DE2950457B2 - Verfahren zur Bestimmung von glycosyliertem Hömoglobin im Blut und Reagens zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von glycosyliertem Hömoglobin im Blut und Reagens zur Durchführung des Verfahrens

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DE2950457B2 DE2950457A DE2950457A DE2950457B2 DE 2950457 B2 DE2950457 B2 DE 2950457B2 DE 2950457 A DE2950457 A DE 2950457A DE 2950457 A DE2950457 A DE 2950457A DE 2950457 B2 DE2950457 B2 DE 2950457B2
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von glycosyliertem Hämoglobin in Blutproben.
Hämoglobin tritt in zwei allosterischen Formen auf: T-(taut)- und R-(relaxed)-Form. Diese Formen weisen unterschiedliche chemische und physikalische Eigen-Schäften auf, Die relativen Mengen w R- wnd TsHämoglobin lassen sich nach bekannten Verfahren bestimmen, beispielsweise durch UV-, IR-.SpeJrt?qsko-
pie, Spektroskopie im sichtbaren Bereich, NMR- und ESR-Spektroskopie, Beispielsweise beschreiben Perutz etaL, Biochenu Nr, 17 (1978), S, 3641, die Absorptionsspektren von Hänjogiobindenvaten, d.h. den R—T-Ubergang als Funktion der Bindung von liganden und Inosithexaphosphat Der Zirkulardichroismus und die chemische Reaktivität sind neben anderen Verfahren zur Unterscheidung des R- und T-Zustands von Hämoglobin geeignet Die relativen Anteüe des R- und T-Zustands lassen sich nach Endpunktsverfahren
is sowie nach kinetischen Verfahren bestimmen.
Erhöhte Konzentrationen an glycosyliertem Hämoglobin treten bei Diabetes mellitus auf. Glycosyüertes Hämoglobin ist bei Nichtdiabetikern in eine» Konzentration von etwa 5 Prozent bezogen auf das Gesamthämöglobin, vorhanden, während die entsprechende Konzentration bei Diabetikern das 2- bis 4fache beträgt (Science 200, 7. April 1378). Die Konzentration an glycosyliertem Hämoglobin stellt ein Maß für die durchschnittliche Glucosekonzentration im Blut eines Patienten über einen langen Zeitraum hinweg dar. Dieses MaS wird durch kurzzeitige Blutzuckerfluktuationen (von einer Stunde zur anderen) nicht beeinflußt und spiegelt daher den Zustand der GlucosekontroUe im Blut von Diabetikern relativ genau wider.
Glycosyüertes Hämoglobin wird im allgemeinen als HbA oder schnelles Hämoglobin bezeichnet da es in einer chromatographischen Säule schneller wandert und im allgemeinen chromatographisch oder elektrophoretisch gemessen wird.
Es wurde festgestellt daß der prozentuale Anteil an glycosyliertem Hämoglobin im Blut gemessen werden kann, indem man die Verschiebung des Gleichgewichts zwischen den allosterischen R- und T-Formen von Hämoglobin, die eintritt wenn nicht-glycosyliertes
*o Hämoglobin mit einer Substanz mit Bindungswirkung auf allosterische Stellen umgesetzt wird, ermittelt Diese Umsetzung bewirkt eine Verschiebung der R- zur T-Form im nicht-glycosyliertem Anteil von Hämoglobin. Glycosyüertes Hämoglobin in der Blutprobe trägt zu dieser Gleichgewichtsverschiebung der allosterischen Formen nichts bei, da die Glycosylierung die allosterische Bindungsstelle blockiert Somit ist die Verschiebung zwischen den allosterischen Formen nach Umsetzung des Hämoglobins mit einer Substanz mit
so Bindungswirkung auf allosterische Stellen um so geringer, je höher der Anteil Mi glycosyliertem Hämoglobin in der Blutprobe ist Erftndungsgemäß wird die Reaktivität der allosterischen Bindungsstelle, die in nicht-glycosyliertem Hämoglobin zugänglich ist ausgenutzt Ferner wird die sich ergebende Gleichgewichtsverschiebung der allosterischen Formen in einem Gemisch aus glycosyliertem und nicht-glycosyliertem Hämoglobin, das erhalten wird, wenn eine Substanz mit Wirkung auf die allosterische Bindungsstelle mit der
W nicht-glycosylierten Hämoglobinfraktion umgesetzt wird, ausgenützt
Das erfifidüfigsgemäße Verfahren zur Bestimmung von glycosyliertem Hämoglobin in Blutproben ist im Patentanspruch 1 beschrieben.
