DE69735374T2

DE69735374T2 - Methode zur auffindung physiologisch aktiver substanzen und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69735374T2
Application number: DE69735374T
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-10-02
Filing date: 1997-10-01
Publication date: 2006-10-19
Anticipated expiration: 2017-10-02
Also published as: EP0933380B1; DE69735374D1; US6787317B1; JPH10109997A; AU4470797A; EP0933380A4; JP3459523B2; ATE318840T1; WO1998014479A1; EP0933380A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden einer Vielzahl von neuen physiologisch aktiven Substanzen und die Herstellung derselben.
Stand der Technik:
Physiologisch aktive Substanzen unbekannter Arten wurden bisher durch Analysieren von Substanzen, die in Körperflüssigkeiten oder Geweben vorkommen, und Identifizieren und Trennen neuer Substanzen daraus, um die biologischen Aktivitäten der Substanzen zu bestimmen, aufgefunden.
Das Verfahren des Standes der Technik, das oben geschrieben wurde, umfasst die Schritte des Analysierens von Bestandteilen in lebenden Organismen, des Auffindens und Isolierens neuer Substanzen, und des Identifizierens der physiologischen Aktivitäten davon. Es ist jedoch offensichtlich, dass es eine extrem große Zahl von Substanzen innerhalb eines lebenden Organismus gibt, und viele physiologisch aktive Substanzen sind häufig in sehr geringen Konzentrationen anwesend, was es schwierig macht, neue Substanzen zu isolieren. Weil lebende Organismen weiterhin eine Vielzahl von physiologischen Aktivitäten ausführen, kann es auch schwierig sein, die physiologischen Aktivitäten einer neu isolierten Substanz zu identifizieren. Wie aus der obigen Diskussion geschlossen werden kann, machen es die Verfahren des Standes der Technik schwierig, neue physiologisch aktive Substanzen aufzufinden und zu isolieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Auffinden neuer physiologisch aktiver Substanzen, mit größerer Wirksamkeit und einem gewissen Grad an Vorhersagbarkeit, bereitzustellen.
Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat herausgefunden, dass es Fälle geben kann, in denen es Rezeptoren gibt, die zwei oder mehr Größen aufweisen, wenn die Rezeptoren funktionell zueinander identisch sind, der Rezeptor ein Rezeptor einer Substanz ist, wenn im menschlichen Körper eine Substanz oder Zelle anwesend ist, die einen funktionellen Antagonismus aufweist, oder der Rezeptor ein Rezeptor von Substanz A ist, wenn im menschlichen Körper eine Zelle oder Substanz anwesend ist, die einen funktionellen Antagonismus gegenüber von Zellen aufweist, auf welche die Substanz A einige Wirkungen ausübt, und dass die Aminosäure-Sequenz des fehlenden Abschnitts oder gespleißten Abschnitts eine physiologische Bedeutung aufweist. Zum Beispiel kann Beispiel Calcitonin an einen Calcitonin-Rezeptor gebunden sein, der auf Osteoklasten anwesend ist, um die Knochenerweichung (Deossifikation), die durch Osteoklasten bewirkt wird, zu supprimieren, während es Osteoblasten gibt, die einen funktionellen Antagonismus gegenüber den Osteoklasten aufweisen. Bezüglich der Calcitonin-Rezeptoren wurde bereits die Aminosäure-Sequenz davon beschrieben, aber es wurden zwei oder mehr verschiedene Arten mit verschiedenen Größen beschrieben. Nissenzveig et al., J. Biol. Chem. 269 28123-28129 (1994) offenbaren verschiedene physiologische Wirkungen von zwei verschiedenen Isoformen des menschlichen Calcitonin-Rezeptors. Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat vorhergesagt, dass im Fall von Calcitonin-Rezeptoren solcher Arten, die zwei oder mehr Größen aufweisen, ein Bereich bzw. eine Domäne in dem Rezeptor mit der längeren Größe gespleißt wird, wodurch der Rezeptor kürzerer Größe gebildet wird, und dass die gespleißte Domäne Wirkungen auf Osteoblasten ausüben kann, die antagonistische Wirkungen zu den Wirkungen von Osteoklasten sind, auf welche Calcitonin Wirkungen ausübt. Nach der Untersuchung der gespleißten Domäne nach dem chemischen Synthetisieren der Domäne wurde bestätigt, dass dieses neue Peptid Osteogenese durch Binden an Rezeptoren auf den Osteoblasten fördert. Eine solche Bestätigung, wie oben, zeigte die Richtigkeit der vorangegangenen Vorhersage, die vom Erfinder der vorliegenden Erfindung gemacht wurde, und die vorliegende Erfindung wurde gemacht.
