DE2703668C2 - Verfahren zur Messung der Menge an Schilddrüsenhormon in einer Serumprobe - Google Patents

Description

15 dadurch gekennzeichnet, daß man

e) die Äquilibrierung des vom Schilddrüsenhormon bindenden Protein abgetrennten Schilddrüsenhormons mit dem radioaktiv markierten Hormon und dem Antikörper in Abwesenheit von Blockierungsmitteln bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,5 durchführt, ohne zuvor das Schilddrüsenhormon bindende Protein aus

20 der Mischung zu entfernen und

f) die Trennung gemäß Stufe (c) durchführt, indem man die Mischung aus Stufe (e) mit einer wäßrigen Lösung eines Sulfats in solcher Menge vermischt, daß die Sulfatkonzentration in der entstehenden Mischung 20 bis 30 Gew.-% beträgt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßrige saure Lösung eine wäßrige

HCl-LöEung mit einem pH-Wert von etwa 1,0 bis etwa 3,0 verwendet

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung des wasserlöslichen Sulfats verwendet, die eine wirksame Menge tierisches Serum enthält

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als tierisches Serum Rinder-, menschliches oder Schafserum verwendet

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das tierische Serum in einer Menge verwendet daß das Volumen des der Mischung zugefügten tierischen Serums mindestens das 6-fache des Volumens der Serumprobe und das Volumen der Serumprobe bis zu etwa 10 Mikroliter beträgt

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet daß man das tierische Serum in einer Menge verwendet daß das volumetrische Verhältnis der Serumprobe zum zugefügten tierischen Serum etwa 1 :6

bis etwa 1 :20 beträgt

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet daß man das tierische Serum in einer Menge verwendet daß das volumetrische Verhältnis etwa 1 :6 bis etwa 1:12 beträgt

8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet daß man als tierisches Serum Pferdeserum verwendet

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das Pferdeserum in einer Menge verwendet daß das Volumen des der Serumprobe zugefügten Pferdeserums mindestens das zweifache der Serumprobe beträgt

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als tierisches Serum Kaninchenserum verwendet

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet daß man das Kaninchenserum in einer Menge verwendet daß das Volumen des der Serumprobe zugefügten Kaninchenserums das 8-fache der Serumprobe beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man als Sulfatlösung eine wäßrige Alkalimetallsulfat- oder Ammoniumsulfatlösung verwendet

13. Vefahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als wäßrige Sulfatlösung eine wäßrige Ammoniumsulfatlösung mit etwa 30 bis etwa 40 Gew.-% Ammoniumsulfat verwendet

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet daß man die wäßrige Sulfatlösung in einer Menge verwendet, daß die entstehende Mischung eine Sulfatkonzentration von etwa 23 bis 27 Gew.-%

55 aufweist

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schilddrüsenhormon Thyroxin verwendet.

IC. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als Schilddrüsenhormon Trijodthyroxin verwendet.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Menge an Schilddrüsenhormon in einer Serumprobe, die endogenes Schilddrüsenhormon und endogenes Schilddrüsenhormon bindendes Protein enthält, bei dem man

a) daj Schilddrüsenhormon von dem das Schilddrüsenhonnon bindenden Protein durch Behandlung mit einer wäßrigen sauren Lösung trennt,

b) bei einem höheren pH-Wert eine bekannte Menge radioaktiv markierten Schilddrüsenhormons und eine bekannte Menge Schilddrüsenhormon-Antikörper zufügt,

c) das freie, nicht an SchikWräsenhormon-Antikörper gebundene Schilddrüsenhormon von dem an die Antikörper gebundenen Hormon abtrennt und

d) in einem Sdntillationszähler entweder das freie radioaktiv markierte Schilddrüsenhonnon oder das an die Antikörper gebundene radioaktiv markierte Schilddrüsenhormon auszählt

Es sind verschiedene diagnostische Tests zur Prüfung der Schilddrüsenfunktion bekannt Diese Tests umfassen die Bestimmung des Grundumsatzes, den Schilddrüsenhormon-Aufnahmetest, verschiedene kolorimetrische und chemische Verfahren zur Bestimmung des Thyroxinjodgehalts im Blut sowie einen Test, der gewöhnlich als T-3-Aufnahmetest bezeichnet wird und das Vermögen von Globulin und anderen Proteinen, Schilddrüsenhormon in einer Serumprobe zu binden, mißt Der wahrscheinlich am häufigsten angewandte diagnotische Test wendet mit Radioisotopen markiertes Hormon an, um den Gehalt des Schilddrüsenhormons Thyroxin (Ci₅HuUNO₄) im Serum zu messen. Dieser Tesi, der gewöhnlich als T-4-Test bezeichnet wird, ermittelt die Gesamtmenge an Hormon in einer Probe von Blutserum. Der am häufigsten angewandte T-4-Test, der den Thyroxinspiegel in einer Probe von Blutserum feststellt, wendet die Technik der konkurrierenden Proteinbindung an. Zur Durchführung des T-4-Tests ist es notwendig, zuerst das Schilddrüsenhormon Thyroxin aus den das endogene Thyroxin bindenden Proteinen in einer Serumprobe freizusetzen. Danach werden eine bekannte Menge Thyroxin-bindendes Protein (im allgemeinen Schilddrüsenhormon-bindendes Globulin) und radioaktiv markiertes Schilddrüsenhormon zu dem aus der Probe erhaltenen Thyroxin gegeben. Das endogene Thyroxin aus der Probe und das radioaktiv markierte Thyroxin gehen mit der bekannten Menge an zugesetztem Protein eine Bindung ein. Nach dieser Bindung wird das freie oder nicht gebundene Thyroxin vom gebundenen Thyroxin abgetrennt und die relative Menge des Thyroxins in der ursprünglichen Probe wird durch Feststellung der Radioaktivität des freien oder des gebundenen Thyroxins in einer Scintillationszählvorrichtung ermittelt

Vor kurzem wurden für die Bindung des Schilddrüsenhormons an Prcieine anstelle der das Thyroxin bindenden Globuline spezifische Antikörper eingesetzt Diese Verfahren werden als radioimmunologische Untersuchungen auf Schilddrüsenhormon bezeichnet