Vorteilhafte Weiterbildungen des Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen 2 bis 5, während Reagentien zur Durchführung des Verfahrens in den Ansprüchen 6 bis 10 beschrieben sind.
Es sind, dje verschiedensten Verbindungen bekannt, die eine Bindongswirkung auf aHosterfsche Effekto^tej-M ausüben. Beispiele dafür sind; Orgenophosphate, Sulfate und Carbonsäuren, wie Inosithexapbosphat (J, BioL Chem, Bd 246 [1971], S, 7168), ^Piphosphoglycerat (Nature, Bd 234 [1971J S, 174), Adenosintriphosphat (Biochem. Biophys. Res, Conum Bd 26 [1967], S. 162X Pyridoxalphosphat (Fed Proc, Fed Amer. Soc, ExpL BioL, Bd 28 [1.969], S. 604), Inosithexasulfat (Biochemistry, Bd 15 [1976J S. 3396), Inositpentaphosphat (Can. J, Chem, Bd 47 [1969], S.63X 8-Hydroxy-1,3,6-pyrentrisulfonat (J- BioL Chem, Bd 246 [1971], S. 5832) und Natrium-o-jodosobenzoat (The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Bd 203 [19771S. 72). Es stehen somit eine Reihe von Substanzen mit Effektorstellen-Bindungswirkung zur Verfügung, die sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen. Inosithexaphosphat wird als Substanz; mit aüosterischer Effektorstellen-Bindungswirkung bevorzugt.
Im allgemeinen, ist es wünschenswert, die roten Blutkörperchen' easer Lysis zu unterziehen, um das Hämoglobin freizusetzen. Zur Durchführung einer derartigen Lysis an roten Blutkörperchen sind übliche kationische Detergentien, wie Cetyltrimethylammoniumbromid anionische Detergentien, wie Natriumdodecylsulfat und Natriumdesoxycholat, und neutrale Detergentien, wie Saponin und OctylphenoxypolyäthoxyäthanoL geeignet Neutrale Detergentien im Konzentrationsbereich von etwa 0,025 bis 0,5 Volumenprozent werden bevorzugt Zur Freisetzung von Hämoglobin aus roten Blutkörperchen kann auch ein mechanisches Aufbrechen, beispielsweise durch Ultraschallbehandlung oder durch hypotone Lysis, vorgekommen werden.
Durch Bindung von bämbinJeaden Liganden an das Häm-Eisen wird im allgemeinen das G.eichgewicht der allosterischen Hämoglobin-Isomeren in die R-(relaxed)-Form verschoben. Wird somit der hämbindende Rest von Hämoglobin in der zu untersuchenden Probe mit einem hämbindenden LJganden koordiniert, so wird eine größere Gleichgewichtsverschiebung der allosterischen Hämoglobinformen, beobachtet Diese Verstärkung der Gleichgewichtsverschiebung erhöht die Genauigkeit der Bestimmung von glycosyliertem Hämoglobin. Diese Koordination eines hämbindenden LJganden zur Verschiebung des Gleichgewichts der allosterischen Formen ist anwendbar, wenn das Eisen im Fe*2- oder Fe+3-(Methämoglobin-)Zustand vorliegt
Es stehen eine Reihe von verschiedenen hämbindenden Liganden zur Verfügung, die eine Bindung mit dem Eisen in Hämoglobin oder Methämoglobin eingehen.
Isocyanide, wie Alkylisocyanide mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Phenylisocyanide, sind besonders geeignete hämbindende Liganden für Hämoglobin im Fe+^Zustand Andere geeignete Liganden sind O2 und NO.
