DE19632156C1 - Verfahren zur Detektion mehrerer Antigene auf biologischem Material - Google Patents
Verfahren zur Detektion mehrerer Antigene auf biologischem MaterialInfo
- Publication number
- DE19632156C1 DE19632156C1 DE1996132156 DE19632156A DE19632156C1 DE 19632156 C1 DE19632156 C1 DE 19632156C1 DE 1996132156 DE1996132156 DE 1996132156 DE 19632156 A DE19632156 A DE 19632156A DE 19632156 C1 DE19632156 C1 DE 19632156C1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- antibody
- enzyme
- reaction
- antigen
- conjugated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/289—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD45
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von einem
ersten und zumindest einem weiteren Antigen auf biologischem
Material durch einen für das erste Antigen spezifischen ersten
Primärantikörper und einen für das weitere Antigen spezifischen
weiteren Primärantikörper, wobei diesen Antikörpern jeweils
ein Enzym zugeordnet ist, mit den Schritten:
- a) Detektion des ersten Antigens mit Hilfe einer ersten Nachweisreaktion, die durch das dem ersten Primärantikörper zugeordnete Enzym katalysiert wird;
- b) Detektion des weiteren Antigens mit Hilfe einer weiteren Nachweisreaktion, die durch das dem weiteren Primäranti körper zugeordnete Enzym katalysiert wird.
Ein derartiges Verfahren ist aus dem Laboralltag bekannt.
Die Detektion mehrerer verschiedener Antigene auf einem biolo
gischen Material wie Zellen oder Geweben mit Hilfe immunen
zymatischer Techniken (Immunzytochemie bzw. Immunhistochemie)
ist auch aus der Literatur bekannt (Van der LOOS, C.M. et
al. (1993): Practical Suggestions for Successful Immunoenzyme
Double-Staining Experiments. Histochem. J. 25: 1-13; KRENACS,
T. et al. (1990): Double and Triple Immunocytochemical Labelling
at the Light Microscopical Level in Histopathology. Histochem.
J. 22: 530-536).
Solche Verfahren sind immer dann notwendig, wenn festgestellt
werden muß, ob zwei oder mehr Antigene auf Zellen oder Geweben
zur gleichen Zeit exprimiert werden.
Diese Verfahren werden z. B. in der Grundlagenforschung dazu
eingesetzt, die Expressionsmuster neuer, gerade erst gefundener
Antigene zu analysieren. Von besonderer Bedeutung sind solche
Verfahren jedoch in der klinischen Pathologie, bei der Diagnose
von Krankheiten aus Blut oder Biopsie-Material, insbesondere
bei der Diagnose von Tumoren. Zur Unterscheidung, ob aus einem
Tumor entnommene Zellen in einem benigne- oder maligne-entarteten
Stadium vorliegen, kann häufig die gleichzeitige Expression
mehrerer Antigene wie bspw. von Onkogenen oder Antionkogenen
herangezogen werden.
In diesen Fällen müssen die Antigene mit Hilfe verschiedener
Nachweisreaktionen detektiert werden, um die verschiedenen
Antigene unterscheiden zu können.
Eine Möglichkeit zum Nachweis unterschiedlicher Antigene auf
Zellen oder Geweben besteht darin, Primärantikörper einzusetzen,
die mit Fluoreszenz-Farbstoffen unterschiedlichen Spektral
verhaltens markiert sind. Im Fluoreszenz-Mikroskop können dann
mit Hilfe verschiedener Lichtfilter die unterschiedlichen
Farbstoffe erkannt und deren Verteilung auf dem biologischen
Material analysiert werden.
Der Einsatz von Fluoreszenz-Farbstoffen hat jedoch den Nachteil,
daß die Fluoreszenz während des Mikroskopierens sehr schnell
ausbleicht, daß Fluoreszenz-markierte Antikörper sehr teuer
sind und daß Fluoreszenz-Mikroskope in der Anschaffung und vor
allem im Unterhalt mit großen Kosten verbunden sind, weil die
darin eingesetzten Lampen eine nur begrenzte Lebensdauer auf
weisen. Außerdem findet die Fluoreszenz-Mikroskopie im Dunkelfeld
statt. Dadurch können Strukturen, die nicht mit Fluoreszenz-
Farbstoffen markiert sind, nicht begutachtet werden.
Bei dem eingangs genannten Verfahren werden dagegen den für
die Antigene spezifischen Antikörpern (Primärantikörper)
verschiedene Enzyme zugeordnet, die unterschiedliche Nachweis
reaktionen, meist Farbreaktionen katalysieren (Mehrfach
färbungen). Die hierbei am häufigsten eingesetzten Enzyme sind
die Meerrettich-Peroxidase (POD), die Alkalische Phosphatase
(AP) und die Beta-Galactosidase. Diese Enzyme setzen unterschied
liche Farbstoffe (Chromogene) um, die nach der Reaktion einen
unlöslichen Farbstoff-Komplex bilden. Auf diese Art und Weise
wird die Stelle, an der das Antigen vorhanden ist, an das der
mit dem Enzym konjugierte Antikörper gebunden ist, irreversibel
markiert. Weisen die Farbstoff-Komplexe unterschiedliche Far
ben auf, so ist es möglich, die verschiedenen Antigene zu un
terscheiden.