Die Methodik im Τ-4-Proteinbindungsversuch und im radioimmunologischen Versuch ist im allgemeinen ziemlich ähnlich. Bei beiden Verfahren muß zuerst das Thyroxin aus den das endogene Thyroxin bindenden Proteinen im Serum freigesetzt und die das Thyroxin bindenden Proteine müssen in solcher Weise verändert werden, daß ihre weitere Teilnahme an der Umsetzung verhindert wird. Bei der herkömmlichen T-4-Proteinbildung wird dies dadurch erreicht, daß man zu Beginn die Serumprobe mit organischen Lösungsmitteln, wie Äthylalkohol behandelt um die das Schilddrüsenhormon bindenden Proteine zu denaturieren, vergleiche die US-Patentschrift 36 66 854. Andere chemische Verfahren wenden die Behandlung der Probe mit anorganischen Chemikalien, wie alkalische Lösungen an. Die Verwendung von alkalischen Extraktionslösungen in handelsgängigen Testsystemen ist jedoch nicht erwünscht da diese Lösungen bei der Lagerung und Anwendung unbeständig sind. Insbesondere absorbieren diese Lösungen rasch CO₂, was zu einer Verringerung des pH-Wertes führt Ein anderes Verfahren besteht in der Behandlung der Probe mit einer sauren Lösung, um eine Trennung des Schilddrüsenhormons von den das Hormon bindenden Proteinen zu bewirken und der nachfolgenden Behandlung der Lösung mit einem anorganischen kristallinen Adsorptionsmittel, wie Magnesiumsilikat das lediglich das freie Hormon adsorbiert. Ein solches Verfahren ist in der US-Patentschrift 37 76 698 beschrieben. Wenn saure Extraktionen in Testmethoden durchgeführt werden, die die Proteinbindung anwenden, werden die ausgefällten endogenen Proteine physikalisch vom freigesetzten endogenen Schilddrüsenhormon entfernt bevor bei höheren pH-Werten die nachfolgenden Stufen des Testverfahrens erfolgen. Dies beruht hauptsächlich auf der Tatsache, daß sauer ausgefällte oder denaturierte Proteine bekanntlich in Lösungen von höherem pH-Wert erneut gelöst oder renaturiert werden. Man nimmt daher an, daß die saure Denaturierung »reversibel« ist. In der Tat wendet ein im Handel erhältliches, sogenanntes normalisiertes T-4-Testsystem dieses Phänomen der Renaturierung sauer denaturierter Proteine als wesentliche Stufe an. S₀

Eine andere Methode zur Freisetzung des Thyroxins aus den endogenen, das Thyroxin bindenden Proteinen besteht in der Denaturierung durch Anwendung von Wärme. Diese Art der Denaturierung ermöglicht eine Extraktionseffizienz des Schilddrüsenhormons von etwa 100%. Sie ist jedoch zeitraubend, denn sie erfordert mindestens 15 Minuten in eineni siedenden Wasserbad, um einen vollständigen Abbau der bindenden Proteine zu erreichen.

Auch bei Anwendung des radioimmunologischen Tests muß das Thyroxin zuerst aus den endogenen, das Thyroxin bindenden Proteinen in der Serumprobe freigesetzt und die bindenden Proteine müssen in solcher Weise verändert werden, dd3 ihre weitere Teilnahme an der Umsetzung verhindert wird. Beim radioimmunologischen Test wird dies gewöhnlich bis zu einem Grad durch Blockierung der das Thyroxin bindenden Stellen in den endogenen Proteinen mit chemischen Substanzen, wie 8-Anilino-l-naphthalinsulfonsäure, Diphenylhydantoin, Salicylaten oder Thimerosal bewirkt. Die Anwendung dieser Blockierungsmittel birgt jedoch Probleme in sich. Zum Beispiel wurde nachgewiesen, daß die zur Besetzung aller Stellen notwendige Menge der blockierenden Mittel in Beziehung zur Menge der endogenen, das Schilddrüsenhormon bindenden Proteine stehen kann, die in den einzelnen Serumproben beträchtlich schwanken kann.

Das heißt, sowohl bei der herkömmlichen Τ-4-Proteinbindung wie auch im radioimmunologischen Test muß das Thyroxin zuerst aus den nativen Proteinen extrahiert und dann an spezifische Proteine gebunden werden, worauf das freie Hormon von dem an Protein gebundenen Hormon getrennt wird. Die endgültige Trennung wurde durch Adsorption des freien Hormons, zum Beispiel an Harze, Aktivkohle oder anorganische kristalline

Adsorptionsmittel bewirkt Die üblichen Harze umfassen Ionenaustauscherharze, wie Ionenaustauscher mit stark basischen Amino- oder quarternären Ammoniumgruppen, wie sie in der US-Patentschrift 3414 383 beschrieben sind. Diese organischen Ionenaustauscherharze können entweder in loser Form vorliegen oder in Polyurethanschwimme eingebaut seH »ehe hierzu die US-Patentschrift 32 06 602. Sie können auch in porösen

freien Hormons durch Aktivkohle, die mit geeigneten Proteinen oder anderen Polymeren fiberzogen ist, öder die Verwendung von Molekularsieb«!, wie Sephadex. Die Verwendung anorganischer kristalliner Adsorptionsmittel ist in den US-Patentschriften 36 66 854 und 37 76 698 beschrieben. Im allgemeinen hängen die Adsorptionsverfahren zur Trennung des freien Hormons von dem a*i das Protein gebundenen Hormon von der Proteinkon- Hk ίο zentration im Untersuchungssytem ab, und einige Systeme können zur Erzielung gültiger Ergebnisse eine ■ Einstellung des Proteingehalts erfordern. Außerdem sind einige Adsorptionsmittel, wie die Harze, temperatur-

~ empfindlich und erfordern die Korrektur von unter den Testbedingungen erhaltenen Werten, wenn die Temperaturen variabel sind. Hinzu kommt, daß die Adsorptionsmittel im allgemeinen zeitabhängig reagieren, so daß, k. um reproduzierbare Werte zu erhalten, die Zeit des Adsorptionsprozesses sorgfältig überwacht werden muß.

