DE19632156C1 - Verfahren zur Detektion mehrerer Antigene auf biologischem Material - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von einem ersten und zumindest einem weiteren Antigen auf biologischem Material durch einen für das erste Antigen spezifischen ersten Primärantikörper und einen für das weitere Antigen spezifischen weiteren Primärantikörper, wobei diesen Antikörpern jeweils ein Enzym zugeordnet ist, mit den Schritten:

• a) Detektion des ersten Antigens mit Hilfe einer ersten Nachweisreaktion, die durch das dem ersten Primärantikörper zugeordnete Enzym katalysiert wird;
• b) Detektion des weiteren Antigens mit Hilfe einer weiteren Nachweisreaktion, die durch das dem weiteren Primäranti­ körper zugeordnete Enzym katalysiert wird.

Ein derartiges Verfahren ist aus dem Laboralltag bekannt.

Die Detektion mehrerer verschiedener Antigene auf einem biolo­ gischen Material wie Zellen oder Geweben mit Hilfe immunen­ zymatischer Techniken (Immunzytochemie bzw. Immunhistochemie) ist auch aus der Literatur bekannt (Van der LOOS, C.M. et al. (1993): Practical Suggestions for Successful Immunoenzyme Double-Staining Experiments. Histochem. J. 25: 1-13; KRENACS, T. et al. (1990): Double and Triple Immunocytochemical Labelling at the Light Microscopical Level in Histopathology. Histochem. J. 22: 530-536).

Solche Verfahren sind immer dann notwendig, wenn festgestellt werden muß, ob zwei oder mehr Antigene auf Zellen oder Geweben zur gleichen Zeit exprimiert werden.

Diese Verfahren werden z. B. in der Grundlagenforschung dazu eingesetzt, die Expressionsmuster neuer, gerade erst gefundener Antigene zu analysieren. Von besonderer Bedeutung sind solche Verfahren jedoch in der klinischen Pathologie, bei der Diagnose von Krankheiten aus Blut oder Biopsie-Material, insbesondere bei der Diagnose von Tumoren. Zur Unterscheidung, ob aus einem Tumor entnommene Zellen in einem benigne- oder maligne-entarteten Stadium vorliegen, kann häufig die gleichzeitige Expression mehrerer Antigene wie bspw. von Onkogenen oder Antionkogenen herangezogen werden.

In diesen Fällen müssen die Antigene mit Hilfe verschiedener Nachweisreaktionen detektiert werden, um die verschiedenen Antigene unterscheiden zu können.

Eine Möglichkeit zum Nachweis unterschiedlicher Antigene auf Zellen oder Geweben besteht darin, Primärantikörper einzusetzen, die mit Fluoreszenz-Farbstoffen unterschiedlichen Spektral­ verhaltens markiert sind. Im Fluoreszenz-Mikroskop können dann mit Hilfe verschiedener Lichtfilter die unterschiedlichen Farbstoffe erkannt und deren Verteilung auf dem biologischen Material analysiert werden.

Der Einsatz von Fluoreszenz-Farbstoffen hat jedoch den Nachteil, daß die Fluoreszenz während des Mikroskopierens sehr schnell ausbleicht, daß Fluoreszenz-markierte Antikörper sehr teuer sind und daß Fluoreszenz-Mikroskope in der Anschaffung und vor allem im Unterhalt mit großen Kosten verbunden sind, weil die darin eingesetzten Lampen eine nur begrenzte Lebensdauer auf­ weisen. Außerdem findet die Fluoreszenz-Mikroskopie im Dunkelfeld statt. Dadurch können Strukturen, die nicht mit Fluoreszenz- Farbstoffen markiert sind, nicht begutachtet werden.

Bei dem eingangs genannten Verfahren werden dagegen den für die Antigene spezifischen Antikörpern (Primärantikörper) verschiedene Enzyme zugeordnet, die unterschiedliche Nachweis­ reaktionen, meist Farbreaktionen katalysieren (Mehrfach­ färbungen). Die hierbei am häufigsten eingesetzten Enzyme sind die Meerrettich-Peroxidase (POD), die Alkalische Phosphatase (AP) und die Beta-Galactosidase. Diese Enzyme setzen unterschied­ liche Farbstoffe (Chromogene) um, die nach der Reaktion einen unlöslichen Farbstoff-Komplex bilden. Auf diese Art und Weise wird die Stelle, an der das Antigen vorhanden ist, an das der mit dem Enzym konjugierte Antikörper gebunden ist, irreversibel markiert. Weisen die Farbstoff-Komplexe unterschiedliche Far­ ben auf, so ist es möglich, die verschiedenen Antigene zu un­ terscheiden.

