JPS58191968A - ヘモグロビンＡ↓１↓ｃの分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、糖尿病に悩む患者や糖尿病の診断に関して、
長期の血液中のグルコースレベルの監視に関するもので
ある。詳しくは、本発明は、人の血液中に存在するグリ
コジル化ヘモグロビン成分からヘモグロビンＡＩＣを単
離する方法に関するものである。

ヘモグロビンＡｓ　（ＨｂＡｔ）　、即ち成人のヘモグ
ロビン（ｌＩｂＡ　’）のグリコジル化体の量が正常人
の血液中より糖尿病患者の血液中に多いことが知られて
いた。ヘモグロビンＡＩはそれ自体数種の成分がらなり
、そのうちの主な成分はＨｂ＾ｌａ、　　ｌＩｂＡ１ｂ
及びＨｂＡ、ｃとして同定されている。これらの３つの
成分はクロマトグラフのカラムを道って比較的速＜ｆ６
ｍするため、ファーストヘモグロビンとして、知うして
いる。一番多く存在するファーストヘモグロビンは１Ｉ
ｂＡ１ｃであり、これは血液中のグルコースレベルの最
も信頼できる指標であることも知られている。また、Ｈ
ｂＡｌｃの前駆体が、グルコース分子とヘモグロビン分
子との間の結合がアルジ１３− ミン結合である不安定な付加物（以下シッフ塩基という
）であることも知られている。グルコースとヘモグロビ
ンＡとからのＨｂＡｌｃの生成反応速度がこれらの出発
原料への解離速度と同様に高いため、シッフ塩基のレベ
ルは、意義ある糖尿分析において定量することが要求さ
れる長期のグルコースレベルよりむしろ血液中のグルコ
ースレベルの短期の変動を表している。このため、シッ
フ塩基を除去しないで行う分析は、患者のグルコース制
御能力の指標としては、劣っている。

従って、グリコジル化ヘモグロビンを分析する場合、長
期のグルコースの制御の正確で信頼できる指標を得るた
めには、シッフ塩基前駆体及び他のグリコジル化ヘモグ
ロビンの両方がら１ＩｂＡｌｃを分離することが望まし
い。グリコジル化ヘモグロビン及びその糖尿病との関連
についての一般的礒Ｍはバーン（Ｂｕｎｎ）ら番こよっ
てサイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００．２１〜２７
頁（１９７Ｂ）に提供されている。イオン交換樹脂の使
用は、チョウ（Ｃｈｏｕ）らによってタリフ。ケミ　（
ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｗ。

１４− ）、２４αｌ、１７０８〜１７１０頁（１９７８）に、
及びアーキューフ（＾ｃｕｆｆ　）の一連の米国特許：
第４．１４２，８５５号、第４，１４２，８５６号、第
４，１４２，８５７号及び第４．１４２．８５８号（す
べて１９７８年３月６日に特許）、第４，１６８，１４
７号（１９７９年９月１８日に特許）及び第４．２３８
．１９６号（１９８０年１２月９日に特許）に記載され
ている。

シッフ塩基付加物を除去する従来の方法は赤血球の塩類
培養（ｓａｌｉｎｅ　１ｎｃｕｂａｔｉｏｎ　）及び溶
血物の透析を包含する。前者は、ゴールドスティン（Ｇ
ｏｌｄｓｔｅｉｎ　）らによってダイアビーティーズ（
Ｄｉａｂｅｔｅｓ）　、２９．６２３〜６２Ｂ頁（１９
８０）に、スヘンセン（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ）らによって
ダイアベトロシア（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ）　、１
９．１３０〜１３６頁（１９８０）に、及びチツウ（Ｃ
ｈｏｕ）らによってタリフ。ケミ　（ＣＩｉｎ、　Ｃｈ
ｅｗ、　）　、２４Ｑｌ、　１７０８〜１７１０頁（１
９７Ｂ）に記載されている。後者は、ゴールドスティン
（Ｇｏｌｄａｔｅｉｎ　）らによってサブラ（ｓｕｐｒ
ａ　）に、及びウィッドネス（Ｗｉｄｎｅｓｓ　）らに
よってジェイ、ラブ、タリノ。

メト、　　（Ｊ、　　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　　Ｗｅｄ
、）　　、９５（３１，３８６〜３９４頁（１９８０）
に記載されている。

予めシッフ塩基を除去しないでのＨｂＡＩＣの正確な分
析は、酸加水分解、次いでチオバルビッル酸での処理を
行う比色法によって達成されている。

これはスベンセン（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ）らによってサプ
ラ（ｓｕｐｒａ　）に記載されている。

本発明は、塩類による洗浄、溶血物の透析及び複雑な分
析法を必要としない、ヘモグロビンＡＩＣをそのシッフ
塩基前駆体から及び他のグリコジル化ヘモクロビンから
分離する、ヘモグロビンＡＩＣの分離方法を提供するも
のである０本発明の分離方法は、カチオン交換体に連続
的に通す２つの異なる溶離緩衝溶液の使用を含む。本発
明の分離方法によれば、迅速且つ容５に分離することが
でき、短期の変動や妨害物質のない、人の血液中の長期
のグルコースレベルのより正確で信頼できる定量を提供
することができる。

本発明は、下記の（ａ）、世）、（Ｃ１、（ｄｌ及び＋
ｅ）の工程からなる、人の血液のサンプル中のヘモグロ
ビンＡＩＣを他のグリコジル化及び非グリコジル化ヘモ
グロビン及びヘモグロビンＡＩＣの前駆体のシッフ塩基
から分離する、ヘモグロビンＡＩＣの分離方法である。

