DE3312380C2

DE3312380C2 - Verfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A↓1↓↓C↓

Info

Publication number: DE3312380C2
Application number: DE3312380A
Authority: DE
Inventors: Mark Seiji Mill Valley Calif. Hanamoto; Steve Kiyoshi Vallejo Calif. Tanaka
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1982-04-26
Filing date: 1983-04-06
Publication date: 1986-06-26
Also published as: GB2118948A; JPS58191968A; GB2118948B; US4389491A; GB8310652D0; DE3312380A1; CA1189774A

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Ionenaustauschverfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A ↓1 ↓c von anderen Hämoglobinkomponenten in einer Humanblutprobe. Nach diesem Verfahren wird die Probe zuerst lysiert und dann zum Imprägnieren eines schwachen Kationenaustauschers verwendet. Dann werden zwei Pufferlösungen nacheinander durch die Säule laufen gelassen, von denen die erste eine Alkalimetallionenkonzentration von etwa 0,02 M bis etwa 0,05 M und die zweite eine Alkalimetallionenkonzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M aufweisen. Das zweite Eluat enthält praktisch das gesamte Hämoglobin A ↓1 ↓c und praktisch keine der anderen Hämoglobinkomponenten der ursprünglichen Probe. Die Analyse des zweiten Eluats stellt somit eine zuverlässige Indikation für den Langzeit-Glucosespiegel im Blut eines Patienten dar und setzt dadurch den Patienten in die Lage, die durch die Nahrung aufgenommene Glucosemenge zu regulieren.

Description

Hämolysat vorhandenen HbAu- und praktisch keine der anderen Hämoglobinkomponenten, glycosylierten oder anderen, enthält. Der Gehalt des zweiten Eluats an HbA,,; kann dann mittels einer konventionellen Analyse leicht bestimmt werden.

Jede Stufe des Verfahrens wird nachstehend in der Reihenfolge, in der sie durchgeführt wird, näher beschrieben.

Die roten Blutkörperchen können in der gesamten Blutprobe oder in einem Teil davon, der alle oder praktisch

alle roten Blutkörperchen enthält, lysiert werden. Die roten Blutkörperchen können von dem Rest der Probe abzentrifugiert werden; das Lysieren kann aber auch leicht ohne eine derartige Abtrennung durchgeführt werden, ohne daß die Genauigkeit der Endanalyse darunter leidet. Es ist daher am zweckmäßigsten, die Hämolysetechnik auf die gesamte Probe anzuwenden.

Es ist jede Hämolysemethode geeignet, bei der die Membranen der roten Blutkörperchen in ausreichendem Maße unter Freisetzung des Zelleninhalts an die umgebende Flüssigkeit zerreißen. Vorzugsweise führt man die Hämolyse in Gegenwart einer wäßrigen Detergenslösung durch, wobei man die dabei erhaltene Mischung etwa bei Raumtemperatur mindestens etwa 10 min. lang inkubiert.

Nach der Hämolyse wird das Hämolysat zum Imprägnieren eines schwachen Kationenaustauschers verwendet. Obgleich jeder konventionelle Aufbau angewendet werden kann, wird der Kationenaustauscher vorzugsweise in einer vertikalen Säule in Form eines Fixbettes angeordnet, durch das Flüssigkeiten Ip.ufen können. Das Volumen des Hämolysats ist am zweckmäßigsten mehrere Größenordnungen kleiner als das Volumen des Kationenaustauscherbettes, so daß eine vollständige Wechselwirkung zwischen dem Hämolysat und den Kationenaustauscherteilchen erzielt wird und während der beiden Elutionen ausreichend Gelegenheit für den Ionenaustausch und die Komponententiennung besteht. In der Regel dringt die Probe nur in den bntrittsbereich des Kationenaustauscherbettes ein, so daß '■•er Rest des Bettes für die weitere Wechselwirkung während des Elutionsverfahrens verbleibt.

Es können die verschiedensten Kationenaustauscher verwendet werden, vorzugsweise wird ein schwacher Kationenaustauscher mit einem schwach sauren Charakter verwendet. Beispiele für aktive Gruppen, die einen schwach sauren Charakter verleihen, sind Carbonsäure-, Methyicarbonsäure- und Phosphorsäuregruppen. Zu Beispielen für Harzmatrices gehören Acryl-, Methacryl- und Phenolpolymere sowie Polystyrol, Polyvinylverbindungen, Cellulose und Agarose. Ein bevorzugter Kationenaustauscher ist ein Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymeres, wobei etwa 30 bis etwa .50%, insbesondere etwa 35 bis etwa 45%, der aktiver, Zentren an dem Austauscher durch Ionen eines Alkalimetalls besetzt sind, während der Rest durch Wasserstoffionen besetzt ist.

Die Teilchengröße des Harzes ist nicht kritisch und variiert je nach dem Typ der verwendeten Säule. Bei vertikalen Säulen, bei denen die Pufferlösungen nach unten fließen, liegt die Teilchengröße des Harzes vorzugsweise innerhalb des Bereichs von etwa 0,074 bis etwa 0,03 mm.

