対して特異的な抗
体に接合されることが特に好ましい。特に、ＦｒＴＣが
試薬Ｘとして好ましく、この場合、抗−ＦＩＴＣ抗体が
固形支持体に共有結合されている。ＦＩＴＣに対する抗
血清は、従来の方法、たとえば、キーオールリンペット
　（赤貝類）のヘモシアニンに接合されたＦＩＴＣによ
り羊を免疫感作することによって容易に調製され得る。
固形支持体への抗血清のカップリングは、たとえばＡｘ
ｅｎなど、（Ｎａｔｕｒｅ、　　２１４゜１３０２〜１
３０４　（１９６７）　）の方法によって影響を及ぼさ
れ得る。結合対、アビジン／ビオチンの使用はまた、ひ
じょうに好ましい。便利には、固相は、磁気性粒子、た
とえば磁気性セルロース粒子（Ｆｏｒｒｅｓｔ　ａｎｄ
　Ｒａｔｔｌｅ　、　”　ｆｍｕｎｏａｓｓａ　ｓユ肛
■亘江虹」匝畦■ｕ”中の“磁気粒子によるラジオイム
ノアッセイ　（門ａｇｎｅｔｉｃ　ＰａｒｔｉｃｌｅＲ
ａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）　　″、　　１４７
〜１６２ページ、１１ｕｎｔｅｎ　ａｎｄ　Ｃｏｒｒｉ
ｅ出版、Ｃｈｕｒｃｈ口Ｉ　Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ。
Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（１９８３）　）を含むことができ
る。
さらに本発明の特徴によれば、本発明の検定方法を行な
うための試薬のキットが供給される。成分検定が２種の
１一部位ＩＥＭＡ、２種の２一部位ＩＥＭＡ又は１つの
１一部位ＩＥＭ＾及び１つの２一部位ＩＥＭＡである、
好ましい二重分析物酵素イムノアッセイのためのキット
は、たとえば適切な成分（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（
ｅ）並びに、試薬Ｘに対して特異的な結合パートナ−を
担持する固相を含んで成る。
便利に使用するために、複数の成分、（ｂ）。
（ｃ）、　（ｄ）及び（ｅ）を、単独の試薬に混合する
ことができる。１又はそれよりも多くのこれらの成分は
、凍結乾燥形で供給され得る。
次の例は、本発明を例示するものであって、制限するも
のではない。
ＬＨ及びＦＳＨに対するモノクローナル抗体を、Ｋｔ５
ｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　　（Ｎａｔｕｒ
ｅ　、　２５６　、（１９７５）４９５〜４９７ページ
〕によって報告された方法によって、マウスの腹水から
得た。個々のハイブリドーマ細胞系からの抗体をスクリ
ーンし、別々の抗原決定基に対する抗体を産生ずる細胞
系を同定した。問題の抗原に対して最とも高い親和性を
有するこれらの抗体を、検定に使用するために選択した
。
（ｉｉ）筑止跋１皇ｍ盟 （ａ）　ＬＨ−アルカリホスフ　　−ゼＬＨに対する１
つの群のモノクローナル抗体を、次のようにしてアルカ
リホスファターゼ酵素によりラベルした。０．１６−の
Ｎ−スクシンイミジル４−　（Ｎ−マレイミドメチル）
シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）　
（ジメチルホルムアミド−ＤＭＦ中において６０ｍＭ）
を、１．６　ｒｎｌのアルカリホスファターゼ（５０ｍ
Ｍホウ酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム及び０．
１＃１Ｍ塩化亜鉛溶液（ｐｌ＋　７．６　）において２
■／−〕に添加し、そして３０℃で１時間インキュベー
トした。０．１ＭのＴｒｉｓ、　　１　ｍＭ塩化マグネ
シウム及び０．１　ｍＭ塩化亜鉛溶液（ｐＨ７，０）に
より平衡化された５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５媒体カラム
（ＩＸ３５ｃｍ）を通過せしめることによって、前記酵
素を分離した。その精製された酵素を、必要なまで＋４