Die Erzeugung von Farbstoff-Komplexen durch unterschiedliche
Enzyme hat zwar den Vorteil, der wesentlich einfacheren und
billigeren Lichtmikroskopie zugänglich zu sein, sie beinhal
tet jedoch eine aufwendige Planung der vielen verschiedenen
Verfahrensschritte. Dabei benötigt jedes Enzym seine eigenen
Reaktionsbedingungen, wie beispielsweise verschiedene Puffer,
pH-Werte, Salzkonzentrationen und Kofaktoren. Diese Bedingun
gen müssen für jedes Enzym den individuellen experimentellen
Voraussetzungen angepaßt werden, was u. U. sehr zeitaufwendig
sein kann. Außerdem ist eine Vielzahl verschiedener Rea
genzien notwendig. Wird die POD eingesetzt, so ist aufgrund
einer endogenen Peroxidase-Aktivität vieler Zellen und Gewebe
mit erhöhten Hintergrundreaktionen ("background") zu rechnen.
Ein ähnliches Verfahren, bei dem die mit einem Antikörper
verbundenen Enzyme die Erzeugung eines Farbstoffkomplexes ka
talysieren, ist in der US 5,108,896 beschrieben. Hier erfolgt
der Nachweis jedoch nicht durch die Lichtmikroskopie, sondern
durch Messung der Lichtabsorption durch die Farbstoffkomplexe
bei verschiedenen Wellenlängen. Bei dem hier beschriebenen
Verfahren befinden sich zwei verschiedene Antigene in Lösung,
wobei der Test in Form eines dem Fachmann geläufigen ELISAs
durchgeführt wird. Die beiden Antigene werden dabei gleich
zeitig mit zwei für sie spezifischen Antikörpern inkubiert,
an die zwei verschiedene Enzyme konjugiert sind. Das erste
Enzym kann bspw. β-Galactosidase sein, die die Umsetzung von
Nitrophenyl-β-D-Galactosid katalysiert, und das zweite Enzym
alkalische Phosphatase, die das Substrat Phenolphthaleinmono
phosphat umsetzt. Die enzymatische Katalyse erzeugt dann un
terschiedlich gefärbte Farbstoffkomplexe, deren Anwesenheit
und Konzentration durch Messung der Lichtabsorption gemessen
wird. Bei diesem Verfahren sind also zwei verschiedene Enzyme
notwendig, die an die spezifischen Primärantikörper konju
giert werden müssen, wodurch dieses Verfahren sehr aufwendig
wird.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfah
ren zum Nachweis mehrerer Antigene auf biologischem Material
bereitzustellen, das einfach, schnell und preiswert durch
zuführen ist.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei dem eingangs genannten
Verfahren dadurch gelöst, daß dem ersten und dem weiteren
Primärantikörper das gleiche Enzym zugeordnet wird und vor
jeder weiteren Nachweisreaktion das Enzym der vorherigen
Nachweisreaktion inhibiert wird. Unter der Inhibition des En
zyms wird im folgenden jede Inhibition, Inaktivierung, Dena
turierung oder anderweitige Zerstörung des Enzyms verstanden,
also jede Reaktion oder Behandlung, die zum Unterbinden der
Enzymaktivität führt.
Dieses Verfahren hat den wesentlichen Vorteil, daß alle Nachweis
reaktionen vom gleichen Enzym katalysiert werden, so daß die
jeweils gleichen Reaktionsbedingungen angewandt werden können.
Dadurch ist insgesamt weniger Planung und Optimierung erforder
lich, und das Verfahren ist einfacher und preiswerter durchzufüh
ren. Der Erfinder hat nämlich erkannt, daß es überraschenderweise
möglich ist, Enzymmoleküle einer bereits durchgeführten Nachweis
reaktion dauerhaft und zuverlässig zu inhibieren, ohne daß danach
eingesetzte Moleküle des gleichen Enzyms für die nächste
Nachweisreaktion in ihrer Aktivität beeinträchtigt werden oder
das umgebende Gewebe geschädigt bzw. verändert wird.
Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft, wenn im Zuge der
Routinediagnostik eine Vielzahl von Mehrfachfärbungen täglich
durchgeführt werden müssen.
Somit wird die Aufgabe vollkommen gelöst.
In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Enzym direkt an
zumindest einen Primärantikörper konjugiert.
Dies hat den Vorteil, daß keine unterschiedlichen, Enzym
spezifischen Reaktionsbedingungen ausgetestet werden müssen.