Man kann als Austauscherharz auch ein Polymeres von Methacrylsäure mit einer Teilchengröße innerhalb des Bereichs von etwa 0,15 bis etwa 0,03 mm verwenden.

Unter dem hier verwendeten Ausdruck »Alkalimetallionen« sind die Ionen der Metalle der Gruppe IA des

Periodensystems der Elemente zu verstehen. Bevorzugte Alkalimetalle sind solche mit einem Atomgewicht, das gleich demjenigen von Kalium oder kleiner ist. Vorzugsweise sind die Alkalimetallionen an dem Austauscher und in der ersten und in der zweiten Pufferlösung vom Typ her identisch und stellen vorzugsweise Natrium oder Kalium c¹ ir. Besonders bevorzugt wird Natrium.

Die Einstellung des lonenverhältnisses am Austauscher er'olgt nach Zweckmäßigkeitsgründen. Diese Einstellung muß vor dem Imprägnieren beendet sein.

Sobald der Ionenaustauscher mit dem Hämolysat imprägniert ist, wird die erste der beiden Pufferlösungen über den Austauscher laufen gelassen. Es kann jeder beliebige konventionelle anionische Puffer verwendet werden, der mit dem Alkalimetallkation bei der Konzentration des letzteren an den aktiven Zentren des Austauschers kompatibel (verträglich) ist, ohne einen merklichen Aussalzungseffekt hervorzurufen, der in der Lage ist, einen pH-Wert innerhalb des gewünschten Bereiches zu halten und der die Blutprobe nicht abbaut. Das kritischste Merkmal des Elutionspuffers ist sein Alkalimetallionengehalt. Als Austauscher selbst sind Alkalimetalle mit einem Atomgewicht gleich demjenigen von Kalium oder kleiner bevorzugt, wobei Natrium und Kalium besonders bevorzugt t:nd und Natrium am meisten bevorzugt ist. Obgleich der Bereich der Alkalikationenkonzentration, die für die gewünschte Abtrennung geeignet ist, von dem jeweils verwendeten Alkalikation abhängt, liegt είπΐ geeignete Konzentration im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 0,02 M bis etwa 0,05 M, vorzugsweise von etwa 0,03 M bis etwa 0,04 M.

Der pH-Wert der ersten Pufferlösung muß lediglich die Bedingung erfüllen, daß die Hydrolyse des Hämogiobins durch eine übermäßige Acidität vermieden wird und die gewünschte Trennung erzielt wird. Unlcr Berücksichtigung dieser Gesichtspunkte liegt der pH-Wert der ersten Pufferlösung im allgemeinen innerhalb des Bereiches von etwa 0,5 bis etwa 7,5, vorzugsweise von etwa 6,3 bis etwa 7,3. Es kann jedes konventionelle Puffersystem mit einem pH-Wert innerhalb dieses Bereiches verwendet werden. Zu Beispielen gehören biochemische Puffer, zwitterionische Puffer und Phosphatpuffer. Bevorzugte i'uffer sind Kalium- und Natriumphosphate, sowohl monobasische als auch dibasische. Natriumphosphate sind besonders bevorzugt.

Die Temperaturen des Verfahrens entsprechen denen der üblichen lonenaustauschverfahren. Die geeignete Arbeitstemperatur hängt somit vom Volumen des Austauschers in der Säule, der Teilchengröße und dem Alkalimetallgehalt des Austauschers, der Oberflächengröße und anderen ähnlichen Variablen ab und kann durch Routineversuche leicht bestimmt werden. Am zweckmäßigsten ist es, bei einer Temperatur innerhalb des Bereiches von etwa 14°C bis etwa 35°C, vorzugsweise von etwa 17°C bis eitta 30⁰C, insbesondere von etwa 20⁰C bis etwa 28°C, zu arbeiten.

Das Volumen und ώ j Durchflußrate des ersten Elutionspuffers, der über das Austauscherbett laufen gelassen wird, werden so gewählt, daß eine optimale Trennung erzielt wird. Sowohl das optimale Volumen als auch die

optimale Durchflußrate des Elutionspuffers können durch Routincversuche leicht bestimmt werden.

Schließlich können in der Pufferlösung verschiedene konventionelle Stabilisatoren, insbesondere Natriurnazid und/oder Ethylendiamintetraessigsäure, in konventionellen Mengen enthalten sein.

Sobald die erste Elution beendet ist. wird das Eluat beiseite gestellt und es wird ein /weiter Elutionspuffcr über das Harz laufen gelassen, um ein zweites Eluat zu sammeln, das von dem ersten getrennt gehallen wird. Der ϊ zweite Elutionspuffcr ähnelt dem ersten mit Ausnahme der höheren Konzentration an Alkalimetallionen. Je nach dem verwendeten Alkalimetall liegt die Metallionenkonzentration in dieser zweiten Pufferlösung innerhalb des Bereiches von etwa 0.06 M bis etwa 0.11 M, vorzugsweise von etwa 0,07 M bis etwa 0.09 M. Auch hier kann jedes Metallion der Gruppe IA des Perioden-Systems der Elemente verwendet werden, vorzugsweise ein solches mit einem Molekulargewicht, das gleich demjenigen von Kalium oder kleiner ist, wobei Natrium und in Kalium besonders bevorzugt sind und Natrium am meisten bevorzugt ist. Vorzugsweise sind die Alkulimetallionen an dem Austauscher und in der ersten und in der zweiten Pufferlösung vom Typ her identisch.