15 An Antikörper gebundenes Hormon kann von der freien Fraktion durch Fällung des spezifischen Proteins

γ getrennt werden. Eine herkömmliche Methode zur Fällung der gebundenen Fraktion besteht in der doppelten

'§ Antikörper-Technik, die jedoch aufgrund einer zweiten Einwirkungszeit zeitraubend ist Ein anderes Trennver-

^ fahren besteht in der chemischen Fällung der gebundenen Fraktion durch Polymere mit hohem Molekularge-

■; wicht oder Salze. Eine Übersicht über Trennverfahren findet sich in Brit Med. BuIL, Band 30,1974, Nr. 1, Seiten

κ 20 32—37. Unter anderem wird dort die Verwendung von Natrium- und Ammoniumsulfat zur Ausfällung von

proteingebundenem Hormon erwähnt Um die sehr geringen Mengen an vorhandenem /-Globulin zu fällen, wird gewöhnlich exogenes /-Globulin vor der Trennung der gebundenen, von der freien Fraktion zu dem Untersuchungssystem gegeben.

Ein weiteres aufgetretenes Problem besteht in der nicht-spezifischen Bindung während des Versuchs. Unter

' 25 der nicht-spezifischen Verbindung ist die Bindung von freiem Hormon, einschließlich des freien radioaktiv markierten Hormons, an andere Materialien als an das das Schilddrüsenhormon bindende Protein im T-4-Test oder an den Antikörper im radioimmunologischen Test zu verstehen. Die Tatsache, daß man nicht in der Lage ist, den Grad der nicht-spezifischen Bindung in Abwesenheit des bindenden Proteins abzuschätzen, stellt einen

Nachteil solcher Untersuchungssysteme dar, in denen das bindende Protein und das radioaktiv markierte

30 Hormon die einzigen Reaktionsteilnehmer sind.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, einen Schilddrüsenhormon-Test zu schaffen, bei dem zu Anfang das gesamte oder im wesentlichen das gesamte endogene Schilddrüsenhormon in reproduzierbarer Weise von dem das endogene Schilddrüsenhormon bindenden Protein getrennt wird, der nach der konkurrierenden Bindung keine Blockierungsmittel oder feste Adsorptionsmittel zur Trennung des gebundenen Hormons vom freien Hormon erfordert, die Trennung aber rasch und wirksam in reproduzierbarer Weise ermöglicht, bei dem eine geringe, aber reproduzierbare nicht-spezifische Bindung auftritt, und der in einem einzigen Teströhrchen ohne zwischenzeitliches Abdekantieren der Testlösung(en) durchführbar ist

Zur Lösung dieser Aufgabe wird das eingangs geschilderte Verfahren mit den Verfahrensstufen (a) bis (d) dadurch verbessert, daß man

(e) die Äquilibirierung des vom Schilddrüsenhormon bindenden Protein abgetrennten Schilddrüsenhormons mit dem radioaktiv markierten Hormon und dem Antikörper in Abwesenheit von Blockierungsmitteln bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,5 durchführt, ohne zuvor das Schilddrüsenhormon bindende Protein aus der Mischung zu entfernen und

(0 die Trennung gemäß Stufe (c) durchführt, indem man die Mischung aus Stufe (e) mit einer wäßrigen Lösung eines Sulfats in solcher Menge vermischt, daß die Sulfatkonzentration, in der entstehenden Mischung 20 bis 30 Gew.-% beträgt

Erfindungsgemäß besteht also der radioimmunologische Test auf Schilddrüsenhormon darin, daß zuerst das

endogene Schilddrüsenhormon mit einem sauren Reagenz unter wirksamer Inaktivierung der endogenen, das Schilddrüsenhormon bindenden Proteine aus der Serumprobe extrahiert wird, nachfolgend (ohne Entfernung der endogenen, das Schilddrüsenhormon bindenden Proteine) der pH-Wert auf einen für eine konkurrierende Bindungsreaktion geeigneten Wert erhöht und radioaktiv markiertes Schilddrüsenhormon und eine bekannte Menge Schilddrüsenhormon-Antikörper zugefügt wird. Anschließend ermöglicht man in der gebildeten Lösung die Einstellung eines Gleichgewichts und das Eintreten einer Bindungsreaktion. Dann wird der gebundene Anteil durch Zugabe einer wäßrigen Sulfatsalzlösung, die zur Ausfällung des gebundenen Anteils führt, vom freien Anteil getrennt. Anschließend wird die Radioaktivität des ausgefällten, gebundenen Anteils oder die der überstehenden, den freien Anteil enthaltenden Flüssigkeit in einem Scintillationszähler ermittelt Dieses Verfahren läßt sich in einem einzigen Teströhrchen ohne zwischenzeitliches Abdekantieren durchführen.

Weiterhin wurde festgestellt, daß die Trennung der freien Schilddrüsenhormonfraktion von der gebundenen wirksam in reproduzierbarer Weise so bewirkt werden kann, daß die nicht-spezifische Bindung im System auf einem niedrigen konstanten Wert gehalten wird, wenn man die gebundene Fraktion mit einer wäßrigen Sulfatsalzlösung ausfällt, der zuvor eine geringe, aber wirksame Menge tierisches Serum zugegeben wurde.

Bei der Suche nach einem »Einröhrchentest« zur Feststellung von Schilddrüsenhormon ohne Verwendung

von Blockierungsmitteln oder festen Adsorptionsmitteln bei geringstem manuellen Aufwand durch das Laborpersonal stellte man fest, daß die endogenen, das Schilddrüsenhormon bindenden Proteine durch Behandlung mit einem sauren Reagenz inaktiviert und dadurch vom endogenen Schilddrüsenhormon getrennt werden können. Dann kann der pH-Wert der entstandenen Mischung erhöht, und es können die Schilddrüsenhormon-

Antikörper für die konkurrierende Bindungsreaktion mit dem endogenen Schilddrüsenhormon zugegeben werden, ohne daß eine Beeinträchtigung durch das endogene Protein eintritt. Dies ist absolut überraschend, nachdem bekannt ist, daß durch Säure inaktiviertes, Schilddrüsenhormon bindendes Protein bei höheren pH-Werten renaturiert wird und die Bindungsreaktion zwischen dem Schilddrüsenhormon und von außen eingeführtem. Schilddrüsenhormon bindendem Protein durch Teilnahme an der Bindungsreaktion beeinflußt. Demgegenüber wurde nun gefunden, daß ein radioimmunologiichcrTest auf Schilddrüsenhormon unmittelbar nach der sauren Abtrennung des endogenen Schilddrüsenhormons von dem das Hormon bindenden endogenen Protein durch einfache Erhöhung des pH-Wertes der Mischung und ohne zuvor das endogene Protein von der Mischung abgetrennt zu haben, durchgeführt werden kann.