In einer Weiterbildung ist es bevorzugt, das Enzym an gegen
die Primärantikörper gerichtete Sekundärantikörper zu konju
gieren. Diese Sekundärantikörper erkennen die konstanten Anteile
der Primärantikörper, die für alle Primärantikörper gleich sind,
sofern diese in der gleichen Spezies gewonnen wurden.
Dies hat den Vorteil, daß für alle Primärantikörper, die häufig
so ausgewählt werden können, daß sie aus der gleichen Spezies
stammen, der gleiche Sekundärantikörper eingesetzt werden kann.
Dies erspart nicht nur das zeit- und arbeitsaufwendige Austesten
und Optimieren verschiedener Reaktionsbedingungen, sondern durch
den Einsatz des immer gleichen Sekundärantikörpers auch enorme
Kosten. Darüber hinaus wird durch ein standardisiertes Verfahren
mit dem jeweils gleichen Sekundärantikörper vorteilhafterweise
die Fehlerrate des gesamten Verfahrens gesenkt. Eine hohe
Reproduzierbarkeit und damit hohe Qualität des Verfahrens bei
niedrigen Kosten ist die Folge. Dies ist besonders vorteilhaft
in klinischen Routinediagnostik-Labors, wo Fehlanalysen über
Leben und Tod entscheiden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung werden gegen
zumindest einen der Primärantikörper gerichtete sogenannte
Brückenantikörper eingesetzt, die wiederum von Sekundäranti
körpern, an die das Enzym konjugiert ist, erkannt werden.
Der Einsatz von Brückenantikörpern hat den Vorteil, das Signal
zu verstärken, denn an ein Molekül des Brückenantikörpers können
ggf. mehrere Moleküle des Sekundärantikörpers binden. Ein
weiterer Vorteil besteht darin, auch an den Brückenantikörpern
das Enzym zu konjugieren. So kann die Menge des durch das Enzym
katalysierten Farbkomplexes je Antigen zusätzlich erhöht werden,
und-das Verfahren gewinnt an Sensitivität.
Besonders vorteilhaft ist der Einsatz von Brückenantikörpern
dann, wenn die Primärantikörper aus verschiedenen Spezies
stammen, so daß beim Einsatz von Sekundärantikörpern auch diese
jeweils unterschiedliche Spezifitäten aufweisen müßten. Durch
verschiedene Brückenantikörper, die, da kein Enzym an sie
konjugiert sein muß, weniger aufwendig herzustellen sind, kann
dieser Mangel ausgeglichen werden. Somit können wiederum
identische Enzym-konjugierte Sekundärantikörper eingesetzt
werden.
Beim Nachweis mehrerer Antigene können die Primär-, Sekundär-
und Brückenantikörper nach der jeweiligen Verfügbarkeit einge
setzt werden. So kann zum Nachweis eines ersten Antigens ein
Primärantikörper, an den die AP konjugiert ist, zum Nachweis
eines weiteren Antigens ein Sekundärantikörper mit konjugierter
AP und ggf. ein Brückenantikörper eingesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird als Enzym
die Alkalische Phosphatase (AP) eingesetzt.
Die AP hat den Vorteil, eines der am weitesten verbreiteten
Enzyme in der Immunzytochemie und Immunhistochemie zu sein.
Eine Vielzahl von Sekundärantikörpern mit allen gängigen
Spezifitäten, an die jeweils die AP konjugiert ist, sind von
verschiedenen Firmen günstig kommerziell zu erwerben.
Die AP katalysiert eine einfache Reaktion, nämlich das Abspalten
(Hydrolyse) eines Phosphatrests. Der große Vorteil von AP-Färbungen
gegenüber POD-Färbungen ist der Wegfall der störenden
endogenen Peroxidase-Aktivität. Außerdem ist die AP ein sehr
stabiles Enzym, das bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt werden
kann und nicht zur Lagerung eingefroren und bei Benutzung wieder
aufgetaut werden muß.
Die AP hydrolysiert z. B. Naphtholphosphat-Ester (Substrat) zu
Phenolkomponenten und Phosphaten. Die Phenole kuppeln mit
farblosen Diazoniumsalzen (Chromogene) und bilden so unlösliche
Azofarbstoffe. Dabei katalysiert die AP die Umsetzung einer
Vielzahl verschiedener Chromogene, bspw. Fast Red TR und Fast
Blue BB. Während das Chromogen Fast Red TR ein intensiv rotes
Farbprodukt bildet, bildet Fast Blue BB ein blaues Farbprodukt.
Beide Farbstoffe sind in alkoholischen oder anderen organischen
Lösungsmitteln löslich. Ein weiteres von der AP umgesetztes
Chromogen, Neufuchsin liefert ein ebenfalls rotes Reaktions
produkt. Die durch Neufuchsin entstehende Farbe ist nicht in
Alkohol oder anderen organischen Lösungsmitteln löslich und
erlaubt es daher, die gefärbten Präparate vor der Lagerung zu
entwässern. Dadurch sind die Präparate länger haltbar. Ein
weiterer Vorteil des Neufuchsin ist eine stärkere Färbung als
diejenige von Fast Red TR oder Fast Blue BB. Weitere Substrate
wie Naphthol AS-BI-Phosphat, Naphthol AS-TR-Phosphat und 5-Brom-
4-Chlor-3-Indoxylphosphat, Fast Red LB, Fast Garnet GBC und
Nitroblautetrazolium (NBT) sind als Substrate der AP bekannt.