Der pH-Wert der zweiten Pufferlösung entspricht etwa dem der ersten Pufferlösung.

Vorzugsweise liegt er jedoch innerhalb des Bereichs von etwa einer pH-Werteinheit unterhalb des isoelektrischen Punktes von HbA_k bis etwa zum isoelektrischen Punkt selbst. Besonders bevorzugt liegt der pH-Wert ΐϊ innerhalb des Bereiches von etwa 0.5 pH-Werteinheiten unterhalb des isoelektrischen Punktes von HbA_k bis etwa zum isoelektrischen Punkt selbst. Die Temperatur der zweiten Pufferlösung entspricht ebenfalls der der ersten Pufferlösung.

In entsprechender Weise sollte das Elutionsvolumen so sein, daß die Menge ausreicht zur Abtrennung praktisch des gesamten HbA₁₁. das nach der ersten Elution an dem Harz zurückbleibt und wobei praktisch das _>o gesamte nicht-glycosyliertc Hämoglobin zurückbleibt. Wie oben können das Elutionsvolumen und die Durchflußrate. die für das jeweils verwendete System geeignet sind, durch Routineversuche leicht bestimmt werden.

Eine Verbesserung des Wirkungsgrades der Abtrennung der instabilen Glucosekomplexe von HbAi₁ kann dadurch erzielt werden, daß man der Flüssigkeitslösung eine chemische Verbindung zusetzt, die eine Affinität für vicinale Diole aufweist und sich dadurch an den Glucoserest bindet. Es kann jede beliebige derartige Verbindung verwendet werden, die in der Pufferlösung löslich ist und inert ist mit Ausnahme ihrer Affinität gegenüber den Glucoseresten.

Vorzugsweise liegt im Hämolysat. in der ersten Pufferlösung unoVoder in der zweiten Pufferlösung eine wirksame Menge einer Dihydroxyborylverbindung, wie Borsäure und niedere Alkylboronsäuren, vor. Es ist aus der US-PS 42 69 605 bekannt, eine Dihydroxyborylverbindung zur Entfernung der Schiffsche Basen-Vorläufer jo bei einer Bestimmung von glycosylierten Hämoglobinen zu verwenden: hie: wird die Dihydroxyborylverbinuüfig ä!ici"uiug.» an ciiicii festen Tr uger gebunden.

Man setzt die Dihydroxyborylverbindung vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 1.00 M zu. Wenn ein Detergens als Hämolysereagens verwendet wird, setzt man die Dihydroxyborylverbindung zweckmäßig in einer Menge von etwa 0.1 M bis etwa 1,0 M, bezogen auf das Hämolysat, zu. In den zum Eluieren verwendeten Pufferlösungen beträgt die Menge der Dihydroxyborylverbindungen im allgemeinen etwa 0,01 M bis etwa ö,iö M. vorzugsweise etwa ö.öi FvI bis etwa Ö,Ö3 M.

Sobald die zweite Elution beendet ist, enthält das resultierende Eluat praktisch das gesamte HbAi_c. das in der ursprünglicher. Probe enthalten war. und praktisch keine der anderen Hämoglobinkomponenten. Das Eluat kann dann unter Anwendung einer konventionellen Methode, insbesondere unter Anwendung biochemischer Methoden und spektrophotometrischer Methoden, wie sie auf diesem Gebiet bekannt sind, analysiert werden zur Bestimmung seines Gehalts an HbA_k.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung eines Reagens-Set, welches (a) einen schwachen Kationenajstauscher. (b) eine erste Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,02 M bis etwa 0,05 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls und (c) eine zweite Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls umfaßt, zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens. Das Reagens-Set kann zusätzlich ein Hämolyse-Reagens mit oder aus einer wäßrigen Detergenslösung enthalten, z. B. eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis 1,0 M, wobei die erste Pufferlösung zusätzlich eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 0.10 M enthalten kann.

Die Erfindung ist durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit eines erfindungsgemäßen dualen Pufferverfahrens in bezug auf die Entfernung der an eine Schiffsche Base gebundenen Glucose von Hämoglobin und in bezug auf die Trennung von HbAic von den anderen Hämoglobinfraktionen in Proben von Humangesamtblut. Bei diesem Versuch wurde die Bildung der Schiffschen Base induziert durch Inkubieren von Gesamtblutproben mit mehreren verschiedenen Mengen Glucose bei 30⁼C für einen Zeitraum von 6 Stunden. Das Ausmaß der Entfernung der Schiffschen Base wurde verglichen mit der Menge, die unter Anwendung der bekannten Salzlösungs-Waschmethode entfernt wurde.

