DE2016555C3 - Verfahren zur kolorimetrischen oder photometrischen Bestimmung von Bilirubin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kolorimetrischen oder photometrischen Bestimmung von Bilirubin, bei der die Farbe des durch Kupplungsreaktion eines Azoreagens mit Bilirubin gebildeten Azobilirubins gemessen wird

Bilirubin ist eine orangefarbene oder gelbliche, im Blutserum vorliegende Substanz oder ein Pigment, welches aus dem Hämoglobin der roten Blutkörperchen gebildet wird und welches auf Grund des normalen oder des auf einige Körperzustände zurückzuführenden Zerfalls der roten Blutkörperchen gebildet wird.

Physiologisch wird offenbar das Bilirubin durch die Leberzellen in die Galle ausgeschieden. Bei normalen Körperzuständen ist der Metabolismus des Bilirubins ein normaler Prozeß; und aus diesem Grunde ist immer eine kleine Menge Bilirubin im Blutserum anwesend.

Bilirubin tritt in dem Blut in zwei Formen auf, und zwar erstens in der freien oder unkonjugierten Form und zweitens als Bilirubinglucuronid oder konjugiertes Bilirubin. Unkonjugiertes Bilirubin wird als Zersetzungsprodukt der Erythrozyten gebildet und wird konjugiert und durch die Leber in die Galle ausgeschieden.

Die spezifische Bestimmung der beiden Bilirubintypen ergibt eine diagnostische Information, die zum Unterscheiden von verschiedenen krankhaften Zuständen, insbesondere von Gelbsuchterkrankungen, herangezogen werden kann. Weil Bilirubin beispielsweise infolge des Zerfalls der roten Blutkörperchen oder der Hämolyse gebildet wird, werden bei hämolytischen Zuständen erhöhte Niveaus an unkonjugiertem Bilirubin wahrgenommen. Hier ist eine der bekanntesten die hämolytische Erkrankung von Neugeborenen infolge

Rhesusunverträglichkeit Die Bilirubinprobe ist eine Hilfe bei der Diagnose dieser Erkrankung, noch wichtiger ist sie jedoch, um den Verlauf dieser Erkrankung zu verfolgen, weil bei einem Bilirubinniveau von annähernd 20 mg/100 ml Serum eine permanente Gehirnzellenzerstörung auftreten kann. Um dies zu verhindern, wird eine Blutaustauschtransfusion durchgeführt Da jedoch durch die Blutaustauschtransfusion das kindliche Leben stark gefährdet und die Gehirnzellenzerstörung im Bereich des Möglichen liegt, ist es besonders notwendig, dem Arzt eine genaue und zuverlässige Bilirubinprobe in die Hand zu geben, auf die er seine Entscheidungen stützen kann.

Die Menge an jedem Bilirubintyp wird ebenfalls benutzt um verschiedene Typen von Lebererkrankungen zu unterscheiden. Bei diesen Lebererkrankungen, bei denen die Leberzellen zerstört werden, sind die Zellen nicht mehr in der Lage, Bilirubin zu konjugieren, und unkonjugiertes Bilirubin häuft sich in dem Blut an. Bei diesen durch obstruktive Prozesse (wie Steine, Turnorc und andere raumbeanspruchende Schädigungen) gekennzeichneten Lebererkrankungen ist die Leber nicht mehr in der Lage, Bilirubin auszuscheiden, und in dem Blut erscheint ein größerer Anteil an konjugiertem Bilirubin.

Konjugiertes Bilirubin wird als direkt reagierendes Bilirubin gemessen, und unkonjugiertes Bilirubin wird quantitativ bestimmt, indem das Gesamtbilirubin gemessen wird, von dem das direkt reagierende Bilirubin subtrahiert wird. Deshalb ist für die quantitative Bestimmung sowohl des unkonjugierten als auch des konjugierten Bilirubins eine genaue direkte Reaktionsprobe erforderlich.

