Diese
Erfindung betrifft den kolorimetrischen Nachweis von Analyten in
einer flüssigen
Probe und findet in den Bereichen Biologie, medizinische Analyse
und analytische Chemie Anwendung.
In
diesem Abschnitt wird eine Vielzahl von Verfahren zum Nachweis von
Verbindungen anhand des Aussehens einer Farbe erörtert. Die Anführung einer
Bezugnahme oder eines Konzepts in diesem Abschnitt ist jedoch nicht
als Hinweis darauf anzusehen, dass die Bezugnahme oder das Konzept
ein gegenüber
dieser Erfindung bereits vorhandener Stand der Technik ist.
Nachweis
und Messung von Farbe ist ein geeignetes Verfahren zur Messung der
Menge einer Substanz in Lösung.
Wenn die nachzuweisende Substanz, d.h. das "Analyt", keine Eigenfärbung aufweist, kann als Surrogat
für die
Substanz mit Hilfe einer Vielzahl von chemischen, enzymatischen
oder immunochemischen Verfahren eine Farbe erzeugt werden. Diese
bekannte Technik findet zum Beispiel sowohl in klinischen als auch
Forschungslaboratorien in den Bereichen Biologie und Gesundheitspflege
Anwendung. Das Prinzip der Kolorimetrie beruht auf dem stetigen
Verlust von Licht beim Durchtritt durch eine Lösung infolge der Absorption
von Licht in die gefärbte
Verbindung. Eine Molekülspezies
absorbiert bei jeder Messung bei gleicher Wellenlänge die
gleiche Lichtmenge im Verhältnis
zur Konzentration. Der Lichtverlust beim Durchtritt durch eine Lösung wird
mit Hilfe der Konzentration der absorbierenden Moleküle und der
Länge des
Lichtwegs bestimmt. Wenn die Länge
des Lichtwegs und der Lichtverlust sowie das Volumen der Lösung bekannt
sind, ist es möglich,
die Menge oder Masse einer Substanz zu berechnen. In der Praxis
wird die Berechnung oft durch eine Standardkurve ersetzt, die durch
die gleiche Reaktion bei einer Reihe bekannter Mengen der gleichen Substanz,
die zur Erzeugung von Farbe mit den gleichen Reaktionen behandelt
wurden, dargestellt wird. Mit anderen Verfahren kann die durch Streuung
verloren gegangene Lichtmenge ermittelt werden.
Assay für Liganden
Die
Empfindlichkeit eines kolorimetrischen Tests wird als die mittels
dieses Verfahrens zuverlässig nachzuweisende
Grenzmenge definiert. Eine Möglichkeit
zur Erhöhung
der Empfindlichkeit (d.h. Reduzierung der nachzuweisenden Grenzmenge)
besteht in der Anwendung eines Verstärkerverfahrens zur Erzeugung
von Farbe. Verstärker,
die für
die Auslegung von biowissenschaftlichen Assays von besonderem Interesse
sind, sind Katalysatoren und insbesondere die als Enzyme bekannte
Klasse biologischer Katalysatoren. Farbreaktionen zum Nachweis von
Enzymen oder zum Nachweis der Substrate, auf denen Enzyme als Katalysatoren wirken,
sind bekannt. Die Empfindlichkeit kann durch Anlagern von Enzymen
an Moleküle,
die das Analyt erkennen und die normalerweise als Liganden bezeichnet
werden, weiter verbessert werden.
ELISA
Ein
Standardassay für
den Nachweis und die Quantifizierung eines Analyts in einer Lösung ist
der Enzyme Linked Immunosorbent Assay oder ELISA. Dieser Assay kann
jedoch schwer ausführbar
und teuer sein. Bei diesem Assay muss der überschüssige enzymgebundene Ligand,
der nicht an Analyt angelagert ist, nachdem der enzymgebundene Ligand
mit dem gesamten, im Assay vorhandenen Analyt verbunden wurde, aus der
Lösung
ausgeschieden werden und dies erzeugt ein unerwünschtes Verstärkungssignal.
Die Standard-Assayauslegung
beinhaltet eine Reihe von Schritten wie folgt:
Ein Beispiel
eines Standardbehälters
für solche
Assays ist eine 96er Muldenplatte, die so bezeichnet wird, weil sie
eine Matrix von 12 mal 8 Mulden in Standardgröße innerhalb eines Standardrahmens
aufweist. Hersteller können
solche Platten in einer Weise behandeln, dass sich bestimmte Molekülspezies
fest an den Muldenwandungen anlagern.
Das
Zusetzen einer ligandhaltigen Lösung
in jede Mulde auf der Platte bei 4 °C erlaubt das Anlagern und erhält die Aktivität des Liganden.
Dies ist ein "über Nacht" anwendbares Verfahren.
Die
Platten werden dann gewaschen, um alles Ligandmaterial, das nicht
fest an die Muldenwandung angelagert ist, zu beseitigen. Es finden
drei sequentielle Waschdurchgänge
statt.
Die
Platten werden zumeist sofort verwendet, da die so angelagerten
Liganden nicht lagerstabil sind. Muster- oder Standard-Analytlösungen oder
Blindproben, die nur Reagens enthalten, werden einzelnen Mulden
zugesetzt. Die Analytspezies, die das Ligandenpaar bildet, lagert
sich an den Liganden an der Muldenwandung an.
Nach
einer gewissen Inkubationszeit werden die Platten zur Beseitigung
der verbliebenen Probenlösung
wieder gewaschen. Es finden drei sequentielle Waschdurchgänge statt.
Dann
wird jeder Mulde enzymkonjugierter Ligand zugesetzt. Normalerweise
weist dieser Ligand eine Spezifität für eine andere Erkennungsstelle
am Analyt-Molekül
auf.
Die
Platte wird wieder gewaschen, um in der Lösung verbliebenen überschüssigen enzymkonjugierten Liganden
zu beseitigen. Es finden drei sequentielle Waschdurchgänge statt.
An diesem Punkt wird die Menge des an die Wandung jeder Mulde angelagerten
Enzyms anhand der ebenfalls an der Muldenwandung angelagerten Analytmenge
bestimmt.
Dann
werden Reagenzien zur Untersuchung auf das Vorhandensein des Enzyms
zugesetzt und die so erzeugte Farbe bezieht sich auf die jeder Mulde
zugesetzte Analytmenge.
Die
Messung erfolgt in einem für
das Lesen der Platten ausgelegten Fotometer, einem sogenannten Plattenleser.
Es
ist offensichtlich, dass ELISA ein mühsamer, zeitaufwändiger Assay
ist, der zahlreiche Schritte erfordert. Ein Hersteller kann die
Platten zunächst
präparieren.
Solche fertigen Platten sind teuer. So kann zum Beispiel eine Assay- Platte für 96 Tests
$ 650 kosten. Bei der Anwendung ist der Assay mit einer solchen
Platte immer noch erst nach ca. 5 Stunden abgeschlossen.
Channeling
Eine
Verbesserung gegenüber
dem ELISA-Verfahren ist als "Channeling" bekannt und wird
in Gibbons et al., Methods of Enzymology 136:93 beschrieben. Das
Channeling-Prinzip besteht in der Bildung kleiner, spezialisierter
Partikel während
des Assays. Die Partikel erlauben das Anlagern von Liganden mit
zwei gesonderten Enzymen. Die Enzyme wirken in der Weise koordiniert,
dass das Produkt eines Enzyms als Substrat für das nächste dient. Channeling ist
nur möglich
mit Enzymen, die an die Partikel angelagert sind. Nicht an Partikel
angelagerte Enzyme erzeugen kein Farbreaktionsprodukt. Wenngleich
dies gegenüber
ELISA eine theoretische Verbesserung darstellt, gibt es hinsichtlich
der Bildung solcher spezialisierter Partikel Überlegungen, die dieses Konzept
in der Praxis unmöglich
machen.
Weitere Lösungsassays
Es
sind weitere Lösungsassays,
die mit Verstärkern
arbeiten, bekannt. Das US-Patent Nr. 3.975.237 zum Beispiel offenbart
einen für
kleine Moleküle
typischen Lösungsassay.
Das Assay-Prinzip besteht aus einer Inhibition der Enzymaktivität durch
Anwendung eines Großmolekülrezeptors,
zum Beispiel eines Antikörpers, auf
das Analyt mit geringem Molekulargewicht als Konkurrenz zu einer
kleinmolekularen Version des gleichen Analytmoleküls. Beschrieben
werden Verfahren zur Herstellung von Enzymkonjugaten mit Analyten
und die Empfindlichkeit von Assays dieser Art. Ein weiterer Lösungsassay
wird von Kricka und Ji, 1994, in Clinical Chemistry 40:1828–30 beschrieben.
Dieser Assay nutzt kleinmolekulare Arylboronsäuren zur Verbesserung der enzymatischen
Lumineszenz. In einem ähnlichen
Assay, der in den US-Patenten Nr. 5.843.666 und 5.306.621 beschrieben
ist, wird die Chemilumineszenz durch kleinmolekulare Phenole verbessert.
Das Verfahren nutzt einen mit einem hydrolytischen Enzym markierten
Bindungspartner für
die Erzeugung eines Phenol-Enhancers in unmittelbarer Nähe zu einem
peroxidasemarkierten spezifischen Bindungspartner. Der Wirkungsmechanismus
der Verstärkung
ist nicht bekannt. Es handelt sich dabei um einen Lumineszenzassay,
der kostspieliges Equipment voraussetzt, das den meisten Labors
nicht zur Verfügung
steht, und der nur über
begrenzte Empfindlichkeit verfügt.
Histochemie
In
den Bereichen Histochemie und Zytochemie wird in Geweben oder Zellen
ein Farbkontrast zwecks mikroskopischer Untersuchung oder Erkennung
erzeugt. Liganden, die Gewebekomponenten erkennen und an Enzyme
angelagert werden, dienen als Verstärker, die dann mit geeigneten
Reagenzien Farbe erzeugen können.
Für die
visuelle Untersuchung ist es möglich,
mehrere Farben eines Reaktionsprodukts für mehrere Einzelanalyte mit
unterschiedlichen enzymkonjugierten Liganden zu erzeugen. Dieses
Verfahren ist solange akzeptabel, wie die verschiedenen Analyte
in unterschiedlichen Zellen oder Gewebekomponenten liegen. Befinden
sich die beiden Analyte jedoch an der gleichen Stelle, sind die
daraus resultierenden Farben additiv und erzeugen eine neue Farbe,
die mikroskopisch nicht interpretierbar ist. Eine weitere Möglichkeit
zur Auflösung von
zwei Farben an einer Stelle besteht im Einsatz von fluoreszierenden
Markern. Die Fluoreszenzmikroskopie ist jedoch weit teurer und die
automatische Fluoreszenzerkennung erfordert längere Integrationszeiten, sodass eine
Automatisierung einer zweifarbigen Bilderkennung in der Praxis unmöglich wird.
Farbfotografische Entwicklung
Bei
der Belichtung von Farbfilmen werden im Film aktivierte Silberkörner erzeugt.
Licht unterschiedlicher Farbe aktiviert Silberpartikel in verschiedenen
Schichten des Farbfilms. Bei der Entwicklung mit einem üblichen
Reagens werden die Silberkörner
reduziert und bewirken dadurch die Oxidation des gemeinsamen Entwicklers.
Der in der Schicht enthaltene oxidierte Entwickler verbindet sich
chemisch mit Farbkopplern. Es ist nur das Produkt der Kombination
von oxidiertem Entwickler und Farbkopplern, das Farbe erzeugt. Jede Schicht
weist mindestens einen Farbkoppler auf, der ein für die betreffende
Schicht spezifisches Farbreaktionsprodukt erzeugt. Fängermoleküle, zuweilen
auch als "weiße Koppler" bezeichnet, verhindern
die Diffusion des Entwicklers aus einer Schicht in eine andere.