℃で保存した。
Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネ−）（ＳＰＤＰ）　（エタノール中において２５
ｍＭ）　１６．３−を、１−の抗−ＬＨモノクローナル
抗体（２０Ｏｎ＋Ｍプロピオン酸ナトリウム溶液（ｐＨ
６，０）中において３■／ｄ〕に添加し、そして室温で
３０分間、インキュベートした。２００ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ４，５）により平衡化された使い捨て
の５ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（ＰＤ　−１０）を
通過せしめることによって、抗体を分離した。ジチオト
レイトール（１Ｍ）を、前記抗体（抗体体積２０に対し
てジチオトレイトール１が添加された）に添加し、室温
で１０分間、放置した。２００ｍＭプロピオン酸ナトリ
ウム溶液（ｐＨ６，０）により平衡化された５ｅｐｈａ
ｄｅｘＧ−２５媒体カラム（Ｉ　Ｘ　３５０）を用いて
、前記抗体を脱塩せしめた。
上記のようにして調製された抗体及びアルカリホスファ
ターゼを、等モル比で混合し、そして４℃で２４時間、
接合せしめた。得られた接合体を、２００ｍＭプロピオ
ン酸ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１　
ｍＭ塩化亜鉛溶液（ｐＨ６，０）により平衡化されたＴ
ＳＫ　３０００Ｓ−カラムによる高性能液体クロマトグ
ラフィー（ＩＩＰＬＣ）によって精製した。
（ｂ）坑二印二■匹 ＬＨの異なったエピトープに向けられた、第２群のモノ
クローナル抗体を、ＦＩＴＣによりラベル化した。この
第２群のモノクローナル抗体へのＦＩＴＣの接合を、室
温で１８時間、０．２　Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（
ｐＨ９，０）　　１．４−中、抗体５■とＦＩＴＣ（Ｓ
ｉｇｍａ　Ｌｏｎｄｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、
Ｅｎｇｌａｎｄ）２００ｎとを反応せしめることによっ
て達成する。その反応混合物を、５ｅｐｈａｄｅｘＧ−
５０超微粉によるゲル濾過によって精製し、抗体分子当
り平均６分子のＦＩＴＣを組み込んだ生成物を得た。
（Ｃ）［−ガークトシ゛−ゼ ５ＰＤＰ　（エタノール中２５ｍＭ）１５０ｍを、０．
２　Ｍプロピオン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）中
、１００ｎ／−抗−ＦＳＨ抗体溶液９．４艷に添加し、
そして室温で３０分間、インキュベートした。次に、得
られた抗体を、プロピオン酸ナトリウム緩衝液（０，０
２Ｍ　、　ｐＨ６，０）　ニより平衡化されたＨＰＬＣ
ＴＳＫ３０００ＳＩ／Ｉカラムを通すことによって精製
した。次に、このようにして得られた抗体を、等モル濃
度のβ−ガラクトシダーゼと共に混合し、そして４℃で
１晩インキエベートし、そしてプロピオン酸ナトリ、ウ
ム緩衝液（０，２Ｍ、ｐＨ６，０）により平衡化された
ＴＳＫ　４０００カラムにより精製した。
（ｄ）筑二上鋒ユヨ１匹 ＦＳＨの異なったエピトープに向けられた第２群のモノ
クローナル抗体を、抗−ＬＨ−ＦｒＴＣ接合体を調製す
るために用いられたのと同じ方法を用いて、ＦＩＴＣに
接合した。
（ｅ）　　ｇ　　畳″カクテル”の８８′検定緩衝液〔
０，５％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、０．２％羊血
清、０．２％アジ化ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリ
ウ、ム、１ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１ｍＭ塩化亜