A) Entfernung der Schiffschen Base gemäß dem Stand der Technik

Ein 500μ1-Αηΐεϋ jeder der mit Glucose behandelten Gesamtblutproben wurde dreimal mit 10 ml einer physiologischen Kochsaiziösung gewaschen. Nach jedem Waschen wurden die Anteile (Aliquote) zentrifugiert und dekantiert. Nach dem zweiten Dekantieren wurden 10 ml physiologische Kochsalzlösung zugegeben und die Mischung wurde 4'/₄ Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach einem dritten Dekantieren wurden 200 μΐ physiologische Kochsalzlösung zu den gefüllten Zellen zugegeben.

B) Hämolyse

Sowohl die gewaschenen Proben als auch die ungewaschenen Proben wurden dann lysiert. indem man einen

gut gemischten 100 μΙ-Anteil jeder derselben mit 500 μI eines Hämolyse-Reagens, bestehend aus einer 0,33 vo!.-°/oigen wäßrigen Lösung eines Polyoxyethylenether-Tensids vereinigte, die Mischung verwirbelte und mindestens 5 Minuten lang stehen ließ. Ein 20 μΙ-Anteil jedes Hämolysats wurde dann beiseite gestellt zum Vergleich mit den in den folgenden Stufen erhaltenen eluierten Proben.

C) HbA|_t-Abtrennung

Es wurde eine Reihe von lonenaustaurchharzsäulen wie folgt hergestellt: ein schwach saurer» Ionenaustauschharz, das aus einem Methacrylsäure/Divinylbenzol-Copolymeren bestand, wurde mit Phosphorsäure konditioniert, bis das Verhältnis von Wasserstoffionen zu Natriumionen an den aktiven Zentren des Harzes 55 :45 betrug. Eine Kunststoff-Harzsäule mit einer Länge von etwa 12 cm und einer Volumenkapazität von etwa 12 ml, die in der Nähe des Bodens ein Sieb (eine Fritte) enthielt, wurde mit 1,0 g(3.0 ml) des vorkonditionierten Harzes beschickt. Die Säule wurde geschüttelt, um eine gleichmäßige Suspension zu erzielen. Unmittelbar nach dem Schütteln wurde die Kappe an der Oberseite der Säule abgenommen und die Spitze am Boden wurde abgebrochen, so daß die Säule in einen Abfallbehälter auslaufen konnte.

Nachdem die Säule ausgelaufen war, wurde mittels einer Pipette -u'f da« Zentrum der Oberseite des Harzbettes ein 100 μΙ-Anteil Hämolysat aufgebracht. Dann wurde das Bett 5 bis 7 Minuten lang stehen gelassen.

Dann wurde eine erste Elutionspufferlösung durch die Säule laufen gelassen. Die Lösung enthielt einen

0.023 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 und einer Natriumionenkonzentration von 37 meq/l. Es wurde eine Gesamtmenge von 5,0 ml der Lösung verwendet, von denen die ersten ml auf die Oberseite der Säule aufgetropft wurden und der Rest in einem Strom gegen die Säulenwand gerichtet wurde. Das Eluat wurde verworfen.

Nachdem die erste Elutionspufferlösung vollständig aus der Säule ausgelaufen war, wurde eine zweite Elutionspufferlösung durch die Säule laufen gelassen. Die zweite Lösung enthielt einen 0,05 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 und einer Natriumionenkonzentration von 74 meq/l. Diese Lösung wurde auf die gleiche Weise wie die erste Lösung zugegeben und durch das Harzbett laufen gelassen, wobei diesmal jedoch eine jo Gesamtmenge von 10,0 ml verwendet wurde.

Nachdem die zweite Pufferlösung aus der Säule vollständig ausgelaufen war, wurde das Eluat gründlich durchgemischt und in eine Küvette mit einem Lichtweg von 10 mm überführt und es wurde ihre Extinktion bei 415 nm in einem Labor-Spektrophotometer abgelesen, der mit dem zweiten Elutionspuffer als Blindprobe auf 0 eingestellt worden war.

J5 Um den Hämoglobingehalt in dem zweiten Eluat als Prozentsatz des Gesamthämoglobins in der ursprünglichen Probe auszudrücken, wurde eine ähnliche Extinktionsmessung mit dem Hämolysat-Antei! durchgeführt, der vorher zur Seite gestellt worden war (vgl. den letzten Satz im obigen Abschnitt »Hämolyse«), nachdem er mit dem zweiten Elutionspuffer verdünnt worden war. Der Prozentsatz in dem Eluat wurde dann nach der folgenden Formel bestimmt:

_n, .... ι .· · , r-i Extinktion des Eluats ...

o/o Hämoglobin ,n dem Eluat = ^{x 10}°

Diese gibt den Gehalt an HbAi_c als Prozentsatz des Gesamthämoglobins in der ursprünglichen Probe an. Bei diesem Verfahren wurden sowohl das gewaschene Hämolysat als auch das ungewaschene Hämolysat eluiert.

r>\UhA, , .AhtronnnniT L^iρ i *«. M.1,0.1: ■ · —^l O

Zur Bestimmung der gesamten SchifFschen Base, die in den ursprünglichen Proben vorhanden war, wurde die bekannte Einzelpuffer-Elution angewendet. Aufgrund der Ionenstärke dieses Puffers und des Verhältnisses von Wasserstoffionen zu Natriumionen in dem Austauscher sammeln sich alle schnellen Hämoglobine (HbAu, HbAib und HbA_lc) in dem Eluat einschließlich der SchifFschen Basen-Addukte.