Ｔａｌ　　上記サンプルに含有される赤血球を分解し、
溶血物を形成する。

（ｂ）　　上記溶血物を弱カチオン交換体に含浸する。

（Ｃ）　　上記交換体に、アルカリ金属のイオンが約０
゜０２Ｍから約０．０５　Ｍの濃度で溶解している第１
溶離ｖｉ街溶液を通し、上記シッフ塩基前駆体をグルコ
ースとヘモグロビンＡに解離し且つ上記ヘモグロビンＡ
１上記ヘモグロビンＡＩＣ及び上記他の亦グリコジル化
ヘモグロビンより上記グルコース及び上記他のグリコジ
ル化ヘモグロビンを優先的に溶離する。

＋ｄ）　　上記交換体に、アルカリ金属のイオンが約０
゜０６Ｍから約０．１１Ｍの濃度で熔解している第２熔
離緩街溶液を通し、上記ヘモグロビンＡ及び上記他の非
グリコジル化ヘモグロビンより上記ヘモグロビンＡＩＣ
を優先的に溶離する。

＝１７− ｔｏ＞　　工程（ｄ）における溶出液を回収する。

第１及び第２溶離緩衝溶液の容量は、溶血物中に初めか
ら存在するＨｂＡＩＣの全部を実質的に含有し且つ他の
グリコジル化及び非グリコジル化ヘモグロビン成分の何
れも実質的に含有していない第２溶出液が得られるよう
に、通常の実験をすることによって調整することができ
る。第２ｆ４出液のＨｂ＾１ｃ含量は従来の分析法によ
って容易に定量することができる。

以下に本発明の分離方法を工程順に詳述する。

赤血球の分解は、完全な血液のサンプル、または赤血球
の全部若しくは実質的に全部を含有する一部の血液のサ
ンプルに溶血法を通用することによって達成することが
できる。上記サンプルの大部分から赤血球を分離するの
に遠心分離を用いることができるが、遠心分離を用いな
くとも最終分析の精度に悪影響を与えずに分解を容易に
達成することができる。従って、完全な血液のサンプル
に溶血法を通用するのが最も便利であろう。

溶血法は、赤血球の内容物質を外部の流体へ流−１８＝ 出させるのに十分に赤血球の膜を破壊する方法で十分で
ある。この方法には、従来の溶血法も包含される。好ま
しい方法は、清浄液の添加、次いでこの混合物を略室温
で少なくとも約１ｏ分間培養することを含む。

溶血したら、溶血物を弱カチオン交換体に含浸する。カ
チオン交換体は、従来のように配置したものを使用する
ことができるが、好ましくは、液体が通過できる固定ベ
ッドのように鉛直カラム内に配置する。溶血物とカチオ
ン交換体の粒子との間の充分な相互作用を達成し且つ２
回の溶離の間中、イオン交換及び成分の分離のための充
分な機会を与えるには、溶血物の容量は、カチオン交換
体ベッドの容量より幾分少なめにするのが最適である。

典型的には、サンプルは、カチオン交換体ベッドの占有
領域にのみ浸透し、溶離工程の間にさらに一層の相互作
用のためにベッドの残部を通過する。

本発明においては、種々のカチオン交換体を用いること
ができるが１．好ましくは、弱酸性の弱カチオン交換体
を用いるのがよい。弱酸性を与える活性基の例としては
、カルボン酸、メチルカルボン酸及びリン酸の基が挙げ
られる。樹脂マトリックスの例としては、ポリスチレン
、ポリビニル化合物、セルロース及びアガロースの他に
アクリル樹脂、メタクリル樹脂及びフェノール樹脂を挙
げることができる。好ましいカチオン交換体は、メタク
リル酸とジビニルベンゼンとの共重合体である。

上記樹脂の粒子サイズは特に制限されるものではなく、
使用するカラムのタイプに応じて変化させる。溶離緩衝
溶液の重力による流下によって操作する鉛直カラムにお
いては、１００〜４００メソシユ〔ニー、ニス、シブ　
シリーズ（Ｕ、Ｓ、　５ｉｅｖｅ　５ｅｒｅｉｓ　）　
）　、好ましくは２ｏｏ〜４ｏｏメソシユの粒子サイズ
のものを使用するのが最も都合がよい。

カチオン交換体としてメタクリル酸とジビニルベンゼン
の共重合体を使用する場合、カチオン交換体の活性点の
約３０％から約５０％、好ましくは、約３５％から約４
５％がアルカリ金属のイオンで、残りが水素イオンで占
有されていることが好ましい、ここで、アルカリ金属と
は、周期律表の第１ａ属の金属を示すものである。好ま
しいアルカリ金属は原子量がカリウムと同じか若しくは
それ未満のものである。これらのうち、ナトリウムとカ
リウムが特に好ましく、そしてナトリウムが最も好まし
い、イオンの割合の調整は都合よく達成される。この調
整は溶血物の含浸前に行っておく必要がある。

イオン交換体に溶血物を含浸したら、２つの溶離＠衝溶
液の内の第１番目のものく第１溶離緩衝溶液）を上記交
換体に通す。著しい塩効果を引き起こさずに、上記イオ
ン交換体の活性点において後者の濃度でアルカリ金属カ
チオンと両立し、所望の範囲内にｐＨレベルを保持でき
、且つ血液のサンプルを劣化させない、従来のアニオシ
緩衝溶液を用いることができる。溶離緩衝溶液の最も臨
界的特徴は、そのアルカリ金属のイオンの含量である。

上記交換体の場合と同様、原子量がカリウム２１− と同じか若しくはそれ未満のアルカリ金属が好ましく、
それらのうち特にナトリウムとカリウムが好ましく、そ
してナトリウムが最も好ましい、所望の分離を達成する
のに適当なアルカリカチオンの濃度範囲は使用する特定
のアルカリカチオンに依存するが、適当な濃度は通常的
０．０２Ｍから約０．０５Ｍ、好ましくは０．０３Ｍが
ら０．０４Ｍ（７）範囲内である。