Hinzu kommt, daß, wie oben angegeben, die meisten Adsorptionsmittel von der Gesamtproteinkonzentration in der Mischung abhängig sind, so daß geringfügige Variationen in der Proteinkonzentration der Proben die prozentuale Aufnahme durch das Adsorptionsmittel beeinträchtigen können. Außerdem muß ein wirksamer radioimmunologischer Test auf Thyroxin eine geringe reproduzierbare nicht-spezifische Bindung des Schilddrüsenhormons besitzen, die im wesentlichen auf einem niedrigen, aber gleichmäßigen Bindungsgrad des Schilddrüsenhormons an andere Bestandteile als den Antikörper beruht.

Im erfindungsgemäßen radioimmunologischen Test auf Schilddrüsenhormon wird eine Salzfällung angewandt, um das gebundene Hormon in der Lösung vom freien Hormon zu trennen. In herkömmlicher Weise werden Träger oder Hilfsproteine zu diesen Mischungen gegeben, bevor man das Sulfat zufügt, um die Fällung zu bewirken und zu beschleunigen. Es wurde jedoch gefunden, daß das Hilfsprotein mit dem Sulfat vermischt werden kann, bevor man dieses der zu untersuchenden Mischung zugibt. Man hat festgestellt, daß die Zugabe dieses kombinierten Fällungsmittels zu einer konstanten, reproduzierbaren nicht-spezifischen Bindung sowie zu einer annehmbaren Verteilung zwischen den hypothyroiden und den hyperthyroiden Proben führt Außerdem ermöglicht die Verwendung dieses Kombinationsfällungsmittels die Anwendung eines breiten Volumenbereiches der Serumproben sowie von Serumproben mit einem breiten Proteinkonzentrationsbereich.

Die Erfindung ist nachfolgend an der radioimmunologischen Untersuchung von Thyroxin beschrieben, kann vom Fachmann jedoch leicht auf die Untersuchung von Trijodthyronin und anderen Thyroninen abgewandelt werden.

Bevor das endogene Thyroxin des Serums unter Anwendung der verbesserten Salzfällung gemäß der Erfindung untersucht werden kann, muß das Hormon wirksam und reproduzierbar aus einer Serumprobe extrahiert werden. Außerdem muß das gesamte endogene Protein, das während der verschiedenen Stufen des Tests Thyroxin binden könnte, vollständig inaktiviert werden.

Erfindungsgemäß wird das endogene Thyroxin mit einer sauren Lösung aus der Serumprobe extrahiert Die saure Lösung wird im allgemeinen auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 1,0 bis 2,2 gehalten. Der bevorzugte pH-Bereich beträgt etwa 1,0 bis 2,0. Jede beständige Säurelösung, die das Schilddrüsenhormon nicht beeinträchtigt, kann im Rahmen der Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können wäßrige Lösungen von HCl, H2SO4, H3PO4 und dergleichen angewandt werden, wobei HCl als Säure bevorzugt wird. Diese Materialien können mit geeigneten Puffersubstanzen gepuffert sein, zum Beispiel Salzen schwacher Säuren in einer Konzentration von etwa 0,02 bis 0,07 M. Auch die Ionenstärke der sauren Lösung kann durch die Gegenwart geeigneter Materialien, wie neutraler Salze, zum Beispiel von NaCl, KCl und dergleichen auf einer Konzentration von 0,02 bis 0,07 M gehalten werden.

Im allgemeinen werden mindestens etwa 10 und vorzugsweise etwa 20 Volumenteile des Säureextraktionsmittels je Volumenteil mit der Serumprobe vereinigt Der pH-Wert der entstehenden Mischung sollte im Bereich von etwa 1,3 bis etwa 3,0 liegen. Es tritt sofort eine vollständige Inaktivierung der endogenen, das Thyroxin bindenden Proteine ein, obwohl die inaktiven Proteine in Lösung bleiben. Zum Beispiel kann man das Serum zu der in einem Fläschchen befindlichen sauren Extraktionslösung geben und das Fläschchen einige Sekunden, im allgemeinen 10 bis 15 Sekunden schütteln, um das Serum und die saure Lösung sorgfältig zu vermischen. Dies ermöglicht der sauren Lösung die Bindungen zwischen dem Thyroxin und dem das Thyroxin bindenden Protein zu lösen und das das Thyroxin bindende Protein vollständig zu inaktivieren.

Nachdem die gebildete Lösung das gesamte endogene Thyroxin enthält und im wesentlichen das gesamte, das Thyroxin bindende Protein inaktiviert ist, muß der pH-Wert der Lösung auf einen geeigneten pH-Wert erhöht so werden, bei dein die BindungsFcäküon zwischen dem Schilddrüsenhormon und seinem Antikörper eintreten kann, worauf man zu der Lösung das radioaktiv markierte Schilddrüsenhormon (T-A) und eine bekannte Menge des die Antikörper enthaltenden Antiserums zugibt Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das radioaktive Schilddrüsenhormon und dann das Antiserum zu der sauren Lösung gegeben, welche die unbekannte Menge des endogenen Schilddrüsenhormons enthält Insbesondere kann die das radioaktive Thyroxin enthaltende Lösung einen pH-Wert von etwa 7,6 bis 9,0 und vorzugsweise von etwa 83 aufweisen und vorzugsweise eine Puffersubstanz zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes der Lösung enthalten. Eine geeignete Lösung ist ein 0,04 M Natriumbarbitalträger, der durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf den pH-Wert 83 eingestellt ist und das Markierungsmaterial M¹²⁵I enthält

Es kann jedes radioaktive Isotop von Jod, Tritium oder Kohlenstoff verwendet werden. Vorzugsweise wird ein Honnon verwendet, das ¹²⁵I markiert ist Die gepufferte Lösung mit dem radioaktiv markierten Schilddrüsenhormon Thyroxin, die mindestens des 20- und vorzugsweise das 40-volumenfache der Serumprobe ausmacht, wird zu der Säurelösung gegeben, worauf durch Schütteln sorgfältig vermischt wird. Anschließend wird zu der gebildeten Lösung eine, das Antithyroxin-Serum enthaltende Lösung gegeben. Das Antiserum kann eine geeignete Puffersubstanz, zum Beispiel NatriumbarbitaL enthalten und im allgemeinen einen pH-Wert im Bereich von es etwa 7,6 bis 9,0 aufweisen. Das der Testmischung zugefügte Volumen der Antiserumlösung kann das gleiche sein, wie das der Testmischung zugefügte Volumen der das radioaktive Isotop enthaltenden Lösung. Nach der Zugabe der Lösung des Thyroxin-Antiserums wird wiederum sorgfältig gemischt Die gebildete Lösung hat

einen pH-Wert von etwa 7,0 bis 8,5 und vorzugsweise von etwa 7,4 bis 8,4 und wird etwa 30 bis etwa 60 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, um die Bildung des Thyroxin-Antikörper Komplexes zu ermöglichen. Da der Antikörper sowohl das radioaktive Thyroxin als auch das Thyroxin des Serums bindet, ermöglicht die Menge des gewonnenen radioaktiven Thyroxins einen Rückschluß auf die Konzentration des Thyroxins in der ursprünglichen Probe. Das in dieser Stufe verwendete Antiserum sollte eine hohe Spezifität gegenüber Thyroxin besitzen. Wie schon ausgeführt, beeinträchtigt das inaktivierte, das Schilddrüsenhormon bindende Protein in der Mischung überraschenderweise nicht die Bindungsreaktion zwischen dem Schilddrüsenhormon und dem Antikörper.
Nachdem in der Lösung ein Gleichgewicht eingestellt und die Bindungsreaktion zwischen den Thyroxin-Antikörpern und dem Thyroxin vollständig ist, werden -die Antikörper mit dem an sie gebundenen Hormon unter Anwendung der verbesserten erfindungsgemäßen Salz-Fällungsmethode ausgefällt Die Fällungslösung besteht aus einer wäßrigen Lösung eines wasserlöslichen Sulfatsalzes, das proteinhaltige Materialien wirksam ausfällt, ohne zu einer Ausfällung von freiem Hormon aus der Lösung zu führen. Beispiele für geeignete verwendbare Sulfatsalze sind die Alkalimetallsulfate, wie Natrium- und Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat und Zinksulfat. Wegen

;s seines Lcslichkeitsbereiches und seiner leichten Zugänglichkeit wird Ammoniumsulfat am meisten bevorzugt. Die Konzentration des Ammoniumsulfats kann gemäß der Menge des gewünschten zu verwendenden wäßrigen Fällungsmittels variieren. Im allgemeinen sollte die Konzentration in der Fällungslösung so beschaffen sein, daß beim Vermischen mit der Thyroxin-Antikörper enthaltenden Lösung die entstehende Sulfatkonzentration im Bereich von etwa 20 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise im Bereich von etwa 23 bis 27 Gew.-% und insbesondere bei etwa 23 bis 24 Gew.-% liegt Die Konzentration des Sulfats in der Fällungslösung kann zweckmäßig etwa 30 bis etwa 40 Gew.-% und vorzugsweise etwa 33 bis 39 Gcw.-% betragen.

Außer dem Sulfat muß zum Zeitpunkt der Fällung eine kleinere aber wirksame Menge tierisches Serum als Hilfsmittel zu der Antikörper-Thyroxin enthaltenden Lösung gegeben werden, um eine geringfügige, aber reproduzierbare nicht-spezifische Bindung und einen deutlichen Unterschied in den Thyroxinspiegeln von hypothyroiden und hyperthyroiden Serumproben zu erzielen. Außerdem ermöglicht die obige Kombination die Anwendung eines breiten Volumenbereiches der Proben, das heißt von etwa 2 bis etwa 50 Mikroliter, und die Untersuchung von Serumproben mit einem breiten Proteinkonzentrationsbereich. Im allgemeinen ist die Menge des zugefügten Serums, das zur Erzielung dieses Ergebnisses notwendig ist, um ein Volumen größer als das ursprüngliche Volumen der untersuchten Serumprobe. Gewöhnlich kann jedes tierische Serum als Hilfsmittel verwendet werden, obwohl gefunden wurde, daß eine gewisse Variation in der Menge des Serums erforderlich ist, die in direktem Zusammenhang zu der Art des Tieres steht, von der das Serum erhalten wurde. Bei Verwendung einer Serumprobe von 10 Mikrolitern oder weniger und Verwendung von Rinderserum, Schafserum oder menschlichem Serum als Hilfsprotein muß das Volumen des zugefügten Trägerproteins im allgemeinen größer als etwa das vierfache des ursprünglichen Volumens der untersuchten Serumprobe und vorzugsweise größer als das etwa 6-fache des Volumens der untersuchten Probe sein. Es kann auch wesentlich größer sein und zum Beispiel das 12- bis 20-fache des Volumens der ursprünglichen Probe betragen. Wenn das Gesamtprotein in der Lösung etwa 60 Mikroliter erreicht wird eine konstante nicht-spezifische Bindung und eine annehmbare prozentuale Verteilung erreicht, und weitere Mengen zugefügten Proteins, entweder aus der Probe oder anderweitig, beeinträchtigen die Analyse nicht Von Kaninchenserum ist etwa das 2-fache des oben genannten Rinder-, Schaf- oder menschlichen Serums erforderlich, und von Pferdeserum etwa die Hälfte des Rinder-, Schafoder menschlichen Serums. Das Serum ist vorteilhaft in der konzentrierten Sulfatfällungslösung enthalten, deren Konzentration, wie oben angegeben, im allgemeinen etwa 30 bis 40 und vorzugsweise etwa 33 bis 39 Gew.-% beträgt
Zur Trennung der freien von den gebundenen Fraktionen in der Testlösung wird eine ausreichende Menge der Fällungslösung zu der das Thyroxin und den Antikörper enthaltenden Probenlösung gegeben, so daß eine Endkonzentration an Sulfat zwischen etwa 20 und 30Gew.-% erreicht wird, wie oben dargelegt, und die Konzentration des Hilfsproteins innerhalb der vorstehend genannten Bereiche liegt Die Mischung wird sorgfältig vermischt, zum Beispiel durch Verschließen des Röhrchens in der sie enthalten ist, und 5- bis 20-faches Umkehren. Die Fällung aus Antikörper und an ihm gebundenen Hormon zusammen mit den Hilfsproteinen

so erfolgt unmittelbar an der unteren Grenze der Sulfatkonzentration. Das gebildete Gemisch sollte zentrifugiert werden, bis das auseefällte proteinhaltige Material am Boden des Gefäßes ein kleines knopfförmiges Gebilde bildet

Darauf wird entweder das freie Hormon in der überstehenden Flüssigkeit oder das gebundene in der Fällung in einem Scintillationszähler untersucht Vorzugsweise wird das gebundene Hormon ausgezählt Der im Scintillationszähler festgestellte Wert wird dann mit der Gesamtanzahl der Signale verglichen, die von dem zu Anfang zugefügten radioaktiv markierten Schilddrüsenhormon ausgesandt werden. Auf diese Weise erhält man den Prozentsatz an gebundenem Hormon. Dieser Prozentsatz wird dann zu Standardwerten in Beziehung gebracht, die man durch Messen des Prozentsatzes an gebundenem Hormon von Standardproben mit bekannten Mengen an Schilddrüsenhormon erhalten hatte, um auf diesem Weg in bekannter Weise die Menge des Schilddrüsenhor-

mons in der Probe zu ermitteln. ,

Die kleine aber wirksame Menge an Hilfsprotein ist notwendig, um einen Test zur Verfügung zu stellen, in dem bei konstanter nicht-spezifischer Bindung verschieden große Volumen an Serum eingesetzt werden können und sowohl bei hohen als auch bei niedrigen Thyroxinwerten ein annehmbarer Rückgewinnungsbereich erzielt wird. Man nimmt an, daß das wirksame Prinzip im Serum, das zu den gewünschten und unerwarteten Ergebnissen führt,/-Globulin ist Das meiste tierische Serum enthält im allgemeinen zwischen etwa 0,5 und 2 g /Globulin je 100 ml Serum, während der Gesamtproteingehalt im Serum etwa 5 bis 8 g je 100 ml Serum ausmacht Auf diese Tatsache wird deshalb hingewiesen, weil man, wie vorstehend angegeben, annimmt, daß /Globulin der wirksame Bestandteil des Serums für diesen Zweck ist, aus Zweckmäßigkeitsgründen aber vorteilhaft die

gesamte Serumprobe verwendet. Bei Verwendung von Rinder-, menschlichem oder Schafserum in Mengen vom vierfachen des Volumens der eingesetzten Serumprobe oder weniger wurden schwankende, nicht-reproduzierbare Werte der nicht-spezifischen Bindung sowie eine unannehmbare prozentuale Verteilung zwischen den Serumproben mit hohem und niedrigem Thyroxingehalt festgestellt. Bei Verwendung dieses Serums in Volumenmengen von mehr als etwa dem vierfachen des Volumens des eingesetzten Serums wird jedoch eine Ebene erreicht, auf der die nicht-spezifische Bindung im wesentlichen konstant ist und auch die Rückgewinnungswerte ausgezeichnet sind. Diese Ebene liegt beim etwa 6-fachen des Volumens der eingesetzten Probe und erfährt keine Änderung bei Zugabe von Proteinmengen von bis dem 12-fachen oder mehr, bezogen auf das ursprüngliche Volumen der Serumprobe.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Reproduzierbarkeit des neuen erfindungsgemäßen TV'r-xin-Tests. Hierbei wurden die folgenden Reaktionslösungen verwendet:

(a) Die Extraktionslösung bestand aus einer Lösung mit 0,025 η HCi und 0,05 η KCi.

(b) Die T-4¹²⁵I-Reaktionslösung enthielt eine Markierungsmenge des Radioisotopen T-4¹²⁵I in einer 0,04 molaren Natriumbarbitallösung mit ausreichend HCl, um den pH-Wert auf 8,3 einzustellen.

(c) Das T-4 Antiserum enthielt Thyroxin-Antikörper (aus Kaninchen) in einer 0,04 m Natriumbarbitallösung,

die mit HCl auf den End-pH-Wert von 8,3 eingestellt worden war.

(d) Die Fällungslösung bestand aus einer wäßrigen Lösung mit 37 Gew.-% Ammoniumsulfat und Rinderserum in einer Konzentration von 4 VoL-%.

(e) Als Standardlösungen wurden verwendet:

1 Mikrogramm Thyroxin je Deziliter

6 Mikrogramm Thyroxin je Deziliter

12 Mikrogramm Thyroxin je Deziliter 18 Mikrogramm Thyroxin je Deziliter

Die obigen Lösungen wurden zur Untersuchung von gefrorenem hypothyroiden Serum, normalem Serum und hyperthyroidem Serum durch 11 verschiedene Fachleute verwendet

Das Testverfahren bestand darin, daß man zunächst 10 Mikroliter einer Serumprobe (oder eines Standards) zu 200 Mikroliter der Extraktionslösung gab. Die gebildete Lösung wurde sorgfältig gemischt Dann wurden 400 Mikroliter der T-4¹²⁵I-Reaktionslösung zugefügt, worauf man rührte. Anschließend wurden 400 Mikroliter der T-4-Antiserumlösung zugegeben, und die gebildete Lösung wurde sorgfältig gemischt Dann wurde die Lösung 45 oder 60 Minuten bei Raumtemperatur bebrütet und nach Ablauf dieser Inkubationszeit wurde die Fällung in der Sulfatlösung resuspendiert, und 2 ml dieser Suspension wurden zu jedem Röhrchen mit der Testlösung gegeben. Dies bedeutet daß 80 Mikroliter des Hilfsserums zu jeweils 10 Mikroliter der ursprünglichen Probe gegeben wurden und die endgültige Sulfatkonzentration in jeder Testlösung 23,7 Gew.-% betrug. Die Röhrchen wurden verschlossen und sanft etwa zehnmal umgedreht.