Im allgemeinen wird die Bindung eines einzelnen Liganden an das Eisen bevorzugt, da dies zu einfacheren Messungen der Verschiebung der allosterischen Formen führt Beispielsweise wird Oxyhämoglobin (glycosyliert oder nicht-glycosyliert) vorzugsweise durch umietzung mit Natriumdithionit oder anderen bekannten Reduktionsmitteln zu Desoxyhämoglobin desoxygeniert Das Desoxyhämoglobin wird mit einem Alkaliiso· cyananid wie n-Butylisocyanid, umgesetzt Die anschlie-Bende Umsetzung mit einem Liganden mit Bindungswirkung für die allosterische Effektorstelle ergibt eine ausgeprägtere Gleichgewichtsverschiebung der allosterischen Formen, was eine Bestimmung von glycosyliertem Hämoglobin erlaubt.
Hämoglobin kww nach bekannten Verfahren m Meth&moglobro oxidiert werden, Kaliumferricyanid, ;Natriwmnitrit, Anilin und Phenylbydrazin sind hierfür zweckmäßige Reagentien. Eine Autoxidation in Gegenwart von Farbstoffen, wie Methylenblau führt ebenfalls zur Oxidation von Hämoglobin zu Methämoglobin,
Nicht-glyccsyliertes Methämoglobin reagiert mit den für nicht-glycosyliertes Hämoglobin beschriebenen Substanzen mit Bindungswirkung für allosterische Effektorstellen.
Es stehen eine große Anzahl an bekannten hämbindenden Liganden zur Verfugung, die eine Bindung mit Methämoglobin eingehen. Beispiele für derartige LJgpndeD sind Cyanat, Thiocyanat, N-Hydroxyacetamid Imidazol und Derivate davon.
Weitere übliche Liganden sind Fluorid, Azid, Nitrit, Cyanid Wasser, Hydroxid Ammoniak, Acetat und Formiat Imidazol in einer Konzentration von etwa 0,1 m wird als hämbindender Ligand für Methämoglobin bevorzugt
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird
1 ml Reagens (0,1 m Imidazol, 0,2 mOlimolar Kaliumferricyanid (K3Fe(CN)6) und 0,05 Volumenprozent Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (Triton X-IOO) in einem Puffer vom pH-Wert 6,8) zu 10 bis 20 μΐ Vollblut gegeben. Das Gemisch wird anschließend 10 Minuten inkubiert
Das Kaliumferricyanid oxidiert das Hämoglobin zu Methämoglobin. Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (Triton X-IOO) ist ein neutrales Detergens, das eine Lysis der Zellen unter Freisetzung von Hämoglobin herbeiführt Imidazol geht eine Koordination mit dem Eisen ein und verschiebt das Gleichgewicht der allosterischen Isomeren zur R-Form.
Das Absorptionsspektrum dieses Gemisches wird bei 560 und 635 nm aufgezeichnet Anschließend werden
2 μΐ einer 0,1-m Lösung von Inosithexaphosphat vom pH-Wert 6,8 zugesetzt Das letztgenannte Reagens reagiert mit der allosterischen Bindungsstelle von nicht-glycosyliertem Hämoglobin und verschiebt das Gleichgewicht der allosterischen Isomeren zurT-(taut)-Form. Anschließend wird wieder das Absorptionsspektrum bei 560 und 635 nm gemessen. Steigende Konzentrationen an glycosyliertem Hämoglobin machen sich durch eine Abnahme der Absorption bei 560 nm und eine Zunahme bei 635 nm bemerkbar.
Gegenstand der Erfindung sind auch Reagentien, die zwei oder mehr der folgenden Bestandteile enthalten:
(a) Ein Mittel zur Lysis von roten Blutkörperchen,
(b) ein Oxidationsmittel zur Oxidation von Hämoglobin zu Methämoglobin,
(c) einen hämbindenden Liganden und
(d) eine Substanz mit Bindungswirkung auf allosterische Stellen.