Es wurde das gleiche Ionenaustauscherharz mit einem etwas niedrigeren Verhältnis von Wasserstoffionen zu Natriumionen verwendet, und das Hämolysat wurde auf die gleiche Weise wie oben angegeben auf das Harzbett aufgegeben. Der Elutionspuffer bestand aus einem 0.05 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 und einer Natriumionenkonzentration von 74 mVal/l. Es wurde eine Gesamtmenge von 4,0 ml verwendet.

Wie oben wurden die Hämolysate sowohl aus den gewaschenen als auch aus den ungewaschenen roten

Blutkörperchen nach diesem Verfahren eluiert. Die Anlayse des Eluats ergab die Gesamtmenge der drei schnellen Hämoglobine plus der Schiffchen Basen-Addukte. Ein Vergleich der Eluate aus ungewaschenen

ro Proben vor der Hämolyse mit denjenigen aus gewaschenen Proben vor der Hämolyse ergab einen Hinweis auf die gesamte Schiffsche Base in den ursprünglichen Proben.

Die Ergebnisse dieser Analysen sind in der nachstehenden Tabelle 1.1 zusammengestellt, aus der hervorgeht, daß die Zunahme von HbAic mit zunehmender Glucosebehandlung viel geringer ist als die Zunahme von HbA,. Dies zeigt an, daß das erfindungsgemäße Zweipuffer-Verfahren ein zuverlässigerer Indikator für den Langzeit-Giucoses-ehalt im Blut darstellt.

Tabelle 1.1

Glycosyliertes Hämoglobin, bestimmt nach dem Zweipufferverfahren gegenüber dem Ein-Puffer-Verfahren

Zugegebene	HbAi₁ nachdem	gewaschen	HbAi nach dem	gewaschen
Glucoscmenge		(%)*)		(%)*)
(mg/dl)	Zwei-Puffer-Verfahren	5,07	Ein-Puffer-Verfahren	7,58
	ungewaschen	5,06	ungewaschen	7,48
0	(%)·)	5,20	(%)·)	7,69
250	5,20	5.09	8,24	7,77
500	5,38	4.93	9,25	7,63
750	5,34	10,33
1000	5.56	11,38
5,85	11,96

*) Prozentsatz des gesamten Hämoglobins in der ursprünglichen Blutprobe E) Prozent der gesamten Schiff'schen Base,

Die oben bestimmten Werte wurden in die nachstehende Gleichung eingesetzt, um die Menge der Schiffschen Base zu errechnen, die nach dem Zwei-Puffer-Verfahren entfernt wurde, als Prozentsatz der ursprünglich in der Blutprobe vorhandenen Gesamtmenge.

% entfernte Schiffsche Base =

worin bedeuten:

[% HbA, ungewaschen! _ r% % HbA, gewaschenj |_ %

HbAι _c ungewaschen Ί
HbA,,. gewaschen J

L %

HbA, ungewaschen!

HbA| gewaschen J

x 100

% den Prozentsatz des gesamten Hämoglobins in der ursprünglichen Probe

HbAi das in dem Eluat des Einzelpuffertests enthaltende Hämoglobin HbAi,- das indem zweiten Eluat des Zwei-Puffer-Tests enthaltene Hämoglobin.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1.2 zusammengefaßt, aus der hervorgeht, daß in jedem Falle der größte Teil der Schiffschen Base entfernt wurde.

Tabelle 1.2

Prozent der gesamten Schiff'schen Base, die nach

dem Zwei-Puffer-Verfahren entfernt wurde

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt den Einfluß der Einführung von Borationen in das Hämolysat und in den ersten Elutionspuffer.

Gesamtblutproben von vier nicht-diabetischen Personen wurden in jeweils zwei Portionen aufgeteilt. Eine Portion jedes Paares wurde 5 Stunden lang bei 37° C mit 900 mg/dl Glucose inkubiert. Diese Portionen wurden dann als die Schiffsche Base enthaltende Proben verwendet. Die restlichen Portionen wurden bei 4⁰C bis zum Analyser.zeitpunkt aufbewahrt, wonach sie als Proben ohne Schiffsche Base verwendet wurden (die tatsächliche Menge an Schiffscher Base in diesen Proben war vernachlässigbar gering, da sie aus gesunden Personen gewonnen wurden und 18 Tage nach der Entnahme verstrichen waren).

Aliquote Anteile sowohl der inkubierten als auch der nicht-inkubierten Proben wurden dann lysiert und in Ionenaustauschsäulen und in Doppelpuffersystemen aufgeUsnnt auf die gleiche Weise wie im obigen Beispiel 1 unter Abschnitt C beschrieben. Mit jeder Probe wurden vier verschiedene Versuche durchgeführt unter Verwendung variierender Mengen an Borationen sowohl in dem Hämolyse-Reagens als auch in dem ersten EIutionspuf f er auf die folgende Weise.

