DE4405249C2 - Stabilisierte Troponin-Zubereitung für Immunoassays und Verfahren zur Stabilisierung von Troponin für Immunoassays - Google Patents

Stabilisierte Troponin-Zubereitung für Immunoassays und Verfahren zur Stabilisierung von Troponin für Immunoassays

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabilisierte Zubereitung von Troponin, die als Vergleichsprobe bei Immunoassays verwendet werden kann, die darauf abzielen, Troponin im Blutserum oder Blutplasma zu bestimmen.
Es ist bekannt, daß Troponin ein in den Muskelfasern vorliegender Proteinkom­ plex ist, der aus drei Proteinen, den Troponinen C, I und T, besteht, der die Steu­ erung der Muskelkontraktion durch Ca2+ auslöst, eine Kontraktion, die sich durch die Wechselwirkung von Myosin und Aktin in den Muskelfasern ergibt.
Wenn der Muskel geschädigt ist, so der Herzmuskel im Fall eines Myokardinfarkts, oder ein Skelettmuskel bei langanhaltenden physischen Belastungen, erscheinen hierbei freigesetzte kontraktile Proteine mehr oder weniger schnell in dem Blutkreislauf.
Es wurde bereits die Bestimmung von Troponinen als vorbeugende Diagnose von Myokardinfarkten vorgeschlagen, sei es nun die Bestimmung von Troponin T in Circulation 83 (1991), 902-912 oder die von Troponin I in Am. Heart J. 113 (1987), 1333-44 und Molecular Immunology 29 (2) (1992), 271-278.
Jeder enzymatische Immunoassay oder jeder Radioimmunoassay, die in Krank­ heitsanalyselaboratorien durchgeführt werden, setzen im allgemeinen neben der Lieferung der für die Bestimmung notwendigen Reagenzien, d. h. markierte oder unmarkierte Antikörper, Zeichner (tracer) und Verdünnungslösungen, durch den Hersteller auch die Lieferung einer Eichlösung der zu probierenden Verbindung ein, die bei der Anwendung unter Bedingungen, die analog sind je­ nen der zu untersuchenden Probe, als Vergleichsmaßstab zur Berechnung der Ergebnisse und/oder als positive Kontrolle dient.
Es ist bekannt, daß Proteine in Lösung wenig stabil sind und daß sie enthalten­ de Reagenzien häufig in gefriergetrockneter Form vertrieben werden zusammen mit einem Lösungsmittel geeigneter Zusammensetzung, indem sie vor der Ver­ wendung von dem Benutzer aufgelöst werden müssen. Wenn man die in dieser Weise erhaltenen Lösungen bei 4°C aufbewahrt, kann man sie während mehre­ rer Tage benutzen, selbst wenn die tägliche Bestimmung eine gewisse Verände­ rung der Konzentrationen des Reagens zeigt. So werden im allgemeinen - und es wird auch im Fall von Troponin T empfohlen - die ausgehend von dem gefrierge­ trockneten Material erhaltenen Vergleichslösungen in Einheitsdosisform einge­ froren.
Wäßrige gepufferte Lösungen von Troponin, und insbesondere von Troponin I und T, können mehrere Monate bei -80°C aufbewahrt werden. Es hat sich jedoch gezeigt, daß sie nicht mehr als einige Stunden bei +4°C stabil sind, selbst wenn man Proteaseinhibitoren oder antibakterielle Mittel zusetzt, so daß es für die Krankheitsanalyselaboratorien erforderlich ist, ihre Eichlösungen häufig und in einigen Fällen zweimal täglich herzustellen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Aufbewahrung von mehr oder weniger stark verdünnten Eichlösungen von Troponin I oder Troponin T, die bei spezifi­ schen Immunoassays als Vergleichssubstanz dienen, während einiger Tage bei +4°C.
Die stabilisierte Zubereitung der vorliegenden Erfindung umfaßt in wäßrigen Medium in Abhängigkeit von dem durchzuführenden Assay eines der beiden Troponine I oder T und 1 bis 10 Moläquivalente Troponin C und vorzugsweise 2 bis 5 Äquivalente, sowie eine große Menge von Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Ionen, ins­ besondere in Form von CaCl₂. Die Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Ionen liegen in Form von Salzen vor, insbesondere des Chlorids, Bromids oder Nitrats. Die Menge der Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Salze, insbesondere von CaCl₂, kann dem 100- bis 10 000fachen des Gewichts von Troponin I oder Troponin T entsprechen.
Das Troponin C kann menschlichen oder tierischen Ursprungs sein.
