DE3312380A1

DE3312380A1 - Verfahren zur abtrennung von haemoglobin a(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)c(pfeil abwaerts)

Info

Publication number: DE3312380A1
Application number: DE19833312380
Authority: DE
Inventors: Mark Seiji Mill Valley Calif. Hanamoto; Steve Kiyoshi Vallejo Calif. Tanaka
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1982-04-26
Filing date: 1983-04-06
Publication date: 1983-10-27
Also published as: GB2118948B; DE3312380C2; CA1189774A; US4389491A; GB8310652D0; GB2118948A; JPS58191968A

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft die Überwachung der Langzeit-Blutglucosespiegel bei Patienten, die unter Diabetes mellitus leiden, und verwandte Diagnose- und Prüfverfahren. Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Isolierung von Hämoglobin A₁ aus anderen glycosylierten Hämoglobin-Komponenten, die in Humanblut vorhanden sind.

Seit einiger Zeit ist es bekannt, daß die Menge an Hämoglobin A₁ (HbA₁), einer glycosylierten Form des Stamm-Hämoglobins (HbA)₄ im Blut von unter Diabetes leidenden Personen höher ist als im Blut von gesunden Personen. Hämoglobin A₁ selbst besteht aus mehreren Komponenten, von denen die hauptsächlichen identifiziert worden sind als HbA. , HbA.,. und HbA. . Diese drei

la Ib Ic

Komponenten werden als "schnelle Hämoglobine" bezeichnet, da sie beim Eluieren relativ schnell durch eine chromatographische Säule laufen. Das in der größten Menge vorliegende schnelle Hämoglobin ist HbA₁ , das auch als zuverlässigster Indikator für den Blutglucosespiegel bzw. -gehalt bekannt ist. Es ist auch bekannt, daß der Vorläufer für HbA₁ ein labiles Addukt ist, in dem die Brückenbindung zwischen den Glucosemolekülen und dem Hämoglobinmolekül eine Aldimin-Brückenbindung ist (nachstehend als "Schiffsche Base" bezeichnet). Wegen der bei seiner Bildung aus Glucose und Hämoglobin A auftretenden hohen Reaktionsrate sowie seiner ausgeprägten Neigung, wieder zu den Ausgangsmaterialien zu dissoziieren, spiegelt der Gehalt an Schiff'scher Base eher die Kurzzeit-Schwankungen in den Blutglucosespiegeln wieder als die Langzeit-Spiegel, die bei einer aussagekräftigen Diabetesanalyse bestimmt werden sollen. Aus diesem Grunde sind häufig Analysen ohne Entfernung der Schiff'sehen Basen schlechte Indikationen für die Fähigkeit eines Patienten, seinen Blutglucosespiegel zu regu-

lieren.

Bei der Analyse von glycosyliertem Hämoglobin ist es deshalb erwünscht, HbA₁ sowohl von seinem Schiff'sehen

Basen-Vorläufer als auch von anderen glycosylierten Hämoglobinen abzutrennen, um eine genaue und zuverlässige Indikation für die Langzeit-Glucoseregulierung zu erhalten.

Eine generelle Diskussion über glycosylierte Hämoglobine und ihre Bedeutung für Diabetes mellitus ist in Bunn et al., "Science", 200, S. 21-27 (1978), zu finden. Die Verwendung von Ionenaustauscherharzen wird von

Chou et al. in "Clin. Chem.", 2A_ (10), S. 1708-1710 (1978), und in den US-PS 4 142 855, 4 142 856, 4 142 857, 4 142 858, 4 168 147 und 4 238 196 beschrieben.

Zu bekannten Verfahren zur Entfernung der Schiff'sehen Basen-Addukte gehören die Inkubation von Erythrocyten in einer Salzlösung und die Dialyse des Hämolysats. Erstere wird von Goldstein et al. in "Diabetes", 29_, S. 623-628 (1980), von Svendsen et al. in "Diabetologia", 19, S. 130-136 (1980), und von Chou et al. in "Clin. Chem.", 2Λ (10), S. 1708-1710 (1978), beschrieben. Letztere wird von Goldstein et al. in supra und Widness et al. in "J. Lab. Clin. Med.", 95 (3), S. 386-394 (1980), beschrieben.

Die genaue Analyse von HbA₁ ohne vorherige Entfernung

der Schiff'sehen Base wurde erreicht unter Anwendung einer kolorimetischen Methode, in der eine Säurehydrolyse angewendet wird, woran sich die Behandlung mit Thiobarbitursäure anschließt (vgl. Svendsen et al., supra).

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A₁ von seinem Schiff'sehen

* Basen-Vorläufer und von anderen glycosylierten Hämoglobinen, bei dem Waschungen mit einer Salzlösung, eine Hämolysatdialyse oder komplizierte analytische Methoden nicht erforderlich sind. Dieses Verfahren umfaßt die

° Verwendung von zwei verschiedenen Elutions-Puffern, die nacheinander über einen Kationenaustauscher laufen gelassen werden. Die daraus.resultierende Auftrennung erfolgt schnell und leicht und ergibt eine zuverlässigere und genauere Bestimmung der Langzeit-Glucosespiegel *0 in Humanblut, die frei von Kurzzeit-Schwankungen und störenden Species ist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A₁ von anderen glycosy-¹^ lierten Hämoglobinen und von seinem Schiff'sehen Basen-Vorläufer in einer Humanblutprobe, das die folgenden Stufen umfaßt:
a) Die roten Blutkörperchen in der Probe werden lysiert unter Bildung eines Hämolysats,

b) ein schwacher Kationenaustauscher wird mit dem Hämolysat imprägniert,

c) eine erste Pufferlösung wird durch den imprägnierten Kationenaustauscher in einer ausreichenden Menge und mit einer geeigneten Zusammensetzung laufen gelassen, um zu bewirken, daß die instabilen Komplexe in HbA dissoziieren und um die von HbA. verschie-

1 c

denen störenden Substanzen bevorzugt aus dem Austauscher zu eluieren unter Zurücklassung von HbA₁ und HbA; die Pufferlösung, mit der dies erreicht wird, ist eine solche, die Ionen eines Alkalimetalls in einer Konzentration von etwa 0,02 M bis etwa 0,05 M enthält; und

d) eine zweite Pufferlösung wird dann aufgegeben, die bevorzugt HbA₁ eluiert; diese Lösung enthält ge-

löste Ionen eines Alkalimetalls in einer Konzentration von etwa 0,0 5 M bis etwa 0,11 M.

