DD239877A1 - Langzeitstabiles kontrollmaterial fuer haematologische mehrfachuntersuchungen und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein langzeitstabiles Kontrollmaterial fuer haematologische Mehrfachuntersuchungen und Verfahren zu dessen Herstellung. Dieses Material findet Anwendung in der Qualitaetskontrolle aller medizinischen Laboratorien, die haematologische Labordiagnostik in Form von Zellzaehlungen, Zellgroessenmessungen und Bestimmungen des Haemoglobingehaltes von Blutproben durchfuehren. Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Kontrollmaterials, mit dessen Hilfe die parallele Pruefung von Verfahren zur Bestimmung kennzeichnender Parameter der einzelnen Blutzellarten ueber einen Haltbarkeitszeitraum von mehr als 12 Monaten stabil moeglich ist. Diese Aufgabe wird erfindungsgemaess durch die Verwendung stabilisierter, partikelfreier Haemoglobinloesung als Suspensionsmedium fuer fixierte Blutzellen oder Partikel in Blutzellgroesse geloest. Dabei kann durch weitere chemische Zusaetze zur Suspension die Kontrollqualitaet des Materials erhoeht werden. Weiterhin ist durch Zumischung zweier im Partikelvolumen verschiedener Teilchenpopulationen eine weitgehende Aehnlichkeit mit der Volumenverteilungskurve nativer Humanleukozyten zu Kontrollzwecken simulierbar. Bei der moeglichen Verwendung des Materials fuer Geraetekalibrierungen ist die stets erfolgende Mitverduennung des Haemoglobinanteils der Suspension zur gleichzeitigen Pruefung von notwendig zu justierenden Verduennungsschritten dienlich.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung .

Die Erfindung betrifft ein Material zur Langzeitkontrolle hämatologischer Mehrfachuntersuchungen sowie Verfahren zu dessen Herstellung. Das Material kann zur Qualitätskontrolle in allen medizinischen Laboratorien eingesetzt werden, in denen Blutzellen gezählt und deren Volumina bestimmt werden sowie in denen eine Messung der Hämoglobinkonzentration im Blut erfolgt. Weiterhin ist das Material zur Kalibrierung von hämatologischen Analysengeräten geeignet.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Naturgemäß befaßt sich die Labordiagnostik in der Hämatologie mit der Untersuchung der Blutzellen. Als vitale Elemente des Organismus haben Blutzellen eine Vielzahl von Eigenschaften, aus deren Kenntnis im speziellen Fall Schlußfolgerungen für Diagnose und Therapie von Krankheiten abgeleitet werden können. Bei der Anwendung von in-vitro-Untersuchungen (z. B. Zellzählung, Zellvolumenmessung, Bestimmung von Zeilinhaltsstoffen) sollten möglichst viele Eigenschaften der Zellen so erhalten bleiben, wie sie im in-vivio-Zustand gegeben sind, um so ein repräsentatives Meßergebnis zu ermöglichen. Die Erhaltung aller Eigenschaften vitaler Blutzellen ist jedoch unter den meist unphysiologischen Verfahrensbedingungen der Laboranalysen kaum zu bewerkstelligen. Noch viel Weniger gelingt es nun, Blutzellen über einen langen Zeitraum haltbar zu machen und dabei in ihren ursprünglichen Eigenschaften zu konservieren. Das wiederum ist aber die entscheidende Voraussetzung für die Schaffung eines vollwertigen Qualitätskontrollmaterials der hämatologischen Labordiagnostik, mit dessen Hilfe endgültige Aussagen über die Richtigkeit und Zuverlässigkeit der Blutzellenanalysen getroffen werden können. Das Problem besteht nun darin, entweder möglichst viele Eigenschaften der nativen Blutzellen zu bewahren und auf eine lange Haltbarkeit der Zellen zu Kontrollzwecken au'Grund fortschreitender Zellalterung und Zellzerfall zu verzichten; oder aber die Zellen mit Hilfe chemischer Methoden sehr lange haltbar zu machen und dabei eine krasse Änderung vieler den Meßvorgang bestimmenden Eigenschaften (Zellform, Verformbarkeit, chemische und physikalische Labilität) in Kauf zu nehmen. Im ersten Fall spricht man von stabilisierten (vital konservierten) Zellen. Eine solche Stabilisierung der unter in-vitro-Bedingungen sehr labilen Blutzellen erreicht man durch bestimmte chemische Zusätze zum Blut bzw. zu gewaschenen Zellfraktionen. Diese Zusätze dienen zur Aufrechterhaltung des Zellstoffwechsels und/oder zur Schaffung eine chemisch/ physikalisch die Zellen erhaltenden und gleichzeitig bakteriostatisch wirksamen Milieus. Die so präparierten Suspensionen stabilisierter Blutzellen sind auf Grund ihrer geringen Haltbarkeit nur acht bis zwölf Wochen als Qualitätskontrollmaterial zu verwenden (Spaethe, R.;M.Ley; A.Lampertu.S. Vavra; Lab.med.8:437-444(1984).