Es gilt als Vorteil der Reaktion von Fängern und farbigen Kopplern
mit oxidierten Entwicklern, wenn das Reaktionsprodukt in der Schicht,
in der es gebildet wird, verbleibt. Dies erreicht man durch Entwicklung
oder Auswahl von Kopplern, die sowohl vor als auch nach dem Kopplungsvorgang
in der Entwicklerlösung
unlöslich
sind. Einige Fänger
und einige Farbkoppler sind mit Anlagerung an immobilisierte Polymere
ausgelegt. Es gibt aktive Regionen an Farbkopplermolekülen und
weißen Kopplern,
die die Kopplung an oxidierte oder aktivierte fotografische Entwickler
verbessern.
Die
chemische Struktur der Farbkoppler ist dem Reaktionsprodukt histochemischer
farberzeugender Verbindungen sehr ähnlich. Tatsächlich sind
die histochemischen und zytochemischen Substrate häufig die gleichen
wie fotografische Farbkoppler unter Hinzufügung einer Schutzgruppe am
aktiven Zentrum. Die Schutzgruppe wird aus der aktiven Region durch
Einwirkung des betreffenden Enzyms hydrolysiert. Die chemische Struktur
von fotografischen Farbentwicklern gleicht auch sehr stark Substraten,
wie sie in der Histochemie von Peroxidasereaktionen verwendet werden.
Das oxidierte Reaktionsprodukt ist in der Histochemie und in farbfotografischen
Entwicklern ebenfalls ähnlich.
Bei beiden chemischen Reaktionen ist das Oxidationspotenzial ebenfalls
nahezu das gleiche. Die Anwendung fotografischer Entwickler bei
der Erkennung von Reaktionsprodukten von hydrolytischen Enzymen
wurde zum Beispiel von Ornstein, 1959, Histochemistry and Cytochemistry
7:231 und von Ornstein, 1974, Histochemistry and Cytochemistry 22:453–69, die
hier beide als Quellenangaben genannt werden, vorgeschlagen.
Innerhalb
der Fotoindustrie ist allgemein bekannt, dass bestimmte Koppler
Farbe wirksamer erzeugen als andere. Dies bedeutet, dass sie zur
Farberzeugung weniger oder mehr oxidierten Entwickler erfordern.
Da die Menge des oxidierten Entwicklers von der Zahl der sensibilisierten
Silberionen abhängt,
ist die Folge, dass für
einige Koppler mehr sensibilisierte Silberionen benötigt werden
als für
andere. Die effizienteren Koppler sind als 2-Äquivalent-Koppler bekannt,
während
die weniger effizienten als 4-Äquivalent-Koppler
bekannt sind.
Diese
Erfindung beschreibt einen Assay für Analyte in Lösung. Der
Assay basiert teilweise auf dem Kombinieren zweier eng beieinander
liegender katalytischer Aktivitäten
zur Erzeugung eines nachweisbaren Produkts. Die Erfindung nutzt
die Nähe
der beiden katalytischen Aktivitäten,
zum Beispiel Enzymaktivitäten, um
die Erzeugung von Farbe zu begrenzen, während die gleichen, nicht in
der Nähe
befindlichen Enzyme nur eine untergeordnete Hintergrundfarbe erzeugen.
Die vorliegende Erfindung nutzt Analogverbindungen zu geschützten Farbkopplern
und Analogverbindungen zu fotografischen Farbentwicklern, um Farbe
zu erzeugen, die auf Regionen in der Lösung begrenzt ist, in der oxidierende
Enzyme und ein hydrolytisches Enzym nahe beieinander liegen. Bei
einer Ausführungsform
der Erfindung werden weiße
Koppler als Fänger
eingesetzt, um die Farberzeugung in der Lösung dort, wo die Enzyme nicht
nahe beieinander liegen, zu inhibieren.
Diese
Erfindung hat gegenüber
vorhandenen Verfahren zum Nachweis von Analyten in Lösung, wie ELISA,
Vorteile. Der vorliegende Assay kann beispielsweise in Platten mit
zahlreichen Mulden (z.B. 96 Mulden) ohne Waschstufen ausgeführt werden,
um einen ungebundenen Liganden, im Beispiel Nicht-Analyt-Moleküle, und
einen ungebundenen, enzymkonjugierten Liganden zu beseitigen. Ohne
jede Anlagerung von Fängerreagens,
Analyt oder Nachweisreagens an der Muldenwandung erlaubt diese Erfindung
den Abschluss eines Tests innerhalb 1 bis 1,5 Stunden. Die Ergebnisse
können
mit Hilfe von kolorimetrischen Plattenlesern gelesen werden, wie
sie in klinischen und Forschungslabors weitgehend zur Verfügung stehen.
Der erfindungsgemäße Assay
ist daher schneller, umfasst weniger Stufen und ist wirtschaftlicher
als bestehende Verfahren.
Gemäß einem
Aspekt ermöglicht
die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines Analyts in Lösung, umfassend
(a) das Kombinieren (I) einer auf das Vorhandensein oder die Menge
des Analyts zu untersuchenden Lösung;
(II) eines ersten Liganden, der zum Binden des Analyts geeignet
ist, worin der genannte erste Ligand direkt oder indirekt an ein
erstes Enzym gebunden ist, welches zum Spalten eines ersten Substrats
zur Erzeugung eines farblosen ersten Produkts fähig ist, worin das genannte
erste Enzym eine Hydrolase ist; (III) eines zweiten Liganden, der
das Analyt bindet, worin das Binden des ersten Liganden an das Analyt
das Binden des zweiten Liganden nicht stört und worin der zweite Ligand
direkt oder indirekt an ein zweites Enzym gebunden ist, welches
zum Oxidieren eines zweiten Substrats zur Erzeugung eines farblosen
zweiten Produkts fähig
ist, worin das genannte zweite Enzym eine Oxidase ist; (IV) des
genannten ersten Substrats; und (V) des genannten zweiten Substrats,
wobei die Hydrolase das erste Substrat zur Erzeugung des ersten
Produkts spaltet und die Oxidase das zweite Substrat zur Erzeugung
des zweiten Produkts oxidiert, worin sich das erste Produkt und
das zweite Produkt zur Erzeugung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts
chemisch kombinieren, wobei das genannte nachweisbare Reaktionsprodukt
ein farbiges Reaktionsprodukt ist; (b) das Nachweisen der Erzeugung
des farbigen Reaktionsprodukts; (c) das In-Beziehung-Bringen der Erzeugung des
farbigen Reaktionsprodukts mit dem Vorhandensein von Analyt in der
Lösung.
Das Verfahren kann des Weiteren das Kombinieren einer Verbindung,
die ein Fänger
für das
erste Reaktionsprodukt oder das zweite Reaktionsprodukt ist, in
Schritt (a) umfassen. Der Fänger
kann 3-Amino-1-(2,4,6-trichlorphenyl)-2-pyrazolin-5-on
oder Acetoacetamid sein. Das erste Substrat kann eine Verbindung
sein, die einen Benzolring oder eine Naphthalenstruktur mit einer
aktiven Hydroxylgruppe, zum Beispiel 1-Naphtholphosphat oder Phenylphosphat,
umfasst. Das zweite Substrat kann N,N-Dimethylparaphenylendiamin; N,N-Diethylparaphenylendiamin;
N-Phenylparaphenylendiamin; N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin; 4-Aminoantipyren
oder N,N-Dimethylaminobenzidin sein. Bei verschiedenen Ausführungsformen
ist der erste Ligand ein erster Antikörper, der speziell das Analyt
bindet, und der zweite Ligand ist ein zweiter Antikörper, der
speziell das Analyt bindet, die Hydrolase ist eine Phosphatase,
eine Esterase, eine Galactosidade, eine Lipase, eine Glucuronidase,
eine Amidase, eine Peptidase oder eine Sulphatase. Bei einer Ausführungsform
ist zum Beispiel die Hydrolase alkalische Phosphatase und die Oxidase
ist Meerrettichperoxidase. Bei einer Ausführungsform ist das erste Substrat
ein Naphthylphosphat oder Phenylphosphat und das zweite Substrat
ist N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin.
Bei einigen Ausführungsformen ist
mindestens einer des ersten und des zweiten Liganden ein Antikörper oder
ein Lectin.
Gemäß einem
verwandten Aspekt ermöglicht
die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines Analyts in Lösung, umfassend
(a) das Kombinieren (I) einer auf das Vorhandensein oder die Menge
des Analyts zu untersuchenden Lösung,
worin das genannte Analyt eine Oxidaseaktivität aufweist, die fähig ist,
auf ein erstes Substrat so einzuwirken, dass ein farbloses erstes
Produkt entsteht; (II) eines Liganden, der zum Binden des Analyts
geeignet ist, worin der genannte Ligand direkt oder indirekt an
ein erstes Enzym gebunden ist, welches zum Spalten eines zweiten
Substrats zur Erzeugung eines farblosen zweiten Produkts fähig ist,
worin das genannte erste Enzym eine Hydrolase ist; (III) des genannten
ersten Substrats; und (V) des genannten zweiten Substrats, wobei
die Hydrolase das zweite Substrat zur Erzeugung des zweiten Produkts
spaltet und die Oxidase das erste Substrat zur Erzeugung des ersten
Produkts oxidiert, worin sich das erste Produkt und das zweite Produkt
zur Erzeugung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts chemisch kombinieren,
wobei das genannte nachweisbare Reaktionsprodukt ein farbiges Reaktionsprodukt
ist; (b) das Nachweisen der Erzeugung des farbigen Reaktionsprodukts;
(c) das In-Beziehung-Bringen der Erzeugung des farbigen Reaktionsprodukts mit
dem Vorhandensein von Analyt in der Lösung. Bei einer Ausführungsform
weist das Analyt eine Pseudoperoxidaseaktivität auf. Bei einer Ausführungsform
ist das Analyt glykiertes Hämoglobin.
Bei einer Ausführungsform
umfasst die Lösung
unglykiertes Hämoglobin
und den glykierten Anteil von Hämoglobin,
der mit dem Gesamthämoglobin
verglichen werden soll. Bei verschiedenen Ausführungsformen ist der Ligand
eine organische Boronsäureverbindung,
die direkt oder indirekt an eine Hydrolase konjugiert ist. Des Weiteren
kann die Hydrolase alkalische Phosphatase sein; das Verfahren kann
das Kombinieren einer Verbindung, die ein Fänger für das erste Reaktionsprodukt
ist, in Schritt (a) umfassen; das erste Substrat ist ausgewählt aus
der Gruppe, bestehend aus N,N-Dimethylparaphenylendiamin;
N,N-Diethylparaphenylendiamin; N-Phenylparaphenylendiamin;
N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin;
4-Aminoantipyren oder N,N-Dimethylaminobenzidin, das zweite Substrat
ist Naphthylphosphat oder Phenylphosphat und der Fänger ist
3-Amino-1-(2,4,6-trichlorphenyl)-2-pyrazolin-5-on oder Acetoacetamid.
