DE3103612C2 - Verfahren und Reagens zur direkten quantitativen Bestimmung von Chlorid im Blutserum - Google Patents

Abstract

Es wird ein direktes quantitatives Verfahren zur Bestimmung von Chlorid im Blutserum zur Verfügung gestellt, das auf der Reaktion zwischen Chlorid und Eisen(III)-ionen beruht. Ein neues Reagens wird in diesem Verfahren verwendet, das kein Quecksilber, jedoch ein Netzmittel enthält, das die Proteinausfällung verhindert.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagens für die direkte quantitative Bestimmung von Chlorid Im Blutserum.

Es ist In der Biologie seit langem bekannt, daß Chlorid das extrazelluläre Hauptanion in biologischen Flüssigkeiten ist. Die Bewegung des Chlorids in die roten Blutzellen und aus den roten Blutzellen Ist wesentlich für den Transport von Blcarbonatlonen In Antwort auf sich verändernde Mengen von Kohlendloxid. Erhöhte Chloridwerte im Serum deuten Im allgemeinen auf Entwässerung, Hyperventilation, Herzinfarkt, Harnwegobstruktion durch Prostata oder andere Leiden hin. Niedrige Serumchlorldwerte findet man bei ausgedehnten Verbrennungen, übermäßigem Erbrechen, metabollscher Acidose, Nephritis, Darmverschluß, Addlsonkrlse und Diarrhöe,

Das früheste praktisch durchführbare Bestimmungsverfahren für Chlorid wurde von T. Volhard 1874 (J. Prakt. Chem.' Bd. 9, S. 217 [1874]) angegeben. Seit dieser Zelt sind in der Literatur Dutzende von direkten und indirekten Analyseverfahren beschrieben worden. Die beliebsten Methoden sind die coulometrlsche Titration, das spezifische lon-Elektrodenverfahren und die kolorlmetrlsche Quecksllber(II)-thlocyanat-Methode.

P. W. West und H. Coil berichten in »Anal. Chem.«, Bd. 28 (1956), über eine direkte spektrophotometrische Methode für die Chloridbestimmung im Bereich von 0,02 bis 0,2 mVal/l. Später wurde dieses Verfahren, in dem kein QuecKSilber verwendet wird, für die Chlorbestimmung im Serum übernommen (vgl. B. Fingerhut, »Clin. Chem. Acta«, Bd. 41, S. 247 [1972]). Da das Reagens ein starkes Perchlorsäure-Medium ist, das den weiteren Reaktionsablauf stört, muß es durch Dialyse entfernt

ίο werden u. a. zur Vermeidung von Problemen, die mit der Proteinausfällung zusammenhängen. Diese Dialyse wiederum wird stark vom pH-Wert der Lösung beeinflußt, weshalb der zu untersuchenden Probe ein Puffer zugesetzt wird. Diese Methode fand keine weite Verbreitung

i- in klinischen Laboratorien, obwohl bei dieser direkten kolorimetrischen Bestimmung kein Quecksilber verwendet wird, das in anderen kolorimetrischen Bestimmungsverfahren unerwünschte Beseitigungsproblcme schafft. Festgestellt werden sollte, daß in dem originalen West- und Coll-Artikel keine Absorptionsveränderung bei einer Säurekonzentration unter 2,0 r. beobachtet wurde.

In der DE-AS 22 62 781 wurde empfohlen, die bei der Bestimmung von anorganischem Phosphat in Körperflüssigkeiten störenden Proteine durch Zugabe eines Netzmittels In Lösung zu halten. Eine solche Phosphatbestimmung mittels Ammoniummolybdat kann aber keine Anhaltspunkte geben, wie sich eine direkte quantitative Chloridbestimmung im Blutserum durchführen läßt.
Aufgabe der Erfindung war es, ein neues Verfahren

JO und ein neues Reagens für die direkte quantitative Bestimmung von Chlorid in Blutserum zur Verfügung zu stellen, das die Reaktion zwischen dem Chlorid und Eisen(lII)-ionen ausnützt, jedoch kein Quecksilber enthält. Außerdem sollte das neue Reagens Perchlorsäure In niedrigeren Konzentrationen als bisher enthalten. Das Verfahren sollte eine hohe Linearität für die Chlorldionenbestlmmung aufweisen, durch andere im Blutserum vorhandene Verbindungen nicht gestört werden und in einem spektrophotometrischen Zentrifugalanalysator durchgeführt werden können.