鉛を含ム１００ｍＭ　（７）Ｔｒｉｓ／ＨＣ４ａｉ衝液
、ｐＨ８，０）中、β−ガラクトシダーゼに接合された
抗−ＦＳＨ抗体（５■／ｍｌ）、ＦＩＴＣに接合された
抗−ＦＳＨ抗体（１，２５ｎ／ｍ／）　、アルカリホス
ファターゼに接合された抗−ＬＨ抗体（３７５ｎｇ／ｍ
７）及びＦｒＴＣに接合された抗−ＬＨ抗体（２５０ｎ
ｇ／ｍｌ）から成る“試薬カクテル”を製造した。
（ｉｉｉ　）皿批成１旦」裂 この材料は、磁気性セルロース粒子に共有結合された抗
−１４Ｔｃポリクロ一ナル抗体を含有した。
抗−ＰＩＴＣは、キーホールリンペットヘモシアニンに
接合されたＦｆＴＣによる免疫感作羊により得られた従
来のポリクローナル抗血清であった。磁気性セルロース
粒子は、３μの平均粒子直径を有する、およそ５０％の
黒色酸化鉄（Ｆｅ、、０．）を含むセルロースの複合材
料であった（Ｆｏｒｒｅｓｔ　ａｎｄ　Ｒａｔｔｌｅ。
“Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｒａｄｉｏｉ
ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”　、　ｉｎ”　Ｉｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ″＋１４７〜１６２ページ、Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎｄ
　Ｃｏｒｒｉｅ出版、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎ
ｇｓｔｏｎｅ、　Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（１９８３）を参
照のこと］。抗−ＦｒＴＣ抗血清を、Ａｘｅｎなど。
（Ｎａｔｕｒｅ、　２１４．１３０２〜１３０４（１９
６７））の方法に従って、セルロースの臭化シアンによ
る活性化の後、磁気性セルロース粒子に共有結合せしめ
た。その抗血清を、磁気性固相１ｇに対して抗血清２ｍ
７の割合で結合せしめた。
その固相を、０．１％アジ化ナトリウム、０．５％ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、画分■、０．２５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０及び０．５％メトセルを含む５０ｍＭのＴｒｉ
ｓ／ＩＩ（Ｊ　ｉ衝液（ｐＨ８，０）により５ｑ／ｍｌ
に希釈した。
（ｉｖ）　　　　　’−’Ｉ　Ｏ）”ｒ　　’基質緩衝
液は、１５０ｍＭのＮａｃｌ、１ｍＭのＭｇｃ／ｚ。
３ｍＭのリン酸モノフェノフタレイン及び５０ｍＭのｐ
−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む、ジェ
タノールアミンの１Ｍ溶液（ｐＨ８，６）から構成され
た。
（ｖ）　　　　”’　（７）ｉｏ　’ ２００ｍＭのＮａｚＣＯｉ　、　２０　ｍＭのＮａ５Ｐ
Ｏａ及び３００ｍＭのＥＤＴＡを含む溶液をｐＨ１２に
調整し、そして次に、ＮａＯＨを添加することによって
１５０ｍＭに調整することによって停止溶液を、調製し
た。
（ｖｉ）■Ｚ本し挟定土 サンプル１００ｐｆ及び抗体試薬カクテル２００Ｉを、
混合し、攪拌し、そして３７℃で２０分間インキュベー
トし、その後、抗−ＦＩＴＣ固相（５■／−）２００１
１１を添加し、そして攪拌した。その後、さらに１０分
間インキュベートし、次にその同相を、磁気的に沈降せ
しめ、そして上清液を捨てた。その磁気性粒子の固相を
、洗浄緩衝液（０，９％塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
のＴｒｉｓ／ＨＣ４？容ン佼、ｐＨ８、６）５００１１
１を添加し、攪拌し、そして磁気的に分離し、次に上清
液をデカントすることによって、３度洗浄した。第３回
目の洗浄及びデカントが終った後、その固相を、２分間
