JP3398255B2 - 新規ペプチド及びそれを有効成分とする骨疾患治療薬 - Google Patents

新規ペプチド及びそれを有効成分とする骨疾患治療薬

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Description

【発明の詳細な説明】 【0001】 【産業上の利用分野】本発明は、新規なペプチドを有効
成分として含有する骨疾患治療薬に関する。 【0002】 【従来の技術】生体内には数多くの生理活性物質が存在
し、生体の正常な生命活動の維持に密接に関与している
ことは周知の事実である。それらの生体内生理活性物質
及び合成生理活性物質はそれら自身、新しい医薬として
の可能性を有すると共に、新たな医薬を開発するための
知見を提供するものでもある。従って、これらの生理活
性物質の探索は極めて重要なものである。 【0003】一方、骨粗鬆症のような骨疾患の治療に
は、現在、カルシトニン、女性ホルモン及び活性化ビタ
ミンD3 等が用いられているが、その治療効果は必ずし
も満足できるものではない。 【0004】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、新規
骨疾患治療薬を提供することである。 【0005】 【課題を解決するための手段】本発明者は、骨形成に関
与する骨芽細胞に対し、その細胞の活性を促進する物質
を探索している際にこの作用を有する新規なペプチドを
見出し本発明を完成した。 【0006】すなわち、本発明は、配列表の配列番号1
で示されるアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分と
して含有する骨疾患治療薬を提供する。 【0007】以下、本発明を詳細に説明する。 【0008】本発明の骨疾患治療薬の有効成分であるペ
プチドは、配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列
を有する。 【0009】 【0010】 【0011】配列番号1で示される本発明のペプチド
は、構成アミノ酸数が16個と比較的小さいので、常法
に基づき化学合成により容易に製造することができる。
例えば、市販のペプチド合成機を用いて容易に製造する
ことができる。あるいは、該アミノ酸配列をコードする
DNAをDNA合成機により合成し、これを市販のクロ
ーニングベクターのクローニング部位に挿入し、これで
宿主微生物を形質転換し、培養するという、常法の遺伝
子工学的手法によっても容易に製造することができる。 【0012】下記実施例において実験的に確認されたよ
うに、本発明の骨疾患治療薬の有効成分であるペプチド
は骨芽細胞に対する増殖促進作用及び活性促進作用を有
する。従って、本発明の骨疾患治療薬は、骨粗鬆症のよ
うな骨疾患の治療薬として有用である。本発明の骨疾患
治療薬により治療可能な骨疾患としては、骨粗鬆症の他
に骨軟化症等を例示することができる。 【0013】本発明のペプチドは、分子量も比較的小さ
いので、静脈投与、皮下投与及び筋肉内投与の他、製剤
化技術により経口投与及び経皮投与も可能である。 【0014】投与量は、患者の状態に応じて適宜判断さ
れるが、通常、大人1日当たり、本発明のペプチド0.
1〜10mg程度である。 【0015】また、静脈内投与、皮下投与及び筋肉内投
与の場合、本発明のペプチドを、くえん酸緩衝液(pH
4〜6)又は酢酸緩衝液(pH4〜6)のような弱酸性
の緩衝液に溶解して投与することが好ましい。この場
合、緩衝液中のペプチドの濃度は通常0.1mg/ml
〜10mg/ml程度である。また、経口投与及び経皮
投与の場合には、脂溶性の物質(例えば、ワセリン等)
に溶解し、吸収性の向上を図ることが望ましい。この場
合、本発明のペプチドの濃度は通常0.1mg/ml〜
100mg/ml程度である。 【0016】 【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。 【0017】実施例1 ペプチドの製造 市販のペプチド合成機を用い、配列番号1に示されるア
ミノ酸配列を有するペプチドを合成した。 【0018】実施例2 骨芽細胞増殖促進作用 骨芽細胞であるラット由来ROS細胞(入手先:ATC
C)を10%牛胎児血清を含むF10培地(入手先:大
日本製薬)にて培養し、5%炭酸ガス加湿37℃恒温器
内にて育成した。トリプシン処理により24穴培養プレ