Gegenstand der Erfindung ist oin Verfahren zur direkten quantitativen Bestimmung von Chlorid Im Blutserum durch Vermischen einer Probe des Serums mit einem Reagens, das EisendID-perchlorat und Perchlor-

⁴S säure gelöst enthält, und spektrophotometrische Messung der Absorption der sich bildenden gefärbten Reaktionslösung, das dadurch gekennzeichnet 1st, daß das Reagens 0,01 η bis 2,On Perchlorsäure, 0,01 η bis 1,0 η EisenIID-perchlorat und 0,1 bis 20 Gew.-% eines nlcht-lonlschen Netzmittels In entionisiertem Wasser enthält.

Wie vorstehend erläutert, wurden bei der bisher verwendeten Methode zur Bestimmung von geringen Mengen Chlorid In wäßrigen Proben starke Perchlorsäurelösungen (Konzentrationen von 2 η bis 8,5 n) eingesetzt, die zu einer Ausfällung der Serumproteine führen. Um die Chloridkonzentration im Serum bestimmen zu können, muß man ein Trennungsverfahren für die Serumproteine, wie die von Fingerhut beschriebene Dialyse, verwenden, bevor die Bestimmungsmethode für ein automatisches Verfahren angepaßt werden kann. Auch Harnstoff wurde schon verwendet, um die Ausfällung von Protein In einem Perchlorsäuremedlum zu verhindern. Es wurde jedoch beobachtet, daß Harnstoff ein gefärbtes Produkt mit Elsen(IlI)-lonen bildet, dessen Absorption bei 340 nm Hegt, und deshalb für die direkte Reaktion nicht geeignet ist.

Erfindungsgemäß wurde nun festgestellt, daß Elsen(III)-perchlorat und Perchlorsäure in sehr verdünn-

ten Konzentrationen verwendet werden können (Perchlorsäure wird erfindungsgemäß in einer etwa fünffach geringeren Menge, Eisen(HI)-perchlorat in einer etwa dreifach geringeren Menge verwendet als nach dem Stand der Technik] und daß die Verwendung eines Netz- "■ mittels eine getrennte Proteintrennungsstufe überflüssig macht. Dank einer systematischen Untersuchung der pH-Abhängigkeü der Eisen(III)-chlorldkomplex2 wurde gefunden, daß sich Eisen(III)-chloride unter wohldefinierten Bedingungen bei niedriger Azidität bilden. So m wurde turn Beispiel beobachtet, daß die Komplexe linear bei 340 nm im und jenseits des physiologischen Bereiches von Chlorid im Serum absorbieren, wobei die Standardkurve dem Beer'schen Gesetz unterliegt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhält man eine Empfind- π Iichkeit, die mit dem Reagens vergleichbar ist, das konzentrierte Perchlorsäure enthält. Außerdem wurde beobachtet, daß im erfindungsgemäßen Verfahren s'ich der Chloridkomplex In weniger als einer Minute bildet.

Die Erfindung betrifft daher auch ein Reagens für die ?■> Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, enthaltend:

i) 0,01 η bis 2,0 η Perchlorsäure (HClO₄) in entionister-

tem Wasser
ii) 0,01n bis l,0n Eisen(III)-perchIorat in entionisier- ^2> tem Wasser

iii) 0,1 bis 20 Gew.-% eines nicht-ionischen Netzmittel in Form einer wäßrigen Lösung.

Für die nachstehend als Beispiel erwähnte Durchfüh- jo rung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem spektrotfotometrischen Zentrifugalanalysator nach einer Zweiwellenlängen-Methode ist besonders ein Reagens geeignet, das 0,0378 η Fe (ClO₄J₁, eine 9,65%ige Polyoxyäthylen-laurylätherlösung und 0,236 η HClO₄ enthält.