Gemäß einem
verwandten Aspekt ermöglicht
die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines Analyts in Lösung, umfassend
(a) das Kombinieren (I) einer auf das Vorhandensein oder die Menge
des Analyts zu untersuchenden Lösung,
worin das genannte Analyt eine Hydrolaseaktivität aufweist, die fähig ist,
auf ein erstes Substrat so einzuwirken, dass ein farbloses erstes
Produkt entsteht; (II) eines Liganden, der zum Binden des Analyts
geeignet ist, worin der genannte Ligand direkt oder indirekt an
ein erstes Enzym gebunden ist, welches zum Spalten eines zweiten
Substrats zur Erzeugung eines farblosen zweiten Produkts fähig ist,
worin das genannte erste Enzym eine Oxidase ist; (III) des genannten
ersten Substrats; und (V) des genannten zweiten Substrats, wobei
die Hydrolase das erste Substrat zur Erzeugung des ersten Produkts
spaltet und die Oxidase das zweite Substrat zur Erzeugung des zweiten
Produkts oxidiert, worin sich das erste Produkt und das zweite Produkt
zur Erzeugung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts chemisch kombinieren,
wobei das genannte nachweisbare Reaktionsprodukt ein farbiges Reaktionsprodukt
ist; (b) das Nachweisen der Erzeugung des farbigen Reaktionsprodukts;
(c) das In-Beziehung-Bringen der Erzeugung des farbigen Reaktionsprodukts
mit dem Vorhandensein von Analyt in der Lösung.
Anders
ausgedrückt,
ermöglicht
die Erfindung gemäß unterschiedlichen
Aspekten und Ausführungsformen
(1) einen quantitativen oder qualitativen kolorimetrischen Lösungsassay
für Analyte,
umfassend: die Bereitstellung eines Analyts in Lösung; die Bereitstellung eines
ersten Liganden zum Analyt; die Bereitstellung eines zweiten Liganden
zum Analyt; die Bereitstellung einer katalytischen Aktivität für den ersten
Liganden zum Analyt; die Bereitstellung einer anderen katalytischen
Aktivität
für den
zweiten Liganden zum Analyt; die Bereitstellung eines Reagens für die erste
katalytische Aktivität,
ausgelegt für
die Erzeugung eines ersten farblosen Reaktionsprodukts; die Bereitstellung
eines Reagens für
die zweite katalytische Aktivität,
ausgelegt für die
Erzeugung eines zweiten farblosen Reaktionsprodukts; die Herstellung
von Bedingungen, unter denen die weitere Reaktion des ersten Reaktionsprodukts
und des zweiten Reaktionsprodukts zu einem farbigen dritten Reaktionsprodukt
nur dann führt,
wenn der erste Ligand und der zweite Ligand an das gleiche Analytmolekül angelagert
sind; Nachweisen des dritten Reaktionsprodukts mittels der erzeugten
Farbmenge und In-Beziehung-Bringen der nachgewiesenen Farbe mit
dem Analyt in Lösung.
Bei verschiedenen Ausführungsformen wird
ein Reagens bereitgestellt, das als Fänger für das erste oder zweite Reaktionsprodukt
dient; ist der an den ersten Liganden angelagerte Katalysator ein
Enzym, wie zum Beispiel eine Oxidase (z.B. Meerrettichperoxidase);
ist der an den zweiten Liganden angelagerte Katalysator ein Hydrolaseenzym
(z.B. alkalische Phosphatase); ist der zweite Ligand an ein anderes
Epitop oder eine andere Verknüpfung
angelagert als der Ligand; ist der erste Katalysator Meerrettichperoxidase,
ist der zweite Katalysator alkalische Phosphatase, ist das erste Reagens
ein oxidierbarer Entwickler und ist das zweite Reagens Naphthylphosphat
oder Phenylphosphat; ist der oxidierbare Entwickler N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin;
umfasst die Reaktion einen Fänger
(z.B. 3-Amino-1-(2,4,6-trichlorphenyl)-2-pyrazolin-5-on
oder Acetoacetamid).
Bei
verschiedenen Ausführungsformen
ist mindestens ein Ligand ein Antikörper oder ist mindestens ein
Ligand ein Lectin oder ist mindestens einer der Liganden ein Molekül mit allgemeineren
Affinitätseigenschaften
(z.B. eine Boronsäureverbindung).
Gemäß einem
Aspekt ermöglicht
die Erfindung einen quantitativen oder qualitativen kalorimetrischen Lösungsassay
für Analyte,
umfassend: die Bereitstellung eines Analyts mit einer ersten katalytischen
Aktivität in
Lösung;
die Bereitstellung eines Liganden zum Analyt; die Bereitstellung
einer zweiten katalytischen Aktivität für den Liganden zum Analyt;
die Bereitstellung eines Reagens für die erste katalytische Aktivität, ausgelegt für die Erzeugung
eines ersten farblosen Reaktionsprodukts; die Bereitstellung eines
Reagens für
die zweite katalytische Aktivität,
ausgelegt für
die Erzeugung eines zweiten farblosen Reaktionsprodukts; die Herstellung von
Bedingungen, unter denen die weitere Reaktion des ersten Reaktionsprodukts
und des zweiten Reaktionsprodukts nur dann zu einem farbigen dritten
Reaktionsprodukt führt,
wenn der Ligand an das Analyt angelagert ist; Nachweisen des dritten
Reaktionsprodukts mittels der erzeugten Farbmenge und In-Beziehung-Bringen
der nachgewiesenen Farbe mit dem Analyt in Lösung.
Bei
verschiedenen Ausführungsformen
ist ein Fänger
für das
erste oder zweite Reaktionsprodukt vorhanden, das Katalysatoranalyt
ist ein Enzym oder Pseudoenzym; das Enzym ist eine Oxidase (z.B.
Peroxidase oder Pseudoperoxidase); der an den Liganden angelagerte
Katalysator ist ein Hydrolaseenzym (z.B. alkalische Phosphatase);
der Ligand ist an ein anderes Epitop oder eine andere Verknüpfung angelagert
als das Enzym oder die aktive Region des Analyts; der erste Katalysator
ist eine Peroxidase, der zweite Katalysator ist alkalische Phosphatase,
das erste Reagens ist ein oxidierbarer Entwickler und das zweite
Reagens ist Napththylphosphat oder Phenylphosphat.
Bei
verschiedenen Ausführungsformen
ist der erste Katalysator glykiertes Hämoglobin; in der Analytprobe
ist eine Menge eines unglykierten Hämoglobins vorhanden und das
zu bestimmende Ergebnis ist die Bestimmung des glykierten Anteils
von Hämoglobin
im Vergleich zum Gesamthämoglobin;
der oxidierbare Entwickler ist N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin; es
ist ein Fängerreagens
enthalten (z.B. 3-Amino-1-(2,4,6-trichlorphenyl)-2-pyrazolin-5-on
oder Acetoacetamid); der Ligand ist ein Antikörper; der Ligand ist ein Lectin;
der Ligand ist ein Molekül
mit allgemeineren Affinitätseigenschaften
(z.B. eine Boronsäureverbindung,
angelagert an alkalische Phosphatase).
Gemäß einem
verwandten Aspekt ermöglicht
die Erfindung ein Set für
Lösungsassays,
umfassend einen ersten Antikörper
für ein
an ein erstes Enzym mit Peroxidaseaktivität angelagertes Analyt, einen
zweiten Antikörper
für das
gleiche, an ein zweites Enzym mit alkalischer Phosphataseaktivität konjugiertes
Analyt, eine Wasserstoffperoxidquelle, einen oxidierbaren Entwickler,
ein phenolähnliches
Substrat für
alkalische Phosphatase und einen farblosen Koppler zum Einsatz als
Fänger.
Bei einer Ausführungsform
ist der oxidierbare Entwickler N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin,
das Substrat ist Phenylphosphat oder Naphthylphosphat und der Fänger ist
Acetoacetamid. Die Erfindung ermöglicht
auch ein Set zum Nachweisen des Verhältnisses von glykiertem zu
Gesamthämoglobin,
umfassend eine für
die Messung in einem Plattenleser geeignete Muldenplatte, ein Enzym
mit alkalischer Phosphataseaktivität, gekoppelt an eine Boronsäure, eine
Wasserstoffperoxidquelle, einen oxidierbaren Entwickler, ein phenolähnliches
Substrat für
alkalische Phosphatase und einen farblosen Koppler für den Einsatz
als Fänger.
Bei einer Ausführungsform ist
der oxidierbare Entwickler N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin,
das Substrat ist Naphthylphosphat und der Fänger ist Acetoacetamid.
1 zeigt eine exemplarische
Reaktion des Typs, der im Rahmen dieser Erfindung angewandt werden
kann.
2 zeigt die Ergebnisse eines
Modelllösungsassays,
wie in Beispiel 1 beschrieben.
3 zeigt die Ergebnisse eines
Modelllösungsassays,
wie in Beispiel 2 beschrieben.
4 zeigt die Ergebnisse eines
Modelllösungsassays,
wie in Beispiel 3 beschrieben.
5 zeigt die Ergebnisse eines
Assays für
GM-CSF, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Übersicht
Diese
Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Nachweisen eines Analyts
in Lösung.
Bei einer Ausführungsform
werden eine Hydrolaseenzymaktivität und eine Oxidaseenzymaktivität zueinander
in enge Nähe
gebracht, indem sowohl Enzyme an ein einzelnes Analytmolekül angelagert
als auch geeignete Substrate in der Weise bereitgestellt werden,
dass die Hydrolase zur Erzeugung eines farblosen löslichen
Produkts auf ein Substrat einwirkt, die Oxidase zur Erzeugung eines
farblosen löslichen
Produkts auf ein zweites Substrat einwirkt und, sofern die beiden
Produkte in enger Nähe
zueinander erzeugt werden, sie sich chemisch zur Erzeugung eines
löslichen
farbigen Produkts kombinieren, das nachweisbar ist. Das Aussehen
des farbigen Produkts wird mit der Analytmenge in der Probe in Korrelation
gesetzt, zum Beispiel durch Anwendung einer Standardkurve. Bei einer
bevorzugten Ausführungsform
sind während
der Reaktion ein oder mehrere Fänger
vorhanden, der (die) mit farblosem Produkt (farblosen Produkten)
reagieren. Der hier verwendete Begriff "chemisch kombinieren" bezieht sich auf die Bildung einer
kovalenten chemischen Bindung zwischen zwei Reaktionsprodukten,
die zu einem dritten Produkt führt,
das nachweisbar und von den beiden Reaktionsprodukten unterscheidbar
ist.
1 enthält, lediglich zur Veranschaulichung
und ohne einschränkenden
Charakter, eine Übersicht eines
Ausführungsbeispiels
des Verfahrens. Hierin wird eine Vielzahl weiterer Ausführungsbeispiele
offenbart. Außerdem
wird eine Vielzahl histochemischer und zytochemischer Prinzipien
und Reagenzien in der am 12. April 2001 als WO 01/25476 veröffentlichten
US-Patentanmeldung
Nr. 09/411.352 offenbart, die für
das vorliegende Verfahren Anwendung finden kann, sofern Kombinationen
von Reagenzien ausgewählt
werden, die löslich
bleiben. Dies kann geschehen, indem Reagenzien zur Erhöhung der
Löslichkeit
ausgewählt
oder modifiziert werden oder, alternativ, indem in das Reaktionsgemisch
ein Lösungsvermittler
(z.B. 1–10%
Ethanol, Diethylenglykol und dergleichen) eingearbeitet wird. Nach
diesem Verfahren ist zwischen zwei enzymatischen Aktivitäten auf
Molekularebene Nähe
erforderlich, was bedeutet, dass die beiden primären Reaktionsprodukte miteinander
reagieren müssen,
um ein endgültiges
Reaktionsprodukt in molekularer Nähe zu bilden.
Analyt
Der
hier verwendete Begriff "Analyt" bezieht sich auf
die mit dem erfindungsgemäßen Assay
nachzuweisende Verbindung in Lösung.