Die Volumina der ersten Pufferlösung und der zweiten

-13-

Pufferlösung können durch Routineversuche so eingestellt werden, daß man ein zweites Eluat erhält, das praktisch die Gesamtmenge des ursprünglich in dem Hämolysat vorhandenen HbA₁ und praktisch keine der anderen Hämoglobinkomponenten, glycosylierten oder anderen, enthält. Der Gehalt des zweiten Eluats an HbA. kann dann mittels

Ic

einer konventionellen Analyse leicht bestimmt werden.

Jede Stufe des Verfahrens wird nachstehend in der Reihenfolge, in der sie durchgeführt wird, näher beschrieben.

Das Lysieren der roten Blutkörperchen (roten Blutzellen) kann bewirkt werden unter Anwendung einer Hämolysetechnik auf die gesamte Blutprobe oder auf einen Teil davon, die (der) alle oder praktisch alle roten Blutkörperchen enthält. Zur Abtrennung der roten Blutkörperchen von dem Rest der Probe kann ein Zentrifugieren angewendet werden, das Lysieren kann aber auch leicht ohne eine derartige Abtrennung durchgeführt werden, ohne daß die Genauigkeit der Endanalyse darunter leidet. Es ist daher am zweckmäßigsten, die Hämolysetechnik auf die gesamte Probe anzuwenden.

Es ist jede Technik ausreichend, bei der die Membranen der roten Blutkörperchen in ausreichendem Maße zerreißen unter Freisetzung bzw. Abgabe des Zelleninhalts an die umgebende Flüssigkeit (Fluid). Sie umfaßt jede konventionelle Hämolysemethode. Eine bevorzugte Methode umfaßt die Zugabe einer wäßrigen Detergenslösung, woran sich die Inkubation der resultierenden Mischung bei etwa Raumtemperatur für einen Zeitraum von mindestens etwa 10 Minuten anschließt.

Wenn einmal die Hämolyse durchgeführt ist,"wird das Hämolysat zum Imprägnieren eines schwachen Kationenaustauschers verwendet. Obgleich jeder konventionelle Aufbau angewendet werden kann, wird der Kationenaustauscher vorzugsweise in einer vertikalen Säule

in Form eines Fixbettes angeordnet, durch das Flüssigkei ten laufen können. Das Volumen des Hämolysats ist am zweckmäßigsten mehrere Größenordnungen kleiner als das Volumen des Kationenaustauscherbettes, so daß eine vollständige Wechselwirkung zwischen dem Hämolysat und den Kationenaustauscherteilchen erzielt wird und während der beiden Elutionen ausreichend Gelegenheit für den Ionenaustausch und die Komponententrennung besteht. In der Regel dringt die Probe nur in den Eintrittsbereich des Kationenaustauscherbettes ein, so daß der Rest des Bettes für die weitere Wechselwirkung während des Elutionsverfahrens verbleibt.

Es können die verschiedensten Kationenaustauscher verwendet werden, vorzugsweise wird ein schwacher Kationenaustauscher mit einem schwach sauren Charakter verwendet. Beispiele für aktive Gruppen, die einen schwach sauren Charakter verleihen, sind Carbonsäure-, Methylcarbonsäure- und Phosphorsäuregruppen. Zu Beispielen für Harzmatrices gehören Acryl-, Methacryl- und Phenolpolymere sowie Polystyrol, Polyvinylverbindungen, Cellulose und Agarose. Ein bevorzugter Kationenaustauscher ist ein Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymeres.

Die Teilchengröße des Harzes ist nicht kritisch und sie variiert je nach Typ der verwendeten Säule. Bei vertikalen Säulen, die mit dem als Folge der Schwerkraft nach unten gerichteten Fluß der Pufferlösungen arbeiten, ist es am zweckmäßigsten, Teilchen irit einer Größe zwischen 0,15 und 0,03 mm (100 bis 400 mesh, U.S. Siebreihe), vorzugsweise von 0,074 bis 0,03 mm (200 bis 400 mesh, U.S. Siebreihe), zu verwenden.

Wenr. e-in Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymeres als Kationenaustauscher verwendet wird, sind vorzugsweise etwa 30 % bis etwa50 %, insbesondere etwa 35 % bis etwa 45 %, der aktiven Zentren des Kationenaustauschers

durch Ionen eines Alkalimetalls besetzt, während der Rest durch Wasserstoffionen besetzt ist. Unter dem hier verwendeten Ausdruck "Alkalimetall" sind die Metalle der Gruppe IA des Periodischen Systems der Elemente zu verstehen. Bevorzugte Metalle sind solche mit einem Atomgewicht, das gleich demjenigen von Kalium oder kleiner ist. Unter diesen sind Natrium und Kalium besonders bevorzugt und Natrium ist am meisten bevorzugt. . Die Einstellung des Ionenverhältnisses erfolgt nach Zweckmäßigkeitsgründen. Diese Einstellung muß vor dem Imprägnieren beendet sein.