Das nicht-ionische Netzmittel dient der Unterblndung und/oder Ausschaltung der Ausfällung von Blutproteinen. Im Gegensatz zu Harnstoff bildet das nicht-ionische Netzmittel mit Eisen(IH)-ionen kein gefärbtes Produkt, das bei 430 nm absorbiert, und ist daher Ideal für diesen to Zweck geeignet.

Die einzigen Anforderungen an das Netzmittel sind, daß es nicht ionisch sein darf, die Ausfällung von Blut proteinen unterdrückt oder verhindert und, im Gegensatz zu Harnstoff, die Absorptionsbesllmniung nicht stört. Bevorzugte Netzmittel sind Polyoxyäthylen-äther mit 2 bis 40 Äthylenoxideinheiten, die sich von primären und sekundären Alkoholen mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen ableiten. Ein besonders bevorzugtes nicht-Ionisches Netzmittel für das erfindungsgemäße Verfahren ist Polyoxyäthylen-l&jryläther, der im Handel erhältlich ist und z. B. in Form einer 19,3gew.-%igen Lösung eingesetzt wird.

Für die quantitative Bestimmung von Chlorid gemäß der Erfindung werden zweckmäßig Blutserumproben von jeweils 70 μΙ verwendet. Hierzu werden dann beispielsweise 2 ml eines Reagens zugesetzt, welches durch Vermischen von gleichen Volumina entionisierter Lösungen erhalten worden ist, die 0,0756 η Elsen(III)-perchlorat bzw. 0,492 η Perchlorsäure enthalten und dem außerdem ein nicht-ionisches Netzmittel zugesetzt worden ist. Für diesen Zweck kann man z. B. 2 ml der vorstehend erwähnten wäßrigen Lösung verwenden, welche 19,3 Gcv/.-% Polyoxyäthylcn-Iauryläther enthält.

Da das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagens ein Oxldationsmit¹, .¹I ist, das Bilirubin oxidiert, erzeugt es bei Serumproben ein dynamisches Interferenzproblem. Zur Ausschaltung dieses Problems wird bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens die spektrofotometrische Messung zweckmäßigerweise durch eine Zweiwellenlängen-Methode durchgeführt, die eine dynamische Leerwertbestimmung umfaßt. Dies kann unter Verwendung von Filtern !m Bereich von 380 bis 450 nm erfolgen. Ein 420-nm-Filter wird bevorzugt, da es gleichzeitig die Interferenzen von Bilirubin und Hämoglobin ausschaltet. Der Serum-Leerwert verändert sich mit der Zeit, da der Bilirubin-Absorptionsgipfel sich langsam von 450 nm auf 370 nm verschiebt. Ein Absorptions-Leerwert, der mit dem übereinstimmt der bei 430 nm, der Meßwellenlänge für den Chlorid-Komplex, sowohl für die statische Hämolyse- als auch die dynamische BIlI-rubininterferenz gemessen wird, kann bei 420 nm bei entsprechender Zeitwahl erhalten werden.

In der Zeichnung ist graphisch eine Serie von Spektralabtastkurven wiedergegeben, die nach dem Vermischen der Probe und des Reagens jede Sekunde in einem analytischen Abtastspektrophotometer auf? jnommsn wurden. Aus diesen Kurven ist ersichtlich, daß ά'-τ, durch Bilirubin verursachte Absorption ein Maximum bei 450 nm hat, das sich mit der Zeit auf 370 nm verlagert. Die nach 4 Sekunden aufgenommene Absorption bei 420 nm entspricht d°r zuletzt abgelesenen Absorption bei 340 nm.

Dieser Serum-Leerwert wird gespeichert und von dem bei 340 nm bestimmten Endwert abgezogen. Dieses Verfahren ist einfach, es umgeht die Lagerung einer Serum-Leerprobe und scheidet das Bilirubin-Inierferenzproblem aus.