So ist es möglich, unter einer Vielzahl von Substraten aus zu
wählen, die farblich klar zu unterscheidende Farbkomplexe
ergeben. Außerdem können sie unter verschiedenen Bedingungen
eingesetzt werden, so daß die für die Primärantikörper jeweils
optimalsten Reaktionsbedingungen angewandt werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird
zur Inhibierung der AP ein Chelatbildner eingesetzt. Dies ist
möglich, da die AP-Aktivität von zweiwertigen Metallkationen
wie M2+, Mn2+ und Ca2+ abhängig ist. Diese Metallkationen werden
durch Chelatbildner komplexiert und damit eingefangen. Bei dieser
schnellen Reaktion wird die AP inhibiert (inaktiviert).
Der Einsatz von Chelatbildnern zur Inhibierung der AP hat den
Vorteil, daß hierbei die Antigen-Antikörper-Reaktion sowie die
Reaktion von Primär-, Sekundär- oder Brückenantikörpern nicht
beeinträchtigt wird. Zudem wird die Integrität des biologischen
Materials (Zellen oder Gewebe) durch den Chelatbildner nicht
beeinflußt, während selektiv die AP inhibiert wird.
In einer bevorzugten Weiterbildung wird als Chelatbildner EDTA
(Ethylen-Diamin-Tetraacetat) eingesetzt.
EDTA hat den Vorteil, ein vielfach verwendetes, sehr billiges
Massenreagenz zu sein, das praktisch in jedem Labor in großen
Mengen vorhanden ist.
EDTA ist ein potenter Komplexierer divalenter Metallkationen
und inhibiert die AP daher effizient. In der Literatur wurde
bisher berichtet, daß die Inhibierung der AP durch EDTA rever
sibel ist und die Konformation des Enzyms nicht beeinflußt,
siehe z. B. Mersol J.V., et al. (1993), "Detection of intermediate
protein conformations by room temperature tryptophan phosphores
cence spectroscopy during denaturation of Escherichia coli
alkaline phosphatase", Biophys. Chem. 48: 281-291. Daher war
es nicht zu erwarten, daß beim Nachweis mehrerer Antigene mit
der AP, trotz Wegwaschens des zur Inhibierung des Enzyms der
vorhergehenden Nachweisreaktion verwendeten EDTA die AP der
vorherigen Nachweisreaktion nicht mehr aktiviert wird. Dies
konnte in intensiven Studien des Erfinders jedoch nachgewiesen
werden. Eine nahezu vollständige Inhibierung der jeweils vorigen
Nachweisreaktion ist bei der Benutzung des jeweils gleichen
Enzyms essentiell, da sich sonst die Farben der Nachweisreaktion
vermischen und keine eindeutige Zuordnung zum jeweiligen Antigen
mehr möglich ist.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens werden folgende
Schritte durchgeführt:
- a) Reaktion eines auf einem biologischen Material befindlichen ersten Antigens mit einem ersten Primärantikörper;
- b) Reaktion eines ersten Sekundärantikörpers, an den die AP konjugiert ist, mit dem ersten Primärantikörper;
- c) Katalyse einer Farbreaktion durch die AP, die an den ersten Sekundärantikörper konjugiert ist;
- d) Reaktion eines zweiten Primärantikörpers mit einem zweiten Antigen;
- e) Inhibierung der AP, die an den ersten Sekundärantikörper konjugiert ist, durch EDTA;
- f) Wegwaschen des EDTA;
- g) Reaktion eines zweiten Sekundärantikörpers, an den die AP konjugiert ist, mit dem zweiten Primärantikörper;
- h) Katalyse einer zweiten Nachweisreaktion durch die AP, die an den zweiten Sekundärantikörper konjugiert ist.
Hier ist von Vorteil, daß das Verfahren einfach, leicht durchzu
führen und standardisierbar ist. Bei diesem lichtmikroskopischen
Verfahren werden nacheinander zwei verschiedene Antigene durch
zwei verschiedene Nachweisreaktionen detektiert, die durch das
jeweils gleiche Enzym, die AP, katalysiert werden. Die Inkubation
mit den gleichen AP-konjugierten Sekundärantikörpern kann unter
den immer gleichen Reaktionsbedingungen stattfinden. Nach
Durchführung der ersten Nachweisreaktion wird die Aktivität
der AP durch EDTA schonend und ohne Konsequenzen für die
Integrität des biologischen Materials inhibiert. Nach Wegwaschen
des EDTA wird eine neue Nachweisreaktion unter Benutzung der
AP durchgeführt, wobei die Aktivität der AP der vorherigen
Nachweisreaktion trotz Wegwaschen des Chelatbildners nicht wieder
aufgenommen wird, so daß die Nachweisreaktion des ersten Antigens
nicht mit der Nachweisreaktion des zweiten Antigens vermischt
wird.