In anderen Worten stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren physiologisch aktiver Peptide, wie in Anspruch 1 definiert, bereit.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt zum ersten Mal ein Verfahren zum Auffinden von neuen physiologisch aktiven Substanzen, mit Wirksamkeit und einem gewissen Grad an Vorhersagbarkeit, bereit. Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können neue physiologisch aktive Substanzen durch Analysieren von Rezeptoren von Substanzen, die mit funktionellem Antagonismus assoziiert sind, identifiziert werden, wodurch die Notwendigkeit des Isolierens von physiologisch aktiven Substanzen, die in einer kleinen Menge in einer Probe des menschlichen Körpers anwesend sind, der eine sehr große Zahl von Bestandteilen einschließt, wie dies zuvor im Stand der Technik notwendig war, eliminiert wird. Weil weiterhin die physiologische Aktivität der identifizierten physiologisch aktiven Substanz mit dem funktionellen Antagonismus assoziiert ist, kann es sehr viel leichter als zuvor sein, die physiologischen Aktivitäten davon zu identifizieren. Deshalb wurde es gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren möglich gemacht, neue physiologisch aktive Substanzen in einer wirksameren Weise als zuvor zu identifizieren.
DIE BESTE WEISE, DIE ERFINDUNG AUSZUFÜHREN
Gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren liegt der Fokus auf Rezeptoren, deren physiologische Funktion Gegenstand von funktionellem Antagonismus in vivo ist. Der funktionelle Antagonismus ist eine grundliegende Funktion für die Homeostase im menschlichen Körper, und es gibt eine große Anzahl von Substanzen oder Zellen, die wechselseitige Antagonismen innerhalb des menschlichen Körpers aufweisen. Beispiele von relevanten Rezeptoren schließen Calcitonin-Rezeptoren (Osteoklasten, auf die Calcitonin wirkt, zeigen funktionellen Antagonismus gegenüber Osteoblasten), Glucagon-Rezeptoren (Glucagon weist funktionellen Antagonismus gegenüber Insulin auf), Somatostatin-Rezeptoren (Somatostatin weist funktionellen Antagonismus gegenüber Wachstumshormonen auf) und Parathyroid-Hormon (das Hormon weist funktionellen Antagonismus gegenüber Calcitonin, etc. auf) und ähnliche. Solche Rezeptoren schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf 7-Transmembran-Typ-Rezeptoren, wie Calcitonin-Rezeptoren.
Gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Aminosäure-Sequenz oder Größen von solchen Rezeptoren analysiert, um Rezeptoren zu finden, die verschiedene Größen aufweisen und die identische Rezeptoren sind. Dieses Verfahren kann durchgeführt werden, indem viele Male die Aminosäure-Sequenzen oder die Größen der identifizierten Rezeptoren identifiziert werden, oder indem die Literatur verwendet wird, wenn sie darin beschrieben sind. Einige Beispiele von Rezeptoren, die Rezeptoren mit zwei oder mehr Arten mit verschiedenen Größen sind, während sie identische Rezeptoren sind, können in Calcitonin-Rezeptoren, Glucagon-Rezeptoren, Somatostatin-Rezeptoren und ähnlichem gefunden werden.