Das Analyt kann jede/jeder von einer Vielzahl von Verbindungen oder
makromolekularen Komplexen in Lösung
sein, u.a. ein Polynukleotid, ein Antigen, ein Hapten, ein Antikörper, ein
Viruspartikel und dergleichen. Bei einer Ausführungsform, wie sie nachstehend
beschrieben wird, weist das Analyt eine enzymatische Aktivität auf. Der
hier verwendete Begriff "Lösung" bezieht sich auf
eine wässrige
Lösung,
bei der es sich um eine Pufferlösung,
ein Homogenat (z.B. Zellhomogenat), eine Körperflüssigkeit (z.B. Plasma, Urin,
Zerebrospinalflüssigkeit),
einen Auszug oder eine teilweise gereinigte Verbindung oder dergleichen
handeln kann, worin die Anwesenheit des Zielanalyts vermutet wird.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind
am nützlichsten
zum Nachweisen von Analyten bei geringer Konzentration (z.B. normalerweise
weniger als 10 Mikrogramm/ml, häufig
unter 1 Mikrogramm/ml).
Liganden und Ligandenkonjugate
Diese
Erfindung nutzt Bindungsmoleküle,
auch als "Liganden" bezeichnet, die
ein Analytmolekül
in Lösung
binden. Normalerweise ist die Bindung nichtkovalent. Bei einer Ausführungsform
der Erfindung kommen zwei Liganden zum Einsatz, die an das gleiche
Analytmolekül
gebunden werden. Bei einer Ausführungsform beispielsweise
binden zwei Antikörper
(Liganden) zwei verschiedene Epitope eines Proteins oder eines makromolekularen
Komplexes. Dies bedeutet, die Antikörper sind mit dem gleichen
Analyt gepaarte Antikörper, jedoch
mit unterschiedlichem spezifischem Bindungsort (Epitop) am gleichen
Analyt. Beim Einsatz im Zusammenhang mit ELISA-Tests werden solche
Antikörperpaare
häufig
als "Fängerantikörper" und "Nachweisantikörper" bezeichnet.
Für die erfindungsgemäße Anwendung
geeignete Antikörper
sind u.a. monoklonale Antikörper,
Bindungsfragmente (z.B. Fab-Fragmente), einkettige Antikörper und
dergleichen. Neben Antikörpern
gehören
zu den geeigneten Liganden Lectine (die speziell Kohlenwasserstoffe
binden) und andere hier beschriebene oder dem Fachmann bekannte
Bindungsmoleküle
(z.B. Biotin, Avidin, Protein A). Ein Inhibitoranalog eines Substrats,
das sich an ein enzymaktives Zentrum bindet, ist ein weiteres Beispiel
für einen
Liganden. Der Begriff Ligand, wie er hier verwendet wird, bezeichnet
keine besondere biologische Funktion außer der selektiven Bindung
an das Analyt. Bestimmte kleine Moleküle (d.h. solche mit einem Molekulargewicht
unter 1000) weisen eine Spezifität
für eine
Klasse von Strukturen auf und sind für Analysezwecke nutzbar. So
haben beispielsweise boronathaltige Verbindungen eine Affinität für Hydroxylgruppen
bei zwei oder mehr benachbarten Kohlenstoffatomen. Boronatkonjugierte
Enzyme, zum Beispiel an alkalische Phosphatase konjugierte Aminophenylboronsäure, können als
Liganden zum Nachweisen von Kohlenwasserstoffen eingesetzt werden
(z.B. sofern die andere Komponente des paarweisen Enzymkonjugats über ausreichende
Spezifität
verfügt,
wie nachstehend beschrieben).
Der
Ligand (die Liganden) ist (sind) direkt oder indirekt an ein Enzym
oder einen anderen Katalysator gebunden oder gekoppelt. Der Begriff "direkte" Bindung, wie er
in diesem Kontext verwendet wird, bedeutet, dass der Katalysator
(das Enzym) kovalent an den Liganden (z.B. Antikörper) gebunden ist. Der Begriff "indirekte" Bindung bezieht
sich auf jedes aus einer Vielzahl von dem Fachmann bekannten Mitteln
für die
kovalente oder nichtkovalente Anlagerung eines Enzyms an ein Bindungsmolekül: Zu den
entsprechenden Beispielen gehören
die Anwendung eines enzymmarkierten sekundären Antikörpers, der einen primären (Antianalyt-) Antikörper bindet,
Biotin-Avidin-vermittelte Bindung und dergleichen. Anders ausgedrückt: Liganden
für die Konjugation
mit den Enzymen umfassen Antikörper,
die für
die zu messenden Analyte spezifisch sind. Die bekannten Ligandenpaare
wie das Avidin-Biotin-Paar können
als sekundäre
Bindungen angewandt werden, um ein vielseitigeres Reagens zu schaffen.
Ein biotinyliertes Nukleotid kann zum Beispiel im Rahmen eines Hybridisierungsassays
eingesetzt werden, wobei ein direkt gebundenes Enzym durch die Temperatur
des Verfahrens inaktiviert werden kann. Nach erfolgter Hybridisierung
kann das Enzym durch Avidin an das hybridisierte Molekül gebunden
werden.
Enzym-Liganden-Konjugate
Bei
bestimmten Ausführungsformen,
bei denen zwei Liganden Anwendung finden, wird jeder der beiden
Liganden an ein Enzym (d.h. einen Proteinkatalysator) mit unterschiedlicher
Substratspezifität
(d.h. einem anderen Enzym) konjugiert. Bei einer Ausführungsform
wird ein Ligand an eine Oxidase und ein zweiter Ligand an eine Hydrolase
konjugiert. Es ist offensichtlich, dass, wenn das betreffende Analyt
eine Hälfte
eines Ligandenpaars und die andere Hälfte an einen Enzymverstärker angelagert
ist, das Analyt indirekt ebenfalls an das Enzym, welches als Verstärker verwendet
wird, gebunden ist.
Oxidaseenzyme
Oxidasen
sind Enzyme, die die Oxidation eines Substrats katalysieren. Jedes
aus einer Vielzahl von Oxidaseenzymen eignet sich für die erfindungsgemäße Anwendung.
Normalerweise kann sich die Oxidase eines fotografischen Entwicklers
als Substrat bedienen. Fotografische Entwickler sind bekanntermaßen lösliche organische
Verbindungen, die durch ihre Anfälligkeit
für Oxidation
durch sensibilisierte Silberionen, nicht jedoch durch unsensibilisierte
Silberionen und die Fähigkeit
gekennzeichnet sind, sich an eine zweite Verbindung mit aktivem
Zentrum zu binden. Praktisch alle fotografischen Entwickler sind
N,N-Alkyl-substituierte Paraphenylendiamine. Zu den geeigneten Oxidasen
gehören
Peroxidasen (z.B. Meerrettichperoxidase, Myeloperoxidase), Galactoseoxidasen,
Zytochromoxidasen, Monoaminoxidasen, Pseudoperoxidasen und andere. Bei
einigen Ausführungsformen,
wie sie hier beschrieben werden, kann das Analyt selbst eine Oxidaseaktivität (d.h.
eine endogene Oxidaseaktivität)
aufweisen. Zu den Beispielen für
solche Analyte mit endogener Oxidaseaktivität gehört die Pseudoperoxidaseaktivität der Hämoglobin-
und Myoglobinmoleküle.
Oxidasesubstrate
Allgemein
kann jedes Oxidasesubstrat, das durch eine Oxidase (z.B. Peroxidase)
in ein zur Kopplung an einen Farbkoppler (hier weiter unten beschrieben)
zur Erzeugung eines löslichen
Reaktionsprodukts fähiges
Produkt umgewandelt wird, im Rahmen der hier offen gelegten Verfahren
Anwendung finden. Zu den geeigneten Substraten gehören diejenigen
mit den gleichen Molekularstrukturen wie die allgemein bekannten
fotografischen Entwickler. Zu den Beispielen von Substraten (die
zuweilen als "Entwickler", "fotografische Entwickler" oder "Farbentwickler" bezeichnet werden)
gehören
N,N-Dimethylparaphenylendiamin;
N,N-Diethylparaphenylendiamin; N-Phenylparaphenylendiamin; N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin; 4-Aminoantipyren
oder N,N-Dimethylaminobenzidin. Eine umfassendere Liste von fünfzig solcher
fotografischer Entwickler ist in Bent et al., 1951, J. Am. Chem.
Soc. 73:3100–24,
zu finden, worauf hier als Gesamteinheit Bezug genommen wird. Weitere,
im Rahmen dieser Erfindung nutzbare Oxidasen und Substrate werden
in der ebenfalls anhängigen
US-Patentanmeldung Nr. 09/0411.352, am 12. April 2001 veröffentlicht
als WO 01/25476, beschrieben, worauf hier für alle Zwecke als Gesamtheit
Bezug genommen wird. Dem Phenylring von Entwickler-Peroxidasesubstraten
können
chemische Gruppen ohne Beeinträchtigung
ihrer Reaktion hinzugefügt
worden sein und einige Gruppen sind bei der Auslegung bestimmter
Assays eine Hilfe. Zum Beispiel ist innerhalb der Fotoindustrie
eine Methylgruppe in ortho-Stellung zum primären Amin bekannt, die eine
Autopolymerisation des oxidierten Entwicklers verhindert. Das Dialkylamin
von N,N-Dialkyl-substituiertem Phenylendiamin kann ebenfalls mit
Nutzen modifiziert werden. Zum Beispiel wird durch Zusetzen einer
Sulphonamidogruppe die Löslichkeit
des schließlichen
Reaktionsprodukts erhöht.
Autopolymerisation
kann als Auslegungsmerkmal angewandt werden, das bei einigen Assays
von Nutzen ist. So hindert die Autopolymerisation zum Beispiel ein
oxidiertes Entwicklermolekül
wirksam daran, sich an einen Farbkoppler zu binden, wenn die Kopplung
nicht unmittelbar nach der Oxidation stattfindet. Die vergleichbaren
Geschwindigkeiten der Kopplung und der Autopolymerisation, zweier
konkurrierender Reaktionen, werden den Diffusionsabstand zur ursprünglichen
Produktion, bei der es zur Farbbildung kommen kann, bestimmen. Wird
die Reaktion jedoch verlängert,
besteht beim autopolymerisierten Entwickler eine Tendenz, sich abzusetzen
und dadurch die optischen Eigenschaften der Lösung in diejenigen einer Suspension
umzuwandeln. Daher ist eine Entwicklerverbindung ohne Methylgruppe
in ortho-Stellung zum primären
Amin für schnelle
Reaktionen nützlicher,
während
eine Verbindung mit einer solchen Methylgruppe bei der Auslegung eines
Assays mit langsamer Entwicklung angewandt wird. Der letztgenannte
Assay dürfte
auch eher einen Fänger
erfordern, wie dies nachstehend beschrieben wird.
Ein
bevorzugter Entwickler ist N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin.
Bei einer Ausführungsform
wird daher N,N-Dialkyl-substituiertes
Phenylendiamin als Substrat in Kombination mit einer Peroxidase
eingesetzt.
Es
ist klar, dass je nach dem Enzym bestimmte Kofaktoren für die Oxidationsreaktion
benötigt
werden. Bei Verwendung eines Peroxidaseenzyms zum Beispiel kommt
auch Wasserstoffperoxid als Kosubstrat für die Oxidationsreaktion zur
Anwendung. Bei Anwendung bestimmter Oxidasen kann Zytochrom C als
Kofaktor erforderlich sein.
Hydrolaseenzyme
Hydrolasen
sind Enzyme, die eine Hydrolysereaktion katalysieren und zum Beispiel
fähig sind,
einen Schutzanteil aus einem Substrat (Farbkoppler) zu beseitigen,
um ein reaktionsfähiges
Produkt (Farbkoppler) zu erzeugen. Beispiele für Hydrolasen sind u.a. Phosphatasen
(z.B. alkalische Phosphatase), Esterasen (z.B. Cholinesterasen,
Carboxylesterase), Galactosidasen (z.B. Alphanaphthol, Betagalactosidase),
Lipasen, Glucuronidasen, Amidasen, Peptidasen und Sulphatasen. Diese
sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. US-Patent Nr. 3.975.237, worauf
in dieser Patentschrift Bezug genommen wird). Bevorzugte hydrolytische
Enzyme sind solche, die bei alkalischem pH-Wert aktiver sind, da
die Fotochemikalien diese Bedingungen vorziehen. Ein aus Gründen der
Wirtschaftlichkeit und kommerziellen Verfügbarkeit besonders bevorzugtes
Enzym ist alkalische Phosphatase.