Wenn einmal der Ionenaustauscher mit dem Hämolysat imprägniert ist, wird die erste der beiden Pufferlösungen über den Austauscher laufen gelassen. Es kann jeder beliebige konventionelle anionische Puffer verwendet werden, der mit dem Alkalimetallkation bei der Konzentration des letzteren an den aktiven Zentren des Austauschers kompatibel (verträglich) ist, ohne einen merklichen Aussalzungseffekt hervorzurufen, der in der Lage ist, einen pH-Wert innerhalb des gewünschten Bereiches zu halten und der die Blutprobe nicht abbaut. Das kritischste Merkmal des Elutionspuffers ist sein Alkalimetallionengehalt. Als Austauscher selbst sind Alkalimetalle mit einem Atomgewicht gleich demjenigen von Kalium oder kleiner bevorzugt, wobei Natrium und Kalium besonders bevorzugt sind und Natrium am meisten bevorzugt ist. Obgleich der Bereich der Alkalikationenkonzentration, die geeignet ist für die Erzielung der gewünschten Abtrennung, von dem jeweils verwendeten Alkalikation abhängt, liegt eine geeignete Konzentration im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 0,02 M bis etwa 0,05 M, vorzugsweise von etwa 0,03 M bis etwa 0,04 M.

Der pH-Wert des ersten Elutionspuffers muß lediglich die Bedingung erfüllen, daß die Hydrolyse des Hämoglobins durch eine übermäßige Acidität vermieden wird und die gewünschte Trennung erzielt wird. Unter Berück-

* sichtigung dieser Gesichtspunkte liegt der pH-Wert

des Elutionspuffers im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 5,0 bis etwa 7,5, vorzugsweise von etwa 6,5 bis etwa 7,0. Es kann jedes konventionelle Puffer- ° system mit einem pH-Wert innerhalb dieses Bereiches verwendet werden. Zu Beispielen gehören biochemische Puffer, zwitterionische Puffer und Phosphatpuffer. Bevorzugte Puffer sind Kalium- und Natriumphosphate, sowohl monobasische als auch dibasische. Natriumphosphate ■"■0 sind besonders bevorzugt.

Die Temperaturbetrachtungen des Verfahrens ähneln denjenigen irgendeines Ionenaustauschverfahrens. Die geeignete Arbeitstemperatur hängt somit vom Volumen des Austauschers in der Säule, der Teilchengröße und dem • Alkalimetallgehalt des Austauschers, der Oberflächengröße und anderen ähnlichen Variablen ab und kann durch Routineversuche leicht bestimmt werden. Am zweckmäßigsten ist es, bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von etwa 14⁰C bis etwa 35⁰C, vorzugsweise von etwa 17⁰C bis etwa 30⁰C, insbesondere von etwa 20⁰C bis etwa 28⁰C, zu arbeiten.

Das Volumen und die Durchflußrate des ersten Elutionspuffers, der über das Austauscherbett laufen gelassen wird, werden so gewählt, daß eine optimale Trennung erzielt wird. Sowohl das optimale Volumen als auch die optimale Durchflußrate des Elutionspuffers können durch

Routineversuche leicht bestimmt werden. 30

Schließlich können in der Pufferlösung verschiedene konventionelle Stabilisatoren, insbesondere Natriumazid und/oder Ethylendiamintetraessigsäure, in konventionellen Mengen enthalten sein.
35

Wenn einmal die erste Elution beendet ist, wird das Eluat beiseite gestellt und es wird ein zweiter Elu-

tionspuffer über das Harz laufen gelassen, um ein zweites Eluat zu sammeln, das von dem ersten getrennt gehalten wird. Der zweite Elutionspuffer ähnelt dem ersten mit Ausnahme der höheren Konzentration an Alkalimetallionen. Je nach dem verwendeten Alkalimetall liegt die Metall-■ ionenkonzentration in dieser zweiten Pufferlösung innerhalb des Bereiches von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M, vorzugsweise von etwa 0,07 M bis etwa 0,09 M. Auch hier kann jedes Metallion der Gruppe IA des Periodischen Systems der Elemente verwendet werden, vorzugsweise ein solches mit einem Molekulargewicht, das gleich demjenigen von Kalium oder kleiner ist, wobei Natrium und Kalium besonders bevorzugt sind und Natrium am meisten bevorzugt ist. Vorzugsweise sind das an dem Harz verwendete Alkalimetallion und das in jedem der beiden Elutionspuffer verwendete Alkalimetallion gleich.

Der pH-Wert des zweiten Elutionspuffers unterliegt den gleichen Erwägungen wie derjenige des ersten Elutionspuffers. Vorzugsweise liegt er jedoch innerhalb des Bereiches von etwa 1 pH-Werteinheit unterhalb des isoelektrischen Punktes von HbA. bis etwa zum isoelektri-

IC

sehen Punkt selbst. Besonders bevorzugt liegt der pH-Wert innerhalb des Bereiches von etwa 0,5 pH-Werteinheiten unterhalb des isoelektrischen Punktes von HbA₁ bis

Ic

etwa zum isoelektrischen Punkt selbst. Die Temperaturerwägungen des zweiten Elutionspuffers sind die gleichen wie sie oben für den ersten Elutionspuffer angestellt worden sind.

In entsprechender Weise sollte das Elutionsvolumen so sein, daß die Menge ausreicht zur Abtrennung praktisch des gesamten HbA₁ , das nach der ersten Elution an dem Harz zurückbleibt und wobei praktisch das gesamte nicht-.35 glycosylierte Hämoglobin zurückbleibt. Wie oben können das Elutionsvolumen und die Durchflußrate, die für das jeweils verwendete System geeignet sind, durch Routineversuche leicht bestimmt werden.