にわたってドレンした。基質溶液３ＱＯｕｌの添加の後
、その管を、３７℃で３５分間インキュベートし、そし
て次に、停止溶液１ｍｊを添加した。
固相を、少なくとも１５分間、磁気的に沈降せしめた後
、ＬＨの濃度を、その上清液のＡ１，４から算定し、そ
してフェノールフタレインの吸光度について４０４ｎｍ
で修正した後、ＦＳＨの濃度を、その上清液のＡ、。４
から算定した。
以下余白 （ｖｉｉ　）稙−来 下記第１表においては、“コンポ”検定を用いて、ＬＨ
及びＦＳＨの両者を含むサンプルのために得られた結果
が、Ａｍｅｒｌｅｘ　ＲＩＡキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ
ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ）を用いて同じサ
ンプル中のＬＨ及びＦＳＨを別々に測定することによっ
て得られた結果と比較されている。“コンポ”検定を用
いて同時に測定する場合のＬＨ及びＦＳＨについての標
準曲線が、第３及び４図にそれぞれ示されている。
第１表 ４．９　　８．３　　４．８　　５．９１５．３　　２
１．８　　２９．５　　３２．０２９．０　　３６．５
　　６７．５　　６６．０５３．０　　６２．０　　＞
１００．０　１３７．０＞１００．０　１４０．０　　
＞１００．０　１６５．０２．４　　２．８　　１．９
　　２．８？、７　　１２．３　　７．０　　８．８■
−１ この例においては、第１図に図示されているようなＴ４
のための１一部位間接結合酵素イムノアッセイと、第２
図に図示されているような２一部位間接酵素イムノアッ
セイ（すなわち、間接結合サンドウィッチイムノアッセ
イ）とを組み合わした。
（ｉ）モノクローナル　　の８・１ Ｔ４およびＴＳＨに対するモノクロ−抗体を、Ｋｏｈｌ
ｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　（Ｎａｔｕｒｅ　ｔ
、　韮（１９７５）４９５〜４９７〕によって報告され
ている方法によって、マウス腹水から得た。個々のハイ
ブリドーマ細胞系からの抗体をスクリーンし、別々の抗
原決定基に対する抗体を産生ずる細胞系を同定した。問
題の抗原に対して最とも高い親和性を有するこれらの抗
体を、検定に使用するために選択した。
（ｉｉ）孤生成策夏跋Ｉ ＴＳＨの異なったエピトープに向けられた２種の群のモ
ノクローナル抗体を、例１に使用された同じ方法を用い
て、アルカリホスファターゼによりラベルし、抗−ＬＨ
−アルカリホスファターゼ接合体を調製した。ＴＳＨに
対する１つのアルカリホスファターゼ−ラベルのモノク
ローナル抗体の結合を、他の酵素−ラベルのモノクロー
ナル抗体の結合により妨害した。
Ｔ４に対するモノクローナル抗体群を、β−ガラクトシ
ダーゼによりラベルし、そしてＴＳＨの第三エピトープ
に向けられた抗−ＴＳＨモノクローナル抗体群を、さら
に例１（ｉｉ）におけるのと同じ方法を用いて、ＰＩＴ
Ｃと接合せしめた。
（ｉｉｉ　）■匹二旦ｑ皿翌 接合体ＦＩＴＣＴａを、Ｓｍ１ｔｈ　（ＦＥＢＳ　Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ　、　７７゜２５（１９７７））の方法によ
って調製し、そして精製した。
（ｉｖ）周部）ＪＢｌ長 例１（ｉｉｉ）におけるのと同じ。
（ｖ）益１１黴丘生皿１ 例１（ｉｖ）におけるのと同じ。
（ｖｉ　）笠址ｊＩＬ囚」裂 例１　（■）におけるのと同じ。
（ｖｉ）挟足試１生Ｈ製 ０．５％ウシ血清アルブミン（画分Ｖ）、０．２％羊血
清、０．２％アジ化ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリ
ウム、１ｍＭ塩化マグネシウム及び０．１　ｍＭ塩化亜
鉛を含む検定緩衝液（ｐＨ８，０）　（１００ｍＭのＴ
ｒｉｓ／１１Ｃｊ！　）中、ＦｒＴＣ−７４，（１０，
５ｐＭ）、ＦＩＴＣに接合された抗−ＴＳＨ抗体（５ｐ
