DE2149763A1 - Verfahren zur Bestimmung des Haemglobingehalts im Blut - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung des Haemglobingehalts im Blut

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung des Hämoglobingehaltes im Blut mit Hilfe des Drabkins Reagens. Das Reagens enthält Kaliumferricyanid (K5Pe(CN)6), Kaliumcyanid (KCN) und Natriumbicarbonat (NaHCO*). Wird das Hämoglobin zu diesem Reagens zugefügt, so wird das Kaliumferricyanid reduziert zu Kaliumferrocyanid (K^Fe(CN)6) und das Hämoglobin wird oxidiert zu Methohämoglobin, das mit dem Cyanid zu dem stabilen Chormagen-Cyanmethämoglobin reagiert.
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Diese Methode wurde zuerst "beschrieben von Drabkin und Austin in"Journal of Biological Chemistry"98, S. 719 (1932) und wurde von den gleichen Autoren in"Journal of Biological Chemistry"112, S. 51 (1935) weiter diskutiert. Das Verfahren ist. auch bekannt als Cyanmethämoglobin-Verfahren. Da Cyanmethämoglobin stabil ist, findet das Verfahren als Test für Hämoglobin weitgehend Anwendung. Das Verfahren stützt sich auf Drabkins Reagens, das anderweitig hergestellt und in speziell bezeichneten Behältern zum Gebrauch des Arztes an Ort und Stelle oder durch die Techniker des Kliniklaboratoriums verschickt werden kann.
Eines der hierbei auftretenden Probleme besteht jedoch darin, daß das Drabkins Reagens bei niederer Temperatur nicht stabil ist. Es zeigte sich, daß Drabkins Reagens, wenn es Gefriertemperatüren ausgesetzt wird, seine Farbe einbüßt, so daß damit keine genaue Hämoglobin-Bestimmung mehr durchgeführt werden kann. Die beim Gefrieren eintretende Reaktion, für welche noch keine befriedigende Erklärung gefunden wurde, scheint u.a. die Reduktion des Kaliumferricyanids zu Kaliumferrocyanid zu umfassen, wobei gleichzeitig Kaliumcyanid zu Kaliumcyanat oxidiert wird.
Ein typisches Drabkins Reagens enthält 61 · 10 ^ Mol Kaliumferricyanid, 77 · 10~5 Mol Kaliumcyanid und 1190 . 10~5 Mol Natriumbicarbonat je Liter. Dieses Reagens ist sehr stabil; In dem in der Zeitschrift Blood 12, S. 1136 (1957) publizierten Artikel von Crosby und Houchin wird berichtet, daß das in diesem Reagens gebildete CyanmethämogloMn bei der Aufbewahrung in verschlossenen braunen Flaschen in einem Zeitraum von 3 Jahren nur einen 4-prozentigen Farbverlust aufwies.
Der Farbverlust dieses Reagens bei Gefriertemperatüren ist selbstverständlich ein Hauptproblem, insbesondere dann, wenn das Reagens abgepackt wird und für den Hämoglobintest
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außerhalb des Krankenhauses verfügbar sein soll.
Gemäß der bevorzugten Durchführungsform der Erfindung setzt man das Drabkins Reagens an und fügt ihm 0,2 bis 10 Gew.-# Aceton zur Verhinderung des Parbverlustes zu. Der Zusatz von Aceton zu dem Drabkins-Reagens führt zusätzlich dazu, daß man eine unmittelbare Wiederherstellung der Spitzenabsorbanz von Cyanmethämoglobin bei der Anwendung des Testes erhält.
Das Drabkins Reagens wird auf übliche Weise angesetzt. Ein typischer Ansatz enthält 200 mg Kaliumferricyanid, 50 mg KCN und 1 g Natriumbicarbonat je Liter. Die Hämoglobin-Bestimmung uwird durchgeführt durch Beobachten der Höhe der 540 Millimikronspitze in einem typischen Spektrometerbild. der die Blutprobe enthaltenden Lösung, Die Konzentration errechnet sich aus der folgenden Gleichung:
CU = AU X 1S
worin Cu die unbekannte Konzentration und C0 die Standardkonzentration in g je 100 ml ist. Au ist die Absorbanz der unbekannten Probe und A_ diejenige des Standards.
Es wurde gefunden, daß bei Zusatz von Aceton zu dem Drabkins Reagens" in den oben angegebenen Konzentrationen, j vorzugsweise in einem Anteil von 0,6 #, der Gefrierpunkt der Drabkins-Lösung nur leicht herabgesetzt wird. Jedoch bleibt die gelbe Farbe erhalten, selbst, wenn das Reagens gefroren ist und die optische Dichte des Reagens erleidet, keine Veränderung. Hierdurch wird offensichtlich das seit langem anstehende Problem gelöst, das durch den Farbverlust des Drabkins Reagens bei Gefriertemperatüren gestellt wurde.
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Außerdem wurde gefunden, daß der Zusatz von Aceton zum Drabkins Reagens eine unmittelbare Wiederaufrichtung der Spitzenabsorbanz in Cyanmethämoglobin bewirkte. Dies ist insbesondere deshalb wichtig, da die charakteristische Spitze bei 540 mm unmittelbar und nicht über eine Zwischenspitze bei 570 mm (die Standardspitze für Oxyhämoglobin) erreicht wird. Die Genauigkeit des Tests ist insofern verbessert, als daß das sofortige Auftreten der Cyanmethämoglobinspitze ohne Auftreten der OxyhämoglObinspitze jede Möglichkeit ausschließt, daß der Wert der Oxyhämoglobin-Ablesung übertragen wird, woraus sich der Irrtum in der Berechnung des Prozentgehaltes an Hämoglobin in der Blutprobe ergeben würde.