第１溶離緩衝溶液のｐＨは、過剰の酸度によるヘモグロ
ビンの加水分解を避け、所望の分離を達成する観点から
決ｉする。これらの観点を考慮すると、第１熔離緩衝溶
液のｐＨは通常的５．０から約７゜５、好ましくは約６
．５から約７．０の範囲内である。

ｐＨがこの範囲内にある、従来の緩衝溶液系を用いるこ
とができる。この例としては、生化学緩衝溶液、双性イ
オンのｖｉ街温溶液びホスフェート緩衝溶液が挙げられ
る。好ましい緩衝溶液は、−塩基性及び二塩基性の、カ
リウム及びナトリウムホスフェートである。ナトリウム
ホスフェートが特に好ましい。

２２− この工程の温度条件は、イオン交換の工程の場合と同様
である。適当な操作温度は、カラムの交換体の容量、交
換体の粒子サイズ及びアルカリ金属の含量、表面積及び
他の同様な変化に依存するが、通常の実験を行うことに
よって容易に決定することができる。温度を約１４℃か
ら約３５℃、好ましくは約１７℃から約３０℃、更に好
ましく奢 は約２０℃から約２８℃の範囲内で操作することが最も
都合がよいであろう。

交換体ベッドを通る第１溶離緩衝溶液の容量及び流速は
、最適な分離を与えるように選択される。

第１溶離緩ｔｉｔ溶液の最適な容量及び最適な流速は通
常の実験を行うことによって容易に決定することができ
る。

種々の従来の安定剤、特にナトリウムアゾ化物及び／又
はエチレンジアミンテトラ酢酸を従来の使用量で第１溶
離緩街溶液に含有させることができる。

１回目の溶離が終了したら、第１溶出液を取って置き、
第２熔離緩衝溶液を樹脂に通し第２ｆ４出液を集める。

第２溶出液は第１溶出液とは分離しておく、第２溶離緩
街溶液はアルカリ金属のイオンの濃度が高い以外は第１
溶離緩衝溶液と同様である。第２溶離媛衝溶液における
アルカリ金属のイオンの濃度は、使用するアルカリ金属
に依存するが、約０．０６Ｍから約０．１１Ｍ、好まし
くは約０．０７Ｍから約０．０９　Ｍの範囲である。再
び、周期律表の第１ａ属の金属のイオンを用いることが
でき、それらのうち原子量がカリウムと同じが若しくは
それ未満のものが好ましく、特にナトリウムとカリウム
が好ましく、そしてナトリウムが最も好ましい。樹脂（
交換体）及び２つの溶ｍ緩衝溶液で用いられるアルカリ
金属のイオンは同じ種類のものが好ましい。

第２溶離緩衛溶液のｐＨは、第１溶離緩衝溶液の場合と
同様な観点から決定する。但し、好ましくは、第２溶離
緩衝溶液のｐＨは、ｎｂａｌ（、の等電点より約ｔｐｎ
下からＨｂ＾１ｃの略等電点までの範囲内である。更に
好ましくは、ＨｂＡｌ（Ｈの等電点より約０゜５ｐＨ下
から１ＩｂＡ１ｃの略等電点までの範囲内である。

第２溶離緩街溶液の溶離工程の温度条件は前述した第１
熔離緩衝溶液の場合と同じである。

同様に、第２熔離緩街溶液の容量は、１回目の溶離後樹
脂に保持されているＨｂＡＩＱの全部を実質的に分離し
、非グリコジル化ヘモグロビンの全部を実質的に残すの
に十分な量である。第１ｆ４離緩衝溶液の場合と同様、
第２溶離ｍ衝溶液の適当な容量及び流速は通常の実験を
行うことによって容易に決定することができる。

必要に応じ、本発明で用いられる溶液（ｉ劇物、溶離＠
衝熔液など）に、隣位のジオールへの親和力を有し、グ
ルコース成分に結合する化学物質を含有させることによ
って、不安定なグルコース錯体をＨｂＡＩＣから効率良
く分離することができる。

溶離緩衝溶液に可溶で且つグルコース成分への親和力以
外は反応不活性な化学物質が用いることができる。

好ましい化学物質はホウ酸及び低級アルキルボロニック
酸類のような、ジヒドロキシボリル化合物である。

２５− 分離を促進させるために、上記化学物質を、本発明で用
いられる溶液・−溶血物、溶離ｍＳｉ液又はこれらの結
合物などに熔解する。溶血物中に存在するジヒドロキシ
ボリル化合物に関して、塩基を添加することによってｐ
Ｈを約４．５から約６．５、好ましくは約５．０から約
６．０の範囲内に保持することが好ましい。存在するジ
ヒドロキシボリル化合物の適当な量は、要求させる程度
即ち、樹脂自体の分離効率に依存する。使用する場合、
ジヒドロキシボリル化合物の濃度は、溶血物又は２つの
溶離緩衝溶液のいずれにおいても通常約０．ＯＩＭから
約１．００Ｍの範囲内である。溶血試薬として清浄液を
用いる場合は、溶血物に対して約０．１　Ｍから約１．
０　Ｍの範囲内のジヒドロキシボリル化合物の量を清浄
液に含有させると良い、溶離緩衝溶液において、ジヒド
ロキシボリル化合物の量は、通常約０．ＯＩＭから約０
．１０　Ｍ、好ましくは約０゜０１Ｍから約０．０３Ｍ
の範囲内である。