Im zweiten Falle handelt es sich um fixierte Blutzellen, die in ihren Eigenschaften den entsprechenden nativen Zellen weitgehend unähnlich geworden sind. Eine Fixierung der Blutzellen erreicht man durch chemische Härtung der Zellmembran bzw. der inneren Strukturen der Zellen. Als Reagenzien werden vorzugsweise Aldehyde (Formaldehyd, Glutaraldehyd) sowie auch Schwermetallsalze (Osmiumtetroxid, Uranylacetat) eingesetzt. . . '

Durch ihre große Stabilität gegenüber chemischen und physikalischen Einflüssen wird bei den fixierten Blutzellen eine wesentlich längere Haltbarkeit als bei den stabilisierten Blutzellen erzielt (Lombarts, A. J. P. F., and B. Leijnse: Clin. Chim. Acta [1983]: 7.9-83). Diese lange Haltbarkeit (1 Jahr und länger) bei gleichzeitigem Mangel blutzellähnlicher Eigenschaften weisen auch künstliche und biologische Partikel bei ihrem Einsatz als Kontrollmaterial für hämatologische Zwecke auf. Ein weiteres Problem der Qualitätskontrolle hämatologischer Laboruntersuchungen ist die Prüfung der Richtigkeit und Zuverlässigkeit von Mehrfachanalysen. Aus dem Untersuchüngsgut Blut können nach dem heutigen Stand der Technik eine Vielza'hl von parallelen Messungen an den verschiedenen Zellpppulationen in einem Arbeitsgang vorgenommen werden. Diese multiparametrische Arbeitsweise moderner Analysengeräte verlangt auch eine gleichzeitige Kontrolle aller Meßstrecken eines Gerätes mit einem Mehrfachparameter-Kontrollmaterial. Ein solches Material bietet weiterhin für die noch vielerorts geübten Einzelparameter-Messungen den Vorteil, nur eine Kontrollmaterialart für verschiedene Verfahren einsetzen zu können.

Ebenfalls in den Problemkreis der Sicherung von Richtigkeit und Zuverlässigkeit hämatologischer Analysen fällt die Aufgabe der ordnungsgemäßen Kalibrierung der Analysengeräte. Wirklich gelöst ist dieses Problem nur für die fotometrische Bestimmung des Hämoglobirigehaltes von Blutproben. Hier gibt es international verbindliche Standards (WHO-Standard). Für die Zählung und Größenbestimmung der Blutzellen arbeitet man im Hinblick auf die Gerätekalibrierung hoch an unterschiedlichen Lösungsmodellen. Die wichtige Voraussetzung der Langzeitstabilität erfüllen bisher nur Suspensionen von Latexteilchen (Jakschik, J.; Lab. med.8:420-423 [1984]. Dagegen erhält man den günstigsten Bezug auf die tatsächlichen Blutzelleigenschaften nur bei der Methode der Primäreichung mit Frischblut (Gilmer, P.R., et al.; Amer. J.CIin.Path.68 [1977], 185-190). Es sind zur Zeit nun folgende Kontrollmaterialien für hämatologische Laboruntersuchungen bekannt:

— Hämoglobinlösungen (Dade Hb-Control)

— Suspensionen stabilisierter Blutzellen (WP G 01 N 206842)