Die Erzeugung von Farbstoff-Komplexen durch unterschiedliche Enzyme hat zwar den Vorteil, der wesentlich einfacheren und billigeren Lichtmikroskopie zugänglich zu sein, sie beinhal­ tet jedoch eine aufwendige Planung der vielen verschiedenen Verfahrensschritte. Dabei benötigt jedes Enzym seine eigenen Reaktionsbedingungen, wie beispielsweise verschiedene Puffer, pH-Werte, Salzkonzentrationen und Kofaktoren. Diese Bedingun­ gen müssen für jedes Enzym den individuellen experimentellen Voraussetzungen angepaßt werden, was u. U. sehr zeitaufwendig sein kann. Außerdem ist eine Vielzahl verschiedener Rea­ genzien notwendig. Wird die POD eingesetzt, so ist aufgrund einer endogenen Peroxidase-Aktivität vieler Zellen und Gewebe mit erhöhten Hintergrundreaktionen ("background") zu rechnen.

Ein ähnliches Verfahren, bei dem die mit einem Antikörper verbundenen Enzyme die Erzeugung eines Farbstoffkomplexes ka­ talysieren, ist in der US 5,108,896 beschrieben. Hier erfolgt der Nachweis jedoch nicht durch die Lichtmikroskopie, sondern durch Messung der Lichtabsorption durch die Farbstoffkomplexe bei verschiedenen Wellenlängen. Bei dem hier beschriebenen Verfahren befinden sich zwei verschiedene Antigene in Lösung, wobei der Test in Form eines dem Fachmann geläufigen ELISAs durchgeführt wird. Die beiden Antigene werden dabei gleich­ zeitig mit zwei für sie spezifischen Antikörpern inkubiert, an die zwei verschiedene Enzyme konjugiert sind. Das erste Enzym kann bspw. β-Galactosidase sein, die die Umsetzung von Nitrophenyl-β-D-Galactosid katalysiert, und das zweite Enzym alkalische Phosphatase, die das Substrat Phenolphthaleinmono­ phosphat umsetzt. Die enzymatische Katalyse erzeugt dann un­ terschiedlich gefärbte Farbstoffkomplexe, deren Anwesenheit und Konzentration durch Messung der Lichtabsorption gemessen wird. Bei diesem Verfahren sind also zwei verschiedene Enzyme notwendig, die an die spezifischen Primärantikörper konju­ giert werden müssen, wodurch dieses Verfahren sehr aufwendig wird.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfah­ ren zum Nachweis mehrerer Antigene auf biologischem Material bereitzustellen, das einfach, schnell und preiswert durch­ zuführen ist.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe bei dem eingangs genannten Verfahren dadurch gelöst, daß dem ersten und dem weiteren Primärantikörper das gleiche Enzym zugeordnet wird und vor jeder weiteren Nachweisreaktion das Enzym der vorherigen Nachweisreaktion inhibiert wird. Unter der Inhibition des En­ zyms wird im folgenden jede Inhibition, Inaktivierung, Dena­ turierung oder anderweitige Zerstörung des Enzyms verstanden, also jede Reaktion oder Behandlung, die zum Unterbinden der Enzymaktivität führt.

Dieses Verfahren hat den wesentlichen Vorteil, daß alle Nachweis­ reaktionen vom gleichen Enzym katalysiert werden, so daß die jeweils gleichen Reaktionsbedingungen angewandt werden können. Dadurch ist insgesamt weniger Planung und Optimierung erforder­ lich, und das Verfahren ist einfacher und preiswerter durchzufüh­ ren. Der Erfinder hat nämlich erkannt, daß es überraschenderweise möglich ist, Enzymmoleküle einer bereits durchgeführten Nachweis­ reaktion dauerhaft und zuverlässig zu inhibieren, ohne daß danach eingesetzte Moleküle des gleichen Enzyms für die nächste Nachweisreaktion in ihrer Aktivität beeinträchtigt werden oder das umgebende Gewebe geschädigt bzw. verändert wird.

Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft, wenn im Zuge der Routinediagnostik eine Vielzahl von Mehrfachfärbungen täglich durchgeführt werden müssen.

Somit wird die Aufgabe vollkommen gelöst.

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Enzym direkt an zumindest einen Primärantikörper konjugiert.

Dies hat den Vorteil, daß keine unterschiedlichen, Enzym­ spezifischen Reaktionsbedingungen ausgetestet werden müssen.

In einer Weiterbildung ist es bevorzugt, das Enzym an gegen die Primärantikörper gerichtete Sekundärantikörper zu konju­ gieren. Diese Sekundärantikörper erkennen die konstanten Anteile der Primärantikörper, die für alle Primärantikörper gleich sind, sofern diese in der gleichen Spezies gewonnen wurden.

Dies hat den Vorteil, daß für alle Primärantikörper, die häufig so ausgewählt werden können, daß sie aus der gleichen Spezies stammen, der gleiche Sekundärantikörper eingesetzt werden kann.

Dies erspart nicht nur das zeit- und arbeitsaufwendige Austesten und Optimieren verschiedener Reaktionsbedingungen, sondern durch den Einsatz des immer gleichen Sekundärantikörpers auch enorme Kosten. Darüber hinaus wird durch ein standardisiertes Verfahren mit dem jeweils gleichen Sekundärantikörper vorteilhafterweise die Fehlerrate des gesamten Verfahrens gesenkt. Eine hohe Reproduzierbarkeit und damit hohe Qualität des Verfahrens bei niedrigen Kosten ist die Folge. Dies ist besonders vorteilhaft in klinischen Routinediagnostik-Labors, wo Fehlanalysen über Leben und Tod entscheiden können.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung werden gegen zumindest einen der Primärantikörper gerichtete sogenannte Brückenantikörper eingesetzt, die wiederum von Sekundäranti­ körpern, an die das Enzym konjugiert ist, erkannt werden.

Der Einsatz von Brückenantikörpern hat den Vorteil, das Signal zu verstärken, denn an ein Molekül des Brückenantikörpers können ggf. mehrere Moleküle des Sekundärantikörpers binden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, auch an den Brückenantikörpern das Enzym zu konjugieren. So kann die Menge des durch das Enzym katalysierten Farbkomplexes je Antigen zusätzlich erhöht werden, und-das Verfahren gewinnt an Sensitivität.

Besonders vorteilhaft ist der Einsatz von Brückenantikörpern dann, wenn die Primärantikörper aus verschiedenen Spezies stammen, so daß beim Einsatz von Sekundärantikörpern auch diese jeweils unterschiedliche Spezifitäten aufweisen müßten. Durch verschiedene Brückenantikörper, die, da kein Enzym an sie konjugiert sein muß, weniger aufwendig herzustellen sind, kann dieser Mangel ausgeglichen werden. Somit können wiederum identische Enzym-konjugierte Sekundärantikörper eingesetzt werden.

Beim Nachweis mehrerer Antigene können die Primär-, Sekundär- und Brückenantikörper nach der jeweiligen Verfügbarkeit einge­ setzt werden. So kann zum Nachweis eines ersten Antigens ein Primärantikörper, an den die AP konjugiert ist, zum Nachweis eines weiteren Antigens ein Sekundärantikörper mit konjugierter AP und ggf. ein Brückenantikörper eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird als Enzym die Alkalische Phosphatase (AP) eingesetzt.

Die AP hat den Vorteil, eines der am weitesten verbreiteten Enzyme in der Immunzytochemie und Immunhistochemie zu sein. Eine Vielzahl von Sekundärantikörpern mit allen gängigen Spezifitäten, an die jeweils die AP konjugiert ist, sind von verschiedenen Firmen günstig kommerziell zu erwerben.