Diese Bestandteile sind in Wasser oder wäßrigem Puffer als Verdünnungsmittel, pH-Wert etwa 6 bis 8 und vorzugsweise etwa 63, enthalten. Kombinationen aus (a)+(b), (a)+(b)+(c) und (a)+(b)+(c)+(d) in einem Verdünnungsmittel werden als Reagentien bevorzugt
Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1
Reagens A:
0,1 m Imidazol, 0,2 millimolar K3Fe(CN)6, 0,05 Prozent (VolTVol.) Octylphenoxypolyäthoxyätha-
nol (Triton X400) als Detergens m Wasser,
PHW
Reagens B:
O1Im mpsithewphosphat (IHP) in Wasser, HWt6^
1,0 ml Reagens A wird bei 25°C mit 10 bis 20 μΐ Vollblut versetzt Zur Durchführung der Zellysis und zur Oxidation von Hämoglobin zu Methämpglobin wird
JO Minuten inkubiert Anschließend wird das Spektrum Im sichtbaren Bereich von 450 bis 700 nm aufgezeichnet, Wobei insbesondere dje Absorption bei 560 und 635 mn festgehalten wirft Anschließend wird das Reaktipnsgemiscfr mit 2μ1 Reagens B versetzt Hierauf wird das vorstehend erwähnte Spektrum noch einmal aufgenommen,
Eichsubstanzen werden hergestellt indem man Vollblut mit glycosyliertem Hämoglobin versetzt
Ergebnisse Kein IHP 635 nm I kein IHP + IHP P + IHP 635 nm Hb Normalisierte
Eichkurve 560 nm A A A-mp-J+m A 560 nm A*^ nm 560 nm A 560 nm a 635 nm A Differenz
% glycosyliertes Hb A ■ iJinerenz p IHP 0,705 0,098 A 0,637 0,135 AA
0,089 ±IHP =>8% 0,123 A-me
0,664 0,086 0,592 glycolisiertes 0,120 0,184
0,654 0.089 unbekannte 1 0,588 0,121 0,176
0% 0,657 0,090 0,593 0,118 0,169
5% 0,658 0,095 0,596 0,123 0,158
10% 0,663 0,091 0,609 0,117 0,144
15% 0,651 0,098 Probe (Vollblut) = 0,600 0,113 0,138
20% 0,645 0,123 0,611 0,128 0,090
25% 0,717 0,715 0,012
50% Berechnungen: A = A560 nm - A635 nn
100% Normalisierte
ι "ΓϊϊίΤίΤρηττ TT AA
A-MP
0,173 '
Eine Überprüfung nach dem Säulenverfahren (Han- Reagens C:
delsprodukt der Finnen Helena und ISOLAB) ergibt 45 1 Volumenteil Reagens B wird mit 500 Volumentei-Folgende Werte: len Reagens A von Beispiel 1 versetzt
Helena: 11,2%; ISOLAB: 7,8% Beispiel 2
Es wird ein Einzelreagens zugesetzt wobei die isobestischen Punkte für die IHP-Wirkung ausgenutzt werden, um auf die Hämoglobinkonzentration zu normalisieren.
Ergebnisse
Eichkurve
1,0 ml Reagens C wird mit 10 bis 20 μΐ Vollblut versetzt Zur Durchführung der Lysis, Oxidation von
so Hämoglobin zu Methämoglobin und Umsetzung von Methämoglobin mit Imidazol und IHP wird 10 Minuten inkubiert Das Spektrum im sichtbaren Bereich von 450 bis 700 nm wird aufgezeichnet wobei insbesondere die W^rte bei 476,560,635 und 700 nm festgehalten werden.
Bei den Wellenlängen 476 und 700 mn handelt es sich um isosbetische Wellenlängen für die IHP-Wirkung.
% glycosyliertes Hb A'
47«
.«5
1700
Normalisierte
ΔΛ
0% 0,60!} 0,592 0,123 0,016 0,792
5% 0,598 0,588 0,120 0,018 0,807
10% 1602 0.593 0.121 0,020 0,811
7 A4-* 0,596 29 50 457 8 A-no Normalisierte
0.609 A A
Fortsetzung 0,598 0,600 0,019 0,826
% glycosyliertes Hb 0.613 0.611 A*" 0,024 0,825
0.603 0.715 0,022 0,831
15% 0,598 0,118 0,026 0,871
20% 0.685 0,123 0.044 0.916
25% 0,117
50% 0,113
10O0O 0.128
Typische normale 0,653
unbekannte Probe
Berechnung: Normalisierte Δ A =
Beispiel 3
0.63"
A'6"-.V-"
Λ1'" - Λ"""
0.135
0.030
0.806
Reagens A:
50 millimolar Bis-tris-Puffer [Bis-(2-hydroxyäthyl)-imino-tris-(hydroxymethyl)-methan]. 0,05 Prozent (Vol/Vol.) Triton X-100, 1 millimolar n-Butylisocyanid und 2 mg/m! Natriumdithionit in Wasser, ρ H-Wert 6,8.