— Suspensionen fixierter Blutzellen (WP A 61 K 2161 93)

— Suspensionen von biologischen Materialien (z. B. Pollen)

— Suspensionen von künstlich produzierten Partikeln (z. B. Latex) mit blutzellähnlichen Dimensionen (DE-OS 2722897) Hämoglobinlösungen sind Einzelparameter-Kontrollen. Sie gestatten die Kontrolle des Hämoglobingehaltes (Hb) hämolysierter Blutproben. Die als Mehrfachparameter-Kontrollen ausgelegten Suspensionen stabilisierter Erythrozyten ermöglichen erstens eine Prüfung des ganzen Verfahrens der Hämoglobinbestimmung (einschließlich Zell-Lyse); zweitens kann man mit ihrer Hilfe auch die Zählung (RBC) und Volumenmessung (RDV = Volumenverteilungskurve der roten Blutzellen, abgeleitet z. B.:

MC = mittleres Zellvolumen) der Erythrozyten nachvollziehen und drittens die Bestimmung des Hämatokrit (PVC) sowie der abgeleiteten Parameter MCH (mittlerer Hämoglobingehalt des Einzelerythrozyten) und MCHC (mittlere korpuskulare Hämoglobinkonzentration) kontrollieren. Durch Zusatz von fixierten Vogel- oder Säugerblutzellen wird gleichzeitig eine Kontrollmöglichkeit für die Leukozytenzählung (WBC) gegeben. Es wurden auch Verfahren zur Herstellung von Materialien beschrieben, die darüber hinaus noch stabilisierte oder fixierte Thrombozyten zur Kontrolle der Thrombozytenzahl (PBC) und des Thrombozytenvolumens (PVD = Volumenverteilungskurve der Thrombozyten, abgeleitet z.B.: MPV = mittleres Zellvolumen) enthatten (DE-OS 2923957). Die Haltbarkeit all dieser Mehrfachparameter-Kontrollen beträgt maximal 8-12 Wochen. Reine Suspensionen fixierter Blutzellen sind meist als Einzelparameter-Kontrollen im Gebrauch. Sie weisen ebenso wie Hämoglobinlösungen eine Haltbarkeit von über 12 Monaten auf. Eine für die parallele Zählung von Leukozyten und Thrombozyten präparierte Kontrollsuspension aus fixierten Blutzellen wurde mit einer Stabilität von fünf Monaten beschrieben (Lombarts, A.F.P.F., and. Leijnse; Clin.Chim.Acta 130 [1983]; 95-102).

Es gibt also keine langzeitstabilen Kontrollmaterialien für hämatologische Mehrfachuntersuchungen. Alle bekannten Mehrfachparameterkontrollen sind nicht langzeitstabil. Und die bekannten langzeitstabilen Kontrollmaterialien erlauben nurdie Kontrolle eines Einzelparameters (z. B. Hämolysat für Hb) oder weniger, auf nur eine Zellart bezogene Parameter (z. B. fixierte Erythrozyten für RBC und MCV).

Keines der bekannten Kontrollmaterialisten ermöglicht langzeitstabil die gleichzeitige Prüfung von Parametern aller drei Zellsysteme des Blutes (Erythrozyten, Leukozyten, Thrombozyten). Ebenfalls fehlen langzeitstabile Kontrollen für die Parameterkombinationen Erythrozyten/Leukozyten bzw. Erythrozyten/Trombozyten. Weiterhin ist kein Material beschrieben, das für die Kalibrierung mehrerer Meßstrecken von hämatologischen Vielfachanalysatoren bzw. parallel zur Eichung von verschiedenen Einzelparameter-Geräten geeignet wäre.

Ziel der Erfindung

Mit der Schaffung langzeitstabiler Qualitätskontrollen für die hämatologische Mehrfachanalyse wird das bestehende Kontrollregime, das auf dem kontinuierlichen Bezug von nur begrenzt haltoaren Materialien in Abonnementslieferung beruht, wesentlich erweitert und verbessert. Da die deklarierten Sollwerte langzeitstabiler Materialien auch über viele Kontrollperioden hinweg stabil bleiben, wird so die Sicherheit der Analytikerhöht und die Abhängigkeit von zufälligen Fehlern und systematischen Trends der einzelnen, begrenzt haltbaren Kontrollmaterialchargen entscheidend verringert.