Hydrolasesubstrate
Zu
den Substraten für
Hydrolasen gehören
u.a. Ester, Amide, Peptide, Ether oder alle chemischen Verbindungen
mit enzymatisch hydrolysierbarer kovalenter Bindung. Die enzymkatalysierte
Hydrolysereaktion führt
zu einem Hydroxyl oder einer Aminverbindung als einem Produkt (sowie
freiem Phosphat, Acetat usw. als einem zweiten Produkt). Gemäß dieser
Erfindung eingesetzte Hydrolaseenzymsubstrate sind solche, die durch
Einwirkung des Enzyms mittels Beseitigung einer Blockierungsgruppe
in einen Farbkoppler umgewandelt werden. Das Vorhandensein der Blockierungsgruppe
verhindert die chemische Zusammenlagerung des Substrats mit dem
oxidierten Entwickler. Normalerweise hat daher das Substrat die
Formel: "R-B", worin "R" ein Farbkoppleranteil ist, "-B" eine Blockierungsgruppe
wie ein Phosphat, ein Sulphat, ein Acetat oder ein Butyrat oder
dergleichen ist, die durch eine enzymspaltbare Bindung (z.B. hydrolasespaltbar)
wie eine Esterbindung (einschließlich eines Phosphatesters
oder eines Sulphatesters) oder eine Amidbindung an den Farbkoppleranteil
gebunden ist.
Das
bevorzugte Substrat für
die Hydrolase ist eine substituierte (geschützte) Phenol- oder Naphtholverbindung
(z.B. ist ein bevorzugtes Substrat für alkalische Phosphatase eine
phosphatsubstituierte Phenol- oder Naphtholverbindung). Die für Histochemie-
und Zytochemie-Anwendungen allgemein bevorzugten Substrate sind
im Sinne dieser Erfindung keine bevorzugten Substrate, da sie dafür ausgelegt
sind, sich in den Geweben oder Zellen zur Lokalisierung der Enzymaktivität abzulagern.
Die für
die vorliegende Erfindung bevorzugten Substrate sind kleinere Moleküle wie 1-Naphtholphosphat
oder Phenylphosphat, die nach der Hydrolyse und auch nach Kopplung
an den bevorzugten Entwickler in Lösung bleiben. Substitutionen
an diesen einfachen Naphthol- und Benzolverbindungen können das
Reaktionsvermögen
oder die Bildung der bevorzugten Farbe ohne Beeinträchtigung
ihrer Anwendung verbessern. So wird beispielsweise durch Substitution
einer Chlorgruppe in der para-Stellung zur Phosphatgruppe eine schnellere
Kopplung und effizientere Reaktion ermöglicht, weil Chlor in der Stellung,
an die der oxidierte Entwickler ankoppelt, als Abgangsgruppe wirkt.
Diese effizienteren Substrate sind mit den in der Fotoindustrie
bekannten 2-Äquivalenten-Kopplern
vergleichbar. (In der Fotoindustrie ist allgemein bekannt, dass
bestimmte Koppler Farbe effizienter erzeugen als andere, d.h. sie
erfordern zur Farbbildung weniger oder mehr oxidierten Entwickler.
Da die Menge des oxidierten Entwicklers von der Anzahl sensibilisierter
Silberionen abhängt,
wirkt sich dies so aus, dass für
einige Koppler mehr sensibilisierte Silberionen benötigt werden
als für
andere. Die effizienteren Koppler sind als 2-Äquivalent-Koppler bekannt,
während
die weniger effizienten Koppler als 4-Äquivalent-Koppler bekannt sind.)
Die Wahl eines Substrattyps mit 2-Äquivalent- oder 4-Äquivalent-Koppler
richtet sich nach der relativen Aktivität der beiden Enzyme in jedem
gemäß dieser
Erfindung beschriebenen spezifischen Assay. So muss sich beispielsweise
bei der Verwendung eines 4-Äquivalent-Kopplers zweimal
so viel aktive Peroxidase in Nähe
der Hydrolase befinden als bei Verwendung eines 2-Äquivalent-Kopplers.
Avidin ist ein tetravalenter Ligand und bei Verwendung einer avidinkonjugierten
Hydrolase werden sich in der Nähe
zahlreiche Ligandenoxidasen befinden und ein 4-Äquivalent-Koppler ist akzeptabel.
Wenn die Enzyme in Liganden-bezogener Nähe im Verhältnis 1:1 vorhanden sind, ist
ein 2-Äquivalent-Koppler
wirksam.
Substrate
für hydrolytische
Enzyme enthalten normalerweise die enzymspezifische Komponente,
die dem Benzol- oder Naphthalenring benachbart ist. Bei verschiedenen
Ausführungsformen
umfasst das Substrat eine substituierte Phenol- oder Naphtholverbindung,
d.h. eine Verbindung, die einen Benzolring oder eine Naphthalenstruktur
mit einer durch die enzymspezifische Substratzusammensetzung geschützten aktiven
Hydroxylgruppe hat, deren Ring mindestens ein Kohlenstoffatom in
einer ortho- oder para-Stellung zu der aktiven Hydroxylgruppe aufweist,
in der die Substitutionsreaktion stattfinden kann. Eine solche ortho-
oder para-Stellung kann durch Wasserstoff oder durch ein Halogen
oder eine andere Gruppe abgedeckt werden, die die Ringstruktur während einer Substitutionsreaktion
ohne weiteres verlässt.
Die substrataktive Komponente ist eine spezifische Struktur, die
bei jedem Enzym unterschiedlich ist. Das Substrat für Sulphatase
kann 1-Naphthylsulphat sein. Das Substrat für jede Caspase ist ein Vieraminosäurepeptid,
das je nach der entsprechenden Caspase unterschiedlich ist, jedoch
stets einen Aspartatrückstand
in Nähe
des Naphthols oder Phenols aufweist. Nach Enzymeinwirkung auf das
Substrat weist das Benzol oder Naphthalen eine freie (ungeschützte) Hydroxylgruppe
an dem Ort auf, wo die spezifische Substratkomponente angelagert
wurde. Das freie Hydroxyl aktiviert die ortho- oder vorzugsweise
die para-Stellung am Ring und erlaubt das Ankoppeln in diesen Stellungen.
Wird ein Halogen, Carboxyl oder eine andere effiziente Abgangsgruppe
in der ortho- oder para-Stellung substituiert, ersetzt das Ankoppeln
in dieser Stellung die Abgangsgruppe während der Kopplungsreaktion
und die Reaktion ist effizienter als in einem nichtsubstituierten
Naphthalen- oder Benzolring. Umgekehrt verhindert ein Nitro- oder
anderer stark bindender Substituent in der ortho- oder para-Stellung
am Phenol das Ankoppeln in dieser Stellung, kann jedoch das Ankoppeln
in der alternierenden para- oder ortho-Stellung erlauben. So wird zum Beispiel
Paranitrophenylphosphat nach dem Spalten des Phosphats zu Paranitrophenol,
das bei oxidierten Entwicklern keinen effizienten Koppler darstellt.
Die "Abgangsgruppe" (leaving group)
verschwindet während
einer Kopplungsreaktion tatsächlich
und die daraus resultierende Farbverbindung hat die gleiche Farbe,
ob nun eine Abgangsgruppe vorhanden war oder nicht. So weisen zum
Beispiel an N,N-Diethylparaphenylendiamin angelagertes 4-Chlor-1-Naphthol
oder 1-Naphthol identische Lichtabsorptionsspektren auf, jedoch
geht das Ankoppeln (gemessen an der Farbentwicklung) des 4-Chlors
wenigstens doppelt so schnell vonstatten.
Die
Naphthol-AS-Substrate, die in der Histochemie vorzuziehen sind,
weil ihre ungeschützten
Reaktionsprodukte in wässrigen
Lösungen
schwer löslich
sind, stellen im Sinne dieses Lösungsassays
keine bevorzugten Substrate dar. Vorzuziehen ist das Gegenteil insofern,
als dass eine Solubilisierungsgruppe wie Sulphonsäure am gegenüberliegenden
Ring zur Hydroxylgruppe, zum Beispiel 8-Hydroxy-1-Naphthalensulphonsäure, eine
stark gefärbte,
sehr leicht lösliche,
gekoppelte Verbindung mit einer sehr scharfen Absorptionsspitze
im äußeren Blaubereich
des Spektrums ergibt. Bei einer äquivalenten
8-Phospho-1- Naphthalensulphonsäure würde keine
Kopplung stattfinden und keine Farbe würde erzeugt. Nachstehende Tabelle
enthält
Hydrolasesubstrate. Die Tabelle nennt Beispiele von Hydrolasen mit
Blockierungsgruppen, die an chromogene Anteile (d.h. Farbkoppler)
konjugiert werden können.
Teil A zeigt die vom Enzym erkannte Hydrolase und Gruppe, die mittels
einer hydrolysierbaren Verknüpfung
("--") an eine chromogene
Gruppe wie die in Teil B der Tabelle dargestellten Gruppen gebunden
wird.
TABELLE 1
Hydrolasesubstrate für Lösungsassays
Die
substratspezifische Komponente wird mittels einer in den folgenden
Tabellen durch zwei Gedankenstriche (--) bezeichneten Bindung an
den chromogenen Koppler gebunden:
Teil A: Hydrolasen und
substratspezifische Komponenten (Beispiele):
1.
Caspasen
| Caspase
1 | Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-- |
| Caspase
3 | Ac-Asp-Glu-Val-Asp-- |
| Caspase
4 | Ac-Leu-Glu-Val-Asp-- |
| Caspase
5 | Ac-Trp-Glu-His-Asp-- |
| Caspase
6 | Ac-Val-Glu-He-Asp-- |
| Caspase
9 | Ac-Leu-Glu-His-Asp-- |
2.
Glycosidasen
| Glucosidasen
(Alpha und Beta) | Glucose-Alpha-
Glucose-Beta- |
| Galactosidasen | Galactose-Alpha-
Galactose-Beta- |
| Glucosaminidase | N-Acetylglucosamin-- |
| Glucuronidase | Glucuronsäure-- |
3.
Peptidasen und Proteinasen
| Collagenase
I | HO-Darg-Gln-Gly-Ala-III-Gly-Gln-Pro-- |
| Elastase
III | Pyr-Pro-Val--
(Pyr = Pyroglutamyl) |
| Trypsin | Benzoyl-DL-Arginin-- |
4.
Esterasen
| Verschiedene | Acetat--
Chloracetat--
Butyrat-- |
5.