２回目の溶離が終了すると、得られる第２溶出液は、最
初のサンプルに存在する。ｂＡｌ（、の全部を２６一 実質的に含有し、他のヘモグロビン成分のいずれも実質
的に含有していない、第２溶出液は、そのＨｂ＾１ｃ含
量を公知の従来法、特に生化学的方法（ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）及び光電光度法−、
（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｅｅｅｔｒｉｃ　ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ　）によって分析することができる。

以下に本発明の実施例を示し本発明を更に詳説するが、
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ この実施例は、完全な人の血液のサンプルにおいて、シ
ッフ塩基結合したグルコースをヘモグロビンから除去す
ること及びｏｂＡｌ（、を他のヘモグロビンのフラクシ
ョンから分離することについて、本発明の２緩Ｓｆ４液
法の効果を示すものである。

この実験において、シッフ塩基の形成は、完全な血液の
サンプルを、これにいくつかの異なる量のグルコースを
加え、３０℃で６時間培養することによって行った。シ
ッフ塩基の除去の程度は、従来法の塩類洗浄法（ｓａｌ
ｉｎｅ　ｗａｓｈｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　）Ａ
、従来法によるシッフ塩基の除去 グルコース処理した完全な血液の各サンプルからそれぞ
れ５００μｌとり、これらを生理的含塩溶液１０１で３
回洗浄した。各洗浄後、これらを遠心分離し、検温した
。２回目の慢瀉後、生理的含塩溶液１０−■を加え、混
合物を３７℃で４Ｖ４時間培養した。３回目の検温後、
生理的含塩溶液２００μ！加え、セルに充填した。

Ｂ、溶血 洗浄サンプル及び非洗浄サンプルの両方を、十分に混合
した各サンプル１０ｏＩＩＩ！に商標名トリトンＸ　−
１００（Ｔｒｉｔｏｎ　　χ−１００、ローム　アンド
　ハース　カンパニー、ペンシルバニア州フィラデルフ
ィア）を持つポリオキシエチレンエーテル界面活性剤の
水溶液０．３３％（容量百分率）からなる溶血試薬５０
０μｌを加え、この混合物を攪拌し、少なくとも５分間
放置することによって分解した。各溶血物２０μｌを次
の工程で得られる溶離したサンプルと比較するため取っ
て置いた。

ｃ、　　ｎｂ＾１ｃの分離 一連のイオン交換樹脂カラムを次の遺り準備した。

カリフォルニア州りンチモンドのバイオ−ランド　ラボ
ラトリーズから入手できる、メタクリル酸とジビニルベ
ンゼンとの共重合体からなる弱酸性の樹脂であるバイオ
ーレンクス７０　（Ｂｉｏ−Ｒｅｘ７０）イ５オン交換
樹脂を、樹脂の活性点における水素イオンとナトリウム
イオンとの割合が５５：４５になるようにリン酸で調整
した。プラスチック樹脂カラムは、その長さが約１２ｃ
ｍで容量が約１２ｍ１で底部付近にフリ７トを有するも
のを用いた。

このカラムに、予め調整した上記樹脂１．０ｇ（３゜０
１）を充填した。このカラムを振とうして均一な懸濁液
にした。振とう後直ちにカラムの頂部のキンヤブを取外
し、底部の端を切取り、カラムから排出容器に流出でき
るようにした。

カラムから流出できるようにしたら、溶血物１００μｌ
を樹脂ベンドの頂部の中心にピペットで移した。それか
ら、ベッドを５〜７分間放置した。

２９− 次いで、第１溶離緩衡溶液をカラムに通した。

この第１溶離緩街溶液は、ｐｌｌが６．７でナトリウム
イオン濃度が３７ｓｅｑ　／Ｌ　（２）０．０２３Ｍ−
ホスフェート緩衝溶液を含有していた。この溶液を全部
で５．０ｍｌ用い、最初の１１をカラムの頂部に１適ず
つ加え、残りをカラムの壁を伝わらせて流入した。そし
て、その溶出液を捨てた。

第り溶離緩衝溶液をカラムから完全に流出させたら、第
２溶離緩街溶液をカラムに通した、この第２溶離緩衝溶
液は、ｐｕが６．７でナトリウムイオン濃度が７４＋ｗ
ｅｑ　／Ｌ　（７１０，０５Ｍ−＊スフニー　）緩衝溶
液を含有していた。この溶液を、全部で１０．０ｍｌ使
用した以外は第１溶離ｉｉｆｆｉｆｇ液と同様にして樹
脂ベッドに加え流出させた。

第２溶離緩衝溶液をカラムから完全に流出させたら、そ
の溶出液を十分に混合して１０ｍｍの光路を有するキュ
ベントに移し、その吸光度を、ブランクとして第２溶離
緩衝溶液を０とした、４１５ｒｖでの実験用光電光度針
（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔ＠ｒ　）で読みとっ
た。

＝３０− 第２溶出液中のヘモグロビン含量を最初のサンプル中に
存在するヘモグロビン全量に対するパーセントで示すた
めに、同様の吸光度測定を、前に取って置いた溶血物（
前記の溶血の項Ｂの末文を参照）について第２溶離緩衝
溶液で希釈後行った。

溶出液中の上記のヘモグロビンのパーセントは、次式に
よって決定した。

これは、ｏｂａｍ（、のレベルを最初のサンプル中のヘ
モグロビン全量に対するパーセントでＬＬ７いる。洗浄
及び非洗浄溶血物の両方をこの方法によって溶離した。

Ｄ、　　ＨｂＡｌａ、　Ｉｂ、　ＩＣの分離最初のサン
プル中に存在するシッフ塩基の全量を定量するために、
従来法の単−緩衝溶液溶離法を用いた。この緩衝溶液の
イオン強度及び交換体の水素イオン対ナトリウムイオン
の割合のために、ファーストヘモグロビン（Ｈｂ八へａ
＋　　ＩＩｂＡｌｂ及びＨｂＡ、Ｃ）の全部がシッフ塩
基付加物を含有する溶ナトリウムイオンに対する水素イ
オンの割合がわずかに低い、同じイオン交換樹脂を用い
、瀉血物を前と同じ方法で樹脂ベッドに置いた。