Zugegebene Glucosemenge	% entfernte
(mg/dl)	Schiffsche Base
0	70,6
250	73,3
500	92,2
750	80,1
1000	67,1

Tabelle 2.1

Borationengehalt der Reagentien

Versuch Borationenkonzenl ration

Hämohsereagens erster Elutionspuffer

A	0,6 M (pH 5,00)	0,023 M
B	0,6 M (pH 5,00)	—
C	—	0.077 M
D		0,023 M

Die Reagentien waren im übrigen einheitlich: das Hämolysereagens wurde in einer Menge von 500 μI verwendet und enthielt 0,33 Vol.-% des Tensids vom Beispiel 1 (B); der erste Elutionspuffer wurde in einer Menge von 4.0 ml verwendet und enthielt einen 0,025 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 bei einer Natriuiiiicnenkonzentration von 39 meq/1; und der zweite Elutionspuffer wurde in einer Menge von 10,0 ml verwendet und enthielt einen 0,06 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,7 mit einer Natriumionenkonzentration von 87 mVal/l. Das Harzbett selbst wurde in jedem Falle geringfügig modifiziert gegenüber dem im Beispiel 1 verwendeten Verhältnis H⁺ : Na⁺ von 55 : 45, um eine optimale Abtrennung der HbAu-Fraktion von den HbAia- und HbAib-Fraktionen zu erzielen. Die Verhältnisse wurden ausgewählt durch Analysieren des ersten und des zweiten Eluats aus den Säulen, deren Betten in variierenden Graden mit Phosphorsäure behandelt worHen waren. Das Endverhältnis in jedem Falle lag innerhalb des Bereiches von 55 :45 bis 60 : 40.

In jedem Versuch wurde der Prozentsatz an HbAu durch Analyse des zweiten Elutionspuffers auf die im obigen Beispiel 1 beschriebene Weise bestimmt. Die Ergebnisse sind für jede der untersuchten Proben in der folgenden Tabelle 2.2 angegeben. In der Tabelle sind auch die Werte für den Prozentsatz der entfernten Schiffschen Base angegeben, bestimmt nach der gleichen Rechenmethode wie in Beispiel 1 unter Anwendung einer Ein-Puffer-Elution mit 4,0 ml eines 0,05 M Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,7 und einer Natriumionenkonzentration von 74 meq/1 als Indikator für die vorhandene gesamte Schiffsche Base. Aus der Tabelle geht hervor, daß die Entfernung der Schiffschen Base beträchtlich verbessert wurde durch die Verwendung höherer Konzentrationen an Borat und daß die Verwendung von Borat in dem Hämolysereagens besonders

jo wirksam war.

Tabelle 2.2

Borationenzugabe-Testergebnisse bei Anwendung des Zwei-Puffer-Verfahrens

Versuch	Patient	% HbAic	mit 900 mg/ml	% Zunahme als Folge	°/o entfernte
		nicht	Glucose	der Inkubation	Schiffsche Base
		inkubierte Proben	inkubierte Proben	(Durchschnittswert)	(Durchschnittswert)
			5,16
A	1	5,12	5.01	0,2	99.6
	2	4.75	5,53
	3	5,84	4,46
	4	4,44	5,07
B	1	4,97	5,04	-0,8	100
	2	4,83	5,53
	3	5,86	4,32
	4	4,49	5,80
C	1	5,17	5,80	12,4	78,0
	2	5,06	6,26
	3	5,70	5,26
	4	4,65	6,04
D	1	5,17	6,07	16,5	70,8
	2	5,25	6,51
	3	5,62	5,52
	4	4,68

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A_]c von anderen glycosylierten und nicht-glycosylierten Hämoglobinen und dem Schiffschen Basen-Vorläufer für Hämoglobin Ai_c in einer Humanblutprobe, sowie · gegebenenfalls zur Bestimmung von Hämoglobin Ai_c, wobei man die in der Probe enthaltenen roten Blutkörperchen unter Bildung eines Hämolysats lysiert; einen schwachen Kationenaustauscher mit diesem Hämolysat imprägniert; durch den Austauscher eine Pufferlösung mit darin gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt; und das erhaltene Eluat sammelt und gegebenenfalls zur Bestimmung des Hämoglobins Ai_c analysiert, dadurch gekennzeichnet, daß man durch den Austauscher eine erste Pufferlösung mit

ίο darin in einer Konzentration von etwa 0,02 M bis etwa 0,05 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt,

um die Dissoziation des Schiffschen Basen-Vorläufers in Glucose und Hämoglobin A zu bewirken und die Glucose und die anderen glycosylierten Hämoglobine gegenüber dem Hämoglobin A, dem Hämoglobin A_]c JJ

und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren, worauf man eine zweite Puffer- vi

lösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls p,

durch den Austauscher laufen läßt, um das Hämoglobin Ai_c gegenüber dem Hämoglobin A und den anderen H

nicht-glycosyüerten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren. -;|

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkalimetallionen an dem Austauscher V-; und in der ersten und in der zweiten Pufferlösung vom Typ her identisch sind und vorzugsweise Natrium oder fi\ Kalium darstellen. *q