Anorganische Esterasen
| Phosphatase | HO(OO)PO-- |
| Sulphatase | HO(OO)SO-- |
Teil B: Chromogene (Koppler-)Komponenten
(-- alle Bindungen über
Hydroxyl- oder Amingruppen)
- Hydroxybenzol (Phenol)
- 4-Chlor-1-hydroxybenzol (4-Chlorphenol)
- 2-Chlor-1-hydroxybenzol (2-Chlorphenol)
- Aminobenzol (Anilin)
- 4-Chlor-1-aminobenzol (4-Chlor-1-aminobenzol)
- 2-Chlor-1-aminobenzol (2-Chlor-1-aminobenzol)
- 1-Naphthol
- 2-Naphthol
- 4-Chlor-1-naphthol
- 8-Hydroxy-naphthalen-1-Sulphonsäure
- 4-Nitrophenol
- 2-Chlor-4-nitrophenol
- 2-Chlor-4-nitro-1-naphthol
- 5-Nitro-8-hydroxynaphthalen-1-Sulphonsäure
Fänger
In
diesem Kontext ist ein Fänger
eine Verbindung mit den chemischen Kopplungsmerkmalen der fotografischen
Farbkoppler, d.h. er wird mit einem fotografischen Entwickler reagieren,
jedoch mit minimalem oder keinem Farbbeitrag zur Lösung in
den Wellenlängen,
bei denen die Messungen vorgenommen werden sollen. Fänger sind
effektive Konkurrenten zur Farbkopplungsreaktion in der gleichen
Lösung,
außer
in dem Bereich, in dem beide Enzyme nahe beieinander liegen, wo
die Konzentration des freien Farbkopplers nach den Erwartungen weit
höher sein
wird. Für
eine einzelne chemische Verbindung besteht die Möglichkeit, unter einigen Assaybedingungen
als Fänger
und unter anderen Assaybedingungen als Farbkoppler wirksam zu werden.
Ein Beispiel ist 8-Hydroxy-1-Naphthalensulphonsäure. Handelt es sich um den
Farbkoppler, wird der damit gepaarte Fänger entweder überhaupt
keine Farbe aufweisen oder es findet eine Absorption im äußeren Rotbereich
des Spektrums statt.
Beispiele
von Fängerverbindungen
sind u.a. 8-Hydroxy-1-Naphthalensulphonsäure; o-Acetoacetanisidid;
Acetoacetamid; Ethylacetoacetat; 1-(4-Hydroxyphenyl)-1H-tetrazol-5-thiol;
3-(2,4,6-trichlorphenyl)-aminopyrazolin-5-on; Tyramin; 3-Hydroxytyramin; 4-Aminoantipyrin;
4-Hydroxyantipyrin; 4-(Hydroxymethyl)-4-methyl-1-phenyl-3-pyrazolidinon;
1-Phenyl-3-pyrazolidinon; wobei Acetoacetamid, 3-(2,4,6-trichlorphenyl)-aminopyrazolin-5-on
und 3-Hydroxytyramin
bevorzugt werden.
Fänger brauchen
nach dem Ankoppeln nicht völlig
farblos zu sein, sondern sollten ein schmales Farbspektrum aufweisen,
das bei sorgfältiger
Auswahl der Messfarbe nicht stört.
Zum Beispiel ergibt ein naphthol- oder phenolhaltiges Substrat beim
Ankoppeln immer eine blaue Färbung
und die Absorption ist im Bereich von 650 bis 690 nm optimal. Ein
Fänger,
der bei 410 bis 450 nm, nicht jedoch oberhalb 600 nm, absorbiert,
wenn er mit dem gleichen Entwickler gekoppelt wird, ergibt ein gut
passendes Paar.
Zu
den nutzbaren Fängern
gehören
chemische Analoge von weißen
Kopplern, wie sie in der Fotografie verwendet werden, sowie lösliche Triazol-
und Tetrazolverbindungen. Weitere weiße Koppler sind zum Beispiel
im US-Patent Nr. 6.013.428 aufgeführt, worauf hier als Quelle
Bezug genommen wird, und diese Verbindungen oder ihre Analoge können als
Fänger
zur Verhinderung unerwünschter
Farbbildung von Nutzen sein. Die an fotografische weiße Koppler
gestellten Anforderungen sind jedoch nicht genau die gleichen wie
die Anforderungen für
den vorliegenden Lösungsassay.
Die für
den erfindungsgemäßen Lösungsassay
bevorzugten Fänger
sind Verbindungen, die nach Kopplung mit dem Entwickler löslich bleiben.
Demgegenüber
ist eine Anzahl der in dem Patent Nr. 6.013.428 aufgeführten Koppler
dafür ausgelegt,
nach der Kopplung eine Diffusion von einer Filmschicht in eine andere
Schicht zu verhindern. Sie besitzen große Kohlenwasserstoffseitenketten, deren
einziger Zweck darin besteht, ihre Wasserlöslichkeit zu verringern. Fänger dieser
Art finden im Rahmen dieser Erfindung im Allgemeinen keine Verwendung.
Die besten Kriterien für
einen effektiven Fänger
gemäß dieser
Erfindung sind u.a. die Wasserlöslichkeit
vor und nach der Kopplung, die Langzeitstabilität in wässrigen Lösungen, keine Farbe vor oder
nach Kopplung im Spektralmessbereich und keine Wechselwirkung mit
den im Assay verwendeten Enzymen.
Analytmolekül mit enzymatischer
Aktivität
Bei
einer alternativen Ausführungsform
der Erfindung besitzt das Analytmolekül die zusätzliche Reaktionseigenschaft
eines der oben beschriebenen Enzyme. Bei dieser Ausführungsform
wird zur Erzielung der bevorzugten Reaktion nur ein enzymkonjugierter
Ligand benötigt.
Wenn sich das enzymgebundene Ligandenreagens an das spezifische
Analyt anlagert, bildet es auf wirksame Weise ein Enzympaar. Ein
Beispiel dafür ist
der Nachweis von Fetalhämoglobin
mit einem Antikörper
zu an alkalische Phosphatase angelagertem Fetalhämoglobin. Fetalhämoglobin
wirkt als Pseudoperoxidase und die Nähe zwischen hydrolytischem
Enzym und Analyt (mit Oxidaseaktivität) erfüllt die hier beschriebenen
Bedingungen.
Bei
einer Ausführungsform
dient als Ligand eine Hydrolase, zum Beispiel alkalische Phosphatase,
die an einen Boronsäureanteil,
zum Beispiel Aminophenylboronsäure,
konjugiert ist. Diese Verbindung lagert sich an glykiertes Hämoglobin
ebenso an wie an andere glykierte Proteine. Allerdings weist nur glykiertes
Hämoglobin
die Pseudoperoxidaseaktivität
auf, um die Nähe
der Reaktionsprodukte zu bewirken, die den Bedingungen gemäß dieser
Erfindung entspricht. Ein nutzbares Assaybeispiel ist der Nachweis
von glykiertem Hämoglobin
in Anwesenheit anderer glykierter Proteine und von glykiertem Hämoglobin
durch Anwendung von Boronatkonjugat einer alkalischen Phosphatase,
da nur das glykierte Hämoglobin
als Ligandenpaar für
Boronat wirkt und ebenso als Enzym wirksam wird. Andere Boronsäureanteile,
zum Beispiel Butylboronsäure,
können ebenfalls
verwendet werden.
Bei
einigen der hier beschriebenen Ausführungsformen kann das Analyt
eine hydrolytische Enzymaktivität
aufweisen. Analyte mit hydrolytischer Aktivität umfassen Komponenten der
Blutgerinnungskaskade von Enzymen, die am programmierten Zelltod
beteiligten Enzyme (Caspasen) und Phosphatasen, die normalerweise
oder während
eines Krankheitsprozesses im Blutplasma zirkulieren können.
Enzym mit Substratbindungsaktivität
Bei
einer besonderen, alternativen Ausführungsform der Erfindung ist
das Analyt ein Enzym. Bestimmte Enzyme lagern ihre Substrate auch
stark an die jeweiligen aktiven Zentren an. Nach Einwirkung auf
das Substrat wird das Produkt freigesetzt. Es können dem Substrat ähnliche
Inhibitorverbindungen synthetisiert werden, die sich sogar noch
stärker
an das aktive Zentrum des Enzyms anlagern und keine anschließende Freisetzung
erlauben. Ist ein solches Enzym das Analyt, kann ein Inhibitor mit
den beschriebenen Merkmalen als Ligand angesehen werden. Ein solcher
Ligand kann direkt oder indirekt an ein gemäß dieser Erfindung als Reagens
eingesetztes Enzym konjugiert werden. Ein Beispiel für einen
solchen Liganden, das von N.A. Thornberry und Y. Lazebnik, 1998,
Science, 281:1312, beschrieben wurde, ist: Biotin-X-Val-Asp(OMe)-CH2F (worin X eine Bindungsgruppe bezeichnet).
Diese Verbindung ist das biotinylierte Derivat des Caspase-Inhibitors
I. Sie kann im Rahmen dieser Erfindung zum Beispiel zusammen mit
avidinkonjugierter alkalischer Phosphatase eingesetzt werden, um
das Hydrolaseenzym indirekt an das Caspaseanalyt zu binden. Ein
vollständiges
Caspaseassay-Konzept würde
auch einen Antikörper
für die
spezifische, an Meerrettichperoxidase konjugierte Caspase enthalten,
wodurch die Substrate auch sowohl mit Phosphatase als auch Peroxidase,
wie weiter oben beschrieben, versorgt würden.
Assayformat-Beispiele
Der
erfindungsgemäße Assay
kann in einer Vielzahl von Formaten ausgeführt werden. Die nachstehende
Beschreibung dient nur der Veranschaulichung und hat keinen einschränkenden
Charakter. Bei einer Ausführungsform
wird eine Platte mit zahlreichen Mulden, zum Beispiel eine Platte
mit 96 Mulden, verwendet. Die beiden für den Nachweis verwendeten
Enzymligandenkonjugate werden etwa im gleichen Verhältnis gemischt,
und zwar normalerweise in Mengen, die so berechnet sind, dass sie
etwa gleich der höchsten
Konzentration des nachzuweisenden Analyts sind oder leicht darüber liegen.
Während
die 96-Mulden-Platte auf einer konstanten, niedrigen Temperatur
gehalten wird, wird die Lösung
des Enzymligandengemischs in Mulden der 96-Mulden-Platte verteilt. In einer Serie
von mindestens 6 Mulden wird eine Serie von Verdünnungen des Analyts bekannter
Konzentration verteilt. Weitere 6 Mulden werden vorzugsweise als
Duplikat für
die Analytverdünnungen
bekannter Konzentration verwendet. In mindestens eine, vorzugsweise
aber mindestens 3 Mulden wird kein Analyt gegeben, sondern stattdessen
wird im gleichen Puffervolumen der gleiche Puffer verwendet, der
für die
Analytverdünnungen
zum Einsatz kommt. Das unbekannte Analyt wird dann in noch weitere
Mulden verteilt. Das unbekannte Analyt wird vorzugsweise für jede Probe
in Duplikatmulden verwendet. Wenn sich alle Proben und Blindproben
in den Mulden befinden, wird die Inkubation für einen Zeitraum fortgesetzt,
der ausreicht, um eine Ligandenbindung zu bewirken, zum Beispiel
normalerweise mindestens 15 Minuten und bis zu 12 Stunden, vorzugsweise
jedoch 30 Minuten, bei der gleichen niedrigen Temperatur.
Am
Ende der Inkubationszeit wird die Entwicklungslösung zugesetzt. Die Pufferkonzentration
aller Komponenten einschließlich
der Entwicklungslösung
liegt im Bereich von 10 bis 200 mM. Die Pufferkonzentration liegt
vorzugsweise im Bereich von 20 mM bis 100 mM und noch bevorzugter
bei 50 mM.
Für alkalische
Phosphatase in Paarung mit Meerrettichperoxidase liegt der pH-Wert
des Puffers im Bereich von etwa 7,4 bis etwa 10,4. Vorzugsweise
liegt der pH-Wert im Bereich von etwa 8,0 bis etwa 9,3 und noch
bevorzugter beträgt
er etwa 8,3. Die Wasserstoffperoxidkonzentration liegt im Bereich
von 0,01 bis 0,1%. Vorzugsweise beträgt der Bereich der Wasserstoffperoxidkonzentration
0,02 bis 0,09% und noch bevorzugter wird Wasserstoffperoxid als
0,03% der endgültigen
Lösung
verwendet. Substrate kommen im Konzentrationsbereich von 50 μM bis 10
mM zum Einsatz. Vorzugsweise kommen die Substratkonzentrationen
als 100 μM bis
5 mM und noch bevorzugter in einer Konzentration von 1,5 mM zum
Einsatz. Die Farbentwicklung wird mit einem Plattenleser gemessen.