溶離緩衝溶液は、ｐｉが６．７でナトリウムイオン濃度
が７４ｍｅｑ　／Ｌの０．０５Ｍ−ホスフェート緩衝溶
液からなっていた。この溶離緩衝溶液を全部で４．０−
１用いた。

前と同様、洗浄及び非洗浄の赤血球の両方から溶血物を
この方法で溶離した。溶出液の分析は、３つの？アース
トヘモグロビンとシッフ塩基付加物との合計量を与えた
。

溶血前に洗浄したサンプルからの溶出液に対する、溶血
前に非洗浄のサンプルからの溶出液の比較は、最初のサ
ンプル中のシッフ塩基の全量を示していた。

これらの分析の結果を下記の表１．１に示す。

この表から明らかなように、グルコース処理の増加に伴
うＨｂＡｌｃの増加はＨｂＡｌの増加よりはるかに少な
い。これは、本発明の２Ｉａ街溶液法が血液中の長期グ
ルコース含量のより一層信頼できる指標であることを示
している。

表−１−土 ２緩衝溶液法対１緩衝溶液法により ０　　　　５．２０　　５．０７　　８．２４　　７．
５８２５０　　　　５．３８　　５，０６　　９．２５
　　７．４Ｂ５００　　　　５．３４　　５．２０　１
０．３３　　７．６９７５０　　　　５．５６　　５．
０９　１１．３８　　７．７？１０００　　　　５．８
５　　４．９３　１１．９６　　７．６３本最初の血液
のサンプル中のヘモグロビンの全量に対するパーセント Ｅ、　　２緩街溶液法によって除去されたシッフ塩基の
全量のパーセント ２ｖｉ街溶液法によって除去されたシッフ塩基の＝３３
− 量を血液のサンプル中に最初に存在する全量に対するパ
ーセントとして算出するため、上記の測定値を次式に挿
入した。

上式中、％は、最初のサンプル中のヘモグロビンの全量
に対するパーセントを示し、ｎｂＡｌはｌ緩衝溶液法の
溶出液に含有されているヘモグロビンを示し、１ｌｂＡ
ｌｃは２緩衝溶液法の第２溶出液に含有されているヘモ
グロビンを示す。

その結果を下記の表１．２に示す、この表から明らかな
ように、すべての場合において殆どのシ゛ツフ塩基が除
去されていたことが判る。

３４− 、表−１，２゜ ０　　　　　　　　　　７０．６ ２５０　　　　　　　　　７３、　３ ５００　　　　　　　　　９２．２ ７５０　　　　　　　　　８０、　１ １０００　　　　　　　　　６７、　１実施例２ この実施例は、瀉血物中及び第１溶離緩衝溶液中のボレ
ートイオンの含有の効果を示すものである。

４人の糖尿病患者ではない人の完全な血液のサンプルを
それぞれ２つずつのサンプルに分けた。

それぞれ２つのサンプルのうちの１つをグｌレコース９
００ａ＋ｇ／ｄｉを加え３７℃で５時間培養した。

これらのサンプルはシッフ塩基含有サンプＪしとして用
いた。残りのサンプルは、分析時間まで４℃で保存した
。これら残りのサンプルはシッフ塩基を含有しないサン
プルとして用いた（サンプルは正常人から得たものであ
り、又１８日間経過していたので、これらのサンプル中
のシッフ塩基の実際の量は無視できるものであった）。

培養及び非培養サンプルの両方を、分解し、上記実施例
１の項Ｃにおいて記載した方法と同じ方法により、イオ
ン交換カラム及び２つの緩衝溶液系で分離した。溶血試
薬及び第１溶離緩街溶液中のボレートイオンの量を次表
に示す通りに種々変えて、４つの異なった実験を各サン
プルについて行った。

表−」し−１ Ａ　　　　　０．６Ｍ　（ｐＨ５，００）　　　　　　
　０．０２３Ｍ８　　　　０．６Ｍ　（ｐＨ５，００）
　　　　　　　　−ＣＯ，０７７Ｍ Ｄ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ
，０２３ガ他の点では試薬は同様であったニトリトンＸ
−１００を０．３３％（容量百分率）含有する溶血試薬
を５００μβ用いｉｎｎが６．７でナトリウムイオン濃
度が３９ｓｅｑ　／ｌの０．０２５Ｍ−ホスフェート緩
衝溶液を含有する第１溶離緩衝溶液を４．（１＋１用い
；及び、ｐＨが６．７でナトリウムイオン濃度が８７ｓ
ｅｑ　／ＬのＯ，０６Ｍ−ホスフェート緩衝溶液を含有
する第２溶離緩衝溶液を１０．０ｍｌ用いた。

１１ｂＡＩ、及び１ＩｂＡ　１ｂのフラクシヨンからｌ
１ｂＡｔｃを嵌通に分離するために、各実験において、
実施例１で用いた５５　：　４５　　（Ｈ”　：Ｎａ”
）の割合をほん３７− の少し修正した樹脂ベッドを用いた。これらの割合は、
リン酸で種々の程度に処理したベッドのカラムからの第
１及び第２溶出液を分析することによって選択した。各
実験における最終の割合は、５５　：　４５〜６０　：
　４０の範囲内にある。