20 Minuten nach der Zugabe des Fällungsmittels wurden die Röhrchen 10 Minuten bei 1000- bis 1500-facher Gravitation oder 2000 bis 2500 U/Min, zentrifugiert und nach drei Stunden wurde die überstehende Flüssigkeit verworfen und die zentrifugierte Fällung in einem Scintillationszähler untersucht Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt:

Tabelle 1 Die Tabelle zeigt die ausgezeichnete Reproduzierbarkeit des erfuidungsgemäßen Test Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht den linearen Verlauf des erfindungsgemißen radioimmunologischen Tests, wobei die in Beispiel 1 beschriebenen Lösungen verwendet wurden. Das endogene Thyroxin von 3 Serumproben wurde zu Anfang nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren untersucht Darauf wurden Mengen von 5,10,15 bzw. 20 Mikrogramm je Deziliter kristallines Thyroxin zu jeweils vier Proben der 3 Seren gegeben, und es die erhaltenen Proben wurden nach dem Verfahren des Beispiels 1 untersucht, um die übereinstimmende prozentuale Ruckgewinnung in diesem Test zu veranschaulichen. Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 2 zusammengestellt

	Serumprobe	normal	hyperthyroid
	hypothyroid	317	210
Anzahl der Untersuchungen	212	15	16
Anzahl der Tage	16	2	2
Anzahl der Proben	2	U	12
Anzahl der untersuchenden Fachleute	12	7,9	14,1
Mittel, u£/dl	3.2	030	0,47
Standard-Abweichung, u/dl	0,28	33	33
Abweichungskoeffizient %	8,8

Tabelle 2

Serum

endogen, gemessen

exogen, zugefügt

erwartete
Gesamtmenge

gemessene
Gesamtmenge

exogen, zurückgewonnen

exogen, zurückgewonnen,

5	8,3	83	5,0	100
10	133	13,4	10,1	101
15	183	18,4	15,1	101
20	233	23,6	203	102
5	8,6	8,7	5,1	102
10	13,6	13,5	9,9	99
15	18,6	183	15,2	101
20	23.6	24,0	20,4	102
5	8,0	7,9	4.9	98
10	13,0	12,9	9,9	99
15	18,0	18,1	15,1	101
20	23,0	23,0	20,0	100

33

3,6

3,0

Die obigen Ergebnisse veranschaulichen die ausgezeichnete Rückgewinnung des zugefügten T-4 und die Linearität des Testsystems.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die konstante reproduzierbare nicht-spezifische Bindung des Hormons an den Antikörper, die erreicht wird, wenn die Fällungslösung Rinderserum in einem Oberschuß von 4 Volumteilen je Volumteil der ursprünglichen Serumprobe enthält In jedem Fall wurde eine Lösung mit einer bekannten Menge Schilddrüsenhormon (eine 10-Mikroliter-Probe), einer Markierungsmenge radioaktiv gekennzeichneten Schilddrüsenhormons und einer bekannten Menge Antiserum mit verschiedenen Fällungslösungen in Berührung gebracht Die nicht-spezifische Bindung jeder Fällungslösung wurde durch Durchführung jedes Tests, aber unter Weglassung des Antiserums aus der gepufferten Antiserumlösung festgestellt Die Fällungslösung wurde sowohl hinsichtlich der Konzentration an Ammoniumsulfat als auch hinsichtlich des Trägerproteins variiert wie aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich ist, und die nichtspezifische Bindung der drei verschiedenen Standardseren wurde durch Weglassen des Antiserums aus der Antiserum-Pufferlösung wie in diesem Beispiel beschrieben, untersucht Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengestellt

Tabelle 4

nicht-speziflsche Bindung	(N H4J2SO4-Konzentration in der Fällungslösung	80 μΙ	120 μΐ	35%	80 μΙ	100 μΐ	36%	80 μΙ	ΙΟΟμΙ	37%	80 μΙ	100 μΙ	38%	80 μΙ	'■ 120 μΙ	S
	34%															σι
		4,6	44	Trägerprotein,	54	53		5,7	5,6		6,6	6.8		7.6	74
	Trägerprotein,	4,5	44	Volumen	5,6	5,4	Trägerprotein,	5,6	5.6	Trägerprotein,	6,8	6,8	Trägerp rotei.i,	7.7	7,4	00
	Volumen	44	4,6	60 μΙ	5,4	5,4	Volumen	54	5,5	Volumen	6,8	6.7	Volumen	7,4	7,2
Serumstandard	40 μΙ	4.5	44		54	5,4	60 μ!	5,6	5,6	60μ1	6,7	6,8	40 μΙ	7,4	7.4
0,5 μg, %			5,9
18μ&%			5.7		6,1		6,7		8,0
normales menschliches Serum	52		5,6		6,1		6,9		8,6
Durchschnitt	4,9	5,7		5,8		6,9		8.1
5.1	6,0	6,9	Ba

Beispiel 4 ■ .,".

Dieses Beispiel veranschaulicht die konstante nicht-spezifische Bindung und die ausgezeichnete Verteilung der Rückgewinnungswerte zwischen hypotbyroiden und hyperthyroiden Serumproben im erßndUnrjsgemaßen

Test, in dem die Fällungsflüssigkeit eine kleine aber wirksame Menge zugefügtes Serum als Hilfsmittel enthalt Es wurde das Verfahren des Beispiels 3 zur Untersuchung verscniedener Standardseren mit der Abweichung angewandt, daß die Konzentration des Serums in der FUlungslösung variiert wurde, so daß die entstehende Testlösung 60,70,80,90,100 bzw. 110 Mikroliter zugefügtes Serum enthielt, das mit der FUlungslösung zu der Testlösung gegeben wurde, die die ursprünglichen 10 Mikroliter Serumprobe enthielt Aus der Tabelle ist

to ersichtlich, daß, wenn das Trlgerprotein in der Fallungslösung in der 6-fachen Menge des Volumens der ursprünglichen Probe oder mehr vorhanden ist, der Wert der nicht-spezifischen Bindung stabil ist Wenn jedoch die Menge des Tragerproteins nur das 4-fache des ursprünglichen Probenvolumens betragt, weicht die nichtspezifische Bindung in unvorhersehbarer Weise ab. Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengestellt

'

10

■ Tabelle 5	Fällung mit 60 μΐ Serum	%;ge-	(Fortsetzung)	%, ge	Δ*)	Fällung mit 70 μ! Serum	%. ge	Δ	%, ge	Δ	Fällung mit SO μ! Serum	%.ge-	Δ	%, ge	Δ	5 :
1 frobe	nicht-	bunden	Fällung mit 90 μΐ Serum	bunden		nicht-	bunden		bunden		nicht-	bunden		bunden
S könzen-	spez.		nicht-			spez.					spez.
■ tration	Bind.	613	spez.	59,1		Bind.	61,1		602		Bind.	61,6		60,5
(««I)	6,6	612	Bind.	59,8		6.6	612		603		6,6	61,6		61,0		10
0,4		612	6,6	59,7			61,0		59,6			60,8		60,6
		(61.4)··)		(59,5)			(61,1)		(60,0)			(613)		(60,7)
		482		47,6			483		46,6			48,6		47,4
		48,0		47,0			48,6		47,1			483		47,3
32		483		47,0			482		47,2			483		47,7		15
		(483)		(472)	13.1		(48,6)	123	(47,0)	13,0		(48.6)	12,7	(473)	132
		402		39,0			393		39,0			402		39,1
	63	402		38,8		6.7	402		392		6,6	402		392
6,0		393	6,6	38,8			39,7		383			403		38,8
		(40.1)		(38,9)	82		(393)	8,7	(39,0)	8,0		(403)	83	(39,0)	8,5	20
		28,8		28,0			29,0		28,5			28.9		28,5
		293		27,9			29,0		28,8			29.0		283
12,0		29,0		28,1			29,0		283			283		28,7
		(29,0)		(28,0)	11.1		(29,0)	103	(28,5)	10,5		(28.9)	11,4	(283)	10,5
		24,0		22,8			23,7		23,1			23,7		233		25
	6,7	23,7		23,2		6,6	23,8		23,3		6,6	23,8		23,4
18,0		23,6	6,3	22,8			23,7		23,1			23,6		23,4
		(23,8)		(22,9)	52		(23,7)	53	(232)	5,3		(23,7)	52	(23,4)	5,1
					37,6			37,4		36,8			37,6		373	30
I insgesamt					Fällung mit 100 μΐ Serum			Fällung mit 110 μΐ Serum
I Tabelle 5	Δ	nicht-		nicht-
Probe		spez.	spez.
Konzen		Bind.	Bind.
tration		6,8	6,4
fog/dl)				40
0,4
3,2				45
	123
		6,7	6,5
6,0
	8,3			50
12,0
	10.9
		63	6,4	55
18,0
	5,1
	36,6			60
insgesamt

*) Unterschied in der prozentualen Bindung zwischen den Proben.
*·) Zahlen in Klammern stellen Durchschnittswerte dar.

Beispiel 5

Dieses Beispiel erläutert die Spezifität und die Unabhängigkeit vom Serumprotein in der Probe des erfindungsgemäßen radioimmunologischen Tests. Das endogene Thyroxin verschiedener Probenvolumen verschie-

dener Seren mit erhöhten und verringerten Proteinmengen wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens und der dort angegebenen Reaktionslfisungen gemessen. Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 6 zusammengestellt

5 Tabelle 10 15 20

30 35 40

Art der Serumprobe Hyperthyroid, Gesamtprotein, 7 β g/di Hyperthyroid, Gesamtprotein, 73 g/dl

«-Globuline, 2,1 g/dl (erhöht)

Albumin, 5,4 g/dl (erhöht)

^-Globuline, 4,6 g/dl (erhöht)

Hypothyroid, Gesamtprotein, 8,2 g/dl Gesamtprotein, 4,5 g/dl (verringert) Albumin, 0,9 g/dl (verringert)

so Katzen (10 Tiere — jeweils drei Bestimmungen) 55 60 65 Serum
Volumen

gemessen

T4

(μχ/dl)

korrigiert*) auf 10 μ! (Hg/dl)

Hunde (10 Tiere — jeweils drei Bestimmungen) Pferde (10 Tiere — jeweils drei Bestimmungen)

*) Diese Werte sind nur auf das Volumen t0 μΙ korrigiert und stellen keine Korrektur für die nicht-spezifische Bindung dar. Alle Werte für jedes Serum wurden gleich sein, wenn sie hinsichtlich der nicht-spezifischen Bindung korrigiert werden.

10	173	173
73	13,7	183
5,0	9.4	18,8
23	4,7	18,8
1,67	23	17,4
10	13,7	13.7
7,5	10,6	14.1
5,0	7,4	14.8
23	33	14,0
1,67	22	13,2
10	15,4	15.4
73	11,5	153
5.0	7.9	15.8
23	4,1	16,4
10	7,7	7,7
5.0	4.0	8,0
33	2.5	7,5
2,5	1,8	7a
10	73	73
5,0	3,6	7,2
33	2,5	7,5
23	1.7	6,8
10	2.5	23
20	53	2,7
30	8,2	2,7
10	3,1	3,1
20	6,7	3,4
30	10,4	3,5
10	3,5	33
20	7,2	3,6
30	10,4	3,5
10	13	13
20	3,6	1,6
30	5,4	1,8
10	1.4	1,4
20	3,0	1,5
30	4,8	1,6
10	0,8	0,8
20	2,2	1.1
30	3.8	13

Claims (1)

Patentansprüche: '

1. Verfahren zur Messung der Menge an Schflddrüsenhonnon in einer Serumprobe, die endogenes Schilddrüsenhormon und endogenes Schilddrüsenhormon bildendes Protein enthält, bei dem man

a) das Schilddrüsenhormon von dem das Schilddrüsenhormon bindenden Protein durch Behandlung mit einer wäßrigen sauren Lösung trennt, -

b) bei einem höheren pH-Wert eine bekannte Menge radioaktiv markierten Schilddrüsenhormons und eine bekannte Menge Schilddrüsenhormon-Antikörper zufügt,

ίο c) das freie, nicht an Schilddrüsenhormon-Antikörper gebundene Schilddrüsenhormon von dem an die Antikörper gebundenen Hormon abtrennt und

d) in einem Scintillationszähler entweder das freie radioaktiv markierte Schilddrüsenhormon oder das an die Antikörper gebundene radioaktiv markierte Schilddrüsenhormon auszählt,