Als Beispiel für die Wichtigkeit die lange Zeit der genauen Messung des Direktbilirubins zugemessen wurde, haben Duei (H. Duci und C. J. Watson, J. Lab. CHn. Med, 30,293 (1945), N ο s s I i η (Scand. J. CHn. Lab. Invest, 12, Supp. 49, 1 — 176 (I960)) und S. R. Gambino (Manual on Bilirubin Assay (American Society of Clinical Pathologists, 1963) unabhängig voneinander gefunden, daß ein Drittel der abnormalen Bilirubinprobleme ausgeschaltet werden, wenn die direkte Reaktion nicht durchgeführt wird. Darüber hinaus ist es natürlich nicht möglich, die Erkrankungstypen zu unterscheiden, selbst wenn das abnormale gesamte Bilirubinniveau festgestellt wird, wenn nicht die insgesamte Probe eine Unterscheidung zwischen dem direkt reagierenden im Gegensatz zu dem indirekt reagierenden Bilirubin ergibt.

Die Bilirubinprobe wird auch an amniotischer Flüssigkeit vorgenommen, die den Fötus in dem Uterus umgibt und sie wird zur Erkennung des Grades der Erythroblastose in dem Fötus benutzt. Wenn die Probe schwere Erkrankungen anzeigt wird eine Frühgeburt künstlich eingeleitet und der Erkrankungsprozeß durch Austauschtransfusion gestoppt Selbstverständlich ergibt sich durch die Belastung der künstlich eingeleiteten Frühgeburt ein Risiko für das kindliche Leben, und der Arzt braucht eine genaue Bilirubinprobe, um seine Entscheidung zu treffen. Die amniotische Flüssigkeit ist ein besonders anspruchsvolles Versuchsobjekt für diese Probe, weil sie neben Bilirubin auch große Mengen an anderen Hämolyseprodukten enthalten kann, die sich möglicherweise mit der Bilirubinprobe überschneiden.

Die ersten Methoden zur quantitativen Bestimmung des Bilirubins bestanden darin, daß seine gelbe Farbe im Vergleich mit gelben Standardlösungen mit visuellen Mitteln beobachtet wurde. Diese Methode ist. wenn sie

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auch bei höheren Niveaus einigermaßen brauchbar ist nur halbquantitativ und erbringt deshalb nicht die gewünschte erforderliche Genauigkeit Außerdem ist die visuelle Beobachtung auch durch die Tatsache weniger genau, daß das Serum eine Reihe von gelben Pigmenten, wie Carotin, enthält deren Farbe das Auge nicht von der des Bilirubinpigments unterscheiden kann; und weil dieses Pigmentniveau im normalen Serum zwischen 40 und 95% des gelben Pigments schwankt ist eine derartige Schätzung außerordentlich grob und to unzuverlässig. Darüber hinaus ist auf diese Weise keine Unterscheidung zwischen konjugiertem und unkonjugiertem Bilirubin möglich.

Zur Messung des gelben Pigments können spektrophotometrische Methoden angewendet werden, aber da Bilirubin selbst in Abhängigkeit von anderen Bestandteilen des Serums bei verschiedenen Wellenlängen absorbieren kann, so sind solche Messungen ohne spezielles Gerät kompliziert

Vor langer Zeit J1883) hat E h r 1 i c h die Diazoreaklion für Bilirubin eingeführt Bei dieser Reaktion wird Azosulfanilsäure zur Bildung von Azobilirubin verwendet Ehrlich zeigte, daß sich Azobilirubin als Indikator verhält der bei stark sauren und bei alkalischen pH-Werten blau und in der Nähe des Neutralbereiches rot erscheint

Van der Berg und M u 11 e r, andere frühe Forscher auf diesem Gebiet demonstrierten 1916, daß in dem Serum zwei Typen von Bilirubin unterschieden werden können an Hand der Tatsache, daß eine direkte Reaktion innerhalb i'.wa einer Minute in Abwesenheit von Alkohol sowie eine indirekte Reaktion, die den Zusatz von Alkohol erfordert, ablaufen. Die erstere ist jetzt hauptsächlich zum Messen von konjugiertem Bilirubin und die letztere von konjugiertem und J5 unkonjugiertem Bilirubin bekannt