Auf Grund des langfristig stabilen Meßverhaltens der erfindungsgemäßen Materialien sind diese ebenfalls zur Kalibrierung von Meßgeräten einsetzbar. Weiterhin kann mit diesem Material die Qualitätskontrolle hämatologi&cher Parameter auch in kleinen Laboratorien kostengünstig durchgeführt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Kontrollmaterial für hämatologische Laboruntersuchungen und Verfahren zu dessen Herstellung zu entwickeln. Dabei soll aus diesem Material die stabile Kontrolle mehrerer Parameter zur Untersuchung verschiedener Blutzellarten über einen Zeitraum von mindestens zwölf Monaten gewährleistet sein. Das Material muß möglichst blutäquivalente Merkmale aufweisen, wie z. B. ähnliche Viskosität und eine gute Resuspendierbarkeit der Partikel. Die Kontrollqualität soll mit dem zu schaffenden Material gegenüber den bisher bekannten langzeitstabilen Einzelparameter-Kontrollen verbessert werden.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung von Hämoglobinlösungen als Suspensionsmedium für fixierte Blutzellen oder andere biologische oder künstliche Partikel, die den Blutzellen vergleichbare Partikelvolumina aufweisen. Damit ist von vornherein die langzeitstabile Kontrolle der Hämoglobinbestimmung als Parameter für die Kenntnis der Erythrozytenkonzentration im Blut sowie die gleichzeitige langfristige stabile Prüfmöglichkeit der Zählung und Volumenmessung wenigstens einer anderen Blutzellart (Leukozyten und/oder Thrombozyten) gegeben. Die zugesetzten Partikel können gehärtete Vogel- oder Säugererythrozyten oder andere Partikel in Leukozytengröße zur Kontrolle der Parameter WBC und WVD (Volumenverteilungskurve der Leukozyten) sein. Ebenfalls ist die Suspendierung von fixierten Thrombozyten oder von kleinen fixierten Säugererythrozyten oder aber von anderen Partikeln in Thrombozytengröße zur gleichzeitigen Kontrolle der Parameter Hb, PBC und PVD möglich. Erfindungsgemäß kann die Kontrollstabilität der genannten Materialien durch Zusätze von Polyäthylenglykol weiter erhöht werden. Gemäß dem Gegenstand der Erfindung wird weiterhin eine bessere Kontrollmöglichkeit der abgeleiteten Parameter der WVD (z. B. Lymphozytenzahl) durch den Einsatz eines

Gemisches fixierter Blutzellen oder anderer Partikel in Leukozytengröße erreicht, da so eine der zweigipfligen Volumenverteilungskurve nativer Humanleukozyten weitgehend entsprechende WVD simuliert werden kann. Auch die Kontrollqualität reiner Suspensionen von fixierten Erythrozyten zur Kontrolle der Parameter RBC und RVD wird erfindungsgemäß durch die Verwendung von Hämoglobinlösungen als Suspensionsmedium wesentlich verbessert, da eine leichtere Resuspendierbarkeit des Zellsediments gegeben ist.

Im Hinblick auf die Herstellungsverfahren für die genannten langzeitstabilen Kontrollmaterialien für hämatologische Mehrfachuntersuchungen besteht das Wesen der Erfindung in der primären Herstellung blutäquivalent konzentrierter Hämoglobinlösungen aus Säugererythrozyten (speziell Humanerythrozyten). Dabei wird erfindungsgemäß nach Hämolyse der gewaschenen Erythrozyten und Stabilisierung des Hämolysats eine stufenweise oder direkte Ultrafiltration bzw. Zentrifugation des Materials durchgeführt. Hierdurch werden die Membranreste der Erythrozyten bis zu einer minimalen Größe entfernt, die wiederum davon bestimmt wird, welche gehärteten Zellen der Hämoglobinlösung anschließend zugesetzt werden sollen. So muß man für die Herstellung eines Kontrollmaterials, mit dessen Hilfe die Parameter Hb, WBC und WVD geprüft werden, alle Zellreste der hämolysierten Erythrozyten abfiltrieren (bzw. abzentrifugieren), die eine Zählung und Volumenmessung der Leukozyten durch ihre Größe noch beeinträchtigen können. Sollen weiterhin Partikel in Thrombozytengröße zugesetzt werden, so muß man durch die Ultrafiltration (bzw. Zentrifugation) auch alle in der ursprünglichen Hämoglobinlösung enthaltenen Partikel entfernen, die gleich groß oder größer als die kleinsten fixierten Thrombozyten sind.