Nach dem Identifizieren von zwei oder mehr Arten von Rezeptoren mit verschiedenen Größen für identische Rezeptoren, werden die Aminosäure-Sequenzen dieser zwei oder mehr Arten von Rezeptoren miteinander ver glichen, um zu identifizieren, welche Domäne des Rezeptors mit längerer Größe fehlt und dadurch den Rezeptor in der Größe kürzer macht. Die fehlende Domäne in dem Rezeptor mit kürzerer Größe ist die physiologisch aktive Substanz, die einige Wirkungen auf den funktionellen Antagonismus aufweist. Mit anderen Worten sind einige der Elemente in der gespleißten Struktur die physiologisch aktiven Substanzen. Es kann geschlossen werden, dass eine physiologisch aktive Substanz an einen Rezeptor gebunden ist, wodurch ein Abschnitt des Rezeptors gespleißt wird, und dieses gespleißte Stück des Rezeptors zeigt einige physiologische Aktivität, wie eine Kontrollwirkung auf den funktionellen Antagonismus. Es wurde bestätigt, dass zum Beispiel, wie in den Beispielen unten gezeigt, die fehlende Domäne in einem Calcitonin-Rezeptor an einen Rezeptor gebunden ist, der auf einem Osteoblasten anwesend ist, wodurch Osteogenese gefördert wird.
Weil die fehlende Domäne, die durch das oben beschriebene Verfahren identifiziert wurde, physiologische Aktivitäten aufweist, kann eine physiologisch aktive Substanz durch Herstellung einer solchen Domäne erhalten werden. In den meisten Fällen weist die fehlende Domäne Peptide von relativ kurzen Größen auf, und deshalb kann in solchen Fällen ein kommerziell erhältliches Peptid-Synthetisiergerät verwendet werden, um einfach die physiologisch aktiven Substanzen chemisch synthetisiert herzustellen. Alternativ dazu können solche Substanzen unter Verwendung eines Verfahrens von der Art des genetischen Engineerings gemäß bekannter Verfahren hergestellt werden.
Die physiologische Aktivität der derart erhaltenen physiologisch aktiven Substanz steht in Verbindung mit dem oben erwähnten Antagonismus, und deshalb kann die Aktivität einfach durch irgendein geeignetes anwendbares Verfahren in Abhängigkeit von jedem funktionellen Antagonismus bestätigt werden.
Es ist dem Fachmann gut bekannt, dass in Peptiden mit physiologischer Aktivität im Allgemeinen, die physiologische Aktivität davon aufrecht erhalten sein kann, selbst wenn einige der Aminosäuren daraus durch andere Aminosäuren substituiert sind, oder wenn einige Aminosäuren hinzugefügt sind, oder wenn einige Aminosäuren fehlen. Deshalb schließt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz ein, die physiologische Aktivitäten inhärent zu den physiologisch aktiven Substanzen aufweist, umfassend die fehlende Domäne, wobei einige der Aminosäuren, welche die fehlende Domäne bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt sind, oder einige andere Aminosäuren zu den Aminosäuren hinzugefügt sind, welche die fehlende Domäne bilden, oder einige der Aminosäuren aus den Aminosäuren fehlen, welche die fehlende Domäne bilden (die zuvor genannte Substanz wird im Folgenden in der vorliegenden Anmeldung als „Derivat" der fehlenden Domäne bezeichnet). Ein solches Derivat weist vorzugsweise nicht weniger als 70%, und weiter bevorzugt 90%, an Homogenität mit der oben erwähnten fehlenden Domäne auf.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird spezifischer unten mit Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben. Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt ist.
[Beispiel 1] Identifizierung der fehlenden Domäne des Calcitonin-Rezeptors:
Die Aminosäure-Sequenzen von Calcitonin-Rezeptoren sind im Journal of Clinical Investigation, Vol. 90, Nr. 5 (1992) beschrieben. Wenn die beschriebenen Aminosäure-Sequenzen der Calcitonin-Rezeptoren, die in der obigen Referenz beschrieben sind, verglichen werden, fehlen die Aminosäuren an der 175. bis 190. Sequenzposition der Aminosäure-Sequenz des längeren Rezeptors in der Aminosäure-Sequenz des kürzeren Rezeptors. Die Aminosäure-Sequenz der fehlenden Domäne ist in Sequenz 1 gezeigt.
[Beispiel 2] Herstellung von Peptiden:
Unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Peptid-Synthetisiergeräts wurde ein Peptid mit der Aminosäure-Sequenz, die in Sequenz 1 gezeigt ist, synthetisiert.