Die Verwendung von Alkohol zum Ingangsetzen der Reaktion des unkonjugierten Bilirubins ist deshalb kompliziert weil Alkohol Protein ausfällt; und Bilirubin kann mit dem Protein mitgefällt werden, so daß es für -to die nachfolgende Bilirubinmessung in der überstehenden Flüssigkeit nicht mehr zur Verfügung steht so daß die Messung einen negativen Fehler aufweist A. A d 1 e r und L S t r a u s s (Klin. Wochschr. 2,2285 (1922) und Z. Ges. Exp. Med, 44,43 (1925)) berichteten bereits (1922), daß viele Stoffe die Diazokupplung von unkonjugiertem Bilirubin in Gang setzen und daß viele von diesen wasserlöslich sind. 1937 führten H. T. M a 11 ο y und K. A. Evelyn (J. Biol. Chem. 119, 481 (1937)) ein Verfahren ein, bei dem Methanol in einer Endkonzen- so tration von 50% verwendet wird, um die Proteinausfällung auszuschalten; und obwohl noch zahlreiche Schwierigkeiten auftraten, wie infolge von Spektralverschiebungen, Trübungen und langsamem Reaktionsablauf, fand das Verfahren weitverbreitete Aufnahme, weil es mit einem Standard in Chloroform (im Gegensatz zu einem schwierig zu bereitenden Standard in Serum) angewendet werden kann, und es wird in vielen, wenn nicht den meisten, klinischen Laboratorien heutzutage benutzt mi

L Jendrassik und P. Grοf (Biochem., 2.297, 8 (1938)) entwickelten eine Methode, nach der die rote Azobilirubinfarbe wie bei den vorstehend erläuterten Methoden gebildet und dann Alkali zugesetzt wird, um das rote Azobilirubin in die blaue Form umzuwandeln. <" Die blaue Farbe ist erwünscht weil in diesem Bereich weniger interferierende Pigmente vorliegen. Trotz dieses Vorteils erfordert dieses Verfahren einen Standard in Protein, der nicht handelsüblich ist und der im Labor schwierig zu bereiten ist

Da außerdem unkonjugiertes Bilirubin selbst bei Abwesenheit eines Ingangsetzen, wie Alkohol, reagiert, wenn alkalische Bedingungen herrschen, kompliziert die Umwandlung zum alkalischen Bereich die Messung des konkugierten Bilirubins. Aus diesem Grunde wurde dem Gemisch vor dem Alkalischmachen Ascorbinsäure zugesetzt um die Reaktion des unkonjugierten Bilirubins in dem direkten Verfahren zu verhindern.

Mit der einige Jahre zurück liegenden Entwicklung handelsüblicher Bilirubinstandards in Serum ist die weitverbreitete Anwendung der Malloy-Evelyn-Methode seit etwa 1945 (d.h. die Verwendbarkeit mit einem Bilimbinstandard in Chloroform, der im Labor hergestellt werden konnte) ausgeschaltet T. K. W i t h (Acta Physiologica/Scandinavica, 10, 181 — 192 (1945) und Lancet, 618(1962))und J. Fοg (Scand. J.CHn & Lab. Invest, 10,241 -256 (1958)) haben längst die Oberlegenheit der Jendrassik-Grof-Methode gegenüber den anderen aus der Literatur bekannten erkannt D. Watson (Clin. Chem, 7,603-625 (1961)) wies darauf hin, daß die günstigen Berichte von With und Fog nicht ausreichend zur Kenntnis genommen worden sind und daß eine gute Methode, nämlich die von Jendrassik und G r ο f, nicht angewendet wird. Den einzigen Nachteil der Jendrassik-Grof-Methode sieht er in der geringen Empfindlichkeit gegenüber Hämoglobin.