Die Konzentration von Troponin I oder T in den erfindungsgemäßen Lösungen entspricht jener, die im allgemeinen bei den Immunoassays angewandt wird, d. h., sie kann zwischen 0,01 ng/ml und 1 µg/ml und vorzugsweise zwischen 0,2 ng/ml und 25 ng/ml liegen, während die Konzentration der Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Salze, die nicht kritisch ist, zwischen 20 µM und 10 mM liegen kann; wo­ bei diese Konzentration in klassischer Weise bei etwa 2 mM liegt.
Die Lösung kann in klassischer Weise auf einen pH-Wert zwischen 4 und 10, vorzugsweise zwischen 5,5 und 7,5, gepuffert werden und das Lösungsmittel kann teilweise oder vollständig aus normalem menschlichem Plasma bestehen, so daß es möglich wird, über eine Vergleichsprobe zu verfügen, die eine Zusam­ mensetzung aufweist, die äquivalent ist der zu untersuchenden Probe, die das Plasma oder das Serum des Patienten enthält.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine pulverförmige Zubereitung von Troponin I oder T, vorzugsweise in gefriergetrockneter Form, die gegebenenfalls Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Ionen, wie zum Beispiel CaCl₂, und 1 bis 10 Moläquivalente Troponin C umfaßt, wobei in diesem Fall die Anwesenheit von Troponin C nur dazu dient, die Stabilität der anderen Troponine zu dem Zeitpunkt sicherzustel­ len, da die Zubereitung von dem Benutzer in eine wäßrige Lösung überführt wird.
Wenn die gefriergetrocknete Zubereitung keine Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Ionen enthält, müssen diese beim Inlösungbringen des Materials zugegeben werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Stabilisierung einer Lösung von Troponin I oder T für Immunoassays, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es darin besteht, 1 bis 10 Moläquivalente Troponin C pro Moläquivalent Tro­ ponin I oder T und Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Ionen, beispielsweise CaCl₂, zuzuge­ ben.
Im folgenden seien Beispiele der Ausführung der Erfindung und die Ergebnisse entsprechender Aufbewahrungsuntersuchungen angegeben.
Menschliches Troponin I (TnI) wurde nach der in FEBS Lett. 40 (1974), 253-257 beschriebenen Methode aus Herzen isoliert. Die erhaltene Lösung kann bei ei­ ner Konzentration oberhalb 10 µg/ml in einem Phosphatsalzpuffer, der 0,5% Kasein enthält, mehrere Monate bei -80°C aufbewahrt werden.
Troponin T (TnT) kann nach der in J. Biochem. 72 (1972), 723-735 oder in J. Biol. Chem. 249 (1974), 4742-4748 beschriebenen Verfahrensweise erhalten werden.
Troponin C (TnC) kann nach der in Acta Chem. Scand. B 42 (1988), 211-215 be­ schriebenen Weise ausgehend von dem im Handel erhältlichen, aus Rindern ge­ wonnenen Komplex der drei Troponine (T, C, I) gewonnen werden.
Die Konzentrationen der hergestellten Lösungen wurden mit Hilfe des Bradford- Reagens bestimmt, das in Anal. Biochem. 72 (1976), 248-254 beschrieben und im Handel erhältlich ist. Das Vergleichsprodukt ist eine bekannte Mischung aus Troponin I, C und T, die von der Firma Sigma in gefriergetrockneter Form unter der Bezugsziffer T 4895 vertrieben wird.
Herstellung einer erfindungsgemäßen Zubereitung
- Zubereitung enthaltend 5 Mol Troponin C pro Mol Troponin I.
Man gibt zu 940 µl des Puffers KH₂PO₄ (0,1 M; pH-Wert = 6,8), der 10% norma­ les menschliches Plasma enthält, 276 µg CaCl₂ · 2H₂O, 10 µl einer Lösung von Troponin I mit einer Konzentration von 10 µg/ml und 50 µl einer Lösung von Tro­ ponin C mit einer Konzentration von 10 µg/ml.
Vorzugsweise bewirkt man die Maßnahmen in sterilem Milieu unter Verwen­ dung von sterilisierten Lösungen von Troponin I und Troponin C, beispielsweise indem man sie durch ein Filter mit einem Porendurchmesser von 0,22 µm führt.
Die erhaltene Lösung mit einer TnI-Konzentration von etwa 100 ng/ml und einer TnC-Konzentration von 500 ng/ml wird anschließend zur Herstellung einer Ver­ dünnungsreihe von 1 ng/ml bis 10 ng/ml, bezogen auf Troponin I, verwendet.
- Man bereitet in gleicher Weise Lösungen, die 1 oder 2 oder 10 Moläqui­ valente Troponin C, bezogen auf Troponin I, enthalten.
Die pulverförmige Zubereitung kann durch Gefriertrocknen einer in der obigen Weise hergestellten wäßrigen Zubereitung, aber ohne menschliches Plasma er­ halten werden.