Dieses Verfahren hat den weiteren Vorteil, daß ein sehr gutes
Signal/Hintergrund-Verhältnis (niedriger "background") erreicht
werden kann.
Durch die sich wiederholende Abfolge der Reaktionsschritte kann
dieses Verfahren auch von angelernten Kräften durchgeführt
werden, was für Routinediagnostik-Labors besonders vorteilhaft
ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung kann ein drittes
Antigen mit Hilfe eines dritten Primärantikörpers nachgewiesen
werden, dem wiederum die AP zugeordnet ist, durch die eine dritte
Nachweisreaktion katalysiert wird.
Dieses Verfahren ist beim Nachweis von mehr als zwei Antigenen
besonders vorteilhaft, da durch die immer wiederkehrenden
Reaktionsbedingungen sowohl der zeitliche als auch der
finanzielle Aufwand eingeschränkt werden können.
Um das neue Verfahren schnell und ohne aufwendige Vorbereitungen
durchführen zu können, sieht die Erfindung auch einen Kit vor,
der alle benötigten Reagenzien, einen ersten und zumindest einen
weiteren Primärantikörper, denen die Alkalische Phosphatase
zugeordnet ist, eine EDTA-Lösung sowie Reagenzien für eine erste
und zumindest eine weitere von der Alkalischen Phosphatase
katalysierte Nachweisreaktion enthält.
Sind zwei oder mehr Primärantikörper bekannt, die zur Routine
diagnostik bestimmter Krankheiten eingesetzt werden, so können
diese im Kit enthalten sein und entweder direkt an die AP
konjugiert vorliegen oder durch AP-konjugierte Sekundärantikörper
nachgewiesen werden. Abhängig vom jeweiligen Nachweis sind in
dem Kit zusätzlich Brückenantikörper enthalten.
Im Kit sind angemessene EDTA-Lösungen mit einer Konzentration
im Bereich von 50-500 mM, vorzugsweise von 250 mM enthalten.
Chromogene, die nach Reaktion mit der AP Farbstoff-Komplexe
von unterschiedlicher Färbung ergeben, sowie ein ausführliches
Protokoll zur Durchführung des Verfahrens sind im Kit ebenfalls
inbegriffen.
Für Labors mit eigenen spezifischen Primärantikörpern kann der
Kit selbstverständlich ohne Primärantikörper, dafür aber mit
einem Set an Spezies-spezifischen Sekundär- oder Brückenanti
körpern, bspw. Kaninchen-anti-Maus, Maus-anti-Kaninchen, Ziege
anti-Maus, Ziege-anti-Kaninchen, denen die AP zugeordnet ist,
ausgestattet werden.
Ein solcher Kit hat den Vorteil, die reproduzierbare und schnelle
Durchführung von Nachweisreaktionen durch angelernte Kräfte
auch in höchst einfach ausgestatteten Arztpraxen zu erlauben,
da als einziges zusätzlich benötigtes Gerät ein Lichtmikroskop
ausreicht.
Die Benutzung des erfindungsgemäßen Kits erhöht darüber hinaus
die Reproduzierbarkeit und Schnelligkeit des Nachweisverfahrens
auch in Routinediagnostik-Labors.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach
stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils
angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen
oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der
vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung
dargestellt und wird in der nachfolgenden Beschreibung näher
erläutert.
Die einzige Figur zeigt schematisch die Abfolge der Reaktions
schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens.
In der Figur ist schematisch ein biologisches Material 10
angedeutet, das z. B. als Gewebeschnitt vorliegen kann. In dem
gezeigten Beispiel sind auf dem biologischen Material ein erstes
Antigen 11 sowie ein davon verschiedenes, weiteres Antigen 12
vorhanden.
Zum Nachweis des Antigens 11 wird zuerst ein für das Antigen
11 spezifischer Primärantikörper 13 eingesetzt. In einem ersten
Reaktionsschritt bindet der Primärantikörper 13 an das erste
Antigen 11. Ein Sekundärantikörper 14, an den die Alkalische
Phosphatase (AP) 15 konjugiert ist, bindet an den konstanten
Anteil 16 des ersten Primärantikörpers 13. Die dem ersten
Sekundärantikörper 14 zugeordnete AP 15 katalysiert eine
Nachweisreaktion, bei der ein Chromogen 17 in eine unlösliche
und farbige Form 18 überführt wird. Diese Nachweisreaktion ist
in der Figur allgemein mit 19 bezeichnet.
