CN102256995A - 环状酯肽化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可用于预防和/或治疗COPD或哮喘的化合物、以及含有该化合物作为有效成分的医药组合物。本发明人对天然发酵物的药理作用进行了深入研究，结果发现：来自于在东京都奥多摩町采集的色杆菌(Chromobacterium)属土壤细菌的环状酯肽化合物同时具有气管收缩抑制作用和气管炎症抑制作用，可用作COPD或哮喘的预防或治疗剂，从而完成本发明。即，本发明涉及用于预防和/或治疗慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘的医药组合物，该医药组合物含有环状酯肽化合物或其盐作为有效成分，并且通过气管内施用、滴鼻施用或吸入施用的方式来施用。

Description

环状酯肽化合物及其用途
技术领域
本发明涉及环状酯肽化合物、以及该环状酯肽化合物的用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘的用途，该环状酯肽化合物可用作医药组合物(特别是治疗COPD或哮喘的医药组合物)的有效成分。
背景技术
COPD和哮喘均为气管气流受限的疾病。
COPD为以咳嗽(伴随有劳力性呼吸困难和咳痰)为主要症状的疾病。病状恶化时，咳嗽、哮鸣、呼吸困难增强，而且伴随着咳痰量增加且性状向脓性变化。咳嗽、哮鸣等气管症状是由于气管收缩及气管炎症以及随之而来的气管分泌过多而导致的。该疾病的特征在于不完全可逆性气流受限。这种气流受限通常是进行性的，是伴随着肺对有害的粒子或气体的异常性炎症反应而产生的(the Global Initiativefor Chronic Obstructive Lung Disease，2006年，下文称为GOLD)。患者大多为吸烟者。据推测，2020年，COPD将成为世界上第3大死亡率的死亡原因(Lancet，349，pp.1498-1504，1997年)。在世界12个国家以40岁以上的成人为对象所进行的调查中，患有COPD的比率据估计为10.1％(Lancet，370，pp.741-750，2007年)。在日本，40岁以上的患有COPD的比率据估计为10.9％(Respiology，9，pp.458-465，2004年)。
哮喘为以气管的反应性亢进和慢性炎症为特征的疾病，并且为这样的气管慢性炎症疾病：其表现出通过治疗可得到改善的可逆性气管狭窄，并且由于气管粘膜浮肿而反复发生气流受限，其症状表现为(例如)发作性呼吸困难、咳嗽、哮鸣。哮喘为一种慢性呼吸器官疾病，从儿童到老年人在所有的年龄段都有发生。而且，不管是发达国家还是发展中国家，患者量都有增加的趋势，据报道，在日本的患病率中，婴幼儿为4.2％、儿童为4.0％、成年人为1.7％(平成8年厚生省长期慢性疾病综合研究计划)。虽然日本国内由哮喘导致的死亡人数有减少的趋势，但是2006年死亡人数仍然多达2778人。
在COPD和哮喘的诊断中，表示气管阻塞程度的一秒钟用力呼气量(FEV1：Forced Expiratory Volume in 1 Second)作为指标。“一秒钟用力呼气量”被定义为“尽可能深地吸气后尽可能快地呼出时最初一秒钟内呼出的气体的量”。COPD的代表性病期分类由GOLD规定，根据FEV1，分为下列4期：I期(轻度)：FEV1≥80％预测值，II期(中等程度)：50％≤FEV1＜80％预测值，III期(重度)：30％≤FEV1＜50％预测值，IV期(最重程度)：FEV1＜30％预测值或者慢性呼吸衰竭(GOLD，2006年)。根据症状的特征和呼吸功能(FEV1及PEF(最大呼气流量：Peak Expiratory Flow))，哮喘的症状程度分为下列4期：1期(轻度间歇型)：FEV1、PEF≥80％(变动小于20％)，2期(轻度持续型)：FEV1、PEF≥80％(变动20％至30％)，3期(中等持续型)：60％≤FEV1、PEF＜80％(变动超过30％)，以及4期(严重持续型)：FEV1、PEF＜60％(变动超过30％)(喘息予防·管理ガイドライン，2006年)。
COPD中，支气管扩张药被定位为以改善症状为中心的治疗药物，已知有β2激动剂、抗胆碱能药以及茶碱药。
关于哮喘，由于其基本病状为炎症，因此吸入型甾体类化合物已被用作标准治疗药物。但是，对于气管狭窄来说，使用的是支气管扩张药，特别是长效吸入型β2激动剂。另外，也合用白三烯受体拮抗剂或茶碱制剂等。