Die Erfindung sei anhand der Beispiele näher erläutert. Beispiel 1
Zur Bereitung von Drabkins Reagens wurden 200 mg Kaliumferricyanid, 50 mg Kaliumcyanid und 1 g Ifatriumbicarbonat in 1 1 Wasser gelöst. Nach gutem Durchmischen und völliger Auflösung wurde einem Teil des Reagens eine Menge von 6 ml Aceton je 1 Lösung zugegeben. Dem anderen Teil wurde kein Aceton zugefügt. Beide Lösungen wurden dann 96 h einer Temperatur von -300C ausgesetzt, worauf man sie sich wieder auf Raumtemperatur erwärmen, ließ.
Die Testlösungen wurden volumetrisch in 13 x 50 mm Glascuvetten, bekannt als "Unitubes", abgefüllt. Sämtliche Auswertungen wurden mit diesen Behältnissen als erste Reaktionscuvette durchgeführt. In allen Cuvetten befand sich ein Volumen von 3,8 ml Drabkins-Lösung. Als Blutproben wurden jeweils 13 Mikroliter mit Hilfe der Bio-Dynamics Automatic-Pipette zugegeben. Die Cuvetten wurden dann auf ein Coleman-Spektrophotometer mit einem 2 mm-Schlitz überführt. Das Spektrometer
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wurde mit 10 mV volle Skala betrieben. Die Absorbanzen des Reagens wurden gemessen bei der 540 Millimik^ronspitze. Bei Verwendung der acetonhaltigen Lösung war die Höhe der Spitze im wesentlichen die- gleiche wie bei der Verwendung von frischer Drabkins-Lösung. Im Gegensatz dazu betrug die Höhe der Spitze, die man mit einer Drabkins-lösung ohne Aceton-Zusatz nach vorherigem Gefrieren und Wiederauftauen erhielt, nur 30 # der Höhe der Spitze mit frischem Drabkins Reagens.
Wie ersichtlich, verhindert der Aceton-Zusatz tatsächlich jeden !Farbverlust bei Drabkins Reagens und ermöglicht die Herstellung eines Reagens, das ohne Gefahr eines Aktivitätsverlustes durch Gefrieren transportiert werden kann.
Beispiel 2
Zur Auswertung des wie oben hergestellten, mit Aceton modifizierten Reagens wurde eine Spektralkurve aufgestellt mit Hilfe eines 124 Coleman-Spektrophotometers mit 2 mm-Schlitz, Das Spektrometer wurde betrieben mit 10 mV, volle Skala. Es wurden zwei getrennte Tests durchgeführt. Zum Vergleich wurden Blindversuche mit lediglich den Reagentien durchgeführt. Zum ersten Test wurden nur 3,8 ml Drabkins Reagens ohne Aceton verwendet. Beim zweiten Test wurden 3,8 ml Drabkins Reagens mit 6 ml Aceton je 1 verwendet. Beide Tests wurden durchgeführt mit 13 Mikroliter Blut mit normalem Hämoglobingehalt mit / raschem Abtasten bei 10 min, um sicherzustellen, daß keine Sekundärreaktionen aufgetreten waren.
Der mit dem Drabkins Reagens ohne Aceton durchgeführte Test hatte zwei charakteristische Spitzen, von denen die eine bei 570, die andere bei 540 Millimikron auftrat. Die 570 Millimikron-Spitze gehört selbstverständlich zu Oxyhämoglobin.
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Wenn dagegen das mit Aceton modifizierte Drabkins Reagens verwendet wurde ι so wurde unmittelbar die 540 Millimikron-Spitze erhalten und es war keine Anfangsspitze bei 570 Millimikron zu beobachten. Das Reagens mit einem Gehalt an Aceton wurde dann unter Verwendung einer 10 min-Abtastung geprüft. Es war weder primäre noch sekundäre Interferenz zu beobachten.
Aus den Daten geht hervor, daß das Drabkins Reagens mit einem Gehalt an Aceton eine augenblickliche Cyanmethämoglobin-Ablesung ergibt und die Möglichkeit eines Irrtums durch Übertragung der Hämoglobin-Ablesung von dem Spektrometerblatt Auftreten des Cya nme thämoglobins ausschaltet.
Patentansprüche
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Claims (4)

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1..) Verfahren zur Bestimmung des Hämoglobingehaltes Blut mit Hilfe der Cyanmethämoglobin-Methode, v/obei Kaliumcyanid, Kaliumferricyanid und Natriumbicarbonat als aktive Bestandteile in der Bestimmungslösung vorhanden sind, dadurch gekennzeichnet , daß man der Lösung etwa 0,2 bis 10 Gew.-% Aceton zufügt zur Verhinderung eines Parbverlustes bei Temperaturen unterhalb 0°.
2. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, enthaltend Kaliumcyanid, Kaliumferricyanid und Natriumbicarbonat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an etwa 0,2 bis 10 Gew.-^ Aceton.
3» Mittel nach Anspruch 2, gekennzeichnet
—5 durch einen Gehalt von etwa 61,10 Mol Kaliumferricyanid,
77·1Ο~5 Mol Kaliumcyanid und 119Ο.1Ο"5 Mol Natriumbicarbonat.
4. Mittel nach Anspruch 2 oder 3, gekennzeichnet durch einen Gehalt an etwa 2,5 bis 126 car/l Aceton.
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DE2149763A 1970-10-05 1971-10-05 Verfahren zur Bestimmung des Hamoglobingehalts im Blut Expired DE2149763C3 (de)

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