Die AP katalysiert eine einfache Reaktion, nämlich das Abspalten (Hydrolyse) eines Phosphatrests. Der große Vorteil von AP-Färbungen gegenüber POD-Färbungen ist der Wegfall der störenden endogenen Peroxidase-Aktivität. Außerdem ist die AP ein sehr stabiles Enzym, das bei 4°C im Kühlschrank aufbewahrt werden kann und nicht zur Lagerung eingefroren und bei Benutzung wieder aufgetaut werden muß.

Die AP hydrolysiert z. B. Naphtholphosphat-Ester (Substrat) zu Phenolkomponenten und Phosphaten. Die Phenole kuppeln mit farblosen Diazoniumsalzen (Chromogene) und bilden so unlösliche Azofarbstoffe. Dabei katalysiert die AP die Umsetzung einer Vielzahl verschiedener Chromogene, bspw. Fast Red TR und Fast Blue BB. Während das Chromogen Fast Red TR ein intensiv rotes Farbprodukt bildet, bildet Fast Blue BB ein blaues Farbprodukt. Beide Farbstoffe sind in alkoholischen oder anderen organischen Lösungsmitteln löslich. Ein weiteres von der AP umgesetztes Chromogen, Neufuchsin liefert ein ebenfalls rotes Reaktions­ produkt. Die durch Neufuchsin entstehende Farbe ist nicht in Alkohol oder anderen organischen Lösungsmitteln löslich und erlaubt es daher, die gefärbten Präparate vor der Lagerung zu entwässern. Dadurch sind die Präparate länger haltbar. Ein weiterer Vorteil des Neufuchsin ist eine stärkere Färbung als diejenige von Fast Red TR oder Fast Blue BB. Weitere Substrate wie Naphthol AS-BI-Phosphat, Naphthol AS-TR-Phosphat und 5-Brom- 4-Chlor-3-Indoxylphosphat, Fast Red LB, Fast Garnet GBC und Nitroblautetrazolium (NBT) sind als Substrate der AP bekannt.

So ist es möglich, unter einer Vielzahl von Substraten aus zu­ wählen, die farblich klar zu unterscheidende Farbkomplexe ergeben. Außerdem können sie unter verschiedenen Bedingungen eingesetzt werden, so daß die für die Primärantikörper jeweils optimalsten Reaktionsbedingungen angewandt werden können.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird zur Inhibierung der AP ein Chelatbildner eingesetzt. Dies ist möglich, da die AP-Aktivität von zweiwertigen Metallkationen wie M²⁺, Mn²⁺ und Ca²⁺ abhängig ist. Diese Metallkationen werden durch Chelatbildner komplexiert und damit eingefangen. Bei dieser schnellen Reaktion wird die AP inhibiert (inaktiviert).

Der Einsatz von Chelatbildnern zur Inhibierung der AP hat den Vorteil, daß hierbei die Antigen-Antikörper-Reaktion sowie die Reaktion von Primär-, Sekundär- oder Brückenantikörpern nicht beeinträchtigt wird. Zudem wird die Integrität des biologischen Materials (Zellen oder Gewebe) durch den Chelatbildner nicht beeinflußt, während selektiv die AP inhibiert wird.

In einer bevorzugten Weiterbildung wird als Chelatbildner EDTA (Ethylen-Diamin-Tetraacetat) eingesetzt.

EDTA hat den Vorteil, ein vielfach verwendetes, sehr billiges Massenreagenz zu sein, das praktisch in jedem Labor in großen Mengen vorhanden ist.

EDTA ist ein potenter Komplexierer divalenter Metallkationen und inhibiert die AP daher effizient. In der Literatur wurde bisher berichtet, daß die Inhibierung der AP durch EDTA rever­ sibel ist und die Konformation des Enzyms nicht beeinflußt, siehe z. B. Mersol J.V., et al. (1993), "Detection of intermediate protein conformations by room temperature tryptophan phosphores­ cence spectroscopy during denaturation of Escherichia coli alkaline phosphatase", Biophys. Chem. 48: 281-291. Daher war es nicht zu erwarten, daß beim Nachweis mehrerer Antigene mit der AP, trotz Wegwaschens des zur Inhibierung des Enzyms der vorhergehenden Nachweisreaktion verwendeten EDTA die AP der vorherigen Nachweisreaktion nicht mehr aktiviert wird. Dies konnte in intensiven Studien des Erfinders jedoch nachgewiesen werden. Eine nahezu vollständige Inhibierung der jeweils vorigen Nachweisreaktion ist bei der Benutzung des jeweils gleichen Enzyms essentiell, da sich sonst die Farben der Nachweisreaktion vermischen und keine eindeutige Zuordnung zum jeweiligen Antigen mehr möglich ist.