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Austauscher um ein Ji

Methacrylsäürc/Divinylbcnzol-Copolyrneres handelt, wobei etwa 30 bis etwa 50% der aktiven Zentren an

dem Austauscher durch Ionen eines Alkalimetalls besetzt sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchengröße des Harzes innerhalb des

Bereichs von etwa 0,074 bis etwa 0,03 mm liegt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Alkalimetallionen in der ersten Pufferlösung etwa 0,03 M bis etwa 0,04 M und in der zweiten Pufferlösung

etwa 0,07 M bis etwa 0,09 M beträgt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der ersten

Pufferlösung und bei der zweiten Pufferlösung jeweils um Phosphatpuffer handelt.

7. Verfahren nach einem J?r Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der ersten Pufferlösung und der pH-Wert der zweiten Pufferlösung jeweils innerhalb des Bereiches von etwa 6,3 bis etwa 73 liegen.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Harz um ein Polymeres von Methacrylsäure mit einer Teilchengröße innerhalb des Bereiches von etwa 0,15 bis etwa 0,03 mm handelt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden F.luierungsstiifen bei einer Temperatur von etwa 14°C bis etwa 35°C, vorzugsweise von etwa I7°C bis etwa 30⁰C, durchgeführt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hämolyse in Gegenwart einer wäßrigen Detergenslösung durchführt und die dabei erhaltene Mischung etwa bei Raumtemperatur mindestens etwa 10 Minuten lang inkubiert.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß im Hämolysat, in der ersten Pufferlösung und/oder in der zweiten Pufferlösung eine wirksame Menge einer Dihydroxyborylverbindung vorliegt.

Ί5 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 1,00 M, vorzugsweise von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M zusetzt und den pH-Wert des Hämolysats vorzugsweise innerhalb eines Bereichs von etwa 4,5 bis etwa 6,5 hält.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Hämciysats bei etwa 4,5 bis 6,5, vorzugsweise bei 5,5, hält.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man der ersten Pufferlösung eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etw. 0,10 M zusetzt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Dihydroxyborylverbindung Borsäure oder niedere Alkylboronsäuren verwendet.

16. Verwendung eines Reagens-Set, welches

a) einen schwachen Kationenaustauscher

b) eine erste Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,02 M bis etwa 0,05 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls und

c) eine zweite Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,06 M bis etwa 0,11 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls

umfaßt,

zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 15.

17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens-Set zusätzlich ein Hämoiyse-Reagens mit oder aus einer wäßrigen Detergenslösung enthält.

18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Hämolyse-Reagens eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,1 M bis etwa 1,0 M enthält und daß die erste

Pufferlösung zusätzlich eine Dihydroxyborylverbindung in einer Konzentration von etwa 0,01 M bis etwa 0,10 M enthält.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Hämoglobin A,_c von anderen glycosilierten und nicht-glycosilierten Hämoglobinen und dem Schiffschen Basen-Vorläufer für Hämoglobin A,_c in einer Hurnanblutprobe, sowie gegebenenfalls zur Bestimmung von Hämoglobin Ai_c, wobei man die in der Probe enthaltenen roten Blutkörperchen unter Bildung eines Hämolysats lysiert; einen schwachen Kationenaustauscher mit diesem Hämolysat imprägniert; durch den Austauscher eine Pufferlösung mit darin gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt; und das erhaltene Eluat sammelt und gegebenenfalls zur Bestimmung des Hämoglobins A,_c analysiert; sowie die Verwendung eines Reagens-Sets zur Durchführung dieses Verfahrens.

Seit einiger Zeit ist es bekannt, daß die Menge an Hämoglobin A| (HbAi), einer glycosylierten Form des Stamm-Hämoglobins (HbA), im Blut von unter Diabetes leidenden Personen höher ist als im Blut von gesunden is Personen. Hämoglobin Ai selbst besteht aus mehreren Komponenten, von denen die hauptsächlichen identifiziert worden sind als HbAi₃, HbAib und HbAi_c. Diese drei Komponenten werden als »schnelle Hämoglobine« bezeichnet, da sie beim Eluieren relativ schnell durch eine chromatographische Säule laufen. Das in der größten Menge vorliegende schnelle Hämoglobin ist HbA_]c, das auch als zuverlässigster Indikator für den Blutglucosespiegel bzw. -gehalt bekannt ist. Es ist auch bekannt, daß der Vorläufer für HbAi₀ ein labiles Addukt ist, in dem die Brückcnbändung zwischen der, Glucosemoiekülen und dem Hämogiobir.rnolekü! eine AMmin-Brückenbindung ist (nachstehend als »Schiffsche Base« bezeichnet). Wegen der bei seiner Bildung aus Glucose und Hämoglobin A auftretenden hohen Reaktionsrate sowie seiner ausgeprägten Neigung, wieder zu den Ausgangsmaterialien zu dissoziieren, spiegelt der Gehalt an Schiffscher Base eher die Kurzzeit-Schwankungen in den Blutglucosespiegeln wider als die Langzeit-Spiegel, die bei einer aussagekräftigen Diabetesanalyse bestimmt werden sollen. Aus diesem Grunde sind häufig Analysen ohne Entfernung der Schiffschen Basen schlechte Indikationen für die Fähigkeit eines Patienten, seinen Blutglucosespiegel zu regulieren.