In einem neuen Reaktionsschritt bindet ein zweiter Primär
antikörper 21 an das zweite Antigen 12 auf dem biologischen
Material 10. Durch fünfzehnminütiges Inkubieren des Ansatzes
mit EDTA 22 wird die AP 15 inhibiert. Vor der Durchführung einer
neuen Nachweisreaktion muß das EDTA 22 durch Waschen von dem
biologischen Material 10 entfernt werden. Ein zweiter Sekundär-
Antikörper 14, an den die AP 15 konjugiert ist, bindet an den
konstanten Anteil 23 des zweiten Primärantikörpers 21. Die AP
15 katalysiert eine Nachweisreaktion 24, in der ein Chromogen
25, das von dem Chromogen 17 verschieden ist, in eine farbige
und unlösliche Form 26 umgesetzt wird. Der entstehende unlösliche
Farbkomplex 26 weist eine andere Farbe auf als der Farbkomplex
18. Währenddessen bleibt die AP 15, die dem ersten Primär
antikörper 13 zugeordnet ist, inaktiv, so daß keine weitere
Nachweisreaktion am ersten Antigen 11 auftritt.
Mit einer weiteren Reaktionsabfolge entlang der gestrichelten
Linie ist es möglich, durch weitere Reaktions-Runden dritte
und weitere Antigene mit dem gleichen Verfahren nachzuweisen.
Nachstehend ist in Form eines Beispieles ein konkreter Anwen
dungsfall der Erfindung wiedergegeben:
Nachweis der beiden Antigene GFAP (Glial Fibrillary Acidic
Protein) und LCA (Leucocyte Common Antigen) auf Gewebeschnitten
von humanem Glioblastom-Gewebe:
- a) Inkubation der Gewebeschnitte in unspezifischem Schweine serum in einer Verdünnung von 1 : 10 in TBS-Puffer (0,25 M TRIS/HCl, 2 M Natriumchlorid) pH 7,5, für 15 Minuten.
- b) Zusatz eines ersten Primärantikörpers (anti-GFAP aus Maus) in einer Verdünnung von 1 : 10 in TBS für 30 bis 90 Minuten, bevorzugt für 60 Minuten.
- c) Spülen der Schnitte mit TBS (Ansatz wie oben).
- d) Vorinkubation eines Brückenantikörpers (Kaninchen-anti-Maus) mit humanem Normalserum im Verhältnis von 1 : 1 auf Eis und zehnminütige Zentrifugation bei 14 000 upm.
- e) Zusatz des Brückenantikörpers (Kaninchen-anti-Maus) in einer Verdünnung von 1 : 20 in TBS (wie oben) für 15 bis 45 Minuten, bevorzugt für 30 Minuten.
- f) Spülen der Schnitte mit TBS (Ansatz wie oben).
- g) Inkubation der Schnitte mit einem Sekundärantikörper (Maus anti-Kaninchen), an den die AP konjugiert ist, in einer Verdünnung von 1 : 100 in TBS (wie oben) für 15 bis 45 Minuten, bevorzugt für 30 Minuten.
- h) Spülen der Schnitte mit TBS (wie oben).
- i) Zugabe einer Chromogen-Lösung (z. B. Fast Red TR) und Entwicklung der Chromogen-Substrat-Lösung für 5 bis 30 Minuten, bevorzugt für 10 Minuten, abhängig von der Färbungsintensität.
- j) Spülen der Schnitte mit TBS (wie oben).
- k) Inkubation eines zweiten Primärantikörpers (anti-LCA aus Maus) in einer Verdünnung von 1 : 100 in TBS (wie oben) für 30 bis 90 Minuten, bevorzugt für 60 Minuten.
- l) Spülen der Schnitte mit TBS (wie oben).
- m) Vorinkubation eines Brückenantikörpers (Kaninchen-anti-Maus) mit humanem Normalserum im Verhältnis von 1 : 1 für 30 Minuten auf Eis und zehnminütige Zentrifugation bei 14 000 upm.
- n) Inkubation mit dem Brückenantikörper in einer Verdünnung von 1 : 20 in TBS (wie oben) für 15 bis 45 Minuten, bevorzugt für 30 Minuten.
- o) Spülen in TBS (wie oben).
- p) Inkubation mit 0,25 M EDTA Lösung für 5 bis 30 Minuten, bevorzugt für 15 Minuten, um die Alkalische Phosphatase- Reaktion abzustoppen.
- q) Spülen in TBS (wie oben).
- r) Inkubation mit einem Sekundärantikörper (Maus-anti-Kanin chen), an den die AP konjugiert ist, in einer Verdünnung von 1 : 100 in TBS (wie oben) für 15 bis 45 Minuten, bevorzugt für 30 Minuten.
- s) Spülen in TBS (wie oben).
- t) Zugabe einer Chromogen-Lösung (z. B. Fast Blue BB) und Ent wicklung mit der zweiten Chromogen-Substrat-Lösung für 5 bis 30 Minuten, bevorzugt für 8 Minuten.
In diesem Verfahren werden zwei Primärantikörper, die für GFAP
und LCA spezifisch sind, sowie ein Brückenantikörper und ein
Sekundärantikörper, an den die AP konjugiert ist, eingesetzt.