In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens werden folgende Schritte durchgeführt:

• a) Reaktion eines auf einem biologischen Material befindlichen ersten Antigens mit einem ersten Primärantikörper;
• b) Reaktion eines ersten Sekundärantikörpers, an den die AP konjugiert ist, mit dem ersten Primärantikörper;
• c) Katalyse einer Farbreaktion durch die AP, die an den ersten Sekundärantikörper konjugiert ist;
• d) Reaktion eines zweiten Primärantikörpers mit einem zweiten Antigen;
• e) Inhibierung der AP, die an den ersten Sekundärantikörper konjugiert ist, durch EDTA;
• f) Wegwaschen des EDTA;
• g) Reaktion eines zweiten Sekundärantikörpers, an den die AP konjugiert ist, mit dem zweiten Primärantikörper;
• h) Katalyse einer zweiten Nachweisreaktion durch die AP, die an den zweiten Sekundärantikörper konjugiert ist.

Hier ist von Vorteil, daß das Verfahren einfach, leicht durchzu­ führen und standardisierbar ist. Bei diesem lichtmikroskopischen Verfahren werden nacheinander zwei verschiedene Antigene durch zwei verschiedene Nachweisreaktionen detektiert, die durch das jeweils gleiche Enzym, die AP, katalysiert werden. Die Inkubation mit den gleichen AP-konjugierten Sekundärantikörpern kann unter den immer gleichen Reaktionsbedingungen stattfinden. Nach Durchführung der ersten Nachweisreaktion wird die Aktivität der AP durch EDTA schonend und ohne Konsequenzen für die Integrität des biologischen Materials inhibiert. Nach Wegwaschen des EDTA wird eine neue Nachweisreaktion unter Benutzung der AP durchgeführt, wobei die Aktivität der AP der vorherigen Nachweisreaktion trotz Wegwaschen des Chelatbildners nicht wieder aufgenommen wird, so daß die Nachweisreaktion des ersten Antigens nicht mit der Nachweisreaktion des zweiten Antigens vermischt wird.

Dieses Verfahren hat den weiteren Vorteil, daß ein sehr gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis (niedriger "background") erreicht werden kann.

Durch die sich wiederholende Abfolge der Reaktionsschritte kann dieses Verfahren auch von angelernten Kräften durchgeführt werden, was für Routinediagnostik-Labors besonders vorteilhaft ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung kann ein drittes Antigen mit Hilfe eines dritten Primärantikörpers nachgewiesen werden, dem wiederum die AP zugeordnet ist, durch die eine dritte Nachweisreaktion katalysiert wird.

Dieses Verfahren ist beim Nachweis von mehr als zwei Antigenen besonders vorteilhaft, da durch die immer wiederkehrenden Reaktionsbedingungen sowohl der zeitliche als auch der finanzielle Aufwand eingeschränkt werden können.

Um das neue Verfahren schnell und ohne aufwendige Vorbereitungen durchführen zu können, sieht die Erfindung auch einen Kit vor, der alle benötigten Reagenzien, einen ersten und zumindest einen weiteren Primärantikörper, denen die Alkalische Phosphatase zugeordnet ist, eine EDTA-Lösung sowie Reagenzien für eine erste und zumindest eine weitere von der Alkalischen Phosphatase katalysierte Nachweisreaktion enthält.

Sind zwei oder mehr Primärantikörper bekannt, die zur Routine­ diagnostik bestimmter Krankheiten eingesetzt werden, so können diese im Kit enthalten sein und entweder direkt an die AP konjugiert vorliegen oder durch AP-konjugierte Sekundärantikörper nachgewiesen werden. Abhängig vom jeweiligen Nachweis sind in dem Kit zusätzlich Brückenantikörper enthalten.