ＨｂＡＩＣのパーセントを、上記の実施例１に記載した
方法により第２溶出液を分析することによって各実験ご
とに測定した。その結果を、試験したサンプルごとに表
２．２に示す、また、除去されたシッフ塩基のパーセン
トも表２．２に示す、このパーセントは、ｐＨが６．７
でナトリウムイオン濃度が７４■ｅｑ／Ｌの０．０５　
Ｍ−ホスフェート緩衝溶液４．０ｍｌを用いる単−緩衝
溶液溶離法を存在するシッフ塩基の全量の指標として用
い、実施例１で用いた１算方法と同じ１算方法によって
算出した。この表から明らかなように、シッフ塩基の除
去が、より高濃度のボレートを用いることによってかな
り促進され、溶血試薬へのボレートの使用が特に効果的
であることが判る。

３８− 表−」−一影 Ａ　　　　　１　　　　　　５．１２　　　　　５．１
６　　　　０．２　　　９９．６２　　　　　４．７５
　　　　　５．０１３　　　　　　５．８４　　　　　
５．５３４　　　　　４．４４　　　　　４．４６Ｂ　
　　　　１　　　　　　４．９７　　　　　５．０７　
　　　−０．８　　１００２　　　　　４．８３　　　
　　５．０４３　　　　　　５．８６　　　　　５．５
３４　　　　　４．４９　　　　　４．３２（次頁に続
く） （表　２．２の続き） Ｃ１５，１７５，８０１２，４７Ｂ、０２　　　　５．
０６　　　５．８０ ３　　　　５．７０　　　６．２６ ４　　　　４．６５　　　５．２６ Ｄ　　　Ｉ　　　　　５．１７　　　６．０４　　１６
．５　　７０．８２　　　　５．２５　　　６．０７ ３　　　　５．６２　　　６．５１ ４　　　　４．６８　　　５．５２ 特許出願人 バイオ−ラッド　ラボラトリーズ インコーポレイテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記の（ａ）、（ｂ）、（Ｃ）、（ｄ）及び（ｅ
   ｌの工程からなる、人の血液のサンプル中のヘモグロビ
   ンＡｘｃを他のグリコジル化及び非グリコジル化ヘモグ
   ロビン及びヘモグロビン、Ａｔｃの前駆体のシッフ塩基
   から分離する、ヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 Ｔａ）　　上記サンプルに含有される赤血球を分解し、
   溶血物を形成する。 （ｂｌ　　上記溶血物を弱カチオン交換体に含浸する。 （Ｃ）　　上記交換体に、アルカリ金属のイオンが約０
   ゜０２Ｍから約０．０５Ｍの濃度で熔解している第１熔
   離緩ｆｆ＋溶液を通し、上記シッフ塩基前駆体をグルコ
   ースとヘモグロビンＡに解離し且つ上記ヘモグロビンＡ
   、上記ヘモグロビンＡｌｃ及び上記他の非グリコジル化
   ヘモグロビンより上記グルコース及び上記他のグリコジ
   ル化ヘモグロビンを優先的に溶離する。 （ｄ）　　上記交換体に、アルカリ金属のイオンが約０
   ゜０６Ｍから約０．１１Ｍの濃度で溶解している第２溶
   離緩衝溶液を通し、上記ヘモグロビンＡ及び上記他の非
   グリコジル化ヘモグロビンより上記ヘモグロビンＡＩＣ
   を優先的に溶離する。 （ｅ）　　工程（ｄ）における溶出液を回収する。 （２）上記交換体長′び上記第１及び第２熔離緩衡溶液
   中の上記アルカリ金属のイオンが同じ種類である、特許
   請求の範囲第（１１項記載のヘモグロビンＡＩＣの分離
   方法。 （３）上記交換体及び上記第１及び第２溶離ｖｉ街溶液
   中の上記アルカリ金属のイオンが同じ種類で且つその原
   子量がカリウムの原子量と同じかそれ未満である゛、特
   許請求の範囲第（１１項記載のヘモグロビンＡＩＣの分
   離方法。 （４）上記交換体及び上記第１及び第２溶離緩術溶液中
   め上記アルカリ金属のイオンが同じ種類で且つナトリウ
   ム及びカリウムからなる群から選択される、特許請求の
   範囲第（１１項記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （５）上記交換体及び上記第１及び第２溶離緩衝溶液中
   の上記アルカリ金属のイオンがナトリウムイオンである
   、特許請求の範囲第（１）項記載のヘモグロビンＡＩＧ
   の分離方法。 （６）上記交換体がメタクリル酸とジビニルベンゼンと
   の共重合体であり、且つ上記交換体の活性点の約３０％
   から約５０％がアルカリ金属のイオンで占有されている
   、特許請求の範囲第（１）項記載のヘモグロビンＡＩＣ
   の分離方法。 （７）上記第１熔離緩街溶液中のアルカリ金属のイオン
   の濃度が約０．０３　Ｍから約０．０４Ｍである、特許
   請求の範囲第（１）項記載のヘモグロビンＡＩＣの分離
   方法。 （８）上記第２ｆ４離緩衝溶液中のアルカリ金属のイオ
   ンの濃度が約０．０７Ｍから約０．０９　Ｍである、特
   許請求の範囲第（１１項記載のヘモグロビンＡＩＣの分
   離方法。 （９）上記交換体がメタクリル酸とジビニルベンゼンと
   の共重合体であり、及び、上記交換体の活性点の約３０
   ％から約５０％がアルカリ金属のイオンで占有され、上
   記第１溶離緩街溶液中のアルカリ金属のイオンの濃度が
   約０．０３　Ｍから約０．０４Ｍで、上記第２溶離緩衝
   溶液中のアルカリ金属のイオンの濃度が約０．０７　Ｍ
   から約０．０９Ｍであり、且つ、上記アルカリ金属のイ
   オンのすべてがナトリウムイオンである、特許請求の範
   囲第（１）項記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 ０Ｉｌｌｌ上記第１及び第２溶離ａ街溶液がホスフェー