Bei der Analyse von glycosyliertem Hämoglobin ist es deshalb erwünscht, HbA_)c sowohl von seinem Schiffschen Basen-Vorläufer als auch von anderen glycosylierten Hämoglobinen abzutrennen, um eine genaue und zuverlässige Indikation für die Langzeit-Glucoseregulierung zu erhalten.

Eine generelle D'skussion über glycosylierte Hämoglobine und ihre Bedeutung für Diabetes mellitus ist in Bunn et al., »Science«, 200, S. 21 —27 Π 978), zu finden. Die Verwendung von lonenaustauscherharzen wird von Chou et al. in »Clin. Chem.«, 24 (10;, S. 1708-1710 (1978), und in den US-PS 41 42 855. 41 42 856, 41 42 857, 41 42 858,41 68 147 und42 38 196 beschrieben.

Zu bekannten Verfahren zur Entfernung der Schiffschen Basen-Addukte gehören die Inkubation von Erythrocyten in einer Salzlösung und die Dialyse des Hämolysats. Erstere wird von Goldstein et al. in »Diabetes«. 29, S. 623—628 (1980), von Svendsen et al. in »Diabetologia«,

19. S. 130— 136 (1980), und von Chou et al. in »Clin. Chem.«, 24(10), S. 1708—1710(1978), beschrieben. Letztere wird von Goldstein et al. in supra und Widness et al. in »J. Lab. Clin. Med.«, 95 (3), S. 386-394 (1980), beschrieben.

Die genaue Analyse von HbAi₀ ohne vorherige Entfernung der SchifFschen Base wurde erreicht unter Anwendung einer kolorimetischen Methode, in der eine Säurehydrolyse angewendet wird, woran sich die Behandlung mit Thiobarbitursäure anschließt (vgl. Svendsen et al., supra).

Aus den Literaturstellen New Engl. J. of Med., Vol. 284, No 7, 353 bis 357 (1971) und J. of Clin. Invest.. Vol. 58, 820 bis 824 (1976) ist ein Verfahren zur Abtrennung von Hämoglobin Ai₀ von anderen glycosylierten und nicht-glycosylierten Hämoglobinen in einer Humanblutprobe, sowie gegebenenfalls zur Bestimmung von Hamoglobin A]₀ bekannt, wobei man die in der Probe enthaltenen roten Blutkörperchen unter Bildung eines Hämolysats lysiert; einen schwachen Kationenaustauscher mit diesem Hämolysat imprägniert; durch den Austauscher eine Pufferlösung mit darin gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt; und das erhaltene Eluat sammelt und gegebenenfalls zur Bestimmung des Hämoglobins Ar- analysiert.

Bei diesem bekannten Verfahren wird nur eine Pufferlösung verwendet, wodurch eine saubere Trennung der Fraktionen nicht gewährleistet ist. Das Eluat muß laufend analysiert werden, um festzustellen, wann alle unerwünschten Fraktionen, z. B. das Hämoglobin A|_C(a + b) eluiert sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der vorstehend definierten Gattung bereitzustellen, mit dessen Hilfe eine schnelle Abtrennung des Hämoglobins A_]c von den anderen Fraktionen sowie eine genauere Bestimmung des Hämoglobins A|_C möglich ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man durch den Austauscher eine erste Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0,02 M bis etwa 0,05 M gelösten Ionen eines Alkalimetalls laufen läßt, um die Dissoziation des Schiffschen Basen-Vorläufers in Glucose und Hämoglobin A zu bewirken und die Glucose und die anderen glycosylierten Hämoglobine gegenüber dem Hämoglobin A. dem Hämoglobin A|_t und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren. worauf man eine zweite Pufferlösung mit darin in einer Konzentration von etwa 0.06 M bis etwa Ö.l I M gelösten ionen eines Alkalimetalls durch den Austauscher laufen läßt, um das Hämoglobin Ai₁ gegenüber dem Hämoglobin A und den anderen nicht-glycosylierten Hämoglobinen bevorzugt zu eluieren.

Die erfindungsgemaße Abtrennung des Hämoglobins Au- von den anderen Fraktionen erfolgt schnell und "leicht und ergibt eine zuverlässigere und genauere Bestimmung der La ng/eit-Glueose Spiegel in Human blut, die ο·> frei von Kurzzeit-Schwunkungen und dem störenden Onl'kiß von anderen Spe/ies ist.

Die Volumina der ersten Pufferlösung und :kr /weilen Pufferlösung körnen iiuroi Roulineversuchc so eingesteli: werdci. il.n'i man ein -'weites Liiuit erhält, iins prakusdi die GeviintmenL-e des ursprünglich in dem