但是，已经发现现有的支气管扩张药(如抗胆碱能药)导致口渴，并且对于β2激动剂而言，发现对吸入型甾体药具有相加效果，但是，据报道，与哮喘相关的死亡显著增加，另外，在仅用β2激动剂进行治疗的情况下，气道重塑的进展未被抑制、或者气道反应性亢进等，在效果或安全性方面需要进一步改善。
另外，同时具有抗炎作用的支气管扩张药据认为对COPD或哮喘的治疗有用，但是尚未有这样的报道：现有的支气管扩张药除了支气管扩张作用之外还明确地表现出抗炎作用，并且对肺气肿或阻塞性变化具有改善作用。
据报道，式(IV)所示的化合物为环状酯肽，其从在东京都奥多摩町采集的色杆菌(Chromobacterium)属土壤细菌QS3666菌株的培养液中产生，能够抑制由ADP导致的人血小板凝集(专利文献1、非专利文献1)。通过Marfey法及手性HPLC分析法，式(IV)所示化合物的绝对立体结构被确定为下式(非专利文献2)。
Figure BPA00001390107300031
据报道，式(IV)所示化合物为特异性Gq/11抑制剂(非专利文献3)。Gq/11为一种G蛋白质。G蛋白质为由α、β和γ亚单元构成的三聚体蛋白质，根据氨基酸序列的同源性和目标效应器官的不同，G蛋白质分为Gs、Gi、Gq和G12亚家族。另外，据报道，亚家族中存在亚型，Gq存在Gq、G11、G14、G15和G16亚型。式(IV)所示化合物强烈抑制Gq和G11，但不抑制G15和G16(非专利文献3)。
据报道，在体外试验中，式(IV)所示化合物抑制各种受体的反应，具体来说，ADP受体(P2Y1、P2Y2)、半胱氨酰白三烯受体(CryLT-R1、CryLT-R2)以及毒蕈碱受体(M1)(非专利文献3)。
据报道，通过静脉内施予30μg/kg的式(IV)所示化合物，表现出降血压作用(非专利文献4)。
另外，有人报道了下式(IIa)所表示的式(IV)所示化合物及其类似物的立体结构以及其ADP受体抑制作用(非专利文献5)。
[表1]
Figure BPA00001390107300041
据报道，被称为GPAnt-2(其为物质P的N末端被截短后的类似物)及其类似物的直链七肽在10μM条件下分别能够使由Gq/11引起的M1乙酰胆碱诱发性GTP水解被抑制25％和81％(非专利文献6)。但是，在此之后，除了上述环状酯肽之外，没有其他的选择性Gq/11抑制剂的报道，期待着Gq/11抑制剂的进一步临床效果被确认。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2003-210190号公报
非专利文献
非专利文献1：Journal of Antibiotics，56，pp.358-363，2003年
非专利文献2：Tetrahedron，59，pp.4533-4538，2003年
非专利文献3：Journal of Biological Chemistry，279，pp.47438-47445，2004年
非专利文献4：Thromb Haemost，90，pp.406-413，2003年
非专利文献5：Bioorganic and Medicinal Chemistry，12，pp.3125-3133，2004年
非专利文献6：Journal of Biological Chemistry，267，pp.16237-16243，1992年
发明内容
发明要解决的问题
本发明提供一种可用于治疗气管阻塞性疾病(特别是COPD或哮喘)的药物，该药物同时具有气管收缩抑制作用和气管炎症抑制作用。
解决问题的手段
本发明人对天然发酵物的药理作用进行了深入研究，结果发现：来自于在东京都奥多摩町采集的色杆菌(Chromobacterium)属土壤细菌的下式(II)所示环状酯肽化合物同时具有气管收缩抑制作用和气管炎症抑制作用，可用作COPD或哮喘的预防或治疗剂，从而完成本发明。
即，本发明涉及用于预防和/或治疗慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘的药物组合物，该药物组合物含有式(II)所示化合物或其盐作为有效成分，并通过气管内施用、滴鼻施用或吸入施用来施用。
Figure BPA00001390107300051
[其中
R1为-H或-CH3，
R2为-H或式(III)所示基团：
[化学式3]
Figure BPA00001390107300061
R21为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH2SCH3，
R22为-CH(CH3)2或-CH2SCH3，
R3和R4相同或不同，为-H或-CH3，