Eine Verbesserung des Wirkungsgrades der Abtrennung der instabilen Glucosekomplexe von HbA₁ kann dadurch erzielt werden, daß man der Flüssigkeitslösung eine ■ chemische Verbindung zusetzt, die eine Affinität für vicinale Diole aufweist und sich dadurch an den Glucoserest bindet. Es kann jede beliebige derartige Verbindung verwendet werden, die in der Pufferlösung löslich ist und inert ist mit Ausnahme ihrer Affinität gegenüber den Glucoseresten. Bevorzugte Verbindungen sind Dihydroxyborylverbindungen, wie z.B. Borsäure und niedere Alkylboronsäuren. Um die Abtrennung zu verbessern, wird die Verbindung in einer der an dem Verfahren beteiligten Flüssigkeitslösungen, dem Hämolysat, den Elutionspuffern oder einer Kombination derselben gelöst. Wenn die Dihydroxyborylverbindung in dem Hämolysat vorliegt, ist es bevorzugt, durch Zugabe einer Base den pH-Wert innerhalb eines Bereiches von etwa 4,5 bis etwa 6,5, insbesondere von etwa 5,0 bis etwa 6,0, zu halten. Die geeignete Menge der vorhandenen Dihydroxyborylverbindung hängt von dem Ausmaß ab, in dem sie benötigt wird, d.h. sie hängt ab von dem Trennungswirkungsgrad des Harzes selbst. Wenn sie verwendet wird, liegt die Konzentration der Dihydroxyborylverbindung im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 0,01 M bis etwa 1,00 M in dem Hämolysat oder in einer der beiden Pufferlösungen. Wenn ein Detergens als Hämolysereagens verwendet wird, ist die Dihydroxyborylverbindung zweckmäßig in einer Menge innerhalb des Bereiches von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M, bezogen auf das Hämolysat, in der Detergenslösung enthalten. In den Elutionspuffern liegt die Menge der Dihydroxyborylverbindung im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 0,01 M bis etwa 0,10 M, vorzugsweise von etwa 0,01 M bis etwa 0,03 M.

Wenn einmal die zweite Elution beendet ist, enthält das resultierende Eluat praktisch das gesamte HbA₁ , das in der ursprünglichen Probe enthalten war, und praktisch keine der anderen Hämoglobinkomponenten. Das Eluat kann

-19-

dann unter Anwendung einer konventionellen Methode, insbesondere unter Anwendung biochemischer Methoden und spektrophotometrischer Methoden, wie sie auf diesem Gebiet bekannt sind, analysiert werden zur Bestimmung seines Gehaltes an HbA₁ .

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit eines erfindungsgemäßen dualen Pufferverfahrens in bezug auf die Entfernung der an eine Schiffsche Base gebundenen Glucose von Hämoglobin und in bezug auf die Trennung von HbA₁ von den anderen Hämoglobinfraktionen in Proben von Humangesamtblut. Bei diesem Versuch wurde die Bildung der Schiff"sehen Base induziert durch Inkubieren von Gesamtblutproben mit mehreren verschiedenen Mengen Glucose bei 30⁰C für einen Zeitraum von 6 Stunden. Das Ausmaß der Entfernung der Schiff'sehen Base wurde verglichen mit der Menge, die unter Anwendung der'bekannten Salzlösungs-Waschmethode entfernt wurde.

α) Entfernung der Schiff'sehen Base gemäß dem Stand

der Technik

Ein 500 μΙ-Anteil jeder der mit Glucose behandelten Gesamtblutproben wurde dreimal mit 10 ml einer physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. Nach jedem Waschen wurden die Anteile (Aliquote) zentrifugiert und dekantiert. Nach dem zweiten Dekantieren wurden 10 ml physiologische Kochsalzlösung zugegeben und die Mischung wurde 4 1/4 Stunden lang bei 3 7°C inkubiert. Nach einem dritten Dekantieren wurden 200 μΐ physiologische Kochsalzlösung zu den gefüllten Zellen zugegeben.

B) Hämolyse

Sowohl die gewaschenen Proben als auch die ungewaschenen

Proben wurden dann lysiert, indem man einen gut gemischten 100 μΙ-Anteil jeder derselben mit 500 μ,Ι eines Hämolyse-Reagens, bestehend aus einer 0,33 vol.-%igen wäßrigen Lösung eines Polyoxyethylenether-Surfactant (-Tensids) mit dem Handelsnamen "Triton X-100" (der Firma Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pa./USA) vereinigte, die Mischung verwirbelte und mindestens 5 Minuten lang stehen ließ. Ein 20 μΙ-Anteil jedes Hämolysats wurde dann beiseite gestellt zum Vergleich mit den in I^ den folgenden Stufen erhaltenen eluierten Proben.

C) HbA₁ -Abtrennung

Es wurde eine Reihe von Ionenaustauschharzsäulen wie

folgt hergestellt: ein Bio-Rex 70-Ionenaustauschharz, 15

ein schwach saures Harz, das aus einem Methacrylsäure/-Divinylbenzol-Copolymeren bestand und von der Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien/USA, erhältlich ist, wurde mit Phosphorsäure konditioniert zur Erzielung

eines Verhältnisses von Wasserstoffionen zu Natriumionen 20

an den aktiven Zentren des Harzes von 55 : 45. Eine Kunststoff-Harzsäule mit einer Länge von etwa 12 cm und einer Volumenkapazität von etwa 12 ml, die in der Nähe des Bodens ein Sieb (eine Fritte) enthielt, wurde

mit 1,0 g (3,0 ml) des vorkonditionierten Harzes be-25

schickt. Die Säule wurde geschüttelt, um eine gleichmäßige Suspension zu erzielen. Unmittelbar nach dem Schütteln wurde die Kappe an der Oberseite der Säule abgenommen und die Spitze am Boden wurde abgebrochen, so daß die Säule in einen Abfallbehälter auslaufen konnte.

Nachdem die Säule ausgelaufen war, wurde mittels einer Pipette auf das Zentrum der Oberseite des Harzbettes ein 100 μΙ-Anteil Hämolysat aufgebracht. Dann wurde das Bett 5 bis 7 Minuten lang stehen gelassen.