Da Brückenantikörper und Sekundärantikörper gleich sind, können
die gleichen Reaktionsbedingungen, d. h. die gleichen Puffer
und Inkubationszeiten eingesetzt werden. Nach der ersten
Reaktionsrunde wird eine zweite Reaktionsrunde durchgeführt,
die sich bis auf die Verdünnung des Primärantikörpers, den
Inhibierungsschritt mit EDTA und die Chromogen-Reaktion nicht
von der ersten Reaktionsrunde unterscheidet.
Diese Vereinfachung des Verfahrens erhöht die Reproduzierbarkeit
und senkt die Fehlerrate. Durch den Einsatz von einem einzigen
Enzym-konjugierten Sekundärantikörper und dem Massenreagenz
EDTA werden erhebliche Kosten gespart. Durch die Verwendung
von unterschiedlich farbigen Chromogen-Komplexen ist auch bei
Mehrfachfärbungen die Lichtmikroskopie möglich, die wesentlich
weniger aufwendig als die Fluoreszenz-Mikroskopie ist.
Dieses preiswerte, standardisierte Verfahren läßt sich vor allem
in Krankenhäusern angeschlossenen Routinediagnostik-Labors
aufgrund seiner hohen Effizienz einsetzen.
Claims (13)
1. Verfahren zum Nachweis von einem ersten und zumindest einem
weiteren Antigen (11, 12) auf biologischem Material (10)
durch einen für das erste Antigen spezifischen ersten
Primärantikörper (13) und einen für das weitere Antigen
spezifischen weiteren Primärantikörper (22), wobei diesen
Antikörpern jeweils ein Enzym zugeordnet ist, mit den
Schritten:
- a) Detektion des ersten Antigens (11) mit Hilfe einer ersten Nachweisreaktion (19), die durch das dem ersten Primärantikörper zugeordnete Enzym (15) katalysiert wird; und
- b) Detektion des weiteren Antigens (12) mit Hilfe einer weiteren Nachweisreaktion (24), die durch das dem weiteren Primärantikörper (21) zugeordnete Enzym (15) katalysiert wird,
dadurch gekennzeichnet, daß dem ersten und dem weiteren
Primärantikörper (13, 21) das gleiche Enzym (15) zugeordnet
wird und vor jeder weiteren Nachweisreaktion (24) das Enzym
(15) der vorherigen Nachweisreaktion (19) inhibiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Enzym direkt an zumindest einen Primärantikörper
konjugiert ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß das Enzym an einen gegen zumindest einen Primär
antikörper gerichteten Sekundärantikörper (14) konjugiert
ist.
4. Verfahren einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn
zeichnet, daß zumindest ein gegen einen der Primärantikörper
gerichteter Brückenantikörper eingesetzt wird, der von
einem Sekundärantikörper erkannt wird, an den das Enzym
konjugiert ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß das Enzym die Alkalische Phosphatase
(15) ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß zur Inhibierung der Alkalischen Phospha
tase ein Chelatbildner eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
als Chelatbildner EDTA (22) eingesetzt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet
durch die Schritte:
- a) Reaktion eines auf einem biologischen Material (10) befindlichen ersten Antigens (11) mit einem ersten Primärantikörper (13);
- b) Reaktion eines ersten Sekundärantikörpers (14), an den die Alkalische Phosphatase (15) konjugiert ist, mit dem ersten Primärantikörper (13);
- c) Katalyse einer Farbreaktion (19) durch die Alkalische Phosphatase (15), die an den ersten Sekundärantikörper (14) konjugiert ist;
- d) Reaktion eines zweiten Primärantikörpers (21) mit einem zweiten Antigen (12);
- e) Inhibierung der Alkalischen Phosphatase (15), die an den ersten Sekundärantikörper (14) konjugiert ist, durch EDTA (22);
- f) Wegwaschen des EDTA (22);
- g) Reaktion eines zweiten Sekundärantikörpers (14), an den die Alkalische Phosphatase (15) konjugiert ist, mit dem zweiten Primärantikörper (21);
- h) Katalyse einer zweiten Nachweisreaktion (24) durch die Alkalische Phosphatase (15), die an den zweiten Sekundärantikörper (14) konjugiert ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
gekennzeichnet, daß zum Nachweis eines dritten Antigens
ein dritter Primärantikörper eingesetzt wird, dem die
Alkalische Phosphatase zugeordnet ist, durch die eine dritte
Nachweisreaktion katalysiert wird.
10. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche
1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß er einen ersten und
zumindest einen weiteren Primärantikörper, denen die Alka
lische Phosphatase zugeordnet ist, eine EDTA-Lösung sowie
Reagenzien für eine erste und zumindest eine weitere von
der Alkalischen Phosphatase katalysierte Nachweisreaktion
enthält.
11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest
ein Sekundärantikörper enthalten ist.