Im Kit sind angemessene EDTA-Lösungen mit einer Konzentration im Bereich von 50-500 mM, vorzugsweise von 250 mM enthalten. Chromogene, die nach Reaktion mit der AP Farbstoff-Komplexe von unterschiedlicher Färbung ergeben, sowie ein ausführliches Protokoll zur Durchführung des Verfahrens sind im Kit ebenfalls inbegriffen.

Für Labors mit eigenen spezifischen Primärantikörpern kann der Kit selbstverständlich ohne Primärantikörper, dafür aber mit einem Set an Spezies-spezifischen Sekundär- oder Brückenanti­ körpern, bspw. Kaninchen-anti-Maus, Maus-anti-Kaninchen, Ziege­ anti-Maus, Ziege-anti-Kaninchen, denen die AP zugeordnet ist, ausgestattet werden.

Ein solcher Kit hat den Vorteil, die reproduzierbare und schnelle Durchführung von Nachweisreaktionen durch angelernte Kräfte auch in höchst einfach ausgestatteten Arztpraxen zu erlauben, da als einziges zusätzlich benötigtes Gerät ein Lichtmikroskop ausreicht.

Die Benutzung des erfindungsgemäßen Kits erhöht darüber hinaus die Reproduzierbarkeit und Schnelligkeit des Nachweisverfahrens auch in Routinediagnostik-Labors.

Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nach­ stehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.

Die einzige Figur zeigt schematisch die Abfolge der Reaktions­ schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In der Figur ist schematisch ein biologisches Material 10 angedeutet, das z. B. als Gewebeschnitt vorliegen kann. In dem gezeigten Beispiel sind auf dem biologischen Material ein erstes Antigen 11 sowie ein davon verschiedenes, weiteres Antigen 12 vorhanden.

Zum Nachweis des Antigens 11 wird zuerst ein für das Antigen 11 spezifischer Primärantikörper 13 eingesetzt. In einem ersten Reaktionsschritt bindet der Primärantikörper 13 an das erste Antigen 11. Ein Sekundärantikörper 14, an den die Alkalische Phosphatase (AP) 15 konjugiert ist, bindet an den konstanten Anteil 16 des ersten Primärantikörpers 13. Die dem ersten Sekundärantikörper 14 zugeordnete AP 15 katalysiert eine Nachweisreaktion, bei der ein Chromogen 17 in eine unlösliche und farbige Form 18 überführt wird. Diese Nachweisreaktion ist in der Figur allgemein mit 19 bezeichnet.

In einem neuen Reaktionsschritt bindet ein zweiter Primär­ antikörper 21 an das zweite Antigen 12 auf dem biologischen Material 10. Durch fünfzehnminütiges Inkubieren des Ansatzes mit EDTA 22 wird die AP 15 inhibiert. Vor der Durchführung einer neuen Nachweisreaktion muß das EDTA 22 durch Waschen von dem biologischen Material 10 entfernt werden. Ein zweiter Sekundär- Antikörper 14, an den die AP 15 konjugiert ist, bindet an den konstanten Anteil 23 des zweiten Primärantikörpers 21. Die AP 15 katalysiert eine Nachweisreaktion 24, in der ein Chromogen 25, das von dem Chromogen 17 verschieden ist, in eine farbige und unlösliche Form 26 umgesetzt wird. Der entstehende unlösliche Farbkomplex 26 weist eine andere Farbe auf als der Farbkomplex 18. Währenddessen bleibt die AP 15, die dem ersten Primär­ antikörper 13 zugeordnet ist, inaktiv, so daß keine weitere Nachweisreaktion am ersten Antigen 11 auftritt.

Mit einer weiteren Reaktionsabfolge entlang der gestrichelten Linie ist es möglich, durch weitere Reaktions-Runden dritte und weitere Antigene mit dem gleichen Verfahren nachzuweisen.