Dann wurde eine erste Elutionspufferlösung durch die Säule laufen gelassen. Die Lösung enthielt einen 0,023 M

Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 und einer. Natriuinionenkonzentration von 3 7 meq/1. Es wurde eine Gesamtmenge von 5,0 ml der Lösung verwendet, von denen die ersten ml auf die Oberseite der Säule aufgetropft ° wurden und der Rest in einem Strom gegen die Säulenwand gerichtet wurde. Das Eluat wurde verworfen.

Nachdem die erste Elutionspufferlösung vollständig aus der Säule ausgelaufen war, wurde eine zweite EIu-

¹^ tionspufferlösung durch die Säule laufen gelassen.

Die zweite Lösung enthielt einen 0,05 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 und einer Natriumionenkonzentration von 74 meq/1. Diese Lösung wurde auf die gleiche Weise wie die erste Lösung zugegeben und durch das Harzbett laufen gelassen, wobei diesmal jedoch eine Gesamtmenge von 10,0 ml verwendet wurde.

Nachdem die zweite Pufferlösung aus der Säule vollständig ausgelaufen war, wurde das Eluat gründlich durchgemischt und in eine Küvette mit einem Lichtweg von 10 mm überführt und es wurde ihre Extinktion bei 415 nm in einem Labor-Spektrophotometer abgelesen, der mit dem zweiten Elutionspuffer als Blindprobe auf 0 eingestellt worden war.

Um den Hämoglobingehalt in dem zweiten Eluat als Prozentsatz des Gesamthämoglobins in der ursprünglichen Probe auszudrücken, wurde eine ähnliche Extinktionsmessung mit dem Hämolysat-Anteil durchgeführt, der vorher zur Seite gestellt worden war (vgl. den letzten Satz im obigen Abschnitt "Hämolyse"), nachdem er mit dem zweiten Elutionspuffer verdünnt worden war. Der Prozentsatz in dem Eluat wurde dann nach der folgenden Formel bestimmt:

% Hämoglobin in Extinktion des Eluats dem Eluat _{5 χ} (_{Extinktion des} Hämolysats)

Diese gibt den Gehalt an HbA₁ als Prozentsatz des

Gesamthämoglobins in der ursprünglichen Probe an. Bei diesem Verfahren wurden sowohl das gewaschene Hämolysat als auch das ungewaschene Hämolysat eluiert.

D) HbA , -Abtrennung

Zur Bestimmung der gesamten Schiff'sehen Base, die in den ursprünglichen Proben vorhanden war, wurde die bekannte Einzelpuffer-Elution angewendet. Aufgrund der

Ionenstärke dieses Puffers und des Verhältnisses von 15

Wasserstoffionen zu Natriumionen in dem Austauscher sammeln sich alleschnellen Hämoglobine (HbA₁ , HbA₁,

la id

und HbA. ) in ι
lc

Basen-Addukte.

und HbA. ) in dem Eluat einschließlich der Schiff'sehen

Es wurde das gleiche Ionenaustauscherharz mit einem etwas niedrigeren Verhältnis von Wasserstoffionen zu Natriumionen verwendet und das Hämolysat wurde auf die gleiche Weise wie oben angegeben auf das Harzbett aufgegeben. Der Elutionspuffer bestand aus einem 0,05 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 und einer Natriumionenkonzentration von 74 meq/1. Es wurde eine Gesamtmenge von 4,0 ml verwendet.

Wie oben wurden die Hämolysate sowohl aus den gewaschenen 30

als auch aus den ungewaschenen roten Blutkörperchen nach diesem Verfahren eluiert. Die Analyse des Eluats ergab die Gesamtmenge der drei schnellen Hämoglobine plus der Schiff'sehen Basen-Addukte. Ein Vergleich der

Eluate aus ungewaschenen Proben vor der Hämolyse mit ob

denjenigen aus gewaschenen Proben vor der Hämolyse ergab einen Hinweis auf die gesamte Schiffsche Base in den ursprünglichen Proben.

■"· Die Ergebnisse dieser Analysen sind in der nachstehenden Tabelle 1.1 zusammengestellt, aus der hervorgeht, daß die Zunahme von HbA₁ mit zunehmender Glucosebehandlung viel geringer ist als die Zunahme von HbA₁. Dies

° zeigt an, daß das erfindungsgemäße Zweipuffer-Verfahren ein zuverlässigerer Indikator für den Langzeit-Glucosegehalt im Blut darstellt.

Tabelle 10

Glycosyliertes Hämoglobin, bestimmt nach dem Zweipuffer-Verfahren gegenüber dem Ein -Puffer-Verfahren

zugegebene Glucosemange (mg/dl)	HbA₁ nach dem 1 c Zwei-Puffer-Verfahren	gewaschen (%)*	HbA₁ nach dem Ein -Puffer-Verfahren	7,58
0	ungewaschen (%)*	5,07	ungewaschen gewaschen (%)* (%)*	7,48
250	5,20	5,06	8,24	7,69
500	5,38	5,20	9,25	7 ,77
750	5,34	5,09	10,33	7,63
1000	5,56	4,93	11 ,38
5,85	11,96

* Prozentsatz des gesamten Hämoglobins in der ursprünglichen

Blutprobe 25

E) Prozent der gesamten Schiff'sehen Base, die nach dem Zwei-Puffer-Verfahren entfernt wurde

Die oben bestimmten Werte wurden in die nachstehende 30

Gleichung eingesetzt, um die Menge der Schiff'sehen Base zu errechnen, die nach dem Zwei-Puffer-Verfahren entfernt wurde, als Prozentsatz der ursprünglich in der Blutprobe vorhandenen Gesamtmenge.

% entfernte Schiffsche Base =

%HbA₁ ungewaschen gown sehen

%HbÄ₁ ungewaschen ι ÄIIbA gewaschen

%HbA₁ ungewaschen
%I!bA₁ gewaschen

-1

x100

worin bedeuten: % den Prozentsatz des gesamten Hämoglobins in der ursprünglichen Probe

HbA

1c

das in dem Eluat des Einzelpuffertests enthaltene Hämoglobin das in dem zweiten Eluat des Zwei-Puffer-Tests enthaltene Hämoglobin.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1.2 zusammengefaßt, aus der hervorgeht, daß in jedem Falle 20 der größte Teil der Schiff"sehen Base entfernt wurde.

