DE2256331C3 - Verfahren zur quantitativen kolorimetrischen Harnsäurebestimmung - Google Patents
Verfahren zur quantitativen kolorimetrischen HarnsäurebestimmungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen
kolorimetrischen Harnsäurebestimmung in parallelen Test- und Blindproben unter Verwendung von
Uricase in der Blindprobe und eines Puffers, der der Blindprobe und der Testprobe in gleicher Menge und
Konzentration zugesetzt wird.
Bei einem aus Clin. Chem., Vol. 12, No. 1,1966, Seiten
18 bis 24 bekannten Verfahren wird das Eiweiß ausgefällt und abgetrennt.
Die Eiweißfällung verursacht jedoch bei der Analyse folgende Fehlerquellen:
a) Nicht alle Proben enthalten dieselbe Menge Protein, so daß das Volumen der ausgefällten Feststoffe
sehr schwankt. Dies hat den ungünstigen Effekt, daß auch das Volumen der überstehenden
Flüssigkeit in dem Reaktionsgefäß sehr unterschiedlich ist, so daß beträchtliche Verdünnungsfehler
vorkommen können.
b) Bisher konnte der Verdacht nicht ganz ausgeräumt werden, daß mit dem ausgefällten Eiweiß
zusammen auch Harnsäure mit ausfällt, so daß die Analysenwerte zu niedrig ausfallen (vgl. R.
J. Henry, CHn. Chem., Principles and Techniques, Seite 68, New York, Harper ana Kowe,
1968). Und wenn dieser Effekt auch grob abgeschätzt werden kann, so ist dies doch bei routinemäßigen
und automatischen Methoden unanwendbar.
Deshalb ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur quantitativen kolorimetrischen Harnsäurebestimmung
anzugeben, bei dem auf die mühevolle, zeitraubende und letztendlich Fehler verursachende
Stufe der Eiweißabtrennung verzichtet werden kann.
Diese Aufgabe kann überraschenderweise dadurch gelöst werden, daß man bei dem Verfahren der eingangs
genannten Art erfindungsgemäß so vorgeht, daß anstelle einer Eiweißfällung der Blindprobe und der
Testprobe zur Löslichmachung des Eiweißes Harnstoff zugesetzt wird und daß die Harnsäure kolorimetrisch
durch ein Wolframatphosphat-Carbonat-Reagens bestimmt wird. Hierbei enthält der eingesetzte Puffer
vorzugsweise Borat.
Diese Möglichkeit, dank des erfindungsgemäßen Verfahrens völlig auf die Eiweißfällung verzichten zu
können, ist von enormer Bedeutung: Automatische Bestimmungsverfahren werden auf diese Weise viel
leichter durchführbar. Da die neuzeitliche klinische Chemie darauf gerichtet ist, Methoden anzuwenden,
bei denen die mechanische Eiweißfällung unterbleiben kann, ist das erfindungsgemäße Verfahren höchst
vorteilhaft. Außerdem wird durch den Verzicht auf die Eiwsißfällung die Bestimmung auch abgekürzt,
sowohl im Hinblick auf die Zeit als auch auf die Stufenzahl. Dadurch werden Effektivität und Produktivität
des Klinikers gesteigert und Fehlerquellen ausgeschaltet.
Bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfah-
iü ren werden der Puffer und der Harnstoff parallel und
in Kombination eingesetzt. Durch diese Maßnahme wird das vorhandene Eiweiß durch Zusatz von Harnstoff
löslich gemacht und somit sein Chromogenitätseffekt neutralisiert.
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind zur Verdeutlichung des Verfahrens nachstehend näher beschrieben.
Puffer: 800 ml destilliertes Wasser werden mit 9,8 g Propandiol, 5,3 g Natriumchlorid, 5,0 g Tetranätri-
umäthylendiamintetraacetat und 6,2 g Borsäure versetzt. Das Gemisch wird bis zum Erhalt einer klaren
Lösung gerührt. Anschließend wird auf 11 mit Wasser aufgefüllt und der pH-Wert mit konzentrierter HCl
oder 10 η Natriumhydroxid auf 9,0 ±0,05 eingestellt.
Carbonatreagenz: 100 g wasserfreies Natriumcarbonat, 200 g Harnstoff und 5 g Tetranatriumäthylendiamintetraacetat
werden unter Rühren in Wasser gegeben, wobei ein Endvolumen von 11 eingestellt wird.
Uricaseenzym: Spezifische Aktivität: 25 internationale Einheiten pro mg.
Wolframatphosphorsäurereagenz: 40 g molybdänfreies Natriumwolframat werden in etwa 300 ml
destilliertem Wasser aufgelöst. Anschließend werden 32 ml einer 85%igen o-Phosphorsäure dazugegeben
und wird unter mildem Rückfluß 2 h lang erhitzt. Anschließend wird auf Zimmertemperatur abgekühlt und
mit destilliertem Wasser auf 11 aufgefüllt. Daraufhin werden in dem Reagenz unter Rühren 32 g
Li2SO4 · H2O gelöst.
Gepufferte Uricaselösung: Die vorstehend spezifizierte
Uricase wird zu dem ebenfalls spezifizierten Puffer in einer Menge gegeben, daß die erhaltene Lösung
0,1 internationale Einheiten Uricase pro ml enthält.