或者R3和R4可以形成一体表示＝CH2，
R5、R6和R7相同或不同，为-H或-F]。
另外，本发明还涉及通过气管内施用、滴鼻施用或吸入施用的、用于COPD或哮喘预防和/或治疗用药物组合物的式(II)所示环状酯肽化合物或其盐；以及预防或治疗COPD或哮喘的方法，包括采用气管内施用、滴鼻施用或吸入施用中的任意一种方法给需要治疗的患者施用有效量的式(II)所示环状酯肽化合物或其盐。
另外，本发明的式(II)所示环状酯肽化合物包括下式(I)的新化合物。因此，本发明还涉及式(I)所示的新环状酯肽化合物或其盐。
Figure BPA00001390107300062
(其中
R1为-CH3，R21为-CH2CH2CH3，并且R22为-CH(CH3)2；
R1为-H，R21为-CH3，并且R22为-CH(CH3)2；或者
R1为-CH3，R21为-CH3，并且R22为-CH2SCH3)。
发明效果
式(II)所示环状酯肽化合物或其盐具有Gq/11抑制作用，如后述实施例所示，其同时具有气管收缩抑制作用和气管炎症抑制作用。因此，含有该化合物作为有效成分的药物组合物可用作COPD或哮喘等的预防和/或治疗剂。
附图简要说明
图1为示出试验例2中Ref1的气道内压变化率的图。用平均值+标准偏差(n＝3或4)来表示数据。()内的数字表示相对于生理盐水施用组的抑制率。
图2为示出试验例3中Ref1的气道内压变化率的图。用平均值+标准偏差(n＝3)来表示数据。()内的数字表示相对于生理盐水施用组的抑制率。
图3为示出试验例5中Ref1的细胞数的测定结果。用平均值+标准偏差(n＝9或10)来表示数据。N、V、1、10和100分别表示正常组、溶剂组、1μg/kg施用组、10μg/kg施用组和100μg/kg施用组。**表示与溶剂组相比p＜0.01，有显著性差异(Dunnett多重比较)。
图4为示出制备例中例子1的1H-NMR谱的图。
图5为示出制备例中例子1的13C-NMR谱的图。
图6为示出制备例中例子2的1H-NMR谱的图。
图7为示出制备例中例子2的13C-NMR谱的图。
图8为示出制备例中例子3的1H-NMR谱的图。
图9为示出制备例中例子3的13C-NMR谱的图。
图10为示出制备例中例子4的1H-NMR谱的图。
图11为示出制备例中例子4的13C-NMR谱的图。
具体实施方式
下面详细描述本发明。
本发明的式(II)所示环状酯肽化合物具有多个不对称碳原子，相应地，可以存在光学异构体。作为本发明药物组合物的有效成分的环状酯肽化合物也包括式(II)所示化合物的光学异构体经分离后的物质、或者它们的混合物。
作为本发明药物组合物的有效成分的、式(II)所示的环状酯肽化合物或其盐的一些实施方案如下所示。
(1)一种化合物或其盐，其中R2为式(III)所示基团。
(2)一种化合物或其盐，其中R21为-CH3或-CH2CH2CH3。
(3)一种化合物或其盐，其中R3和R4形成一体表示＝CH2。
(4)一种化合物或其盐，其中R5、R6和R7为-H。
(5)式(IIa)或式(I)中任意一者所示的环状酯肽化合物或其盐。
(6)式(IIa)所示的环状酯肽化合物或其盐。
(7)一种化合物或其盐，其中R2为式(IIIa)所示基团。
(6)式(I)所示的环状酯肽化合物或其盐。
(7)式(I)所示的环状酯肽化合物或其盐，其具有由表3所示物理性质确定的立体结构。
作为本发明的式(I)所示新型环状酯肽化合物或其盐，优选为具有由表3所示物理性质确定的立体结构的酯肽化合物或其盐。
[表2]
Figure BPA00001390107300081
Figure BPA00001390107300091
另外，上式(IIa)所示环状酯肽化合物为非专利文献5和专利文献1报道的化合物，Ref1为上述式(IV)所示化合物。这些已知化合物适合用作本发明药物组合物的有效成分。
另外，本发明的式(II)或式(I)所示环状酯肽化合物也包括可药用的前体药物。可药用的前体药物是指具有这样的基团的化合物，所述基团通过溶剂分解或在生理学条件下可以被转化为氨基、羟基、羧基等。作为形成前体药物的基团，例如可以列举在Prog.Med.，5，2157-2161(1985)或「医薬品の開発」(廣川書店、1990年)第7卷分子設計163-198中记载的基团。