Tabelle 1.2

Prozent der gesamten Schiff'sehen Base, die nach dem 25 Zwei-Puffer-Verfahren-^entfernt wurde

zugegebene Glucosemenge (mg/dl)	Beispiel 2	% entfernte Schiffsche Base
0	70,6
250	73,3
500	92,2
750	80,1
1000	67,1

Dieses Beispiel zeigt äqn Einfluß der Einführung von Borationen in das Hämol^sat und in den ersten Elutions-

puffer.

Gesamtblutproben von vier nicht-diabetischen Personen

wurden in jeweils zwei Portionenaufgeteilt. Eine Portion 5

jedes Paares wurde 5 Stunden lang bei 37°C mit 900 mg/dl Glucose inkubiert. Diese Portionen wurden dann als die Schiffsche Base enthaltende Proben verwendet. Die restlichen Portionen wurden bei 4⁰C bis zum Analysenzeitpunkt aufbewahrt, wonach sie als Proben ohne Schiff'-sche Base verwendet wurden (die tatsächliche Menge an Schiff'scher Base in diesen Proben war vernachlässigbar gering, da sie aus gesunden Personen gewonnen wurden und 18 Tage nach der Entnahme verstrichen waren).

Aliquote Anteile sowohl der inkubierten als auch der nicht-inkubierten Proben wurden dann lysiert und in Ionenaustauschsäulen und in Doppelpuffersystemen aufgetrennt auf die gleiche Weise wie im obigen Beispiel 1 unter Abschnitt C beschrieben. Mit jeder Probe wurden

^w vier verschiedene Versuche durchgeführt unter Verwendung variierender Mengen an Borationen sowohl in dem Hämolyse-Reagens als auch in dem ersten Elutionspuffer auf die folgende Weise:

²⁵ Tabelle 2.1

Borationengehalt der Reagentien Versuch Borationenkonzentration

Hämolysereagens

A 0,6M (pH 5,00)

B 0,6M (pH 5,00)

D
35

erster Elutxonspuffer	,023M
0	,077M
0	,023M
0

Die Reagentien waren im übrigen einheitlich: das Hämolysereagens wurde in einer Menge von 500 μΐ verwendet und enthielt 0,33 Vol-% Triton X-100; der erste Elutionspuffer wurde in einer Menge von 4,0 ml verwendet und enthielt einen 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 bei einer Natriumionenkonzentration von 3 9 meq/1; und der zweite Elutionspuffer wurde in einer Menge von 10,0 ml verwendet und enthielt einen 0,06 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 mit einer Natriumionenkonzentration von 87 meq/1. Das Harzbett selbst wurde in jedem Falle geringfügig modifiziert gegenüber dem im Beispiel 1 verwendeten Verhältnis H :Na von 55:45, um eine optimale Abtrennung der HbA₁ -Fraktion von den HbA - und HbA , -Fraktionen zu erzielen. Die Verhältnisse wurden ausgewählt durch Analysieren des ersten und des zweiten Eluats aus den Säulen, deren Betten in variierenden Graden mit Phosphorsäure behandelt worden waren. Das Endverhältnis in jedem Falle lag innerhalb des Bereiches von 55:45 bis 60:40.

In jedem Versuch wurde der Prozentsatz an HbA₁ durch Analyse des zweiten Elutionspuffers auf die im obigen Beispiel 1 beschriebene Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind für jede der untersuchten Proben in der folgenden Tabelle 2.2 angegeben. In der Tabelle sind auch die Werte für den Prozentsatz der entfernten Schiff'sehen Base angegeben, bestimmt nach der gleichen Rechenmethode wie in Beispiel 1 unter Anwendung einer Ein-Puffer-Elution mit 4,0 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,7 und einer Natriumionenkonzentration von 74 meq/1 als Indikator für die vorhandene gesamte Schiffsche Base. Aus der Tabelle geht hervor, daß die Entfernung der Schiff'sehen Base beträchtlich verbessert wurde durch die Verwendung höherer Konzentrationen an Borat und daß die Verwendung von Borat in dem Hämolysereagens besonders wirksam war.

-27-Tabelle

Borationenzugabe -

Testergebnisse bei Anwendung des Zwei-Puffer-Verfahrens

%HbA

1c

Ver- Pati- nicht inku- mit 900mg/ml % Zunahme % entfernsuch ent bierte Proben Glucose inku- als Folge te Schiff'-

bierte Proben der Inku- sehe Base bation

(Durch- (Durchschnitts- schnittswert) wert)

1	5,12	5,16
2	4,75	5,01
3	5,84	5,53
4	4,44	4,46
1	4,97	5,07
2	4,83	5,04
3	5,86	5,53
4	4,49	4,32
1	5,17	5,80
2	5,06	5,80
3	5,70	6,26
4	4,65	5,26
1	5,17	6,04
2	5,25	6,07
3	5,62	6,51
4	4,68	5,52

0,2

-0,8

12,4

16,5

99,6

100

78,0

70,8

Claims

DiPu-iNQ. R. SPLANEMANN dipu-chem. dr. B. REITZNER ZÜGEL. VERTRETER BEIM EPA · PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE EPO · MANDATAIRES AGREES PRES L1OEB ΒΙΟ-RAD LABORATORIES, Inc. eooo munchena 6. April 1983 Tel 13 2200 Wright Avenue Telefon (οβ?j 220207/22020? Telegramme; Inventius München . , , „ , , Telex: 528418 intus d Richmond, Californien 94804 USA Unsere Akte: 1325-1-12.127 Ihr Zeichen: Patentanmeldung Verfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A1 Patentansprüche

1. Verfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A₁ von anderen glycosylierten und nicht-glycosylierten Hämoglobinen und dem Schiff'sehen Basen-Vorläufer für Hämoglobin A₁ in einer Humanblutprobe, dadurch gekennzeichnet , daß man

a) die in der Probe enthaltenen roten Blutkörperchen lysiert unter Bildung eines Hämolysats,

b) einen schwachen Kationenaustauscher mit diesem Hämolysat imprägniert,

c) durch den Austauscher eine erste Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,02 M bis etwa 0,0 5 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt, um die Dissoziation des Schiff'sehen Basen-Vorläufers in Glucose und Hämoglobin A zu bewirken und die Glucose und die anderen glycosylierten Hämoglobine

Konten: Deutsche Bank AG, Mönchen, Konto-Nr. 2014 00? · Postscheck: München iOO40-807

gegenüber dem Hämoglobin A, dem Hämoglobin A₁ und

den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren,
d) durch den Austauscher eine zweite Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt, um das Hämoglobin A₁ gegenüber dem Hämoglobin A und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren, und
e) das in der Stufe (d) erhaltene Eluat sammelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkalimetallionen an dem Austauscher und in der ersten und in der zweiten Pufferlösung vom Typ her identisch sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkalimetallionen an dem Austauscher und in der ersten und in der zweiten Pufferlösung identisch sind und ein Atomgewicht haben, das ebenso groß oder kleiner ist als dasjenige von Kalium.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkalimetallionen an dem Austauscher und in der ersten und in der zweiten Pufferlösung identisch sind und ausgewählt werden aus der Gruppe Natrium und Kalium.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkalimetallionen an dem Austauscher und in der ersten und in der zweiten Pufferlösung Natriumionen sind.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Austauscher um ein Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymeres handelt, wobei etwa 30 bis etwa50 %.der aktiven Zentren an dem Austauscher durch Ionen eines Alkalimetalls besetzt

sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Alkalimetallionen in der ersten Pufferlösung etwa 0,03 M bis etwa 0,04 M beträgt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Alkalimetallionen in der zweiten Pufferlösung etwa 0,07 M bis etwa 0,09 M beträgt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis'8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Austauscher um ein Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymeres handelt, wobei etwa 30 bis etwa 50 % der aktiven Zentren an dem Austauscher durch Alkalimetallionen besetzt sind, daß die Konzentration der Alkalimetallionen in der ersten Pufferlösung etwa 0,03 M bis etwa 0,04 M beträgt, daß die Konzentration der Alkalimetallionen in der zweiten Pufferlösung etwa 0,07 M bis etwa 0,09 M beträgt und daß es sich bei all diesen Alkalimetallionen um Natriumionen handelt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der ersten Pufferlösung und bei der zweiten Pufferlösung jeweils um Phosphatpuffer handelt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der ersten Pufferlösung und der pH-Wert der zweiten Pufferlösung jeweils innerhalb des Bereiches von etwa 6,3 bis etwa 7,3 liegen.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Harz um ein Polymeres von Methacrylsäure mit einer Teilchengröße innerhalb des Bereiches von etwa 0,15 bis etwa

0,03 mm (100 bis 400 mesh) handelt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Harz um ein Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymeres mit einer Teilchengröße innerhalb des Bereiches von etwa 0,074 bis etwa 0,03 mm (200 bis 400 mesh) handelt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen (c) und (d) bei einer Temperatur von etwa 14⁰C bis etwa 35⁰C durchgeführt werden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14,

dadurch gekennzeichnet, daß die Stufen (c) und (d) bei einer Temperatur von etwa 17⁰C bis etwa 3 0⁰C durchgeführt werden.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei allen diesen Alkalimetallionen um Natriumionen handelt, daß es sich bei der ersten Pufferlösung und bei der zweiten Pufferlösung um Phosphatpuffer, jeweils mit einem pH-Wert innerhalb des Bereiches von etwa 6,3 bis etwa 7,3 handelt, daß es sich bei dem Austauscher um ein Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymeres handelt, bei dem etwa 35 bis etwa 45 % der aktiven Zentren durch die Natriumionen besetzt sind, daß die Konzentration der Natriumionen in der ersten Pufferlösung etwa 0,03 M

gO bis etwa 0,04 M und die Konzentration der Natriumionen in der zweiten Pufferlösung etwa 0,07 M bis etwa 0,09 M betragen und daß die Stufen (c) und (d) bei einer Temperatur von etwa 20 bis etwa 28°C durchgeführt werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (a) durchgeführt wird, indem man die Probe einer wäß.rigen Detergenslösung zusetzt und die dabei erhaltene Mischung etwa bei Raum-

temperatur mindestens etwa 10 Minuten lang inkubiert.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine wirksame Menge einer Dihydroxyborylverbindung in mindestens einem Vertreter vorliegt, der ausgewählt wird aus der Gruppe Hämolysat vor Durchführung der Stufe (b), erste Pufferlösung vor Durchführung der Stufe (c) und zweite Pufferlösung vor·Durchführung der Stufe (d).
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19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (a) durchgeführt wird, indem man die Probe mit einer wäßrigen Detergenslösung vereinigt und der Detergenslösung vor Durchführung der Stufe (a) der ersten Pufferlösung vor Durchführung der Stufe (c) oder der zweiten Pufferlösung vor Durchführung der Stufe (d) eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 1,00 M zusetzt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) durchführt, indem man die Probe mit einer wäßrigen Detergenslösung vereinigt und der Detergenslösung vor Durchführung der Stufe (a) eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M zusetzt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) durchführt, indem man die Probe mit einer wäßrigen Detergenslösung vereinigt und der Detergenslösung vor Durchführung der Stufe (a) eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M zusetzt und den pH-Wert dieses Hämolysats innerhalb eines Bereiches von etwa 4,5 bis etwa 6,5 hält.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) durchführt,

indem man die Probe mit einer wäßrigen Detergenslösung vereinigt und der Detergenslösung vor Durchführung der Stufe (a) eine Dihydroxybory!verbindung in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M zusetzt und den pH-Wert dieses Hämolysats bei etwa 5,5 hält.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man der ersten Pufferlösung vor Durchführung der Stufe (c) eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 0,10 M zusetzt.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) durchführt, indem man die Probe mit einer wäßrigen Detergenslösung vereinigt und eine Dihydroxybory!verbindung der Detergenslösung vor Durchführung der Stufe (a) in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M und der ersten Pufferlösung vor Durchführung der Stufe (c) in einer Konzentra-