[Beispiel 3] Proliferationsförderung von Osteoblasten:
ROS-Zellen aus einer Ratte, die Osteoblasten sind (erhältlich von ATCC) wurden in F10 Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum (erhältlich von Dainippon Pharmaceutical) kultiviert und in einer Kammer mit einer konstanten Temperatur von 37°C unter feuchter Luft enthaltend 5% CO₂ Gas inkubiert. Unter Verwendung einer Trypsin-Behandlung wurden die Zellen in eine 24-Vertiefungskulturplatte mit einer Rate von 1 × 10⁵ Zellen/Vertiefung verteilt, und wenn die Kolonien konfluent waren, wurde das Medium gegen F10 Medium mit 1% fötalem Rinderserum ausgetauscht und für 24 Stunden kultiviert. Anschließend wurde das erfindungsgemäße Peptid, das in Beispiel 2 hergestellt wurde, in F10 Medium mit 1% fötalem Rinderserum gelöst, das zu den Vertiefungen in verschiedenen Mengen hinzugefügt wurde, und das Kultivieren wurde für zusätzliche 24 Stunden fortgesetzt. Nach dem Kultivieren wurde die Wirkung der Förderung der Zellproliferation durch das Peptid unter Verwendung eines MTT-Assays gemessen, um das Niveau der Proliferationsförderungswirkung im Vergleich zu den Proben ohne irgendeine Behandlung zu bestimmen. In diesem Fall wurden der MTT-Assay und die Berechnung des Proliferationsförderungsverhältnisses wie folgt durchgeführt: gemäß dem Protokoll des MTT-Zellwachstums Assay Kits, der kommerziell erhältlich ist von Funakoshi, Co. Ltd., wurde die erfindungsgemäße Substanz zu den Vertiefungen in verschiedenen Mengen hinzugefügt, und dann wurden sie für einen Tag und eine Nacht stehengelassen, gefolgt durch Zählen, unter Verwendung von Kolorimetrie, der Zahl der lebenden Zellen, wobei das Phänomen verwendet wurde, dass MTT (3-4,5 Dimethylthiazol-2yl)-2,5 diphenyl-tetrazolium-bromid in dunkelblaues Formazan durch Enzyme, die in Mitochondrien von lebenden Zellen anwesend sind, gespalten wird. Die folgenden Ergebnisse der kolorimetrischen Werte wurden durch Hinzufügen von verschiedenen Mengen der erfindungsgemäßen Substanz erhalten, während der Wert für die Kontrollgruppe, zu der keine erfindungsgemäße Substanz hinzugefügt wurde, bei 100% lag. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten gezeigt.
Tabelle 1:
Wie Tabelle 1 entnommen werden kann, wurde für das Peptid, das gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert wurde, bestätigt, dass es Wirkungen in der Förderung der Proliferation von Osteoblasten hervorruft. Somit wird von dem erfindungsgemäßen Peptid angenommen, dass es eine Erhöhung in der Knochendichte verursacht und somit in der Behandlung von Osteopathie, wie Osteoporose und ähnlichem, verwendet werden kann.
[Beispiel 4] Anwesenheit von Osteoblasten auf den Rezeptoren von erfindungsgemäßen Peptiden:
Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen Peptide fördernde Wirkung auf die Proliferation von Osteoblasten aufweisen, weshalb angenommen wird, dass Osteoblasten Rezeptoren für die erfindungsgemäßen Peptide aufweisen. Wenn die Rezeptoren anwesend sind, kann angenommen werden, dass die erfindungsgemäßen Peptide eine wesentliche Substanz für das Leben sind, und deshalb wurde untersucht, ob es Rezeptoren auf Osteoblasten gibt.