   ト緩衝溶液である、特許請求の範囲第（５）項、第（６
   ）項、第（７）項、第（８）項又は第（９）項何れかに
   記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （１１）上記第１溶離緩衡溶液のｐＨ及び第２溶離ｉ衝
   溶液のｐＨがそれぞれ約６．３から約７．３の範囲内で
   ある、特許請求の範囲第（５）項、第（６）項、第（７
   ）項、第（８）項又は第（９）項何れかに記載のヘモグ
   ロビンＡＩＣの分離方法。 （１２）上記交換体が約１００メツシユから約４００メ
   ソシユの範囲内の粒子サイズの、メタクリル酸の重合体
   である、特許請求の範囲第＋１１項記載のヘモグロビン
   ＡＩＣの分離方法。 （１３）上記交換体が約２００メツシユから約４００メ
   ツシユの範囲内の粒子サイズの、メタクリル酸とジビニ
   ルベンゼンとの共重合体である、特許請求の範囲第（１
   ）項記載のヘモグロビンＡｌｅの分離方法。 （１４）上記工程（Ｃ）及び電ｄ）が約１４℃から約３
   ５℃の温度で実施される、特許請求の範囲第（］）項記
   載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （１５）上記工程（Ｃ）及びｆｄ）が約１７℃から約３
   ０℃の温度で実施される、特許請求の範囲第（１）項記
   載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （１６）上記アルカリ金属のイオンのすべてがナトリウ
   ムイオンであり、上記第１及び第２溶離緩衝溶液がそれ
   ぞれ約６．３から約７．３の範囲内のｐＨのホスフェー
   ト緩衝溶液であり、上記交換体が、その活性点の約３５
   ％から約４０％が上記ナトリウムイオンで占有されてい
   る、メタクリル酸とジビニルベンゼンとの共重合体であ
   り、上記第１溶離緩ｉｆｒ溶液中の上記ナトリウムイオ
   ンの濃度が約０．０３Ｍから約０．０４Ｍで、上記第２
   溶離緩衝溶５− 液中の上記ナトリウムイオンの濃度が約０．０７Ｍから
   約０．０９Ｍであり、及び、上記工程（Ｃ１及び（ｄ）
   が約２０℃から約２８℃の温度で実施される、特許請求
   の範囲第Ｔｌ）項記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法
   。 （１７）上記工程（ａｌが上記サンプルに清浄液を加え
   この混合物を少なくとも約１０分間略室温で培養するこ
   とによって達成される、特許請求の範囲第＋１）項記載
   のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （ＩＢ）上記工程世）前の上記溶血物、上記工程（Ｃ）
   前の上記第１溶離ｌｉｔ街溶液、及び上記工程（ｄ）前
   の上記第２熔離緩衝溶液からなる群から選択される少な
   くとも一つに、ジヒドロキシボリル化合物の有効量が存
   在する、特許請求の範囲第（１１項記載のヘモグロビン
   ＡＩＣの分離方法。 （１９）上記工程（８）が上記サンプルを清浄液と化合
   させることによって達成され、且つジヒドロキシボリル
   化合物が上記工程（ａ）前の上記清浄液、上記工程ＩＣ
   ）前の第１溶離緩衡溶液又は上記工程（ｄ）前の第２溶
   離緩（ｆｉ温溶液約０．ＯＩＭから約１．００Ｍ６− の濃度で添加されている、特許請求の範囲第（１）項記
   載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （２０）上記工程（ａｌが上記サンプルを清浄液と化合
   させることによって達成され、且つジヒドロキシボリル
   化合物が上記工程ｆａｌ前の上記清浄液に約０．１Ｍか
   ら約１．０　Ｍの濃度で添加されている、特許請求の範
   囲第（１）項記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （２１）上記工程（ａｌが上記サンプルを清浄液と化合
   させることによって達成され、且つジヒドロキシボリル
   化合物が上記工程（ａ）前の」二記清浄液に約０．１Ｍ
   から約１．０　Ｍの濃度で添加され、且つ、上記溶血物
   のｐＨが約４．５から約６．５の範囲内に保持されてい
   る、特許請求の範囲第（１）項記載のヘモグロビンＡＩ
   Ｃの分離方法。 （２２）上記工程（ａ）が上記サンプルを清浄液と化合
   させることによって達成され、且つジヒドロキシボリル
   化合物が上記工程ｆａｌ前の上記清浄液に約０、１　Ｍ
   から約１．０Ｍの濃度で添加され、且つ、上記溶血物の
   ｐＨが約５．５に保持されている、特許請求の範囲第（
   １１項記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （２３）ジヒドロキシボリル化合物が上記工程ｆＣ１前
   の上記第１溶離緩衝溶液に約０．　ＯＩ　Ｍから約０゜
   １０Ｍの濃度で添加されている、特許請求の範囲第（１
   １項記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （２４）上記工程ｔａ）が上記サンプルを清浄液と化合
   させることによって達成され、且つジヒドロキシボリル
   化合物が、上記工程（ａｌ前の上記清浄液に約０．１　