12. Kit nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekenn
zeichnet, daß zumindest ein Brückenantikörper enthalten
ist.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996132156 DE19632156C1 (de) | 1996-08-09 | 1996-08-09 | Verfahren zur Detektion mehrerer Antigene auf biologischem Material |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996132156 DE19632156C1 (de) | 1996-08-09 | 1996-08-09 | Verfahren zur Detektion mehrerer Antigene auf biologischem Material |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19632156C1 true DE19632156C1 (de) | 1998-01-08 |
Family
ID=7802219
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1996132156 Expired - Fee Related DE19632156C1 (de) | 1996-08-09 | 1996-08-09 | Verfahren zur Detektion mehrerer Antigene auf biologischem Material |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19632156C1 (de) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5108896A (en) * | 1986-03-21 | 1992-04-28 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Simultaneous immunoassay of two analytes using dual enzyme labelled antibodies |
-
1996
- 1996-08-09 DE DE1996132156 patent/DE19632156C1/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5108896A (en) * | 1986-03-21 | 1992-04-28 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Simultaneous immunoassay of two analytes using dual enzyme labelled antibodies |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
KRENACS, T. (u.a.), in: Histochemical Journal, 1990, Vol. 22, 530-536 * |
LOOS, C.M. van der (u.a.), in: Histochemical Journal, 1993, Vol. 25, 1-13 * |
MERSOL, J.V. (u.a.), in: Biophysical Chemistry, 1993, Vol. 48, 281-291 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE60120257T2 (de) | Verfahren zur Färbung, zum Nachweis und Zählen von Bakterien | |
EP2089715B1 (de) | Verfahren zur bestimmung der aktivität von ace2 | |
DE68918166T2 (de) | Spezifische Bindungszusammensetzung mit einem Protein oder einem Kohlenhydrat mit Nieder-pI und ein diagnostischer Testsatz und Verfahren zur Anwendung. | |
DE60314990T2 (de) | Verfahren zur quantifizierung von glykosyliertem protein unter verwendung einer redoxreaktion sowie eines quantifizierungskits | |
DE60034492T2 (de) | Verfahren zum vorbehandeln von proben und zum quantifizieren von cholesterin in spezifischen lipoproteinen | |
EP0218127A1 (de) | Verfahren und Reagenz zur spezifischen Bestimmung von HDL-Cholesterin im Serum | |
DE2512585A1 (de) | Verfahren zur bestimmung des gesamt-cholesteringehaltes sowie testloesung und analytisches element zur durchfuehrung des verfahrens | |
EP0776374B1 (de) | Verfahren und vorrichtung zur bestimmung der aktivität von enzymen in flüssigkeiten, beziehungsweise der konzentration und/oder aktivität von inhibitoren in flüssigkeiten | |
US4195126A (en) | Albumin-dye complex for fatty acid determination | |
DE60317484T2 (de) | Verfahren und vorrichtung zur vorhersage von kardiovaskulären ereignissen | |
DE68924272T2 (de) | Verfahren zur vorbehandlung von mustern bei peroxidase-katalysierten enzymtestverfahren. | |
DE19920704C1 (de) | Verwendung eines gegen Harn-Trypsin-Inhibitors gerichteten Antikörpers für die Diagnose des Ausbruchs von AIDS | |
DE60119958T2 (de) | Auf liganden basierendes lösungs-assay für niedrig konzentrierte analyten | |
DE19632156C1 (de) | Verfahren zur Detektion mehrerer Antigene auf biologischem Material | |
EP2126110B1 (de) | Messung von der aktivität eines kynurenin-umwandelnden enzyms und/oder eines kynurensäure-, anthranilsäure- und/oder 3-hydroxykynurenin-erzeugenden enzyms | |
EP1040354B1 (de) | Bestimmung von in lipoprotein enthaltenem triglycerid | |
EP0227921B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung einer immunologisch bindefähigen Substanz | |
EP2388588B1 (de) | Verfahren und Schnelltest zur Bestimmung der Fertilität von Spermien | |
DE69219960T2 (de) | Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung biologischer Assays, die ein Partikelsiebsystem enthalten | |
DE3852162T2 (de) | Farbstoff produzierende Zusammensetzung, diagnostischer Testsatz und ihre Verwendung in einem Verfahren zur Bestimmung eines Ligands unter Verwendung eines Peroxidase-markierten Rezeptors. | |
CH651318A5 (de) | Verfahren und reagenz zur bestimmung der peroxidase. | |
DE69201788T2 (de) | Verfahren zur diagnostik eines status einer entzündung oder der zellulären alterung von keratinozyten und testbesteck zur durchführung des verfahrens. | |
DE3889402T2 (de) | Simultanbestimmung von Calcium und Phosphor. | |
EP0659277B1 (de) | Verfahren zur bestimmung von androstenon-gehalten in fettgeweben | |
DE4117619C2 (de) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8100 | Publication of the examined application without publication of unexamined application | ||
D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |