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Gebiet der Erfindung
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Diese Erfindung bezieht sich auf
Standardlösungen,
die Protein, Puffer, Stabilisatoren und Analyten enthalten, welche
auf spezielle Niveaus für
die Eichung chemischer Analysegeräte eingestellt sind. Insbesondere
bezieht sich diese Erfindung auf eine stabilisierte Standardlösung zur
Eichung klinischer Assays, die für
die Bewertung der Schilddrüsenfunktion
geeignet sind, einschließlich
Gesamtthyroxin, ungebundenem Thyroxin, Gesamttriiodthyronin, ungebundenem
Triiodthyronin und Thyreotropin.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die Schilddrüse ist eine endokrine Drüse, die sich
innerhalb des Halses befindet und die Thyroxin (T4) und auch kleine
Mengen Triiodthyronin (T3) durch Einbau von anorganischem Iodid
in Tyrosinreste von Thyroglobulin synthetisiert. T4 ist das hauptsächliche
zirkulierende Schilddrüsenhormon,
aber seine Wirkungen werden erst nach intrazellulärer Umwandlung
in T3 vermittelt. T4 und T3 zirkulieren im Blut vorwiegend gebunden
(> 99%) an die Serumproteine
thyroxinbindendes Globulin (TBG), thyroxinbindendes Prealbumin (TBPA)
und Albumin. Einige physiologische Wirkungen von Schilddrüsenhormon sind
die Stimulation des Stoffwechsels, der Herzfrequenz, der Proteinsynthese
und des Kohlenhydratstoffwechsels in Zielgeweben. Das ungebundene (freie)
Hormon ist vermutlich die physiologisch aktive Form, während die
proteingebundene Fraktion als Reservoir für verfügbares Hormon dient. Dies kompliziert
die Bestimmung des Schilddrüsenstatus,
da Änderungen
in den Mengen der bindenden Proteine zu einem erhöhten Gesamt-T4-Gehalt
im Serum führen können, ohne
die Menge des freien Hormons zu beeinflussen (z. B. während der
Schwangerschaft).
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Die Herstellung von T4 wird normalerweise durch
einen Regelkreis reguliert, der den Hypothalamus und die Hypophyse
einschließt.
Als Reaktion auf einen Mangel an zirkulierendem T4 stimuliert der
Hypothalamus die Schilddrüse
zur Herstellung von TSH. TSH wiederum stimuliert die Herstellung
von T4 durch die Schilddrüse.
Wenn die Mengen des zirkulierenden T4 ausreichend sind, bestimmt
der Hypothalamus, dass die TSH-Herstellung und somit die T4-Herstellung
abnehmen. Eine Unterbrechung des Regelkreises in der Hypothalamus-Hypophysen-Schilddrüsen-Achse
führt zu
unspezifischen Symptomen, die mit Hilfe von Labortests diagnostiziert
und effektiv behandelt werden können.
Primäre Schilddrüsenunterfunktion
tritt infolge einer Zerstörung
der Schilddrüse
selbst auf und führt
zu einer reduzierten Verfügbarkeit
von T4 in den Geweben. Fehlende TSH-Herstellung durch die Hypophyse führt ebenfalls
zu einer Schilddrüsenunterfunktion. Primäre Schilddrüsenüberfunktion
(eine Überversorgung
der Gewebe mit T4) tritt infolge einer übermäßigen Aktivität der Drüse auf.
Eine Überproduktion
von TSH führt
ebenfalls zu einer Schilddrüsenüberfunktion.
Diagnostische Tests helfen beim Nachweis einer Schilddrüsenkrankheit,
bei der Bestimmung ihres Mechanismus und bei der Verfolgung ihrer
Behandlung.