另外，式(II)或式(I)所示环状酯肽化合物的盐是指可药用的盐，根据取代基的种类，有时形成酸加成盐或与碱形成的盐。具体来说，可以列举与无机酸(盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、磷酸等)或与有机酸(甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、扁桃酸、酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、天冬氨酸、谷氨酸等)的酸加成盐等。
另外，作为本发明的式(II)或式(I)所示环状酯肽化合物或其盐，也包括它们的各种水合物或溶剂合物、以及多晶型物质。另外，本发明还包括用各种放射性或非放射性同位素标记的化合物。
(制备方法)
本发明的式(II)或式(I)所示环状酯肽化合物是这样获得的：将属于色杆菌Chromobacterium属的能够产生该物质的菌株在营养培养基中培养，从蓄积有该物质的培养物中收集该环肽化合物。通过进行适当的成盐反应，可以得到所期望的盐。
制备该物质时所使用的微生物可以使用属于色杆菌属并且具有产生该物质的能力的任意微生物。作为这种微生物，例如可以列举在东京都奥多摩町采集的色杆菌属土壤细菌Chromobacterium sp.QS3666。该菌株是已知的，其菌学性状记载于专利文献1中，并且被国际保藏在日本国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566))(保藏日：2002年1月4日，保藏编号FERM BP-10786号)。另外，由于微生物容易发生人工或自然变异，因此，作为Chromobacterium sp.QS3666菌株，除了从天然分离的微生物之外，对这些天然分离的微生物用紫外线、放射线、化学药剂等进行人工变异后的微生物以及它们的天然变异体，只要能够产生本申请的化合物，就可以适合使用。
按照常规的微生物培养方法来进行培养。
作为培养时使用的培养基，可以使用合成培养基、半合成培养基、或天然培养基，只要含有Chromobacterium sp.QS3666菌株所利用的营养源即可。关于培养基的组成，例如，作为碳源，可以使用D-葡萄糖、甘露糖、甘露糖醇、淀粉、葡萄糖、糊精、甘油、植物油等；作为氮源，可以使用肉提取物、蛋白胨、蛋白粉(gluten meal)、棉籽粉、大豆粉、花生粉、鱼粉、玉米浆、干燥酵母、酵母提取物、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、尿酸，此外，还可以使用其它的有机氮源、无机氮源。另外，根据需要，可以添加钠、钾、镁、钙、锌、铁、钴等的硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐、磷酸盐等作为金属盐。此外，根据需要，还可以添加蛋氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、硫代硫酸盐、油酸甲酯、猪油、硅油、表面活性剂等促进生成物质或消泡剂。
本发明的化合物中，R5、R6和R7中至少一者为氟的化合物可以这样得到：将苯环上有氟的苯丙氨酸添加到培养基中并根据上述常规的培养方法进行生产。
作为培养条件，一般在好氧条件下进行培养是有利的，培养温度在15～32℃的范围内，优选为20～28℃左右。培养基的pH调节至约为5～9、优选约为5～6时可以获得好结果。培养时间可根据培养基的组成、温度条件来适当地设定，但是通常为1～20天左右，优选为2～5天左右。
从培养物中纯化分离本发明化合物时，可采用通常的从微生物的培养物中纯化分离生理活性物质的方法。即，可以使用这样的方法：其中，直接使用培养物、或者经离心分离或过滤而去除菌体之后，利用在适当的溶剂中的溶解性以及溶解度的差别、从溶液中析出的速度的差别、对各种吸附剂的吸附亲和性的差别、在2种液相间的分配的差别等。具体可以列举(例如)这样的方法：使培养液与适当的载体接触以吸附滤液中的该化合物，接着以适当的溶剂进行洗脱，从而纯化该化合物。根据需要，这些方法可单独使用、或者以任意顺序进行组合、重复而使用。
本发明的式(II)或式(I)所示环状酯肽化合物也可以这样制备：以对应的本发明式(II)或式(I)所示环状酯肽化合物为原料，任意组合本领域技术人员通常可以采用的步骤，如公知的烷基化、酰基化、取代反应、氧化、还原、水解、脱保护、卤代等。例如，其中R3和R4中的一者为-CH3、另一者为-H的化合物可以通过将R3和R4形成一体表示＝CH2的化合物进行催化还原而得到。
例如，上述Ref7表示的已知化合物可以这样制得：如非专利文献5的第3132页中所记载的那样，将Ref1的化合物在MeOH中用Pd/C进行催化还原。