Ausführungsbeispiel 1

Die Erythrozyten einer Blutkonserve werden in einer geeigneten, nicht lysierenden Pufferlösung mehrmals gewaschen. Das zuletzt verbleibende Erythrozytensediment wird bis zu einem Volumen, das durch die im fertigen Kontrollmaterial gewünschte Hb-Konzentration festzulegen ist, mit destilliertem Wasser aufgefüllt. Dabei ist ebenfalls die nachfolgende Zugabe von Stabilisatoren für das Hämolysat sowie die noch zuzusetzende Menge an Konzentrat gehärteter Zellen oder anderer Partikelsuspensionen zu berücksichtigen. Die Hämolyse der roten Blutzellen kann durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen vervollständigt werden. Nach erfolgter Hämolyse werden dem Hämolysat geeignete Stabilisatoren zugesetzt (z. B. Natriumazid, Natriumnitrit, Di met hy Isu Ifoxid, Kalziumzyanid).

Dann erfolgt die Abtrennung der Membranreste der lysierten roten Blutzellen mittels Ultrafiltration. Für den nachfolgenden Einsatz als kombiniertes Kontrollmaterial der Hb-Bestimmung und der Zählung und Volumenmessung von Leukozyten empfiehlt sich die stufenweise Filtration durch Membranfilter bis zur Porengröße von 0,8 μΐη. Ist eine Abtrennung der Membranreste über Zentrifugation vorgesehen, so kann der Zentrifugationsvorgang dann als abgeschlossen betrachtet werden, wenn in dem Hämolysat mit einem gängigen elektronischen Leukozytenzählverfahren keine Partikel in Leukozytengröße mehr nachweisbar sind. Zum Abschluß der Präparation wird dem Hämolysat eine gewünschte Menge an Partikeln in Leukozytengröße (bezogen auf eine hämolysierte Blutprobe!) zugesetzt. Diese Partikel können sowohl fixierte Human- oder Vogelerythrozyten als auch andere biologische Materialien (z. B. Pollen) oder künstliche Partikel sein. Zur besseren Kontrolle der WVD ist der Einsatz einer Mischpopulation aus zwei im Partikelvolumen verschiedenen Chargen eines Materials möglich.

Das erhaltene Kontrollmaterial ist bei einer Haltbarkeit von mindestens 12 Monaten zur Prüfung der Parameter Hb, WBC und WVD geeignet. Es wird in allen Verfahrensvarianten wie das als Untersuchungsgut verwendete antikoagulierte Vollblut behandelt. Das beschriebene Kontrollmaterial eignet sich weiterhin zur Kalibrierung von Leukozytenzählgeräten. Hierbei kann die parallel erfolgende Verdünnung des Hämoglobinanteils der Kontrollsuspension als Referenzwert für die Überprüfung von Verdünnungsschritten herangezogen werden.

Ausführungsbeispiel 2

Bis auf die notwendigen Schritte der Ultrafiltration ist die Herstellung des Hämolysats dem Ausführungsbeispiel 1 zu entnehmen. Für den nachfolgenden Einsatz als kombiniertes Kontrollmaterial der Hb-Bestimmung und der Zählung und Volumenmessung der Thrombozyten muß die stufenweise Filtration um eine weitere Ultrafiltration mit Membranfiltern der Porengröße 0,2μηη ergänzt werden.

Zum Abschluß der Präparation wird dem Hämolysat eine gewünschte Menge an Partikeln in Thrombozytengröße zugesetzt. Diese Partikel können sowohl fixierte Humanthrombozyten oder Säugererythrozyten als auch andere biologische Materialien oder künstliche Partikel (z. B. Latex) sein. Bei der Verwendung von fixierten Humanthrombozyten werden die Kontrolleigenschaften des Materials verbessert, wenn vor der Zugabe der Partikel im Hämolysat bis zu 20% Polyethylenglykol 6000 gelöst werden.