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Aus der obigen Diskussion geht hervor,
dass ein volles Verständnis
der Schilddrüsenfunktion
genaue Bewertungen der Mengen an T3, T4 und TSH erfordert. Bei der
Ausführung
von Immunoassayverfahren zur Bestimmung von Konzentrationen dieser Schilddrüsenanalyten
besteht eine übliche
Praxis darin, eine Familie von kontrollierten Zubereitungslösungen,
im folgenden Standard- oder Eichlösungen genannt, zu verwenden,
von denen jede genau vorbestimmte Mengen oder Konzentrationen an
T4, freiem T4, T3, freiem T3 und TSH enthält. Im Allgemeinen werden Konzentrationen
eingesetzt, die wesentlich niedriger bzw. höher sind als normal. Da die
Immunoassayverfahren normalerweise zur Analyse von Serumproben gestaltet
sind, werden die Eichlösungen
vorzugsweise unter Verwendung einer Matrix zubereitet, die mit Serum
identisch oder bioaktiv dazu äquivalent
sind. Humanes Serum wird typischerweise als Ausgangsmaterial für Eichlösungen verwendet,
doch ist bekannt, dass die zur Entfernung von endogenem Thyroxin
verwendeten Techniken Verfahrensartefakte und große Schwankungen
von Charge zu Charge verursachen, so dass es schwierig ist, diese
Lösungen
reproduzierbar herzustellen. Ein weiterer Nachteil von Eichlösungen,
die humanes Serum enthalten, besteht darin, dass sie nicht längere Zeit
gelagert werden können,
da Serum viele labile Komponenten enthält, die die Stabilität des Produkts negativ
beeinflussen. Aus diesem Grund werden Eichmaterialien häufig im
trockenen Zustand (lyophilisiert) bereitgestellt, doch führt eine
ungenaue Rehydratisierung dieser Materialien häufig zu ungenauen Eichmaßen.
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Flüssige Eichlösungen vermeiden die Möglichkeit
der ungenauen Rehydratisierung von lyophilisierten Eichmaterialien.
Es ist also kommerziell vorteilhaft, flüssigstabile Materialien bereitzustellen,
die keine Vorbereitung durch den Endverbraucher erfordern. Flüssige Eichlösungen müssen jedoch
Stabilisatoren und Konservierungsstoffe enthalten, die so wirken,
dass sie die Lebensdauer erhöhen
und vor Kontaminanten schützen.
Solche Reagentien sind in der Industrie bekannt. Es ist jedoch bekannt,
dass die Anforderungen an den Zubereitungschemiker für die Herstellung
einer Kombination von Matrix, Analyt und Konservierungsstoff, die
mit dem Analysesystem kompatibel sind, die gewünschten Konzentrationen aller
gewünschten
Analyten enthalten können
und gleichzeitig die Stabilität
aufrechterhalten können, sehr
restriktiv sind. Folglich können
in der Praxis bis zu fünf
verschiedene Eichlösungen
erforderlich sein, um Eichvorschriften für T3, freies T3, T4, freies
T4 und TSH zu ermöglichen.
Dies verursacht unerwünschte
Produktionskosten für
den Hersteller sowie erhöhte
Inventar- und Handhabungskosten für das klinische Labor.
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Das US-Patent Nr. 5,342,788 offenbart
eine serumfreie Standardlösung,
die TBG, Albumin und Puffer enthält.
Wenn T4 oder T3 zu dieser Lösung
gegeben wird, bildet sich ein Gleichgewicht zwischen gebundenem
und freiem Hormon, das demjenigen ähnelt, das man in Humanserum
beobachtet. Die Stabilität
der synthetischen Standardlösung
war größer als
bei einer Lösung
auf der Basis von Humanserum, und weiterhin lieferte Rinder-TBG
eine größere Stabilität als TBG,
das aus Humanserum stammt.
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EP
337 467 offenbart Standardlösungen, die thyroxinbindendes
Globulin als thyroxinbindendes Protein sowie in einer Pufferlösung gelöstes Thyroxin oder
Triiodthyronin zur Verwendung bei der Eichung von Assays zur Bestimmung
von Thyroxin oder Triiodthyronin enthalten. Vorzugsweise enthalten
die Standardlösungen
Albumin als weiteres schilddrüsenhormonbindendes
Protein, das die Stabilität
der Lösungen
verbessert.
EP 337 457 stellt
jedoch keine Standardlösung
bereit, die sowohl Thyroxin als auch Triiodthyronin in einer einzigen
Lösung
enthält
und die sowohl bei der Bestimmung von Thyroxin als auch von Triiodthyronin
zur Eichung verwendet werden könnte.
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In
US
4,157,895 wird offenbart, dass Rinderserumalbumin Bestandteil
einer Lösung
sein kann, die die Zusammensetzung von humanem Blut simuliert und
die in einem Immunoassay verwendet wird, der auf die Bestimmung
von Thyroxin gerichtet ist. Es wurde auch gezeigt, dass Rinderserumalbumin
ein geeigneter Bestandteil von Standards ist, die bei radioimmunologischen
Verfahren verwendet werden, welche zur Bestimmung des Gesamtserumthyroxins dienen
(I. Ilyes et al., Izotoptechnika, 5. 118–126 (1979)). Es ist weiterhin
bekannt, dass Humanserumalbumin für die interne Standardisierung
von Isotopenverdünnungs-Gaschromatographie-Massenspektrometrie
als Verfahren zur Bestimmung von Thyroxin in Serum geeignet ist
(L.M. Thienpont et al., Biol. Mass Spectrom., S. 475–482 (1994)).
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In
US
4,225,576 wird ein Verfahren für die gleichzeitige Bestimmung
von Triiodthyronin und Thyroxin in Serum oder Plasma offenbart,
das aber auf der Markierung von Triiodthyronin und Thyroxin mit
demselben Radioisotop beruht. Daher hat dieses Verfahren den Nachteil,
dass Radioisotope eingesetzt werden. Ein Immunoassay für die gleichzeitige Bestimmung
von Triiodthyronin und Thyroxin auf der Basis einer Markierung mit
zwei getrennten Enzymen ist auch bekannt von C. Blake et al., Clinical
Chemistry, 5. 1469–1473
(1982).
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Ein noch verbleibender Mangel in
der Industrie betrifft die Zugabe von mehreren die Schilddrüse betreffenden
Analyten innerhalb einer einzigen flüssigen Eichlösung zur
Verwendung bei der Bestimmung der Schilddrüsenfunktion, um die Flexibilität bei der Verwendung
zu erhöhen
sowie die Produktions- und Inventaranforderungen zu reduzieren.
Die Erfahrung hat jedoch gezeigt, dass man erwarten würde, dass die
einfache Zugabe mehrerer Analyten plus verschiedener Antimikrobenmittel
innerhalb einer einzigen Eichlösung
die analytische Messung der anderen Analyten in einer Probe stört oder
sogar die Stabilität
eines anderen Analyten in der Lösung
beeinträchtigt.
Dementsprechend war es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine
einzige stabilisierte Eichlösung
bereitzustellen, die bekannte Mengen an T3, T4, freiem T4, freiem
T3 und TSH enthält,
so dass die Vorteile einer Eichlösung
mit mehreren Analyten über einen
längeren
Zeitraum hinweg realisiert werden können.
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Kurzbeschreibung
der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung beruht
auf dem Ergebnis, dass ein physiologisches Gleichgewicht von gebundenen
und freien Schilddrüsenhormonen in
einer einzigen flüssigen
Standard- oder Eichlösung,
die nur Albumin in einem Bereich von 40 g/l bis 80 g/l als bindendes
Protein enthält,
ohne die erwartete Erfordernis der Mitverwendung von TBG gebildet werden
kann. Folglich kann eine Eichlösung
gleichzeitig mit spezifischen Mengen an Triiodthyronin (T3) in Kombination
mit spezifischen Mengen an Thyroxin (T4) zubereitet werden, welche
die Konzentrationen an freiem T3 bzw. freiem T4 bestimmen. In einer
alternativen Ausführungsform
dieser Erfindung wird auch gereinigtes TSH zu dieser Schilddrüsenhormon-Eichlösung gegeben,
obwohl TSH nicht in einem solchen Gleichgewicht zwischen gebundener und
freier Form zirkuliert, so dass eine Assay-Eichvorschrift für mehrere Analyten unter Verwendung der
einzigen Eichlösung
erreicht werden kann. Unerwarteterweise hat die Anwesenheit jedes
der Analyten keine nachteilige Wirkung auf die Verwendbarkeit der
Eichlösung
bei der Messung der anderen Analyten oder auf die Stabilität der Lösung als
Ganzes. Außerdem
wird ein längerer
Zeitraum der Verwendung oder Stabilität der Eichlösung erreicht, indem man eine
Kombination von Antimikrobenmitteln mitver wendet, von denen gezeigt
wurde, dass sie gegen Bakterien und Pilze aktiv sind, und die die
Verwendbarkeit der Eichlösung
nicht beeinträchtigen.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1 ist
eine Eichkurve für
einen heterogenen Sandwich-Immunoassay für TSH unter Verwendung einer
Eichlösung
gemäß dieser
Erfindung.
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2 vergleicht
die Ergebnisse eines TSH-Assays unter Verwendung einer gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellten Eichlösung
mit Ergebnissen, die unter Verwendung eines bekannten kommerziellen
Systems erhalten wurden.
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3 ist
eine Eichkurve für
einen kompetitiven Napten-Immunoassay für freies T4 unter Verwendung
einer Eichlösung
gemäß dieser
Erfindung.
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4 vergleicht
die Ergebnisse eines Assays für
freies T4 unter Verwendung einer gemäß der vorliegenden Erfindung
hergestellten Eichlösung
mit Ergebnissen, die unter Verwendung eines bekannten kommerziellen
Systems erhalten wurden.
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5 zeigt
eine Eichkurve für
einen Assay für
freies Triiodthyronin unter Verwendung einer Eichlösung gemäß dieser
Erfindung.
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6 zeigt
eine Eichkurve für
einen Gesamttriiodthyronin-Assay unter Verwendung einer Eichlösung gemäß dieser
Erfindung.
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7 zeigt
eine Eichkurve für
einen Gesamt-L-Thyroxin-Assay unter Verwendung einer Eichlösung gemäß dieser
Erfindung.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Verschiedene Verfahren sind bekannt,
um T4, T3, freies T4, freies T3 und TSH zu bestimmen. Verfahren
auf der Basis von Immunoassays sind für einen klinischen Routineaufbau
besonders gut geeignet, da es für
die Durchführung dieser
Verfahren automatisierte Plattformen gibt. Die Eichung dieser automatisierten
Plattformen beinhaltet die Definition einer mathematischen Beziehung
zwischen der Konzentration des interessierenden Analyten und dem erzeugten
Nachweissignal. Diese Beziehungen sind bei Immunoassays gewöhnlich nicht
linear, so dass ein System mehrere Standardlösungen erfordert, um die Signal-Analyt-Beziehung
zu definieren.
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In der vorliegenden Beschreibung
und gemäß der Erfindung
wird eine Standardlösung
oder Eichlösung
mit verlängerter
Stabilität
bereitgestellt, die gleichzeitig in Verfahren zur Bestimmung mehrerer
die Schilddrüse
betreffender Analyten verwendet werden kann und die in einfacher
Weise aus leicht erhältlichen
Ausgangsstoffen hergestellt werden kann. Die Eichlösung gemäß der vorliegenden
Erfindung enthält
nur Serumalbumin als Proteinkomponente. Das Protein dient als annehmbares
Bindungsreservoir sowohl für
T4 als auch für
T3 und als annehmbares stabilisierendes Milieu für TSH. Vorzugsweise wird Albumin
aus Rinderserum als Albumin verwendet, obwohl auch andere Albuminquellen
annehmbar sind. Serumalbumin ist in einem Bereich zwischen 40 g/l
und 80 g/l geeignet, was der physiologischen Proteinkonzentration
des Serums entspricht. Ebenso wird NaCl zur Nachbildung der ionischen
Umgebung in Serum in einem Bereich zwischen 100 und 200 mmol/l Lösung hinzugefügt. Die
Menge des NaCl kann in Abhängigkeit
von der Empfindlichkeit des analytischen Systems gegenüber der
Ionenstärke variieren.
Wenn das analytische System gegenüber der Ionenstärke unempfindlich
ist, ist die Zugabe von NaCl möglicherweise
nicht erforderlich. Ebenso können
zur Verstärkung
der Pufferkapazität
der Eichlösung
Puffer erforderlich sein, die den pH-Wert in einem Bereich zwischen
6,0 und 8,0 halten. Ein Beispiel für einen solchen Puffer ist
HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]). Wenn das
analytische System gegenüber
dem pH-Wert unempfindlich ist, kann die Proteinkomponente der Matrix
die gesamte erforderliche Pufferkapazität liefern.
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Anschließend an die Zugabe von Protein, Salz
und Puffer werden Mittel, die gegen kontaminierende Mikroben aktiv
sind, in die Eichlösung
aufgenommen, um eine gewünschte
Menge der Stabilisierung zu erreichen. Diese Mittel können aus
einer beliebigen Zahl von Verbindungen bestehen, die gegen Bakterien
und Pilze effektiv sind, in dem analytischen System inert sind und
unreaktiv gegenüber
Komponenten der Matrix der Eichlösung
und den darin enthaltenen spezifischen Analyten sind. In einer beispielhaften
Ausführungsform
wird Polymyxin B in einer Konzentration von 0,02 g/l zusammen mit
Natriumpyrithion in einer Konzentration von 0,2 g/l hinzugefügt. Bei
diesen Konzentrationen ist Polymyxin B hauptsächlich gegen Bakterien aktiv,
und Natriumpyrithion ist in erster Linie gegen Pilze aktiv. Es ist
auch nützlich,
ein Breitband-Antimikrobenmittel hinzuzufügen, um die Wirkungen der anderen
zu verstärken. Als
Beispiel können
0,1 g/l Polyhexamethylenbiguanid hinzugefügt werden. Diese besondere
Kombination von Mitteln hat sich als sehr effektiv erwiesen, um eine
sterile Umgebung für
die Eichlösung
der vorliegenden Erfindung für
einen längeren
Zeitraum von sechs Monaten oder mehr, wie es im folgenden diskutiert
wird, bereitzustellen.
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Anschließend an die Herstellung der
Grundmatrix werden die interessierenden spezifischen Analyten hinzugefügt. Thyroxin
wird vorzugsweise in einem Bereich zwischen 0 und 500 μg/l hinzugefügt, ein
Bereich, der die physiologisch relevanten Konzentrationen abdeckt,
die man in Humanserum findet. Beispielhafte Lösungen werden mit einem Thyroxingehalt
von 0, 17, 50, 100 und 400 μg/l
(Mikrogramm pro Deziliter) hergestellt. In Gegenwart von 60 g/l
Rinderserumalbumin geben diese Lösungen freie
Thyroxinkonzentrationen von ungefähr 0, 7, 20, 40 bzw. 160 ng/l
(Nanogramm pro Liter) vor. Messungen von freiem T4 sind in der diagnostischen
Industrie schlecht standardisiert, so dass T4-Ergebnisse bei einer
gegebenen T4-Konzentration in Abhängigkeit von den Analyseinstrumenten
stark variieren können.
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Triiodthyronin wird vorzugsweise
in einem Bereich zwischen 0 und 12 μg/l Lösung verwendet, da diese Konzentrationen
den physiologisch relevanten Bereich der Triiodthyronin-Konzentrationen,
die man in Humanserum findet, abdecken. Beispielhafte Lösungen werden
mit einem Triiodthyroningehalt von 0, 1,0, 2,0, 4,0 und 9,0 μg/l hergestellt.
In Gegenwart von 60 g/l Rinderserumalbumin geben solche Lösungen einen
Gehalt an freiem Triiodthyronin von ungefähr 0, 5, 11, 25 bzw. 45 ng/l
vor. Ebenso sind Messungen von freiem T3 in der diagnostischen Industrie schlecht
standardisiert, und derselbe Grad der Variation, den man in Analysen
von freiem T4 beobachtet, kann auch bei Analysen von freiem T3 bei
irgendeiner gegebenen T3-Konzentration in Abhängigkeit von den Analyseinstrumenten
vorkommen.
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Thyroxin und Triiodthyronin haben
unabhängig
von der Spezies dieselbe Struktur, so dass die Quelle dieser Verbindungen
variieren kann und auch synthetisches Material umfasst. TSH variiert
jedoch je nach der Tierspezies. Für die Humandiagnose ist also
TSH, das vom Menschen stammt oder aus der humanen Gensequenz synthetisiert
wurde, erforderlich. TSH zirkuliert nicht in einem Gleichgewicht
von gebundener und freier Form. Die zugegebene Menge wird normalerweise
ohne die Zugabe von Mitteln, die Moleküle aus Bindungsproteinen freisetzen,
vollständig
zurückgewonnen.
TSH wird zu einer beispielhaften Lösung in Mengen von 0, 1, 4,
20 und 55 mIE/l hinzugefügt
(Bioaktivitätseinheiten,
definiert durch Standardmaterial der World Health Organization). Die
hinzugefügten
Mengen aller Analyten werden durch die relevanten physiologischen
Bereiche und die Anforderungen an die Definition einer Signalreaktion
als Funktion der Konzentration für
das spezielle analytische System diktiert.
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Je nach den speziellen Bedürfnissen
kann jede Kombination von Mengen von T4, freiem T4, T3, freiem T3
und TSH zubereitet werden. Die einzigen Einschränkungen sind die gegenseitige
Abhängigkeit der
Gesamthormonmengen und der Mengen an freiem Hormon. Diese können nicht
unabhängig
voneinander eingestellt werden.
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Diese Erfindung wird besser durch
Bezugnahme auf das folgende Beispiel verstanden, das hier zu Veranschaulichungszwecken
mit aufgenommen wurde und nicht als einschränkend anzusehen ist. Zubereitungstechniken,
wie das Handhaben, Abwiegen und Mischen von Flüssigkeiten, erfolgen unter
Verwendung von Standardlaborgeräten
(z. B. Pipetten, Waagen und Magnetrührer) und Techniken, die in
der Industrie bekannt sind.
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Eichlösung
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- 1. Herstellung einer Matrix, die gegen mikrobielle Kontamination
konserviert ist.
- a) Salz/Puffer-Lösung:
135 g NaCl, 89,3 g HEPES und 97,5 g Na-HEPES werden in 15 1 Wasser
gelöst. Die
zu lösenden
Stoffe und das Lösungsmittel
werden mit einem Magnetrührgerät gemischt,
bis die zu lösenden
Stoffe vollständig
aufgelöst
sind. 60 Minuten Mischen bei 25°C
ist ausreichend. Dieses Puffergemisch bewirkt, dass der pH-Wert
der Lösung
innerhalb eines Bereichs von 7,0 bis 8,0, vorzugsweise auf 7,5,
gehalten wird.
- b) Zugabe von antimikrobiellen Mitteln: 3 g Natriumpyrithion,
0,3 g Polymyxin B und 1,5 g Polyhexamethylenbiguanid werden nacheinander
zu der Salz/Puffer-Lösung
gegeben und durch 60 Minuten Rühren
bei 25°C
aufgelöst.
- c) Zugabe von Protein: Zu der konservierten Salz/Puffer-Lösung werden
900 g Rinderserumalbumin gegeben und durch 60 Minuten Mischen bei 25°C aufgelöst.
- d) Nach der Auflösung
des Albumins wird die Matrix durch Filtration durch ein Filter von
0,2 μm sterilisiert. Diese
Lösung
wird im folgenden als "konservierte Matrix" bezeichnet.
- 2. Zugabe von Analyt zu der konservierten Matrix unter Bildung
einer Multianalyten-Eichlösung
auf 5 Niveaus.
- a) Niveau 1 besteht nur aus konservierter Matrix und enthält keine
der Analytsubstanzen.
- b) Vier andere Lösungen,
die als "Eichlösungen"
bekannt sind (Niveaus 2–5)
werden so zubereitet, dass sie Analyt in speziellen Konzentrationen
von niedrigen Konzentrationen (Niveau 2) bis zu hohen Konzentrationen
(Niveau 5) enthalten.
- c) Eine T4-Stammlösung
von 50 mg/l wird durch Auflösen
von T4-Natriumsalz in 0,05 N NaOH hergestellt. Die Stammkonzentration
wird unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten von T4
bei 325 nm bestätigt.