Nachstehend ist in Form eines Beispieles ein konkreter Anwen­ dungsfall der Erfindung wiedergegeben:

Beispiel

Nachweis der beiden Antigene GFAP (Glial Fibrillary Acidic Protein) und LCA (Leucocyte Common Antigen) auf Gewebeschnitten von humanem Glioblastom-Gewebe:

• a) Inkubation der Gewebeschnitte in unspezifischem Schweine­ serum in einer Verdünnung von 1 : 10 in TBS-Puffer (0,25 M TRIS/HCl, 2 M Natriumchlorid) pH 7,5, für 15 Minuten.
• b) Zusatz eines ersten Primärantikörpers (anti-GFAP aus Maus) in einer Verdünnung von 1 : 10 in TBS für 30 bis 90 Minuten, bevorzugt für 60 Minuten.
• c) Spülen der Schnitte mit TBS (Ansatz wie oben).
• d) Vorinkubation eines Brückenantikörpers (Kaninchen-anti-Maus) mit humanem Normalserum im Verhältnis von 1 : 1 auf Eis und zehnminütige Zentrifugation bei 14 000 upm.
• e) Zusatz des Brückenantikörpers (Kaninchen-anti-Maus) in einer Verdünnung von 1 : 20 in TBS (wie oben) für 15 bis 45 Minuten, bevorzugt für 30 Minuten.
• f) Spülen der Schnitte mit TBS (Ansatz wie oben).
• g) Inkubation der Schnitte mit einem Sekundärantikörper (Maus­ anti-Kaninchen), an den die AP konjugiert ist, in einer Verdünnung von 1 : 100 in TBS (wie oben) für 15 bis 45 Minuten, bevorzugt für 30 Minuten.
• h) Spülen der Schnitte mit TBS (wie oben).
• i) Zugabe einer Chromogen-Lösung (z. B. Fast Red TR) und Entwicklung der Chromogen-Substrat-Lösung für 5 bis 30 Minuten, bevorzugt für 10 Minuten, abhängig von der Färbungsintensität.
• j) Spülen der Schnitte mit TBS (wie oben).
• k) Inkubation eines zweiten Primärantikörpers (anti-LCA aus Maus) in einer Verdünnung von 1 : 100 in TBS (wie oben) für 30 bis 90 Minuten, bevorzugt für 60 Minuten.
• l) Spülen der Schnitte mit TBS (wie oben).
• m) Vorinkubation eines Brückenantikörpers (Kaninchen-anti-Maus) mit humanem Normalserum im Verhältnis von 1 : 1 für 30 Minuten auf Eis und zehnminütige Zentrifugation bei 14 000 upm.
• n) Inkubation mit dem Brückenantikörper in einer Verdünnung von 1 : 20 in TBS (wie oben) für 15 bis 45 Minuten, bevorzugt für 30 Minuten.
• o) Spülen in TBS (wie oben).
• p) Inkubation mit 0,25 M EDTA Lösung für 5 bis 30 Minuten, bevorzugt für 15 Minuten, um die Alkalische Phosphatase- Reaktion abzustoppen.
• q) Spülen in TBS (wie oben).
• r) Inkubation mit einem Sekundärantikörper (Maus-anti-Kanin­ chen), an den die AP konjugiert ist, in einer Verdünnung von 1 : 100 in TBS (wie oben) für 15 bis 45 Minuten, bevorzugt für 30 Minuten.
• s) Spülen in TBS (wie oben).
• t) Zugabe einer Chromogen-Lösung (z. B. Fast Blue BB) und Ent­ wicklung mit der zweiten Chromogen-Substrat-Lösung für 5 bis 30 Minuten, bevorzugt für 8 Minuten.

In diesem Verfahren werden zwei Primärantikörper, die für GFAP und LCA spezifisch sind, sowie ein Brückenantikörper und ein Sekundärantikörper, an den die AP konjugiert ist, eingesetzt. Da Brückenantikörper und Sekundärantikörper gleich sind, können die gleichen Reaktionsbedingungen, d. h. die gleichen Puffer und Inkubationszeiten eingesetzt werden. Nach der ersten Reaktionsrunde wird eine zweite Reaktionsrunde durchgeführt, die sich bis auf die Verdünnung des Primärantikörpers, den Inhibierungsschritt mit EDTA und die Chromogen-Reaktion nicht von der ersten Reaktionsrunde unterscheidet.