ｇ／ｍ／）、アルカリホスファターゼに接合された抗−
ＴＳＨ抗体（１ｇ／ｄ）及び８−アニリノ−１−ナフタ
レンスルホン酸（１，５■／−）から成る試薬カクテル
（試薬Ａ）を１用型した。
第２試薬（試薬Ｂ）は、検定緩衝液中、β−ガラクトシ
ダーゼに接合された抗−Ｔ４抗体（７，６１ｇ／＠ｊ）
から構成された。
（ｖｉｉ　）工、　　ＴＳＨ？１ サンプル１００μｌに、試薬Ａ２００　ｍ及び試薬Ｂ１
００Ｉｌｌを添加した。攪拌した後、その混合物を３７
°Ｃで２０分間、インキュベートし、次に抗−ＦＩＴＣ
固相（５Ｎ／　ｍＺ）２００ｕ１を添加した。３７℃で
５分間インキュベートした後、その混合物を磁気的に分
離し、そし上清液をデカントした。磁気性粒子の固相を
、洗浄緩衝液（０，９％塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ
のＴｒｉｓ／ＩＩ（Ｊ　、　ｐＨ８，６）５００Ｊ１１
を添加し、攪拌し、そして磁気的に分離し、次に、上清
液をデカントすることによって３度洗浄した。３回目の
洗浄及びデカントが終った後、その固相を、２分間にわ
たってドレンした。基質溶液３００μｌの添加の後、そ
の管を３７°Ｃで２０分間インキュベートし、そして次
に、停止溶液１ｍ／を添加した。粒子を、少なくとも１
５分間、磁気的に沈降せしめた後、５５４及び４０４ｎ
ｍでの吸光度を測定した。
（ｉｘ　）藍−工 甲状腺機能低下性、甲状腺機能正常性及び甲状腺機能正
常性患者からの血清サンプル中に同時にＴ４及びＴＳＨ
を測定するために、Ｔ４．／ＴＳＨ”コンポ”検定を用
いて得られた結果を、下記の第２表に与える。
以下余白 男−」し−表 甲状腺機能低下　　　？９．１　　　　　９．６甲状腺
機能正常　　　８６．７　　　　　２．８４甲状腺機能
冗進　　１０Ｂ　　　　　　　０．７８４゜“コンポ”
検定を用いて同時に測定した場合のＴ４及びＴＳＨにつ
いての標準曲線が第５及び６図にそれぞれ与えられてい
る。
さらに８８人の患者のサンプルを、Ｔオ／ＴＳＨ“コン
ポ”検定を用いてＴ４及びＴＳＨのために検定し、そし
てまたＡｍｅｒｌｅｘ　Ｔ４　ＲＩＡキット（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｌｃ）を用
いてＴ４について別々に、そしてまた２一部位イムノラ
ジオメトリックアッセイキット　（ＩＲＭＡキット；　
５ｅｒｏｎ。
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）を用いてＴ
ＳＨについて別々に検定した。
第７図は、すべての８８人のサンプルのための“コンポ
”検定によるＴＳＨの結果及びＩＲＭＡによるＴＳＨの
結果の比較を示す。第８及び９図は、それぞれＯ〜１０
μＵ／−及びθ〜２０μＵ／＋ａ／サンプルについての
“コンポ”検定及びＩＲＭＡ検定により得られたＴＳＨ
の結果の比較を示す。
すべての８８人の患者のサンプルについて、“コンポ”
検定及びＡｔ５ｅｒＩｅｘ　Ｔａ、　ＲＩＡキットを用
いて得られたＴ４値の比較を、第１０図に示す。
【図面の簡単な説明】
第１図は、Ｔ４のための１一部位結合ＩＥＭＡを示す。 第２図は、Ｔ４のための２一部位結合ＩＨＭＡを示す。 第３及び４図は、“コンポ”検定を用いて同時に測定さ
れた場合のＬＨ及びＦＳＨ曲線をそれぞれ示す。 第５及び６図は、“コンポ”検定を用いて同時に測定さ
れた場合のＴ４及びＴＳＨ曲線をそれぞれ示す。 第７図は、“コンポ”検定によるＴＳＨ及びＩＲＭＡに
よるＴＳＨの比較を示す。 第８及び９図は、それぞれ０−１０μＵ／−及びＯ〜２
０μＵ／ＩＩ＋７サンプルについての“コンポ”検定及
びＩＲＭＡ検定によるＴＳＨ値の比較を示す。 第１０図は、“コンポ”検定及びＡｍｅｒｌｅｘ　Ｔ４
Ｒ１＾キ７）によるＴ４値の比較を示す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、単独の液体サンプル中において２種の抗原を検定す