Auch S. R-Gambioo empfahl in dem weitverbreiteten »Manual on Bilirubin Assay« (American Society of Clinical Pathologists, 1963) dringend die Jendrassig-Grof-Methode gegenüber den anderen Methoden einschließlich der von M a 11 ο y und Evelyn und wies darauf hin, daß die Hämoglobininterferenz der Jendrassik-Grof-Methode geringer ist als bei der von M a 11 ο y und Evelyn.

Trotz all dieser Empfehlungen ist die Jendrassik-Grof-Methode nicht die in den klinischem Laboratorien am meisten angewendete. Der Grund dafür ist daß bei dem Verfahren Ascorbinsäure erforderlich ist, die instabil und nicht einmal einen Arbeitstag lang verwendbar ist Wenn deshalb Ascorbinsäure für eine längere Zeit als ihre kurze Stabilitätsdauer bereitet wird, so werden die Tests unzuverlässig; wenn sie nämlich instabil wird, blockiert sie nicht mehr genau und folgerichtig die Reaktion des unkonjugierten Bilirubins, wenn das direkte Bilirubinverfahren durchgeführt wird, und setzt die Interferenz des Hämoglobins nicht mehr genau und folgerichtig auf ein Minimum herab. Sie kann vielleicht, wenn sie bereits instabil ist, versehentlich verwendet werden, entweder aus mangelnder Sorgfalt oder unvermeidlich oder aus Nachlässigkeit und dann wird der Durchführende seine Beobachtungen falsch auswerten. Möglicherweise weiß der Arzt auch gar nicht, daß seine Rückschlüsse fehlerhaft sind. Wenn auch für die meisten Prozeduren im klinischen Laboratorium Vergleichsproben zur Verfügung stehen, so ist doch für das direkt reagierende Bilirubin kein Vergleichsserum bekannt Am besten ist es noch, wegen der außerordentlich kurzen Stabilitätsdauer der Ascorbinsäure zusätzliche Kosten in Kauf zu nehmen, indem man diese häufig in kleinen Ansätzen bereitet; daß die nicht verwendeten Teile des Ansatzes nach kurzer Zeit verworfen werden müssen, bedeutet einen weiteren Nachteil und unnötige Kosten.

Wenn auch die meisten Typen von Bilirubinprobemethoden zur Erläuterung diskutiert wurden, so gibt es

doch noch eine Anzahl, die sich mit kleineren Abwandlungen auf diese beziehen, wobei sie sich hauptsächlich im Typ der Verbindung unterscheiden, die zum Ingangsetzen der Reaktion des unkonjugierten Bilirubins mit einer Azoverbindung eingesetzt werden, sowie in dem Typ der verwendeten Azoverbindung. Nachdem A. A d 1 e r und L. S t r a u s s (KUn, Wochschr, 2,2285) 1922 berichtet haben, daß viele Substanzen die Diazokupplung von unkonjugiertem Bilirubin in Gang setzen, wurde eine Vielzahl von Substanzen verwendet, wie Harnstoff, Coffein, Natriumbenzoat u. dgl.

Erfindungsgemäß wurde nun ein Bilirubinbestimmungsverfahren entwickelt, bei dem, ausgehend von dem Verfahren der eingangs genannten Art der Reaktionslösung nach Ausbildung des Azobilirubins zum Unterbinden der Reaktion des unkonjugierten Bilirubins eine saure Hydroxylaminlösung zugesetzt wird

Die Hydroxylaminlösung wird dabei durch Auflösen eines sauren Hydroxylaminsalzes, vorzugsweise Hydroxylaminhydrochlorid, in Wasser bereitet, und die Farbe des Azobilirubins wird nach Zusetzen von Alkali gemessen. Es wird dabei entsprechend tier Jendrassik-Grof-Methode verfahren, wobei die saure Hydroxylaminlösung der Reaktionsmischung an Stelle von Ascorbinsäure zugesetzt wird. Dabei weist die Hydroxylaminlösung vorzugsweise eine mindestens 1,3-molare Konzentration an Hydroxylamin auf.