具体来说，上述Ref1至7所示的已知化合物通过专利文献1或非专利文献5记载的方法来制备。另外，例子1～4中所示的新化合物可通过后述的实施例中记载的方法来制备。本发明所包含的其它化合物可通过调节适当的培养条件或分离纯化方法、或者通过进一步进行化学修饰反应而生产得到。
含有式(II)所示化合物或其盐中的1种或2种以上作为有效成分的药物组合物为气管内施用、滴鼻施用或吸入施用的制剂，可以通过使用本领域通常采用的赋形剂(即，药剂用赋形剂或药剂用载体等)，并通过通常所采用的方法来制备。
在制成吸入剂或经鼻剂等经粘膜剂的情况下，本发明的药物组合物为固体、液体或半固体状，可以采用常规已知的方法来制备。根据需要，也可以适当添加pH调节剂、防腐剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂或增稠剂等。
施用时，可以使用合适的吸入或吹送用装置。例如，可以使用DPI(干粉吸入器，Dry powder inhaler)、MDI(定量吸入器，Metereddose inhaler)等装置或喷雾器，将化合物单独地或作为配方后的混合物粉末来施用、或者可以将化合物与可药用的载体组合后，作为溶液或混悬液来施用。干粉吸入器等可用于一次给药或多次给药，并且可以使用干燥粉末或含有粉末的胶囊。或者，也可以采用加压气溶胶喷雾等形式，通过使用适当的抛射剂(例如，氯氟烷烃、氢氟烷烃或二氧化碳等适当的气体)来给药。
通常在采用气管内、吸入或滴鼻施用的情况下，合适的1天的施用量按体重约为0.00001～10mg/kg，优选为按体重约为0.001～1mg/kg，并将该剂量一日分为一次至多次给药。应考虑症状、年龄、性别等，根据不同的情况，来适当地决定给药量。
式(II)所示化合物可以与通常用于治疗COPD或哮喘的各种治疗剂或预防剂并用。并用时，可以同时给药，或者分别且连续地、或按所希望的时间间隔给药。同时给药时的制剂可以是配合剂，也可以是分别制成的制剂。
实施例
本说明书中有时使用下述缩写。EtOAc＝乙酸乙酯，MeOH＝甲醇，LTD4＝白三烯D4，PBS(-)＝不含钙或镁的磷酸盐缓冲生理盐水，Methacholine＝β-氯化乙酰甲胆碱。
制备例：式(I)所示环状酯肽化合物例子1至4的制备例
(培养)
这样制备种子培养基：向100mL容量的三角烧瓶中分多次加入含有酵母提取物5g、多蛋白胨10g、食盐5g以及蒸馏水1L的培养基，每次30mL，在121℃下用高压锅灭菌30分钟。
这样制备生产培养基：向100mL容量的三角烧瓶中分多次加入含有大豆油50g、多蛋白胨3.3g、酵母提取物7.8g、脱脂大豆粉20g、玉米浆50g、氯化锂0.65g以及蒸馏水1L的培养基(pH 7.0)，每次30mL，在121℃下用高压锅灭菌30分钟。
将Chromobacterium sp.QS3666菌株的斜面培养物用白金耳勺接种到种子培养基上，于30℃下振荡培养2天。然后，向生产培养基(共60mL，每瓶30mL)的各烧瓶中，分多次接种前述的种子培养液，每次2mL，于25℃下振荡培养5天。
(纯化)
向600mL所述培养液中加入600mL丙酮以使菌体破碎后，过滤除去菌体。接着，将该滤液浓缩直至成为水溶液，然后用600mLEtOAc萃取两次。将该EtOAc萃取物7.1g上样到使用了Daiso GelSP-120-15/30-ODS-B的色谱柱(20×250mm)上，用MeOH/水(3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0)洗脱。MeOH/水(8∶2)洗脱的流份1用旋转蒸发仪浓缩至干后，溶解于1mL MeOH中，利用使用了CAPCELL PAK MGII 20×250mm(资生堂)以及MeOH/水(75∶25)的HPLC(流速10mL/分钟)进行纯化，得到6mg实施例化合物1(例子1，保留时间41.4分钟)。MeOH/水(7∶3)洗脱的流份2用旋转蒸发仪浓缩至干后，溶解于1mL MeOH中，利用使用了CAPCELL PAK MGII20×250mm(资生堂)以及MeOH/水(75∶25)的HPLC(流速10mL/分钟)进行纯化，分别得到1mg实施例化合物2(例子2，保留时间16.0分钟)、1mg实施例化合物3(例子3，保留时间18.4分钟)、1mg实施例化合物4(例子4，保留时间19.2分钟)。例子1～4的物理性质数据示于下表。另外，各化合物的1H-NMR谱(测定溶剂：1，4-二
Figure BPA00001390107300141
烷-d8)以及13C-NMR谱(测定溶剂：1，4-二
Figure BPA00001390107300142