Wenn
die Substratpaare das bevorzugte N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin
und Phenylphosphat sind, betragen die bevorzugten Wellenlängen der
Messung 694 nm und 405 nm. Bei Verwendung eines weißen Kopplers
mit leicht gelblicher Farbe, zum Beispiel Acetoacetamid, betragen
die bevorzugten Wellenlängen
der Messung im Plattenleser 694 und 450 nm. Nach Messung am entsprechenden
Wellenlängenpaar,
wird das Messergebnis des unbekannten Analyts mit dem Messergebnis
des Referenzanalyts verglichen und die Konzentration des unbekannten
Analyts wird mit Hilfe geeigneter Standardkurvenverfahren ermittelt.
Bei
der bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird Probenmaterial einer vorgemischten Lösung der
beiden enzymkonjugierten Liganden in Mulden einer 96er Platte zugesetzt.
Etwa eine halbe Stunde lang findet die Inkubation der Probe mit
enzymkonjugierten Liganden statt, bevor die Entwicklerlösung zugesetzt wird.
Die wässrige
Entwicklerlösung
gemäß der bevorzugten
Ausführungsform
enthält
einen fotografischen Entwickler oder eine analoge Verbindung, ein
phosphatsubstituiertes Phenolanalog eines geschützten Farbkopplers, einen weißen Koppler
oder ein Analog desselben, das während
der Reaktionszeit löslich
bleibt, Wasserstoffperoxid und einen Puffer zur Regelung des Säuregrads
der Lösung.
In der Lösung,
die alle diese Komponenten sowie das Enzympaar enthält, findet
eine stetige Farbentwicklung statt. Die bevorzugte Zeit zum Ablesen
der Farbe in einem herkömmlichen
Plattenleser beträgt
ca. 1 Stunde. Je nach spezieller Anwendung und den Reagenzien können Ablesungen
jedoch bereits nach 15 Minuten sowie bis zu 4 Stunden später vorgenommen
werden.
Sets
Die
für die
Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
nutzbaren Reagenzien können
in Set-Form vorgesehen werden. Bei einer Ausführungsform umfasst das Set
einen Behälter
mit gesonderten Phiolen, enthaltend eine oder mehrere der folgenden
Substanzen: (1) ein Hydrolasesubstrat, das zu einem Farbkoppler (wie
einem der hier aufgeführten
speziellen Farbkoppler) hydrolysiert werden kann; (2) einen oxidierbaren
Entwickler (wie einen der hier aufgeführten speziellen oxidierbaren
Entwickler); (3) eine an einen Antikörper konjugierte Hydrolase;
(4) eine an einen Antikörper
konjugierte Oxidase (wie eine hier aufgeführte spezielle Oxidase); (5)
einen Fänger
(wie einen hier aufgeführten
speziellen Fänger);
(6) einen Puffer. Normalerweise sind darin mindestens zwei oder
mindestens drei der oben genannten Reagenzien enthalten.
Beispiele
Alle
hier vorgelegten Beispiele sind Modellversuche mit Verdünnungsserien
eines Analyts. Das dem Versuch zugrunde liegende Analyt wurde in
einer wässrigen
Lösung
gelöst
(im gleichen Puffer, der auch beim Rest des Assays verwendet wurde).
Ein bestimmtes Volumen einer bestimmten Konzentration des Analyts wurde
in eine erste Mulde einer Reihe von 12 Mulden auf einer 96er Platte
gegeben. Ein gleiches Puffervolumen wurde in alle 12 Mulden der
gleichen Reihe gegeben. Nach gründlicher
Vermischung des Analyts und des Puffers in der ersten Mulde wurde
ein Volumenäquivalent
entnommen und in die nächste
Mulde überführt, wo nochmals
gründlich
gemischt wurde. Dieser Prozess der zweifachen Verdünnung wurde
bei allen Mulden mit Ausnahme der letzten oder 12. Mulde fortgesetzt,
die als Blindprobe belassen wurde. Das überschüssige Volumen aus Mulde 11
wurde verworfen, sodass sämtliche
Mulden das gleiche Volumen aufweisen, während die Analytkonzentration
in der Reihe mit 12 Mulden von einem Maximum in der ersten Mulde
(Mulde Nummer 1) bis auf Null in der letzten Mulde (Mulde Nummer
12) variiert.
Beispiel 1. Verdünnungsserie
von Avidin (Analyt) mit biotinkonjugierten Enzymen
Assay-Bedingungen:
Puffer: 50 mM Tris-hydroxymethylaminomethan, mit HCl auf pH 8,3
eingestellt. Der Puffer enthält
auch Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Magnesiumchlorid (d.h. 200
ml der endgültigen
Lösung
enthielten 0,605 g Tris-hydroxymethylaminomethan, 1,15 g NaCl, 0,15
g KCl und 0,1 g MgCl2. Alle in Mulden eingebrachte
Volumen entsprechen 100 μl.
Lösungen von
Avidin, biotinylierter alkalischer Phosphatase (AP-B) und biotinylierter
Meerrettichperoxidase (HRP-B), alle hergestellt von Sigma Chemicals,
St. Louis, MO, wurden als 0,05 mg/ml Stammlösung angesetzt. Die Enzymkonjugate
wurden durch Zusetzen von 50 μl
HRP-B- und 8,5 μl
AP-B-Stammlösungen zu
10 ml Puffer verdünnt.
Diese ersten Stammlösungsverdünnungen
wurden bis zur Verwendung in einem Eisbad oder im Kühlschrank
aufbewahrt und werden nicht als Lösungen von Tag zu Tag erhalten.
Eine
Entwicklerlösung
wurde als 12 ml Puffer, enthaltend 300 μl 3%iges Wasserstoffperoxid,
300 μl einer
50 mM-Stammlösung
von N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin, 150 μl 3-Amino-1-(2,4,6-trichlorphenyl)-2-pyrazolin-5-on
als Fänger
und 300 μl
1-Naphtholphosphat, angesetzt. Alle Reagens-Stammlösungen wurden
als 50 mM-Stammlösungen
angesetzt.
100 μl verdünnte Avidinlösung wurden
der ersten Mulde zugesetzt und gemäß obiger Beschreibung seriell
verdünnt.
Eine genaue Nachbildung dieser seriellen Verdünnung wurde mit dem nächsten Satz
von 12 Mulden durchgeführt.
100 μl verdünntes Enzymgemisch
wurden unmittelbar nach Abschluss der seriellen Verdünnung zugesetzt.
Die präparierte
Platte, in der sämtliche
Mulden Avidin (in unterschiedlichen Konzentrationen) sowie HRP-B
und AP-B in gleich bleibender Konzentration enthielten, wurde für 30 Minuten
auf einer kalten Fläche
abgelegt. Verpacktes und gefrorenes Blaueis, abgedeckt mit mehreren
nassen Papierhandtuchschichten, bietet eine geeignete kalte Fläche. Nach
30-minütiger
Inkubation werden 100 μl
einer Entwicklerlösung
zugesetzt und zum Zeitpunkt des Mischens erfolgt eine Messung. In
der Versuchsphase erfolgen die Messungen im Abstand von 5 Minuten,
um die optimale Auslegungszeit zu bestätigen. Die für diesen
Versuch berichteten Messungen werden 1 Stunde nach dem Zusetzen
des Entwicklers vorgenommen. Die Wellenlänge der Messung ist das Absorptionsvermögen bei
450 nm, subtrahiert vom Absorptionsvermögen bei 694 nm (optische Dichte
694 – 450
mn). Die Wellenlängen
der Messung des Lichtabsorptionsvermögens wurden durch die getrennte
Aufnahme vorläufiger
Lichtabsorptionsspektren von Lösungen
des Reaktionsprodukts des oxidierten Entwicklers mit dem Farbkoppler
und dem Reaktionsprodukt des oxidierten Entwicklers mit Fänger bestimmt.
Als Hauptwellenlänge
wurde eine Filteranordnung auf dem Plattenleser, umfassend das maximale
Absorptionsvermögen
des Entwickler-Koppler-Produkts und das minimale Absorptionsvermögen des
Entwickler-Fänger-Produkts,
gewählt.
Als von der Hauptwellenlänge
zu subtrahierende Wellenlänge
wird eine Filteranordnung gewählt,
bei der beide Verbindungen Minimalablesewerte ergeben.
Messungen
der optischen Dichte wurden auf ein Spreadsheet übertragen und die Ergebnisse
wurden aufgetragen. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt. Daraus ist ersichtlich,
dass die Verdünnungen
von den ursprünglichen
120 Nanogramm in der ersten Mulde bis zur 9. seriellen Verdünnung eine
zufrieden stellende lineare Ordnung aufweisen. Dies entspricht etwas
weniger als 0,5 Nanogramm oder 500 Picogramm Avidin. Da das Molekulargewicht
von Avidin 60 kD beträgt,
liegt die Empfindlichkeit der Messung in der Größenordnung von 0,01 Picomol
des Analyts.
Bei
diesem Versuch beträgt
das Verhältnis
von AP-B zu HRP-B ca. 1:4, da 1-Naphthylphosphat als Farbkoppler
1-Naphthol erzeugt. Unter Assay-Bedingungen
wirkt 1-Naphthol als 4-Äquivalent-Koppler
und daher wird mehr Peroxidase- als Phosphataseaktivität benötigt.
Wird
dieser Versuch wiederholt, dabei jedoch AP-B durch alkalische Phosphatase
ohne Biotin, bei gleicher Aktivität wie sie im AP-B vorläge, ersetzt,
entspricht die Ablesung für
alle Mulden etwa dem Hintergrundwert des obigen Versuchs. Dies bedeutet,
alle Ablesewerte sind so beschaffen, als enthielte die Lösung kein
Avidin, obgleich die Avidinlösungen
dem beschriebenen Versuch entsprechen. Überraschenderweise führen die
erfindungsgemäßen Verfahren
nur dann zu einem effizienten, quantitativen, farbigen Drittreaktionsprodukt,
wenn der erste Ligand und der zweite Ligand an das gleiche Analytmolekül angelagert
werden.
Beispiel 2. Phenylphosphatsubstrat
Für diesen
Versuch gelten gleiche Bedingungen wie in Beispiel 1, außer dass
sowohl AP-B als auch HRP-B mit 50 μl Stammlösung in 10 ml Puffer verwendet
wurden und das Substrat für
AP Phenylphosphat war. Ein weiterer Satz Mulden wird in gleicher
Weise behandelt, außer
dass im Entwickler Polyethylenglykol 600 bei einer Konzentration
von 4% vorhanden war. Die Wellenlängen der Messung betrugen 694 – 405 nm,
da der Phenylkoppler eine andere Spitzenabsorption aufweist und
im Bereich von 400 nm kein Absorptionsvermögen vorliegt. Die Ergebnisse
sind 3 dargestellt.
Die negativen Werte sind auf ein gewisses Absorptionsvermögen des
als Fänger
wirkenden 3-Amino-1-(2,4,6-trichlorphenyl)-2-pyrazolin-5-on in der
405 nm-Region zurückzuführen. Bei
vorläufigen
Versuchen wurde festgestellt, dass für Phenylphosphat die vierfache
alkalische Phosphaseaktivität
erforderlich ist als für
Naphthylphosphat. Da AP auf Phenylphosphat weniger stark wirkt als
auf 1-Naphthylphosphat,
wurden die Enzymverhältnisse
für diesen
Versuch entsprechend angeglichen. Avidin ist ein vierwertiges Molekül. Dies
bedeutet, dass sich vier biotinylierte Moleküle an ein Avidin anlagern können. Infolgedessen
ist es ein gutes Modellanalyt zur Bestimmung der chemischen Wechselwirkungen
und zur Optimierung der Verhältnisse
von Enzym und anderen Reagenzien.