^u tion von etwa 0,01 M bis etwa 0,10 M zusetzt.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) durchführt, indem man die Probe mit einer wäßrigen Detergenslösung vereinigt und der Detergenslösung vor Durchführung der Stufe (a) eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration vonetwa 0,1 M bis etwa 1,0 M zusetzt, den pH-Wert dieses Hämolysats innerhalb des Bereiches

von etwa 4,5 bis etwa 6,5 hält und der ersten Pufferlö- ° sung weitere Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 0,10 M zusetzt.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufe (a) durchführt, indem man die Probe mit einer wäßrigen Detergenslösung vereinigt und der Detergenslösung vor Durchführung der Stufe (b) eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M zusetzt, den pH-

-τι Wert dieses Hämolysats bei etwa 5,5 hält und der ersten Pufferlösung weitere Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 0,10 M zusetzt.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dihydroxyborylverbindung auswählt aus der Gruppe Borsäure und der niederen Alkylboronsäuren.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man als Dihydroxyborylverbindung Borsäure verwendet.

29. Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes an Hämoglobin A in einer Humanblutprobe, die auch noch andere glycosylierte Hämoglobine und den Schiff'sehen Basen-Vorläufer für Hämoglobin A₁ enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man

b) einen Kationenaustauscher, der im wesentlichen aus einem Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymeren besteht,in dem etwa 30 % bis etwa 50 % der aktiven Zentren durch Ionen eines Alkalimetalls besetzt sind, wobei der Rest durch Wasserstoffionen besetzt ist, mit dem Hämolysat imprägniert,

c) durch den Austauscher eine erste Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,02 M bis etwa 0,05 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt, um eine Dissoziation des Schiff'sehen Basen-Vorläufers in Glucose und Hämoglobin A zu bewirken und die Glucose und die anderen glycosylierten Hämoglobine gegenüber dem Hämoglobin A, dem Hämoglobin A₁ und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren,

d) durch den Austauscher eine zweite Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt,

—δι um das Hämoglobin A₁ gegenüber dem Hämoglobin A und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren, und

e) das Eluat aus der Stufe (d) analysiert zur Bestimmung des Hämoglobins A₁ .

I C

30. Verfahren zur Bestimmung des Gehaltes an Hämoglobin A₁ in einer Humanblutprobe, die auch andere glycosylierte Hämoglobine und den Schiff'sehen Basen-Vorläufer für Hämoglobin A₁ enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) die in der Probe enthaltenen roten Blutkörperchen lysiert unter Bildung eines Hämolysats, indem man die Probe einer wäßrigen Lösung eines Detergens zusetzt, die im wesentlichen aus einem Polyoxyäthylenether-Surfactant (-Tensid) besteht und außerdem etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M Borsäure enthält und auf einen pH-Wert von etwa 5,5 eingestellt ist,

b) einen Kationenaustauscher, der im wesentlichen besteht aus einem Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymeren mit einer Teilchengröße innerhalb des Bereiches von etwa 0,15 bis etwa 0,03 mm (100 bis 400 mesh), in dem etwa 30 % bis etwa 50 % der aktiven Zentren durch Natriumionen besetzt sind, während der Rest durch Wasserstoffionen besetzt ist, mit dem Hämolysat imprägniert,

c) durch diesen Austauscher eine erste Phosphatpufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,03 M bis etwa 0,04 M gelösten Natriumionen, die außerdem etwa 0,01 M bis etwa 0,03 M Borsäure enthält und deren pH-Wert innerhalb des Bereiches von etwa 6,5 bis etwa 7,0 liegt, laufen läßt, um zu bewirken, daß der Schiffsche Basen-Vorläufer zu Glucose und Hämoglobin A dissoziiert, und um die Glucose und die anderen glycosylierten Hämoglobine gegenüber dem Hämoglobin A, dem Hämoglobin A₁ und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren,

d) durch den Austauscher eine zweite Phosphatpufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,07 M bis etwa 0,09 M gelösten Natriumionen, deren pH-Wert innerhalb des Bereiches von etwa 6,5 bis etwa 7,0 liegt, laufen läßt, um das Hämoglobin A₁ gegenüber

dem Hämoglobin A und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren, und e) das Eluat aus der Stufe (d) analysiert zur Bestimmung

des Hämoglobins A₁ .
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31. Reagens-Set für die Verwendung in einem Versuch zur Bestimmung des Gehaltes an Hämoglobin A₁ in einer Humanblutprobe, ohne daß die anderen glycosylierten oder nicht-glycosylierten Hämoglobine oder der Schiffsche Basen-Vorläufer für Hämoglobin A₁ stören, gekennzeichnet durch

a) einen schwachen Kationenaustauscher,

b) eine erste Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,02 M bis etwa 0,05 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls und

c) einer zweiten Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,0 6 M bis etwa 0,11 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls.

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32. Reagens-Set nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem umfaßt ein Hämolyse-Reagens mit oder aus einer wäßrigen Detergenslösung.

33. Reagens-Set nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem umfaßt ein Hämolysereagens mit oder aus einer wäßrigen Detergenslösung, die eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M enthält und worin die erste Pufferlösung außerdem eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 0,10 M enthält.