Das Peptid, das in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde mit Biotin markiert, und das erfindungsgemäße Peptid, das mit einer vorbestimmten Menge markiert wurde, wurde zu ROS-Zellen hinzugefügt, die in einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel 3 kultiviert wurden, gefolgt von Lösen, um eine kompetitive Reaktion zu bewirken, in F10 Medium mit 10% fötalem Rinderserum, in dem das erfindungsgemäße Peptid nicht markiert war, und danach durch Hinzufügen, während die Menge variierte, um die kompetitive Reaktion zu beobachten. Die zuvor genannte experimentelle Durchführung wurde spezifischer wie folgt durchgeführt: das erfindungsgemäße Peptid wurde gemäß dem Protokoll des Protein Biotinlabelling-Kit von SUMILON Co., biotinyliert, und eine vorbestimmte Menge des biotinylierten Peptids wurde zu einer vorbestimmten Zahl von Zellen, die in Vertiefungen verteilt waren, hinzugefügt, gefolgt von Hinzufügen von 0-0,512 μg/Vertiefung von nicht markiertem Peptid, das zu jeder Vertiefung hinzugefügt wurde, um für 6 Stunden eine kompetitive Reaktion zu bewirken, und danach wurden die Zellen mit PBS gespült, und die biotinylierten Peptide, die an Rezeptoren auf der Zelloberfläche gebunden waren, wurden mit Peroxidase, die mit Streptavidin markiert war, umgesetzt, um eine Farbentwicklungsreaktion zu beobachten. Wenn irgendein Rezeptor der erfindungsgemäßen Peptide auf der Zelloberfläche anwesend ist, wird eine kompetitive Reaktion mit den erfindungsgemäßen Peptiden, die nicht markiert sind, bewirkt, und die Farbintensität wird verringert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten gezeigt:
Tabelle 2:
Wie in Tabelle 2 gezeigt, variiert das Verhältnis der hinzugefügten Menge an Peptiden des markierten Typs in Abhängigkeit von der hinzugefügten Menge der Peptide des nicht markierten Typs, und deshalb ist es offensichtlich, dass die Osteoblasten Rezeptoren für das erfindungsgemäße Peptid aufweisen, und es wird angenommmen, dass die erfindungsgemäße Substanz eine grundlegende Rolle spielt.
[Akuter Toxizitätstest]
Ein akuter Toxizitätstest des Peptids, das in Beispiel 2 hergestellt wurde, wurde unter Verwendung von ddy männlicher Mäuse (Gewicht 40-45 Gramm) durchgeführt. Das erfindungsgemäße Peptid wurde in einer Salzlösung (pH 6,0) gelöst, um die Lösung durch die kaudale Vene zu verabreichen, und danach wurden die Mäuse für 14 Tage beobachtet. Die Dosis wurde auf 1, 10 und 100 μg/kg eingestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten gezeigt:
Tabelle 3
[Beispiel 5] Identifizierung der fehlenden Domäne in Glucagon-Rezeptoren:
Unter Verwendung der gleichen Methodik wie in Beispiel 1 wurden die Glucagon-Rezeptoren, die in FEBS Letters (351 (1994), S. 271-275) beschrieben sind, verglichen, um die Aminosäure-Sequenz der Domäne, die in den Rezeptoren der längeren Größe anwesend ist, aber in den Rezeptoren der kürzeren Größe fehlt, zu identifizieren. Die so identifizierte Aminosäure-Sequenz der fehlenden Domäne ist in Sequenz 2 gezeigt.
[Beispiel 6] Identifizierung der fehlenden Domäne in Somatostatin-Rezeptoren:
Unter Verwendung der gleichen Methodik wie in Beispiel 1 wurden die Aminosäure-Sequenzen von Somatostatin-Rezeptoren, die in Molecular Pharmacology, 44: S. 1008-1015 (1993) beschrieben sind, verglichen, um die Aminosäure-Sequenz in der Domäne, die in den Rezeptoren der längeren Größe anwesend ist, aber in den Rezeptoren der kürzeren Größe fehlt, zu identifizieren. Die so identifizierte Aminosäure-Sequenz der fehlenden Domäne ist in Sequenz 3 gezeigt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Identifizieren physiologisch aktiver Peptide, wobei das Verfahren die Schritte des Identifizierens von Aminosäure-Sequenzen von Rezeptoren, die eine oder mehrere Größen-Varianten aufweisen, wobei die Rezeptoren für den identischen Liganden rezeptiv sind und Produkte desselben Gens sind, wobei die physiologische Funktion des Rezeptors einem funktionellen Antagonismus in vivo ausgesetzt ist; und des Identifizierens welcher Bereich in dem größeren Rezeptor in dem kleineren Rezeptor fehlt; des Testens eines Peptids, das aus der Aminosäure-Sequenz des fehlenden Bereichs besteht, auf physiologische Aktivität umfaßt.