   Ｍから約１．０　Ｍの濃度で、及び、上記工程（Ｃ１前
   の上記第１溶離緩衝溶液に約０．０１Ｍから約０．１０
   Ｍの濃度でそれぞれ添加されている、特許請求の範囲第
   （１１項記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （２５）上記工程（ａ）が上記サンプルを清浄液と化合
   させることによって達成され、且つジヒドロキシボリル
   化合物が上記工程（ａ）前の上記清浄液に約０．１Ｍか
   ら約１．０　Ｍの濃度で添加され、且つ、上記溶血物の
   ｐＨが約４．５から約６．５の範囲内に保持され、更に
   ジヒドロキシボリル化合物が上記第１溶離緩街溶液に約
   ０．ＯＩＭから約０．１０　Ｍの濃度で添加されている
   、特許請求の範囲第（１１項記載のヘモグロビンＡＩＣ
   の分離方法。 （２６）上記工程（ａｌが上記サンプルを清浄液と化合
   させることによって達成され、且つジヒドロキシボリル
   化合物が上記工程ｆａｌ前の上記清浄液に約０．１Ｍか
   ら約１．０　Ｍの濃度で添加され、且つ、上記溶血物の
   ｐｌ（が約５．５に保持され、更にジヒドロキシボリル
   化合物が上記第１ｆｇ離緩衝溶液に約０゜０１Ｍから約
   ０．１０Ｍの濃度で添加されている、特許請求の範囲第
   （１１項記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （２７）上記ジヒドロキシボリル化合物がホウ酸及び低
   級アルキルボロニック酸類からなる群から選択される、
   特許請求の範囲第（１８）項、第（１９）項、第（２０
   ）項、第（２１）項、第（２２）項、第（２３）項、第
   （２４）項、第（２５）項又は第（２６）項の何れかに
   記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （２８）上記ジヒドロキシボリル化合物がホウ酸である
   、特許請求の範囲第（１８）項、第（１９）項９− １第（２０）項、第（２１）項、第（２２）項、第（２
   ３）項、第（２４）項、第（２５）項又は第（２６）項
   の何れかに記載のヘモグロビンＡＩＣの分離方法。 （２９）下記の（ａｌ、（ｂｌ、（Ｃ１、（ｄｌ及び（
   ｅ）の工程からなる、ヘモグロビンＡＩＣ，他のグリコ
   ジル化及び非グリコジル化ヘモグロビン及びヘモグロビ
   ンＡＩＣの前駆体のシッフ塩基を含有する人の血液のサ
   ンプル中のヘモグロビンＡＩＣの定量方法。 （ａｌ　　上記サンプルに含有される赤血球を分解し、
   溶血物を形成する。 （ｂｌ　　活性点の約３０％から約５０％がアルカリ金
   属のイオンで占有されている、メタクリル酸とジビニル
   ベンゼンとの共重合体から本質的になるカチオン交換体
   に、上記溶血物を含浸する。 （Ｃ）　　上記交換体に、アルカリ金属のイオンが約０
   ゜０２Ｍから約０．０５Ｍの濃度で溶解している第１熔
   離１ｓ街溶液を通し、上記シッフ塩基前駆体をグルコー
   スとヘモグロビンＡに解離し且つ上記ヘモグロビンＡ１
   上記ヘモグロビンＡＩＣ及び上記他の非グリコジル化ヘ
   モグロビンより上記グルコース１０− 及び上記他のグリコジル化ヘモグロビンを優先的に溶離
   する。 （ｄ）　　上記交換体に、アルカリ金属のイオンが約０
   ゜０６Ｍから約０．１１Ｍの濃度で溶解している第２熔
   離緩街溶液を通し、上記ヘモグロビンＡ及び上記他の非
   グリコジル化ヘモグロビンより上記ヘモグロビンＡＩＣ
   を優先的に溶離する。 Ｔｅｌ　　ヘモグロビンＡＩＣに関して上記工程（ｄｌ
   における溶出液を分析する。 （３０）　Ｔｅｌ、（ｂｌ、ＴＣ）、（ｄ）の工程がそ
   れぞれ下記の（ａ）、（ｂｌ、（Ｃ）、（ｄ）の工程か
   らなる、特許請求の範囲第（２９）項記載のヘモグロビ
   ンＡＩＣの定量方法。 （ａ）　　上記サンプルに、ポリオキシエチレンエーテ
   ル界面活性剤から本質的になる清浄液を加え、更にｐｔ
   ＋が約５．５に調整された約０．１Ｍから約１．０　Ｍ
   の濃度のホウ酸を含有させることによって上記サンプル
   に含有される赤血球を分解し、溶血物を形成する。 （ｂｌ　　粒子サイズが約１００メツシユから約４００
   メツシユの範囲内にあり且つ活性点の約３０％から約５
   ０％がナトリウムイオンで残りが水素イオンで占有され
   ている、メタクリル酸とジビニルベンゼンとの共重合体
   から本質的になるカチオン交換体に、上記溶血物を含浸
   する。 （Ｃ）　　上記交換体に、ナトリウムイオンが約０．０
   ３Ｍから約０．０４Ｍの濃度で溶解し且つ約０．０１Ｍ
   から約０．０３Ｍの濃度のホウ酸を含有している、ｐｌ
   ＋が約６．５から約７．０の範囲内の第１ホスフエート
   溶離緩衝溶液を通し、上記シッフ塩基前駆体をグルコー
   スとヘモグロビンＡに解離し且つ上記ヘモグロビンＡ、
   上記ヘモグロビンＡｌｅ及び上記他の非グリコジル化ヘ
   モグロビンより上記グルコース及び上記他のグリコジル
   化ヘモグロビンを優先的に溶離する。 ＋ｄｌ　　上記交換体に、ナトリウムイオンが約０．０
   ７Ｍから約０．０９Ｍの濃度で溶解している、ｐｎが約
   ６．５から約７．０の範囲内の第２ホスフエート溶離緩
   衝溶液を通し、上記ヘモグロビンＡ及び上記他の非グリ
   コジル化ヘモグロビンより上記ヘモグロビンＡＩＣを優
   先的に溶離する。