Verdünnungen
dieser Stammlösung
auf 5 mg/l und 15 mg/l werden in einer Rinderalbuminlösung von
0,2 g/l hergestellt und als "Arbeitsverdünnungen" bezeichnet. Diese
Arbeitsverdünnungen
werden so hergestellt, dass sie eine genaue Abgabe bis zu einem
speziellen Niveau der Eichlösung
erlauben und werden mit dem 100- bis 200fachen der gewünschten
Endkonzentration zubereitet, um große Verdünnungen der Eichlösung bei
ihrer Zugabe zu vermeiden. Die Arbeitsverdünnungen werden zu angegebenen
Mengen der konservierten Matrix gegeben, so dass man bei den Niveaus
4 und 5 Endkonzentrationen von 100 bzw. 400 μg/l T4 erreicht. Die Niveaus
2 und 3 werden durch Verdünnung
von Niveau 4 mit geeigneten Mengen der konservierten Matrix hergestellt,
so dass man Konzentrationen von 17 μg/l bzw. 50 μg/l erhält. Die Niveaus 2–5 werden
60 Minuten lang bei 25°C
gemischt. Diese Mengen an T4 bilden in der Matrix ein Gleichgewicht
zwischen dem gebundenen und dem ungebundenen Zustand, was zu vorhersagbaren
Konzentrationen von ungebundenem (freiem) T4 von ungefähr 7, 20,
40 bzw. 160 ng/l in den Niveaus 2, 3, 4 bzw. 5 führt.
- d) Eine Stammlösung
von gereinigtem Human-TSN wird hergestellt, indem man lyophilisiertes
TSH in kalter (2–8°C) Kochsalzlösung von
9 g/l auflöst.
Arbeitsverdünnungen,
die 100, 400, 2000 bzw. 4400 mIE/l TSH enthalten, werden in der
konservierten Matrix hergestellt. Die Niveaus 2, 3, 4 und 5 werden
so zubereitet, dass sie 1,0, 4,0, 20,0 bzw. 55,0 mIE/l TSH enthalten,
wobei man die geeignete Arbeitsverdünnung verwendet. Die Niveaus
2–5, die
jetzt T4 und TSH enthalten, werden 60 Minuten lang bei 25°C gründlich gemischt.
- e) Ebenso wird eine Stammlösung
von 50 mg/l T3 (Natriumsalz) in 0,05 N NaOH hergestellt, und ihre Konzentration
wird unter Verwendung des bekannten Extinktionskoeffizienten von
T3 bei 325 nm bestätigt. Arbeitsver dünnungen
werden in einer Rinderalbuminlösung
von 2 g/l, die 200, 400, 800, 1800 μg/l T3 enthält, hergestellt und verwendet,
um die Niveaus 2, 3, 4 und 5 zuzubereiten, die 1,0, 2,0, 4,0 bzw.
9,0 μg/l enthalten.
Die Niveaus 2–5,
die jetzt Thyroxin, TSH und T3 enthalten, werden 60 Minuten lang
bei 25°C gemischt.
Diese Mengen an T3 bilden in der Matrix ein Gleichgewicht, was Konzentrationen
von ungebundenem (freiem) T3 von ungefähr 0, 5, 11, 25 bzw. 45 ng/l
in den Niveaus 2, 3, 4 bzw. 5 ergibt.
- g) Keine Änderung
in den Analytkonzentrationen (TSH, Gesamt-T4, freies T4, Gesamt-T3
und freies T3) werden über
einen Zeitraum von bis zu 5 Tagen nach dem Zubereitungsstadium beobachtet.
Die Mischzeiten werden so gestaltet, dass ein homogenes Produkt
gewährleistet
ist. Längere
oder kürzere Mischzeiten
und viele Arten des Mischens sind zulässig.
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Große Glycoproteinhormone wie
TSH werden gewöhnlich
durch die zweiseitige "Sandwich"-Immunoassaytechnik gemessen. 1 zeigt eine Eichkurve für einen
heterogenen Sandwich-Immunoassay für TSH unter Verwendung der
Eichlösung
gemäß dieser
Erfindung auf einem Dimension® RxL Clinical Chemistry
System, das von Dade International Inc. (Newark, DE) erhältlich ist. 2 zeigt die Genauigkeit
der Eichlösung
in 1. Aliquote aus 86
Patientenseren wurden auf dem Dimension® RxL
Clinical Chemistry System, das mit einer Standardlösung gemäß dieser
Erfindung geeicht war, gemessen und mit einem kommerziellen AxSYM®-Analysesystem
verglichen, das mit Material und nach Anweisungen geeicht wurde,
die von seinem Hersteller, den Abbott Laboratories (Abbott Park,
IL), zur Verfügung
gestellt wurden. Die Daten zeigen eine Übereinstimmung zwischen den
beiden Systemen.