Zur Durchführung des Verfahrens kann jeder Analysator, der eine Zweiwellenlängen-Meßausrüstung hat, verwendet werden. Besonders geeignet ist ein Analysator, der für das Vermischen und Einbringen der Reagentien ein Zentrifugalfeld verwendet. Wird die Analyse manuell in einem auf 30° C thermostatisierten Spektrophotometer durchgeführt, so wird eine Durchflußküvette bevorzugt. Bei einem Zentrlfugalfeld-Analysator werden die FToben und Reagentien mit einem Probenverdünnungsfaktor von 1 : 40 in die Transferscheibe plpettiert. Die Analysator-Pv.-ameter können manuell gewählt werden oder man kann den Computer so programmieren, daß die experimentellen Stufen automatisch ablaufen. Die Scheibe wird in den Analysator eingebracht, die Parameter werden eingegeben und die Rotation begonnen. Nach dem Ausdrucken wird der Analysator für die Endergebnisse auf die geänderte Wellenlänge neu eingestellt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1
Herstellung des Reagens

Eine Vorratslösung von 0,7 η Eisen(IH)-perchIorat wird durch Lösen von 36Og Eisen(III)-perchlorat als nicht-gelbe Kristalle "η einem Liter entlonlsifcrtem Wasser hergestellt. Diese Lösung wird filtriert und mit Kaliumdichromat standardisiert. Eine 5 η Perchlorsäure-Vorratslösung wird durch Verdünnen von 450 ml 70%lger Perchlorsäu.e mit einem Liter entionisiertem Wasser hergestellt und mit Natriumhydroxid standardisiert.

Die Arbeltslösungen werden wie folgt hergestellt: Die Lösung A wird aus den Vorratslösungen hergestellt und enthält 0,0856 η Eisen(III)-perchlorat und 0,492 η Perchlorsäure. Die Lösung B wird als wäßrige Lösung hergestellt und enthält 19,3 Gew.-% Polyoxyäthylen-Iauryläther. Dieses Netzmittel ist Im Handel als 20%lge Lösung erhältlich, Lösung B wird daraus durch Verdünnung hergestellt. Die Lösungen A und B werden im Volumenver-

hältnls von
mischt.

zum erfindungsgemäßen Reagens ver-

Manuelles Verfahren

In ein 13 χ 100-mm-Probenröhrchen werden erst 2 ml 5 Lösung B, dann 70 μΙ Probe pipettlert und vermischt. In Serumproben '.ann eine weiße Trübung erscheinen, sie verschwindet jedoch nach dem Vermischen. Anschließend werden 2 ml Lösung A zugesetzt, das Teströhrchen wird zum Vermischen geschüttelt.

Durch Versetzen eines 13 χ lOU-mm-Probenrohrchens mit 2 ml Lösung B, 70 μI entionisierlem Wasser und 2 ml Reagens A und Vermischen wird eine Reagens-Leerwertlösung hergestellt.

Die Serum-Leerwertlösung wird durch Pipettleren von 4 ml entlonlslertem Wasser In ein 10 χ 100-mI-Teströhrchen und Zugabe von 70 μΙ Probe sowie anschließendes Veniiibcrien hergestellt.

Beim manuellen Verfahren werden alle Lösungen in einem 30' C warmen Wasserbad oder einem Heizblock 5 Minuten inkubiert. Dann werden die Lösungen in das Spektrophotometer eingeführt, die Werte werden abgele-

Tabeile i

sen, wenn die Absorption stabil ist (etwa 15 Sekunden). Zweiwellenlängen-Verfahren in einfcm Zentrifugal Analysator kann verwendet werden. Gemäß der Anlei lung für den Analysator werden die Proben und da: Reagens mit einem Probenverdünnungsfaktor von I : 4( In die Transferscheibe pipettiert. Die Analysalor-Parame ter können manuell gewählt werden oder der Compulei wird so programmiert, daß die experimentellen Stufer automatisch ablaufen. Die Scheibe wird in den Analysator eingebracht, die Parameter werden eingegeben und (lic Rotation begonnen. Nach dem Ausdrucken wird dei Analysator für die Endergebnisse auf die veränderte Wellenlänge eingestellt.