烷-d8)分别示于图4至11。
[表3]
Figure BPA00001390107300151
根据上述物理性质数据以及NMR数据，实施例化合物1、2、3、4的平面结构式分别被确定如下。关于它们的立体结构，虽然推测包括具有与式(IIa)同样结构的化合物，但是尚未确定。另外，例子3和例子4存在光学异构体的关系，但是构成异构体的不对称碳原子的位置未确定。
Figure BPA00001390107300161
例子1：R1＝-CH3，R21＝-CH2CH2CH3，R22＝-CH(CH3)2
例子2：R1＝-H，R21＝-CH3，R22＝-CH(CH3)2
例子3：R1＝-CH3，R21＝-CH3，R22＝-CH2SCH3
例子4：R1＝-CH3，R21＝-CH3，R22＝-CH2SCH3
通过下述试验确认了式(II)所示化合物的药理学活性。
试验例1：对Gq/11的抑制作用
(方法)
使用已知可以使Gq/11活化的白三烯受体CysLTR2(半胱氨酰白三烯受体2)，根据非专利文献3的方法来进行。将能够稳定地表达CysLTR2的CHO细胞播种到96孔Black/clear bottom plate(BECTONDICKINSON公司制造)上，使得每孔20,000个细胞，培养24小时后弃去培养基，加入含有2μM Fluo-4，AM(Molecular Probe公司制造)、0.004％pluronic acid、1％FBS、20mM HEPES以及2.5mM probenecid的Hanks BSS(GIBCO公司制造)，使得每孔100μL，在37℃下孵育1小时。孵育后，用含有20mM HEPES的Hanks BSS洗涤细胞4次，加入含有20mM HEPES的Hanks BSS，使得每孔100μL。进一步加入用含有20mM HEPES的Hanks BSS稀释后的被测试化合物50μL，使得最终浓度为1×10-10M至1×10-5M，在室温下放置30分钟。用FLIPR(Molecular Device公司制造)测定加入白三烯D4(LTD4，Cayman公司制造)后细胞内Ca2+浓度随时间的变化，其中白三烯D4为CysLTR2的配体。测定开始后10秒钟时，加入用含有20mMHEPES的Hanks BSS稀释后的白三烯D4 50μL，使得最终浓度为10nM，每隔1秒钟测定一次荧光强度共测定50秒钟，进一步每隔6秒钟测定一次荧光强度共测定2分钟，观测在3分钟的测定时间内的最高荧光强度。将被测试化合物的浓度与最高荧光强度作图，算出IC50值，将其作为Gq/11抑制活性。结果，例如，Ref1、Ref2、Ref3、Ref5和Ref7的Gq/11抑制活性(IC50值)分别为66、34、56、25和32(nM)，例子1、例子2、例子3和例子4的Gq/11抑制活性(IC50值)分别为31、317、97和365(nM)。
由试验例1的结果确认了本发明化合物具有良好的Gq/11抑制作用。
试验例2：气管内施用后，对由乙酰甲胆碱引起的气管收缩的抑制作用
(方法)
SD系雄性大鼠(日本Charles River株式会社)用于实验。向大鼠腹腔内给予乌拉坦(1.2g/kg)使其麻醉。利用气管内给药用导管以0.5mL/kg的剂量气管内施用被测试化合物(0.3、1和3μg/kg)、或者生理盐水(大鼠为3或4只)。在大鼠的外颈静脉处进行静脉给药用插管。切开气管，插入气管导管，并利用呼吸分析计算机系统(flexiVent，SCIREQ公司)进行人工呼吸(10mL/kg，90次/分钟)。在人工呼吸回路中连接上压力传感器(TP-400T，日本光电株式会社)，测定气管内压力变化。气管内压力信号经压变放大器(AP-601G，日本光电株式会社)放大，并使用热书写记录器(WT-685G，日本光电株式会社，或者LINEARCORDER F WR3701，Graphtec公司)记录在记录纸上。使用体温保持装置(BWT-100，Bio Research Center)将大鼠的体温保持在37℃。气管内施用被测试化合物后1小时时，静脉内给予β-氯化乙酰甲胆碱生理盐水(30μg/kg，β-氯化乙酰甲胆碱由SIGMA公司生产)，以导致气管收缩反应。通过与气管内施用生理盐水相比，由气管内压力升高率(％)算出被测试化合物的气管收缩抑制率，并求出ED50值。
图1示出了Ref1的气管内压力变化率。通过在造成气管收缩前1小时时给大鼠气管内施用0.3、1和3μg/kg的Ref1，分别表现出32％、45％和98％的抑制率。由这3点算出的ED50值为0.73μg/kg。另外，Ref2至7以及例子1至4也一样，在1μg/kg至10μg/kg的剂量下抑制了气管收缩反应。