Das Bestimmungsverfahren nach der Erfindung beruht darauf, daß bestimmte Hydroxylaminsalze die Azobilirubinfarbe nach ihrer Bildung stabilisieren, Hämolyseinterferenzen ausschalten und die Reaktion von unkonjugiertem Bilirubin nach Zusatz von Alkali unterbinden. Dadurch kann auf den nachteiligen Einsatz von Ascorbinsäure verzichtet werden.

Wenngleich auch eine Hydroxylaminverbindung, wenn durch sie die bei der Bilirubingruppe verwendete Ascorbinsäure ersetzt wird, in einer der Konzentration der Ascorbinsäure äquimolaren Konzentration auch nicht vollständig die Reaktion von unkonjugiertem Bilirubin nach Zusatz von Alkali bei dem Verfahren unterdrückt, so wurde doch gefunden, daß eine erheblich erhöhte Hydroxylaminkonzentration, die einige Male größer ist als die der gewöhnlich verwendeten 0,24-molaren Ascorbinsäure, zu diesem gewünschten Effekt führt

Während auch außerdem sowohl Ascorbinsäure als auch Hydroxylamin unter einigen Bedingungen Reduktionsmittel sind, so sind sie doch grundlegend unterschiedliche Verbindungen, wobei Ascorbinsäure eine organische Verbindung und Hydroxylamin ein anorganisches Salz ist Außerdem sind andere Reduktionsmittel en'weder wirkungslos oder nur teilweise wirksam oder haben, selbst wenn sie die Reaktion von unkonjugiertem Bilirubin wirksam unterdrücken, andere unerwünschte Eigenschaften, indem sie beispielsweise eine interferierende Farbe entwickeln, die bei der quantitativen Bestimmung irrtümlich dem Bilirubin zugerechnet wird.

Die insgesamte Kombination von einigen Eigenschaften wird durch die Verwendung der nachstehend noch erläuterten HydröXyläminVerbindungen erreicht. Das heißt, die Eigenschaften, gegenüber den sauren Bedingungen in der ersten Stufe der direkten Reaktion verträglich zu sein, bei dem stark alkalischen pH-Wert der zweiten Stufe der Reaktion wirksam zu sein, mit Azoverbindungen oder beim Zusammenkommen mit Luft während der Untersuchung keine gefärbten Komplexe zu bilden, beim Aufbewahren in Lösung stabil und billig erhältlich zu sein, sind Hydroxylerninverbindungen in Lösung eigentümlich, wenn sie unter sauren Bedingungen in mindestens 1,3-molarer Konzentration gelagert werden, wenn sie in denselben Anteilen wie die Ascorbinsäure bei dem Jendrassik-Grof-Verfahren angewendet werden.

Wenn auch Hydroxylamin erfolgreich bei Bilirubinproben in Verbindung mit anderen Ingangsetzen! und in

to Verbindung mit anderen Azoverbindungen eingesetzt werden kann, so wird doch die Erfindung nachstehend an Hand der Methode vom Jendrassik-Grof-Typ beispielsweise erläutert

Reagentien

Hydroxylaminreagens: Die verwendete Hydroxylaminverbindung ist Hydroxylamin-hydrochlorid in 1,6-molarer Konzentration.

Coffein-Reagens; 20 g Coffein, 30 g Natriumbenzoat und 50 g Natriumacetat werden in 400 ml destilliertem Wasser von 50 bis 60° C gelöst

Sulfanilsäure-Reagens: 15 m! konzentrierte HC! und 5 g Sulfanilsäure werden 500 ml destilliertem Wasser zugesetzt, worauf mit destilliertem Wasser auf 11 aufgefüllt wird.