Reagens B:
2,5 millimolar Inosithexaphosphat (IHP) in Wasser, pH-Wert 6.8.
Eine gereinigte Probe von Hämoglobin A wird mit verschiedenen Mengen an glycosyliertem Hämoglobin vermischt. Man erhält Hämoglobinproben mit bekannten Mengen an glycosyliertem Hämoglobin.
100 μΙ der verschiedenen Hämoglobinproben werden jeweils in eine Küvette gegeben und mit 1,0 ml Reagens A versetzt. Nach etwa 2minütiger Inkubation wird die Absorption bei 530 und 585 nm abgelesen.
Nach den ersten Ablesungen bei 530 und 585 nm werde«; 10 μΙ Reagens B zugesetzt. Nach etwa lminütiger Inkubation wird wieder die Absorption bei 530 und 585 nm abgelesen.
«Ivc os\!;;rlc> Kein IHP Λ»' + IHP A^ A<;" - A .'?; + IHP
Hh V" 0.153 Λ5-'" 0.261 A5'1" - A .<8i - IHP
0 0.529 0.159 0,369 0.261 0.287
y , 0.511 0.174 0,363 0.260 0,290
in 0.489 0.177 0,368 0,258 0,343
I;- 0.478 0.191 0,362 0.268 0.346
20 0.487 0.191 0,377 0.258 0,368
2 ν . 0.460 0.361 0.383
Zu 10 bis 20 μΙ Vollblut wird Reagens A mit einem zusätzlichen Gehalt an 0,05 Prozent Triton X-100 als Detergens gegeben. Das Analysenverfahren wird wie vorstehend erläutert durchgeführt, um die unbekannte Menge an glycosyliertem Hämoglobin zu bestimmen.

Claims (9)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von glycosyliertem Hämoglobin in Blutproben, gekennzeichnet durch folgendeSchritte:
— chemische oder physikalische Behandlung der Blutprobe, um glycosyfiertes und nicht-glycosyliertes Hämoglobin aus den roten Blutkörperchen freizusetzen,
— Zumischen einer Substanz mit Bindungswirkung auf aHosterische Effektorstellen, die eine Bindung mit der allosterischen Effektorstelle des nicht-glycosylierten Hämoglobins eingeht und dabei eine Veränderung der Verteilung der allosterischen Hämoglobinformen bewirkt, und
— Messen dieser Verbindung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Hämrest des Hämoglobins mit einem hämbindenden Liganden koordiniert ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämoglobin zu Methämoglobin oxidiert ist
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutprobe zur Freisetzung von Hämoglobin aus den roten Blutkörperchen der Lysis mit einem Detergens unterzogen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Veränderung der Verteilung der allosterischen Hämoglobinformen durch Absorptionsspektroskopie im Bereich von 450 bis 700 mn gemessen wird.
6. Reagens zur Durchführung des Verfahrens gemäß Ansprüchen 1 bis 5, enthaltend zwei oder mehr der nachstehend aufgeführten Bestandteile:
(a) Mittel zur Lysis von roten Blutkörperchen,
(b) Mittel zum Oxidieren von Hämoglobin zu Methämoglobin,
(c) einem hämbindenden Liganden und
(d) eine Substanz mit Bindungswirkung für allosterische Effektorstellen in einem Verdünnungsmittel.
7. Reagens nach Anspruch 6, enthaltend zwei oder mehr der nachstehend aufgeführten Bestandteile:
(a) ein Detergens als Mittel zur Lysis von roten Blutkörperchen,
(b) Kaliumferridcyanid als Oxidationsmittel,
(c) Imidazol als hämbindenden Liganden und
(d) Inosithexaphosphat ab Substanz mit Bindungswirkung für allosterische Effektorstellen.
8. Reagens nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Kombination aus den Bestandteilen (a) und (b) enthält
9. Reagens nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Kombination aus den Bestandteilen (a), (b) und (c) enthält
IU. Reagens nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Kombination aus den Bestandteilen (a), (b), (c) und (d) enthält
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