Beispiel 2 bis 9

Mit den gemäß Beispiel 1 hergestellten Reagentier weiiieri vKiäiiiieueite tSürruin-oiiiiScfüfriprOucn auf in feil Chlorldgehalt in einem CentrifiChem-Analysatoi mit Zweiwellenlängen-Meßausrüslung untersucht. Die Serumproben und ilie Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Beispiel	Probe	(CIi	ICIi
		coulometrisch *)	gefunden
		(mVal/l)	(mVal/l)
2	Normalserum	102	101
3	ikterisches Serum	97	96
4	hämolysiertes Serum	109	108
5	trübes Serum	103	104
6	Kontrollserum	107	106
	(500 mg Hämogiobin/di enthaltend)
7	Kontroliserum	104	104
	(43,5 mg Bilirubin/dl enthaltend)
8	entionisiertes Wasser	32	1
	(40 mVal Br/I haltend)
9	Kontrollserum (sehr trüb)	106	105

*) mittels Digital-Meßgerät der Fa. Corning Glass Works

^{eisp e} längen- und der manuellen Methode verglichen. Auch

Die verschiedenen Parameter des erfindungsgemäßen die Parameter einer Leerwertbestimmung sind angege-

Verfahrens werden unter Verwendung der Zweiwellen- ₅₀ ben. Alle Ergebnisse sind in Tabelle II zusamnv. .!gefaßt.

Tabelle II	Methode Zweiwellenlängen	manuell	Leerwert
Parameter	0-120 mVal/l	0-120 mVal/l	0-180 mVal/l
1. Linearität	1,54% 0,8%	1,7% 1,4%	1,3% 1,8%
2. Genauigkeit während 1 Tages von Tag zu Tag			95-103%
3. Genauigkeit (% Wiedergewinnung)			1 Jahr bei 25° C
4. Stabilität	0,9743	0,968	0,9256
5. Verhältnis zur

coulometrischen Methode

Fortsetzung

Parameter

Methode Zweiwellenlängen

manuell

Leerwert

6. Interferenzen	keine bis	zu	40 rnVal/1	keine bis	zu 5 mg/dl
Br-	keine bis	zu	40 mVal/1	keine bis	zu 300 mg/dl
F-	keine			keine bis	zur starken
Bilirubin	keine bis	zu	300 mg/dl	Trübung
Hämoglobin	keine bis	zur	starken
Trübung	Trübung

keine bis zu 140 mVal/1 keine bis zu 40 mVal/1 keine bis zu 5 mg/dl keine bis zu 500 mg/dl

keine bis zur starken
Trübung

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur direkten quantitativen Bestimmung von Chlorid im Blutserum durch Vermischen einer Probe des Serums mit einem Reagenz, das Eisen-(III)-perchlorat und Perchlorsäure gelöst enthält, und spektrophotometrische Messung der Absorption der sich bildenden gefärbten Reaktionslösung, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens 0,01 η bis 2,0 η Perchlorsäure, 0,01 η bis 1,0 η Eisen(III)-perchiorat und 0,1 bis 20 Gew.-% eines nicht-ionischen Netzmittels in entionsiertem Wasser enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als nicht-ionisches Netzmittel Polyoxyäthylen-Iauryläther verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutserumpro.be in einer Menge von 70 μΐ verwendet wird.

4. Verfaiiren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch von gleichen Volumina entionisierter Lösungen herstellt, die 0,0756 η EisendID-perchlorat bzw. 0,492 η Perchlorsäure enthalten, und von diesem Gemisch insgesamt 2 ml verwendet.

5. Verfahren nach Ansprach 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine wäßrige, 19,3 Gew.-% Polyoxyäthylen-Iauryläther enthaltende Lösung in einer Menge von 2 ml verwendet.

6. Reagens zur Verwendung für die direkte quantitative Chl''t'dbestimmung im Blutserum nach Anspruch !,enthaltend:

(i) 0,01 η bis 2.Gn Perchlorsäure in entionisiertem Wasser,

(ii) 0,01 η bis l,0n Elsen(III)-perchlorat in entionisiertem Wasser und

(iii) 0,1 bis 20 Gew.-% eines nicht-ionischen Netzmittels in Form einer wäßrigen Lösung.