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Moleküle geringerer Größe und Konzentration,
wie freies T4, Gesamt-T3 und freies T3, werden häufig durch kompetitive Hapten-Immunoassays
bestimmt, und das Signal, das aus einem solchen Assay resultiert,
ist umgekehrt proportional zur Konzentration des Moleküls. 3 zeigt Eichkurven für einen
kompetitiven Hapten-Immunoassay für freies T4 unter Verwendung
derselben Eichlösung
von 1 gemäß dieser
Efindung, wobei ebenfalls das Dimension® RxL
Clinical Chemistry System verwendet wurde. 4 zeigt die Genauigkeit der Eichlösung in 2. Aliquote aus 138 Patientenseren
wurden auf dem Dimension® RxL Clinical Chemistry
System, das mit einer Standardlösung
gemäß dieser
Erfindung geeicht war, gemessen und mit einem kommerziellen IMx®-Analysesystem
verglichen, das mit Material und nach Anweisungen geeicht wurde,
die von seinem Hersteller, den Abbott Laboratories, zur Verfügung gestellt
wurden. Die Daten zeigen eine Übereinstimmung
zwischen den beiden Systemen.
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Assays für freies T3 werden in ähnlicher
Weise durchgeführt. 5 zeigt eine Eichkurve für freies T3,
die unter Verwendung einer Standardlösung, die gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt wurde, auf einem kommerziellen IMx®-System angefertigt wurde.
Ein Assay für
Gesamt-T3 kann ähnlich
wie Assays für
das freie Hormon unter Verwendung eines Mittels, das T3 aus Proteinbindungsstellen
freisetzt, durchgeführt
werden. 6 zeigt eine
Eichkurve für Gesamt-T3
unter Verwendung eines kompetitiven Hapten-Immunoassays auf dem
kommerziellen IMx®-Analysesystem.
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Im Unterschied zu TSH, freiem T4,
freiem T3 und Gesamt-T3 sind die Konzentrationen an Gesamt-T4 in
Humanserum groß genug,
um durch Immunoassaytechniken bestimmt zu werden, die keinen Schritt
zum Konzentrieren des interessierenden Moleküls erfordern. Ein Beispiel
für eine
Gesamt-T4-Eichkurve auf dem kommerziellen Dimension®-Analysesystem,
die unter Verwendung einer Eichlösung
gemäß der vorliegenden
Endung hergestellt wurde, ist in 7 gezeigt.
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Wie in der Tabelle unten gezeigt
ist, hat sich bei allen obigen Eichlösungen gezeigt, dass sie sechs
Monate oder länger
stabil sind, wenn sie bei 2–8°C aufbewahrt
werden. Eine Änderung
des Analytenwerts von 5% oder mehr gilt normalerweise als unannehmbar
für die
kommerzielle Anwendung der Eichlösungen.
Die Stabilität
der Analyten in der Eichlösung
wurde durch Messung dieser Analyten mit verschiedenen kommerziellen
Analysesystemen bestimmt. Proben der Eichsubstanz, die bei 2–8°C aufbewahrt
wurden, wurden parallel mit Proben gemessen, die durch Einfrieren
bei -70°C
stabilisiert wurden. Die Ausbeute des Materials ist gezeigt als
die bestimmte Menge des spezifischen Analyten in dem bei 2–8°C gelagerten Material,
dividiert durch die bestimmte Menge des spezifischen Analyten in
dem gefrorenen Material, als Prozentwert ausgedrückt. Für alle Niveaus und Analyten
wird bei 2–8°C praktisch keine Änderung
in der Analytenkonzentration festgestellt. Tabelle
| Analyt | %
des Analyten, zurückgewonnen
nach 6 Monaten Lagerung bei 2–8°C im Vergleich
zu einer Lagerung bei -20°C |
| Gesamtthyroxin | 99,5% |
| freies
Thyroxin | 100,8% |
| Gesamttriiodthyronin | 100,4% |
| freies
Triiodthyronin | 100,4% |
| Thyreotropin | 99,8% |