Die
mit Polyethylenglykol 600 erzielten Ergebnisse zeigen, dass andere
Substanzen als die Hauptreagenzien die Reaktion stören können. In
diesem Fall findet eine Verbesserung der Empfindlichkeit statt,
möglicherweise
als Folge von Volumenausschlusseffekten von PEG. Solche Effekte
erklären
sich aus der Verwendung einer Standardkurve.
Beispiel 3. Verwendung
eines farblosen Fängers
mit Phenylphosphatsubstrat
Die
Bedingungen des Versuchs 2 wurden nochmals wiederholt, allerdings
unter Verwendung von Phenylphosphat und mit gleichen Volumenmengen
der Stammlösungen
HRP-B und AP-B. Zusätzlich
wurde der Fänger
gemäß den Versuchen
1 und 2 durch 12, 24 bzw. 48 μl
Acetoacetamid in 2 ml Entwicklerlösung ersetzt. Die Ablesungen
erfolgten bei 650 – 405
nm. Die Ergebnisse liefern eine ähnliche
Regressionskurve wie in 3,
außer
dass die Regression keine negativen Werte aufweist, weil der Fänger mit
oxidiertem Entwickler eine farblose gekoppelte Verbindung bildet.
Siehe 4. Zu beachten
ist, dass überschüssiger Fänger mit
der Hauptfarbreaktion konkurrieren kann, was bedeutet, dass, wenn
alle übrigen
Bedingungen gleich sind, die Verwendung der doppelten Fängermenge
die Farbe auf etwa die Hälfte
reduzieren wird, da der Fänger
in allen Richtungen konkurriert. Die optimale Fängerkonzentration kann so eingestellt
werden, dass Hintergrundfarbe "ohne
Blindproben" wegfällt und
dennoch bei vorhandener Probe maximale Farbe erzeugt wird.
Diese
Modellversuche sollen demonstrieren, dass die Bedingungen eines
Versuchsmodells passend zu den Anforderungen eines speziellen Assays
variiert werden können.
Die Versuchsbedingungen sind vielseitig genug, um die Anforderungen
von Assays mit biologischen Analyten zu erfüllen.
Beispiel 4. Verdünnungsserie
eines biologischen Analyts geringer Konzentration
Granulocyt-Monocyt-Kolonien
stimulierender Faktor (GM-CSF), mit HRP konjugierter Antikörper für GM-CSF
und ein mit AP konjugierter zweiter Antikörper gegen GM-CSF wurden von
R & D Systems,
Minneapolis, MN, bezogen. GM-CSF und Antikörper wurden als Stammlösungen (0,05
mg/ml) in Tris-Puffer mit auf pH-Wert
7,4 eingestellten Natrium-, Kalium- und Magnesiumchloriden angesetzt.
200 ml der endgültigen
Pufferlösung
enthalten 0,605 g Tris-Hydroxymethylaminomethan, 1,15 g NaCl, 0,15
g KCl und 0,1 g MgCl2.
Eine
Verdünnungsserie
von GM-CSF, wie oben beschrieben, wurde angesetzt, deren Konzentration
in Mulde Nummer 1 von 40 ng/100 μl
reichte und die in den Mulden 2–11
(wobei Mulde 12 als Blindprobe diente) 1:1-Verdünnungen im Puffer aufwies.
Dem Endgemisch wird Antikörper
mit 50 μl
von jeder Stammlösung
in 10 ml Puffer zugeführt.
(Alle biologischen Substanzen werden mit 0,05 mg/ml als Stammlösung angesetzt.
Die Verdünnung
für diesen
Versuch betrug 50 μl
in 10 ml, d.h. eine 200fache Verdünnung gegenüber der Stammlösung, bevor
jeder Mulde 50 μl
zugesetzt wurden. Dies entspricht 6,25 ng/Mulde.)
Der
Entwickler war der gleiche wie in Versuch 3, mit Acetoacetamid als
Fänger
und Phenylphosphat als Substrat, außer dass der pH-Wert des Entwicklers
auf 10 eingestellt wurde. Als der Entwickler jeder Mulde zugesetzt
wurde, betrug der End-pH-Wert 8,3. Somit lag die Ligandeninkubation
bei pH 7,4 und die Farbentwicklung bei pH 8,3. Die in 5 dargestellten Ergebnisse
wurden nach Inkubation über
Nacht gemessen. Ähnliche
Ergebnisse wurden jedoch mit kürzeren
Inkubationszeiten bei Raumtemperatur (z.B. 1–2 Stunden) erzielt. Die Farbentwicklung
erfolgte über
eine Stunde. Wiederum zeigen die Ergebnisse in der grafischen Darstellung
eine Regression der Dosisreaktion.
Dieser
Versuch hat eine Empfindlichkeit auf ca. 0,04 Nanogramm, entsprechend
0,025 Picomol, weil die Molekülmasse
von GM-CSF ca. 14.000 D beträgt.
Beispiel 5. Prozentuale
Bestimmung des glykierten Hämoglobins
in einem Lösungsassay
In
diesem Beispiel war der verwendete Puffer ein anderer als in den
Beispielen 1–4,
da Tris-Puffer für den
Liganden, Aminophenylboronsäure,
als Konkurrent wirkt. Das Analyt, glykiertes Hämoglobin, und ein Kontrollprotein,
unglykiertes Hämoglobin,
wurden mittels Säulenchromatographie
angesetzt. Die Säule
wurde mit Aminophenylboronsäureagarose
der Firma Isolab gefüllt.
Die Säule
wurde mit verdünnter
Salzsäure
gewaschen und anschließend
mit 100 mM Glycylglycin (GG)-Puffer mit pH 9,0 ausgeglichen. Vollblut
wurde mit Triton-X 100 (als Hämolysiermittel)
enthaltendem GG-Puffer hämolysiert.
Das Lysat wurde in der Säule
geschichtet und 5 Minuten stehen gelassen, in welcher Zeit sich
das glykierte Hämoglobin
in der Blutprobe an die Boronagarose anlagert. Die erste Fraktion,
das unglykierte Hämoglobin,
wurde dann mit GG-Puffer bei pH 9,0 eluiert. Die Spitze dieser Fraktion
wurde isoliert und zur weiteren Verarbeitung konserviert. Die zweite
Fraktion wurde dann mit 50 mM Sorbitol enthaltendem Tris-Puffer
bei pH 8,6 eluiert. Die Spitze wurde zur weiteren Verarbeitung ebenfalls
gesammelt. Die Säule
wurde dann mit verdünnter
Salzsäure
aufgefrischt und nochmals mit GG-Puffer ausgeglichen. Die erste
Fraktion wurde wiederum über
die gleiche Säule
gelegt, um sicherzustellen, dass kein glykiertes Hämoglobin
zurückgeblieben
war. Nach erfolgter Elution werden diese erste Fraktion und die
zweite Fraktion in einem großen
Volumen GG-Puffer dialysiert und anschließend wieder mit Polyethylenglykol
in GG-Puffer außerhalb
des Dialysebeutels konzentriert. Dieses Verfahren ergab eine Lösung von
0% Glykohämoglobin
(Hb) und eine Lösung
von 100% Glykohämoglobin
(GHb) in GG-Puffer.
Mit
Aminophenylboronsäure
(AP-Bor) konjugierte alkalische Phosphatase wurde von R & D Systems, Minneapolis,
MN, bezogen. Die Stammlösung
von AP-Bor wurde
mit 0,05 mg/ml in GG-Puffer mit Magnesiumchlorid angesetzt.
In
dem Modellassay werden die Fraktionen GHb und Hb zunächst zu
Lösungen
gleicher optischer Dichte angesetzt, indem sie jeweils um einen
Faktor von ca. 20 verdünnt
werden und die Hb-Fraktion zur Einstellung auf den OD-Wert der GHb-Fraktion
weiter verdünnt
wird. Diese gleichen OD-Lösungen
wurden dann im Verhältnis
gemischt, um ein Verhältnis
GHb zu Gesamthämoglobin
von 0, 5, 15, 33, 50, 66,7 und 100% zu erzielen. In einem Parallelversuch
wurden eine Gefrier-Pool-Patientenprobe mit vom Lieferanten (Primus
Corporation, Kansas City, MO) ermittelten Hb/GHb-Werten auf ähnliche
Weise verwendet. Diese Proben haben einen bekannten GHb-Wert von
6,4, 7,5, 10, 12, 13,7 und 18,9%, was den klinisch zu erwartenden
Bereich abdeckt.
Wenn
50 μl jeder
im vorstehenden Abschnitt beschriebenen Analytprobe in Einzelmulden
einer 96er Platte gegeben wurden, beträgt die optische Dichte bei
540 – 694
nm ca. 0,15 OD. Dieser erste Muldeninhalt wird dann seriell mit
Puffer doppelt verdünnt
und die Nutzverdünnungen
sind die durch vorläufige
Versuche festgestellten ersten 4 oder fünf. Die optische Dichte aller
Verdünnungen
wurde vor der weiteren Behandlung aufgezeichnet. Diese 96er Muldenplatte
verblieb bis zum Zusetzen des Entwicklers auf einer kalten Fläche.
Eine
AP-Bor-Lösung
wurde aus der Stammlösung
durch Zusetzen von 25 μl
Stammlösung
zu 10 ml GG-Puffer und Mischen weiter verdünnt. Diese Lösung verblieb
bis zur Verwendung in einem Eisbad. 100 μl AP-Bor (verdünnt) wurde
jeder Mulde der 96er Muldenplatte zugesetzt. Die Inkubationszeit
betrug 40 Minuten.
Die
Entwicklerlösung
wurde aus 11 ml GG-Puffer angesetzt; dem 1 ml 50 mM-Acetoacetamid,
300 μl 3%iges
Wasserstoffperoxid und jeweils 300 μl 50 mM Naphthylphosphat und
N'-Ethyl-N'-ethyl-(2-methylsulfonamidoethyl)-2-methyl-1,4-phenylendiamin
zugesetzt wurden. Dieser Puffer wurde für jeden Assay ebenfalls frisch
angesetzt und bis zur Verwendung kalt gehalten. Nach Beendigung
der Inkubationszeit wurden jeder Mulde 100 μl zugesetzt. Die Platte wurde
auf einen Plattenleser gelegt und die optische Dichte dreißig Minuten lang
bei 694 – 490
nm in Abständen
von 5 Minuten kontrolliert. Die Ergebnisse des Assays mit gereinigtem GHb
und Hb sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Ergebnisse des Assays
mit Gefrier-Pool-Humanproben der Firma Primus Corporation sind in
Tabelle 3 dargestellt. Daraus ist ersichtlich, dass der Assay die
Linearitätsanforderungen
erfüllt,
was sowohl ein Beweis für
die Genauigkeit als auch die Reproduzierbarkeit ist. Tabelle
2. OD 694 – 490
nm GHb, verdünnt
mit Hb Entwicklung wie in Beispiel 5. Auf 0 GHb normalisiert
Tabelle
3. Glykiertes
Hämoglobin
in %, bestimmt durch Lösungsassay
unter Verwendung von Gefrier-Pool-Patientenproben
Es
versteht sich, dass die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen
nur der Veranschaulichung dienen und dass dem Fachmann beim Lesen
verschiedene Modifikationen oder Veränderungen in den Sinn kommen
werden.