Man bereitet in analoger Weise Lösungen, welche 1 bis 10 Moläquivalente Tropo­ nin C, bezogen auf Troponin T, enthalten, indem man Troponin I durch Troponin T wechselt.
Durchführung der Immunoassays
Man probiert die bei 4°C während 6 Wochen aufbewahrten Lösungen an den ausgewählten Tagen, wobei man als Vergleichsmaßstab eine Eichprobe verwen­ det, die man unmittelbar ausgehend von einer bei -80°C aufbewahrten Lösung von Troponin I hergestellt hat.
Das Assay erfolgt mit zwei monoklonalen Antikörpern, die gegen das Myokard- Troponin I gerichtet sind; wobei der erste Antikörper in den Wandungen von Reagenzgläsern für Immunoassays adsorbiert ist, die von der Firma NUNC (USA) unter der Bezeichnung Maxisorp, Startube, vertrieben werden; während der zweite Antikörper mit Peroxidase markiert ist. Die angewandte Methode ist die Sandwich-Methode.
Die Bildung der Antikörperist in Molecular Immunology 29 (2) (1992), 271-278 beschrieben. Es hat sich gezeigt, daß sich bei diesem Assay keine Interferenz mit den anderen Isoformen von Troponin I, Troponin C oder anderen Myokard-Pro­ teinen ergibt.
In Abwesenheit von TnC beobachtet man vom ersten Tag der Aufbewahrung an eine merkliche Verminderung der TnI-Konzentration bei allen Verdünnungen. Wenn TnC durch Actomyosin oder Tropomyosin ersetzt wird in einer Menge von 5 Moläquivalenten, bezogen auf TnI, so beträgt die nach Ablauf von 12 Tagen ge­ messene TnI-Konzentration nur noch 2/3 der Ausgangskonzentration von 10 ng/ml, während die mit TnC und CaCl₂ stabilisierten Lösungen keine Verände­ rung zeigen.
Nach Ablauf von 40 Tagen zeigen die mit unterschiedlichen Konzentrationen von TnC und CaCl₂ stabilisierten TnI-Lösungen keine Veränderung, während die nichtstabilisierten Lösungen eine scheinbare Konzentration zeigen, die auf bis zu 80% absinken kann.

Claims (11)

1. Stabilisierte Zubereitung von Troponin I oder Troponin T für Immunoas­ say, bestehend aus einer wäßrigen Lösung, die Troponin I oder Troponin T, 1 bis 10 Moläquivalente Troponin C pro Moläquivalent Troponin I oder T und Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Ionen enthält.
2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie Salze von Mg⁺⁺ und/oder Ca⁺⁺, insbesondere MgCl₂, in einer Menge enthält, die dem 100- bis 10 000fachen des Gewichts von Troponin I oder Troponin T entspricht.
3. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeich­ net, daß sie Troponin I und 2 bis 5 Moläquivalente Troponin C pro Moläquiva­ lent Troponin I enthält.
4. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich­ net, daß sie in wäßriger gepufferter Lösung mit einem pH-Wert zwischen 4 und 10 vorliegt.
5. Zubereitung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Lö­ sungsmittel aus bis zu 100%-igem menschlichem Plasma gebildet ist.
6. Zubereitung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeich­ net, daß die Troponin I-Konzentration zwischen 0,01 ng/ml und 1 µg/ml und die Konzentration der Salze von Mg⁺⁺ und/oder Ca⁺⁺, insbesondere von MgCl₂, zwischen 20 µM und 10 mM liegen.
7. Pulverförmige Zubereitung zur Herstellung einer stabilisierten Zuberei­ tung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie Troponin I oder Troponin T, 1 bis 10 Moläquivalente Troponin C pro Mol­ äquivalent Troponin I oder T und gegebenenfalls Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Ionen enthält.
8. Zubereitung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge­ kennzeichnet, daß sie CaCl₂ enthält.
9. Zubereitung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ge­ friergetrockneter Form vorliegt und frei von Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Ionen ist.
10. Verfahren zur Stabilisierung einer wäßrigen Zubereitung von Troponin I oder T für Immunoassays, bei dem 1 bis 10 Moläquivalente Troponin C pro Moläquivalent Troponin I oder T und Mg⁺⁺- und/oder Ca⁺⁺-Ionen zugegeben werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es darin be­ steht, eine Menge von Salzen von Mg⁺⁺ und/oder Ca⁺⁺, insbesondere in Form von CaCl₂, zuzugeben, die vorzugsweise dem 100- bis 10 000fachen des Ge­ wichts von Troponin I oder Troponin T entspricht.
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