从试验例2的结果确认了：通过给大鼠气管内施用本发明化合物，抑制了乙酰甲胆碱诱发的气管收缩反应。
试验例3：气管内施用后，对LTD4引起的气管收缩反应的作用
(方法)
Hartley系雄性豚鼠(日本SLC株式会社)用于实验。给豚鼠腹腔内给予乌拉坦(1.2g/kg)，使其麻醉。使用注射器(30G)，以0.5mL/kg的剂量气管内注射给予被测试化合物(0.3、1和3μg/kg)、或者生理盐水(每组3只)。在豚鼠的外颈静脉处进行静脉给药用插管。切开气管，插入气管导管，并利用人工呼吸器(MODEL683，HARVARD)进行人工呼吸(10mL/kg，60次/分钟)。在人工呼吸回路中连接上压力传感器(TP-400T，日本光电株式会社)，测定气管内压力变化。气管内压力信号经压变放大器(AP-601G，日本光电株式会社)放大，并使用热书写记录器(LINEARCORDER F WR3701，Graphtec公司)记录在记录纸上。使用体温保持装置(BWT-100，Bio Research Center)将豚鼠的体温保持在37℃。气管内注射施用被测试化合物后30分钟时，静脉内给予LTD4的生理盐水溶液(0.3μg/kg)，以导致气管收缩反应。
(结果)
图2示出了Ref1的气管内压力变化率。生理盐水施用组表现出显著的气管收缩反应，与此相对的是，发现Ref1施用组中气管收缩反应被抑制(ED50值为1.1μg/kg)。
由试验例3的结果确认了：通过气管内施用本发明化合物，抑制了LTD4引起的气管收缩反应。
试验例4：气管内施用后对颈动脉压的作用
(方法)
SD雄性大鼠(日本Charles River株式会社)用于实验。向大鼠腹腔内给予乌拉坦(1.2g/kg)使其麻醉。在颈动脉处进行插管，并连接上压力传感器(TP-400T，日本光电株式会社)。测定血压用插管以及压力传感器内充满5％的肝素生理盐水。压力信号经压变放大器(AP-601G，日本光电株式会社)放大，并使用热书写记录器(WT-685G，日本光电株式会社)记录在记录纸上。使用体温保持装置(BWT-100，Bio Research Center)将大鼠的体温保持在37℃。露出气管，用注射器(27G)以0.5mL/kg的剂量向气管内直接注射被测试化合物(30或100μg/kg)或者生理盐水。30μg/kg给药组中使用了5只动物，100μg/kg给药组中使用了1只动物，生理盐水施用组中使用了3只动物。测定气管内施用后30分钟内的平均血压。
(结果)
对于气管内施用生理盐水组或者气管内施用30μg/kg剂量的Ref1组来说，10分钟后的血压降低分别为5±2.4mmHg和7±5.2mmHg，另外，在观察血压的30分钟内的最大降低量分别为20±7.1mmHg和22±3.3mmHg，两者之间没有显著性差异。另一方面，对于气管内施用100μg/kg剂量的Ref1组来说，发现了明显的血压降低。
[表4]
试验例4的结果暗示了给大鼠气管内施用Ref1时对于颈动脉压不产生作用的最大量为至少30μg/kg。该结果暗示了：对于颈动脉压不产生作用的最大量(至少30μg/kg)与气管收缩抑制作用的ED50值(0.73μg/kg)相差至少40倍。
试验例5：滴鼻施用后，对由吸烟诱发的气管炎症的作用
(方法)
BALB/c雄性小鼠(日本Charles River株式会社)用于实验。向小鼠腹腔内给予戊巴比妥钠(40mg/kg)使其麻醉。在第0天至第10天(不包括第5天和第6天)的期间内，每天给小鼠滴鼻施用被测试化合物(1、10和100μg/kg)一次。同样地，给溶剂组滴鼻施用生理盐水。每组10只动物。滴鼻施用后1小时时将小鼠放入笼中，用香烟气体产生装置(SG-200，柴田科学株式会社)，使小鼠吸入用空气稀释至浓度为4％的香烟气体。在第11天时向小鼠腹腔内给予戊巴比妥钠(80mg/kg)后，放血使动物安乐死。呼吸停止后，切开气管，用PBS(-)0.5mL×3次洗涤支气管肺泡，回收洗涤液。通过离心操作除去上清之后，将细胞再混悬在PBS(-)中，用多参数自动血细胞分析装置(XT-2000，Sysmex株式会社)测定白细胞(WBC)、中性粒细胞(NEUT)、淋巴细胞(LYMPH)、巨噬细胞(MONO)以及嗜酸性粒细胞(EO)的细胞数。
(结果)
Ref1的结果示于图3。在每日一次以10和100μg/kg的剂量滴鼻施用Ref1的组中，显著性地抑制了中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞向气管的浸润。