Natriumnitrit: 100 g Natriumnitrit werden in 11 destilliertem Wasser gelöst

Fehling(II)-Reagens: 100 g Natriumhydroxid und 350 g Natrium-Kalium-Tartrat werden in 1 1 destilliertem Wasser gelöst

Bereitung des Diazo-Reagens: 0,02 ml (20 Mikroliter)

der vorstehend beschriebenen Natriumnitritlösung werden 3 ml des Sulfanilsäure-Reagens zugesetzt Diese

Lösung wird bei den nachfolgenden Probeverfahren

innerhalb einer Stunde nach ihrer Bereitung verwendet

Probeverfahren

Es sind zwei Röhrchen zu markieren, nämlich das eine mit »direkt« und das andere mit »gesamt«.

a) Makroverfahren

1. 2,4 ml 0,05%iger HCI werden in das mit »direkt« markierte Röhrchen eingegeben.

2. 2,4 ml Coffein-Reagens werden in das mit »gesamt« markierte Röhrchen eingegeben.

3. Mit den Inhalten jeden Röhrchens werden jeweils 03 ml Serum oder Plasma versetzt und vermischt.

4. Mit den Inhalten jeden Röhrchens werden jeweils 0,2 ml Diazo-Reagens versetzt und vermischt. Es wird zwei Minuten stehengelassen.

5. Mit den Inhalten jeden Röhrchens werden jeweils 0,1 ml Hydroxylamin-hydrochlorid-Reagens versetzt und vermischt

6. Mit den Inhalten jeden Röhrchens werden jeweils 13 ml Fehling(II)-Reagens versetzt und vermischt Jedes Röhrchen wird gegen eine Wasserblindprobe bei 600 m;ι abgelesen.

b) Mikroverfahren

Dieses Verfahren ist für Spektrophotometer mit einem minimalen Ablesevolumen von nicht mehr als 2 ml geeignet, wie für einen vom Typ Coleman Jr. unter Verwendung einer 12 χ 75 mm-Kuveite.

1. 1,1 ml Coffein-Reagens wird in das mit »gesamt« b5 markierte Röhrchen eingegeben.

2. Zur Messt ng von direkt reagierendem Bilirubin wird 1,1 ml 0,05-n-HCI in das mit »direkt« markierte Röhrchen eingegeben.

3. In jedes Röhrchen werden jeweils 0,05 ml (50 Mikroliter) Plasma oder Serum gegeben.

4. Die Inhalte beider Röhrchen werden jeweils mit 0,1 ml Diazo-Reagens versetzt und vermischt. Es wird zwei Minuten stehengelassen.

5. Die Inhalte beider Röhrchen werden jeweils mit

0,1 ml Hydroxylamin-hydrochlorid-Reagens versetzt und vermischt.

6. Die Inhalte beider Röhrchen werden jeweils mit 0,7 ml Fehling(H)-Reagens versetzt und vermischt. Es wird gegen eine Wasserblindprobe bei 600 πιμ abgelesen.

Claims (6)

Patentansprüche;

1. Verfahren zur kolorimetrischen oder photometrischen Bestimmung von Bilirubin, bei der die Farbe des durch Kupplungsreaktion eines Azoreagens mit Bilirubin gebildeten Azobilirubins gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionslösung nach Ausbildung des Azobilirubins zum Unterbinden der Reaktion des unkonjugierten Bilirubins eine saure Hydroxylaminlösung zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxylaminlösung durch Auflösen eines sauren Hydroxylaminsalzes in Wasser bereitet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß die Hydroxylaminlösung durch Auflösen von Hydroxylaminhydrochlorid in Wasser bereitet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche ! bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbe des Azobilinibins nach Zusetzen von Alkali gemessen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet daß entsprechend der Jendrassik-Grof-Methode verfahren wird, wobei die saure Hydroxylaminlösung der Reaktionsmischung an Stelle von Ascorbinsäure zugesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxylaminlösung eine mindestens 13 molare Konzentration an Hydroxylamin aufweist