    るための二重分析物酵素イムノアッセイであって、２種
    の免疫反応が同時に行なわれ、そして続いて２種の酵素
    反応が同時に起こるイムノアッセイ。 ２、酵素／基質対、すなわちβ−ガラクトシダーゼ／ニ
    トロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ｐ−及び／又は
    ｏ−）及びアルカリホスファターゼ／フェノールフタレ
    インモノホスフェートを適切なｐＨで且つジエタノール
    アミンの存在下で酵素反応段階に使用し、該ニトロフェ
    ニル−β−Ｄ−ガラクトシドの濃度は、２種の酵素反応
    が同時に進行するように、前記ジエタノールアミンによ
    るβ−ガラクトシダーゼの阻害を実質的にオフセットす
    るのに十分である特許請求の範囲第１項記載のイムノア
    ッセイ。 ３、前記酵素反応段階を、０．２５Ｍ〜１Ｍの範囲の濃
    度でジエタノールアミンの存在下で行なう特許請求の範
    囲第２項記載のイムノアッセイ。 ４、前記酵素反応段階を、７〜１０の間のｐＨで行なう
    特許請求の範囲第２項記載のイムノアッセイ。 ５、前記酵素反応段階を、８．５〜８．７の間のｐＨで
    行なう特許請求の範囲第４項記載のイムノアッセイ。 ６、ａ）液体サンプル（それぞれ１又はそれよりも多く
    のエピトープを有する２種の分析物リガンドを含む）、 ｂ）第１の分析物リガンドに対して特異的な、１又はそ
    れよりも多くの群のアルカリホスファターゼ−ラベルの
    抗体分子、 ｃ）第２の分析物リガンドに対して特異的な、１又はそ
    れよりも多くの群のβ−ガラクトシダーゼ−ラベルの抗
    体分子、 ｄ）試薬Ｘにより接合された第１の分析物リガンドのリ
    ガンド類似体（前記試薬は、混合物中において遊離試薬
    として存在しない）、及び ｅ）前記試薬Ｘにより接合された第２の分析物リガンド
    のリガンド類似体から成る混合物をインキュベートし； 適切なインキュベーション期間の後、試薬Ｘに対して特
    異的な結合パートナーを担持する固相によって前記混合
    物から成分（ｄ）及び（ｅ）を含む部分を分離し；約８
    ．６のｐＨで、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
    シド、フェノールフタレインモノホスフェート及び０．
    ２５Ｍ〜１Ｍのジエタノールアミンの存在下で前記固相
    又はリガンド相をインキュベートし（前記ガラクトシド
    の濃度が、ジエタノールアミンによるβ−ガラクトシダ
    ーゼの阻害を実質的にオフセットするのに十分である）
    ；そしてフェノールフタレイン及びｐ−ニトロフェノー
    ルの生産をモニターすることを含んで成る特許請求の範
    囲第５項記載のイムノアッセイ。 ７、ａ）液体サンプル（１よりも多くのエピトープを有
    する２種分析物リガンドを含む）、 ｂ）第１の分析物リガンドに対して特異的な、１又はそ
    れよりも多くの群のアルカリホスファターゼ−ラベルの
    抗体分子、 ｃ）第２の分析物リガンドに対して特異的な、１又はそ
    れよりも多くの群のβ−ガラクトシダーゼ−ラベルの抗
    体分子、 ｄ）試薬Ｘにより接合された第１の分析物リガンドに対
    する抗体を含んで成る試薬（前記試薬は、混合物中にお
    いて遊離試薬として存在しない）；（ｅ）前記試薬Ｘに
    接合された第２の分析物リガンドに対する抗体を含んで
    成る試薬、及び （ｆ）非共有結合によって試薬Ｘに結合することができ
    るが、しかし成分（ａ）又は成分（ｂ）及び（ｃ）のい
    づれかに直接的に結合することはできない試薬〔前記試
    薬（ｆ）は、固相支持体に結合されている〕から成る混
    合物をインキュベートし； 適切なインキュベーション期間の後、液体画分から固形