Verfahren: Es werden zwei 12 X 75-mm-Teströhrchen
verwendet. Das eine wird als Testprobe, das andere als Blindprobe gekennzeichnet. In das als Blindprobe
gekennzeichnete Röhrchen werden 0,2 ml gepufferter Uricaselösung gegeben. In das als Testso
probe gezeichnete Röhrchen werden 0,2 ml Pufferlösung gegeben. Zu beiden Proberöhrchen werden je
0,1 ml Serum gegeben. Die Lösungen in den Proberöhrchen werden gut vermischt und 10 min lang bei
37 bis 45 ° C gereift. Jede der beiden Proben wird mit 1,0 ml Carbonatreagenz versetzt und wiederum gut
durchmischt. Anschließend werden 1,0 ml Wolframatphosphorsäurereagenz zu jeder der Proben gefügt.
Nach dem Mischen läßt man anschließend 5 min stehen und mißt dann die Absorption der Testprobe
gegen die Absorption der Blindprobe bei 650 nm auf einem Spektrophotometer mit einer 1-cm-Küvette,
Mit der gemessenen Absorption geht man dann in eine Eichkurve, die in der Weise aufgenommen wurde, daß
man das vorstehend beschriebene Verfahren mit Lösungen
durchführte, die einen bekannten Harnsäuregehalt hatten.
Auf diese Weise stellt das Verfahren gemäß der Erfindung eine fortschrittliche und effektive Bestim-
mungsmethode für Harnsäure dar, bei der Uricase im
Rahmen eicsr kolorimetrischen Bestimmung verwendet wird, wobei die Umstände und die Kosten der Eiweißfällung und anderer Vorbereitungsstufen sowie
die anderen Nachteile der bekannten Verfahren zur Bestimmung von Harnsäure vermieden werden.
Wie dem ausgeführten Beispiel für das Verfahren gemäß der Erfindung deutlich zu entnehmen ist, stellt
dieses Verfahren eine äußerst einfache Bestimmungsmethode dar, die keine über das üblicherweise in Kliniklaboratorien vorhandene Gerät hinausgehende
Ausrüstung erfordert und störend eingreifende Stoffe, wie beispielsweise Glutathion, Glucose, Ascorbinsäure, Coffein oder Phenole, nicht in die eigentliche
Bestimmung mit einbezieht.
Die mit diesem Verfahren erreichte Kombination angestrebter Vorzüge, zu der die allgemeine Brauchbarkeit, die Genauigkeit, die Verläßlichkeit, die Kostenersparnis an Ausrüstung und Arbeitszeit sowie die
Spezifität zählen, ist nach keinem der bekanntgewordenen Verfahren erreicht worden. Auf diese Weise
wird erstmals ein praktikables Harnsäurebestimmungsverfahren vorgeschlagen, das Uricaseenzym
verwendet und dennoch auf einer einfachen kolori metrischen Harnsäurebestimmung beruht. Es versteht
sich dabei von selbst, daß das hier im Detail beschriebene Ausführungsbeispiel vom Fachmann nach Kenntnisnah-
10
15
20 me der Beschreibung abgeändert werden kann, ohne daß
der Erfindungsgedanke durch solche Modifizierungen im Detail berührt wird. So sollte beispielsweise die spezifische
Aktivität der verwendeten Uricase vorzugsweise so gewählt werden, daß der Anteil des in ihr enthaltenen
Eiweißes nicht so hoch ist, so daß er nur zu einer Absorption führt, die nicht größer als diejenige Absorption ist,die
ein Milligramm Harnsäure in 100 mg Testprobenlösung verursacht Auch sollte die Aktivität so gewählt werden, daß sie hoch genug ist, um die
Harnsäure in der Blindprobe während der für die Reifung bzw. Inkubation der Proben gewählten Zeit vollkommen zu zerstören. Als allgemeine Regel kann dabei gelten, daß die höchste spezifische Aktivität des
Enzyms, die im Rahmen der Wirtschaftlichkeit erhalten werden kann, auch die wünschenswerteste ist.
Ferner kann die spektrophotometrische Beobachtung auch bei jeder beliebigen Wellenlänge im Bereich von
600 bis 800 mn durchgeführt werden. Ebenso kann das Verfahren und können die dazu erforderlichen
und vorstehend beschriebenen Reagenzien auch in automatischen Bestimmungssystemen verwendet
werden, wobei Standardverfahren und an sich bekannte Methoden zur Anpassung und Übertragung
manueller Verfahren auf automatische Vorrichtungen verwendet werden können.
Claims (2)
1. Verfahren zur quantitativen lcolorimetrischen
Harnsäurebestimmung in parallelen Test- und Blindproben unter Verwendung von Uricase in der Blindprobe
und eines Puffers, der der Blindprobe und der Testprobe in gleicher Menge und Konzentration zugesetzt
wird, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle einer Eiweißfällung der Blindprobe und
der Testprobe zur Löslichmachung des Eiweißes Harnstoff zugesetzt wird und daß die Harnsäure kolorimetrisch
durch ein Wolframatphosphat-Carbonat-Reagens bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer Borat enthält
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| Date | Code | Title | Description |
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| 8225 | Change of the main classification |
Ipc: C12Q 1/62 |
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| 8281 | Inventor (new situation) |
Free format text: DENNEY, JERRY WILLIAM, CARMEL, IND., US |
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| C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
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