Das so hergestellte Kontrollmaterial ist bei einer Haltbarkeit von mindestens 12 Monaten zur Prüfung der Parameter Hb, PBC und PVD geeignet. Es wird in allen Verfahrensvarianten der Hb-Bestimmung wie das als Untersuchungsgut verwendete antikoagulierte Vollblut behandelt. Bei der Kontrolle von Verfahren zur Zählung und Volumenmessung von Thrombozyten sind alle Verdünnungsschritte wie beim Vollblut nachvollziehbar, jedoch können Probenvorbereitungsverfahren über Zentrifugation oder Sedimentation nicht in die Prüfung miteinbezogen werden. .

Das beschriebene Kontrollmaterial eignet sich weiterhin zur Kalibrierung von Thrombozytenzählgeräten. Hierbei kann man die parallel erfolgenden Verdünnung des Hämoglobinanteils der Kontrollsuspension als Referenzwert für die Überprüfung von Verdünnungsschritten nutzen.

Ausführungsbeispiel 3

Durch Zumischen einer gemischten Menge an Partikeln in Leukozytengröße (siehe Ausführungsbeispiel 1) zu einem Kontrollmaterial für die Parameter Hb, PBC und PVD (siehe Ausführungsbeispiel 2) erhält man ein langzeitstabiles Kontrollmaterial für die hämatologischen Untersuchungen zur Bestimmung der Parameter Hb, WBC, WVD, PBC und PVD. Auch dieses Kontrollmaterial ist mindestens für den Zeitraum von 12 Monaten stabil. Alle weiteren Eigenschaften ergeben sich aus Kombination in der in den Ausführungsbeispielen 1 und 2 dargestellten Charakteristika der jeweiligen Kontrollmaterialien.

Ausführungsbeispiel 4

Durch Zumischen einer gewünschten Menge an Partikeln in Erythrozytengröße (fixierte Erythrozyten, Pollen, künstliche Partikel) zu einem nach Ausführungsbeispiel 1 hergestellten HSmolysat erhält man ein langzeitstabiles Kontrollmaterial für die Parameter RBC und RVD (speziell MCV). Es ist vorteilhaft, die Hämoglobin konzentration hierbei sehr niedrig zu halten. Die Konzentration der suspendierten Partikel sollte günstigerweise zwischen 2,0 und 3,0Tpt/l betragen. Das Material ist mindestens für 12 Monate stabil. Es eignet sich auch zur Kalibrierung von Geräten zur Erythrozytenzählung und Erythrozytenvolumenmessung.

Claims (4)

1. Erfindungsanspruch: ι

   1. Langzeitstabiles Kontrollmaterial für hämatologische Mehrfachuntersuchungen, gekennzeichnet durch Verwendung von stabilisierter und ultrafiltrierter oder partikelfrei zentrifugierter Hämoglobinlösung als Suspensionsmedium, dem fixierte Blutzellen von Vögeln oder Säugern und/oder fixierte Blutzellen humaner Herkunft und/oder biologische oder künstliche Partikel von Blutzellgröße zugesetzt sind.
2. 2. Kontrollmaterial nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß Suspensionsstabilisierende Stoffe (z. B. Polyethylenglykol 6000) zugesetzt sind.
3. 3. Kontrollmaterial nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß für die Kontrolle der abgeleiteten Parameter der Leukozytenvolumenverteilungskurve (WVD) ein Gemisch fixierter Blutzellen oder anderer Partikel in Blutzellgröße zugesetzt wird.
4. 4. Verfahren zur Herstellung von Kontrollmaterial nach Punkt 1,2 und 3, gekennzeichnet durch primäre Herstellung blutäquivalent konzentrierter, stabilisierter Hämoglobinlösungen, die anschließend ultrafiltriert oder partikelfrei zentrifugiert werden und denen man nachfolgend die für die Kontrollzwecke erforderlichen Mengen an fixierten Blutzellen oder anderen

   ' Partikeln in Blutzellgröße zusetzt.