    画分を分離し；約８．６のｐＨで、ｐ−ニトロフェニル
    −β−Ｄ−ガラクトシド、フェールフタレインモノホス
    フェート及び０．２５Ｍ〜１Ｍのジエタノールアミンの
    存在下で前記分離された固相又は液相をインキュベート
    し（前記ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドの
    濃度がジエタノールアミンによるβ−ガラクトシダーゼ
    の阻害を実質的にオフセットするのに十分である）；そ
    してフェノールフタレイン及びｐ−ニトロフェノールの
    生産をモニターすることを含んで成る特許請求の範囲第
    ５項記載のイムノアッセイ。 ８、ａ）液体サンプル（２種の分析物リガンドを含み、
    少なくとも１つの分析物リガンドが１よりも多くのエピ
    トープを有する）、 ｂ）１つの分析物リガンドに対して特異的な、１又はそ
    れよりも多くの群のアルカリホスファターゼ−ラベルの
    抗体分子、 ｃ）第２の分析物リガンドに対して特異的な、１又はそ
    れよりも多くの群のβ−ガラクトシダーゼ−ラベルの抗
    体分子、 ｄ）試薬Ｘに接合された分析物リガンドの１つのリガン
    ド類似体（前記試薬は、混合物中において遊離試薬とし
    て存在しない）、 ｅ）成分（ｄ）が前記試薬Ｘにより接合されたリガンド
    類似体でない分析物リガンドに対する抗体を含んで成る
    試薬（この試薬（ｅ）が特異的である分析物リガンドが
    、１つよりも多くのエピトープを有する）、及び （ｆ）非共有結合によって試薬Ｘに結合することができ
    るが、しかし成分（ａ）又は成分（ｂ）及び（ｃ）に直
    接的に結合することはできない試薬〔前記試薬（ｆ）は
    、固相支持体に結合されている〕から成る混合物をイン
    キュベートし； 適切なインキュベーション期間の後、液体画分から固形
    画分を分離し；約８．６のｐＨで、ｐ−ニトロフェニル
    −β−Ｄ−ガラクトシド、フェノールフタレインモノホ
    スフェート及び０．２５Ｍ〜１Ｍのジエタノールアミン
    の存在下で前記分離された固相又は液相をインキュベー
    トし（前記ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド
    の濃度がジエタノールアミンによるβ−ガラクトシダー
    ゼの阻害を実質的にオフセットするのに十分である）；
    そしてフェノールフタレイン及びｐ−ニトロフェノール
    の生産をモニターすることを含んで成る特許請求の範囲
    第５項記載のイムノアッセイ。 ９、前記酵素反応段階を、初めに０．２５Ｍ〜１Ｍのジ
    エタノールアミン、３〜１０ｍＭのフェノールフタレイ
    ンモノホスフェート及び約５０ｍＭのｐ−ニトロフェニ
    ル−β−Ｄ−ガラクトシドを含んで成る基質緩衝溶液の
    存在下で、約８．６のｐＨで行なう特許請求の範囲第５
    、６、７又は８項のうちいづれか１項記載のイムノアッ
    セイ。 １０、単独の液体サンプル中において２種の抗原を検定
    するためのイムノアッセイを行なうための試薬キット。 １１、１又はそれよりも多くの群のアルカリホスファタ
    ーゼ−ラベルの抗体、１又はそれよりも多くの群のβ−
    ガラクトシダーゼ−ラベルの抗体、試薬Ｘのための特異
    的結合パートナーに接合された固相及びさらに１又はそ
    れよりも多くの適切な試薬を含んで成る特許請求の範囲
    第６、７、８又は９項のうちいづれか１項記載のイムノ
    アッセイを行なうための試薬キット。
JP62064411A 1986-03-21 1987-03-20 イムノアツセイ方法 Pending JPS62284262A (ja)

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