ートに1x105 個/穴(well)蒔種し、コンフルーエ
ントになったところで培地を1%牛胎児血清F10培地
に交換し、24時間培養した。その後、実施例1で製造
した本発明のペプチドを1%牛胎児血清F10培地に溶
解し、容量を変化させながらwellに加えてさらに2
4時間培養を継続した。培養後、本ペプチドによる細胞
の増殖促進効果をMTTアッセイにより測定し、非処理
群に対する増殖促進効果を求めた。なお、MTTアッセ
イ及び増殖促進率の算出は具体的には次のように行っ
た。フナコシ(株)より市販されているMTF−Cel
l−Growth Assay kitの手順に従い、
本物質を用量を変化させながらウェルに加え一昼夜放置
後、生細胞のミトコンドリア中に存在する酵素によりM
TT(3-4,5Dimethylthiazol-2YL)-2,5Diphenyl Tetraz
olium bromide が暗青色のホルマザンに開裂する現象を
利用し比色法にて生細胞を計数した。本物質を加えない
対照群を100%とし用量を変化させて加えた群の比色
度を求めると次のようになった。結果を下記表1に示
す。 【0019】 【表1】 【0020】表1から明らかなように、本発明のペプチ
ドは、骨芽細胞に対し増殖促進的に作用することが確認
された。従って、本発明のペプチドは骨量の増加に結び
つくものと考えられ、骨粗鬆症等の骨疾患の治療に対し
有用である。 【0021】実施例3 本ペプチドに対する骨芽細胞上
の受容体の存在 本ペプチドが骨芽細胞に対し増殖促進作用があることが
判明したことにより、骨芽細胞が本ペプチドに対する受
容体を持っていることが推察される。もし受容体が存在
するならば本ペプチドは生命にとり根源的な物質である
ことが考えられ、次に骨芽細胞に受容体が存在するか否
かを調査した。 【0022】実施例1で得られたペプチドをビオチンで
標識し、実施例2と同様に培養したROS細胞に一定量
に標識した本ペプチドを加え、さらに競合反応をさせる
ために非標識の本ペプチドを10%牛胎児血清F10培
地に溶解し、容量を変化させながら加えて競合反応を見
た。この実験操作は具体的には次のように行った。SU
MILON社製の蛋白ビオチン化標識キットの手順に従
い本ペプチドをビオチン化し、ウェルに播種された一定
数の細胞に対し一定量のビオチン化ペプチドを加え非標
識ペプチド0〜0.512μg/wellを各々加え競合反
応を6時間行い、その後、細胞をPBSにて洗浄しスト
レプトアビジンで標識したペルオキシダーゼで細胞表面
にある受容体に結合したビオチン化ペプチドに反応して
発色反応を見る。細胞表面に本ペプチドの受容体が存在
すれば非標識のペプチドと競合反応が起こり発色強度は
低下する。結果を下記表2に示す。 【0023】 【表2】 【0024】表2に示されるように、非標識体の添加量
に依存して加えた標識体に対する割合が変化しているの
で、骨芽細胞が本ペプチドに対する受容体を持っている
ことは明らかであり、本物質が根源的な役割を担ってい
ることが推察される。 【0025】急性毒性試験 実施例1で作製したペプチドについて、ddy雄性マウ
ス(体重40〜45g)を用い、その急性毒性を試験し
た。本ペプチドを生理食塩水(pH6.0)に溶解し、
これをマウスの尾静脈より投与し、14日間観察した。
投与量は1、10、100μg/kgとした。この結果
を下記表3に示す。 【0026】 【表3】 【0027】以上の様に、100μg/kgまでの範囲
では死亡例は認められなかった。 【0028】 【発明の効果】本発明により、新規な骨疾患治療薬が提
供された。本発明の骨疾患治療薬の有効成分であるペプ
チドは、上記実施例により実験的に確認されたように、
骨芽細胞に対し増殖促進作用及び活性促進作用を有して
おり、骨疾患治療薬としての作用があることが明らかに
なった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C07K 7/08 A61K 38/10 CA(STN) REGISTRY(STN)

Claims (1)

  1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項1】 配列表の配列番号1で示されるアミノ酸
    配列を有するペプチドを有効成分として含有する骨疾患
    治療薬。
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