由试验例5的结果确认了本发明化合物能够抑制中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞向由吸烟诱发的气管的浸润。
由试验例1的结果确认了本发明化合物具有Gq/11抑制作用；试验例2和试验例3的结果暗示了通过气管内施用，本发明化合物具有抑制由乙酰甲胆碱或LTD4诱发的气管收缩的作用。试验例4暗示了对于颈动脉压不产生作用的最大量与表示气管收缩抑制作用的ED50值之间相差很大。另外，由试验例5的结果确认了本发明化合物能够抑制中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞向由吸烟诱发的气管的浸润，从而具有抑制气管炎症的作用。
根据上述结果，暗示了本发明化合物在气管内、滴鼻或吸入施用时，同时具有抑制气管收缩的作用以及抑制气管炎症的作用，另外，表明这些作用可能与血压降低作用相差很大，因此期待可用于预防或治疗COPD或哮喘。
工业实用性
本发明的环状酯肽化合物或其盐具有Gq/11抑制作用、气管收缩抑制作用以及气管炎症抑制作用，因此可用于预防和/或治疗COPD或哮喘等。

Claims (5)

1.式(I)所示的环状酯肽化合物或其盐，
Figure FPA00001390107200011
式中，
R1为-CH3，R21为-CH2CH2CH3，并且R22为-CH(CH3)2；
R1为-H，R21为-CH3，并且R22为-CH(CH3)2；或者
R1为-CH3，R21为-CH3，并且R22为-CH2SCH3。
2.一种用于预防和/或治疗慢性阻塞性肺病(COPD)或哮喘的医药组合物，其包含式(II)所示环状酯肽化合物或其盐作为有效成分，并且该医药组合物通过气管内施用、滴鼻施用或吸入施用的方式来施用，
Figure FPA00001390107200012
式中，
R1为-H或-CH3，
R2为-H或式(III)表示的基团：
R21为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH2SCH3，
R22为-CH(CH3)2或-CH2SCH3，
R3和R4相同或不同，为-H或-CH3；或者R3和R4形成一体表示＝CH2，
R5、R6和R7相同或不同，为-H或-F。
3.权利要求2所述的医药组合物，其中环状酯肽化合物或其盐为式(IIa)或(I)中任意一者所示的环状酯肽化合物或其盐，
Figure FPA00001390107200022
式中，R1、R2、R21、R22、R3、R4、R5、R6和R7为下表中的任意一种组合：
Figure FPA00001390107200023
；
Figure FPA00001390107200031
式中，R1、R21和R22为下表中的任意一种组合：
 R1  R21  R22 -CH3 -CH2CH2CH3 -CH(CH3)2 -H -CH3 -CH(CH3)2 -CH3 -CH3 -CH2SCH3
。
4.式(II)所示的环状酯肽化合物或其盐，其通过气管内施用、滴鼻施用或吸入施用而用于预防或治疗COPD或哮喘，
Figure FPA00001390107200032
式中，
R1为-H或-CH3，
R2为-H或式(III)表示的基团：
Figure FPA00001390107200033
R21为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH2SCH3，
R22为-CH(CH3)2或-CH2SCH3，
R3和R4相同或不同，为-H或-CH3，或者R3和R4形成一体表示＝CH2，
R5、R6和R7相同或不同，为-H或-F。
5.一种预防或治疗COPD或哮喘的方法，包括采用气管内施用、滴鼻施用或吸入施用中的任意一种方法给需要治疗的患者施用有效量的式(II)所示环状酯肽化合物或其盐，
Figure FPA00001390107200041
式中，
R1为-H或-CH3，
R2为-H或式(III)表示的基团：
Figure FPA00001390107200042
R21为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3或-CH2SCH3，
R22为-CH(CH3)2或-CH2SCH3，
R3和R4相同或不同，为-H或-CH3，或者R3和R4形成一体表示＝CH2，
R5、R6和R7相同或不同，为-H或-F。
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