Diese Vereinfachung des Verfahrens erhöht die Reproduzierbarkeit und senkt die Fehlerrate. Durch den Einsatz von einem einzigen Enzym-konjugierten Sekundärantikörper und dem Massenreagenz EDTA werden erhebliche Kosten gespart. Durch die Verwendung von unterschiedlich farbigen Chromogen-Komplexen ist auch bei Mehrfachfärbungen die Lichtmikroskopie möglich, die wesentlich weniger aufwendig als die Fluoreszenz-Mikroskopie ist.

Dieses preiswerte, standardisierte Verfahren läßt sich vor allem in Krankenhäusern angeschlossenen Routinediagnostik-Labors aufgrund seiner hohen Effizienz einsetzen.

Claims (13)

1. Verfahren zum Nachweis von einem ersten und zumindest einem weiteren Antigen (11, 12) auf biologischem Material (10) durch einen für das erste Antigen spezifischen ersten Primärantikörper (13) und einen für das weitere Antigen spezifischen weiteren Primärantikörper (22), wobei diesen Antikörpern jeweils ein Enzym zugeordnet ist, mit den Schritten:

• a) Detektion des ersten Antigens (11) mit Hilfe einer ersten Nachweisreaktion (19), die durch das dem ersten Primärantikörper zugeordnete Enzym (15) katalysiert wird; und
• b) Detektion des weiteren Antigens (12) mit Hilfe einer weiteren Nachweisreaktion (24), die durch das dem weiteren Primärantikörper (21) zugeordnete Enzym (15) katalysiert wird,

dadurch gekennzeichnet, daß dem ersten und dem weiteren Primärantikörper (13, 21) das gleiche Enzym (15) zugeordnet wird und vor jeder weiteren Nachweisreaktion (24) das Enzym (15) der vorherigen Nachweisreaktion (19) inhibiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym direkt an zumindest einen Primärantikörper konjugiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym an einen gegen zumindest einen Primär­ antikörper gerichteten Sekundärantikörper (14) konjugiert ist.

4. Verfahren einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zumindest ein gegen einen der Primärantikörper gerichteter Brückenantikörper eingesetzt wird, der von einem Sekundärantikörper erkannt wird, an den das Enzym konjugiert ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym die Alkalische Phosphatase (15) ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Inhibierung der Alkalischen Phospha­ tase ein Chelatbildner eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Chelatbildner EDTA (22) eingesetzt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch die Schritte:

• a) Reaktion eines auf einem biologischen Material (10) befindlichen ersten Antigens (11) mit einem ersten Primärantikörper (13);
• b) Reaktion eines ersten Sekundärantikörpers (14), an den die Alkalische Phosphatase (15) konjugiert ist, mit dem ersten Primärantikörper (13);
• c) Katalyse einer Farbreaktion (19) durch die Alkalische Phosphatase (15), die an den ersten Sekundärantikörper (14) konjugiert ist;
• d) Reaktion eines zweiten Primärantikörpers (21) mit einem zweiten Antigen (12);
• e) Inhibierung der Alkalischen Phosphatase (15), die an den ersten Sekundärantikörper (14) konjugiert ist, durch EDTA (22);
• f) Wegwaschen des EDTA (22);
• g) Reaktion eines zweiten Sekundärantikörpers (14), an den die Alkalische Phosphatase (15) konjugiert ist, mit dem zweiten Primärantikörper (21);
• h) Katalyse einer zweiten Nachweisreaktion (24) durch die Alkalische Phosphatase (15), die an den zweiten Sekundärantikörper (14) konjugiert ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zum Nachweis eines dritten Antigens ein dritter Primärantikörper eingesetzt wird, dem die Alkalische Phosphatase zugeordnet ist, durch die eine dritte Nachweisreaktion katalysiert wird.

10. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß er einen ersten und zumindest einen weiteren Primärantikörper, denen die Alka­ lische Phosphatase zugeordnet ist, eine EDTA-Lösung sowie Reagenzien für eine erste und zumindest eine weitere von der Alkalischen Phosphatase katalysierte Nachweisreaktion enthält.

11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest ein Sekundärantikörper enthalten ist.

12. Kit nach einem der Ansprüche 10 und 11, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zumindest ein Brückenantikörper enthalten ist.