CN114989246B - Fk3多肽类似物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一类可以用于治疗或预防耐药细菌感染和生物膜感染等相关疾病的FK3多肽类似物及其应用。本发明的FK3多肽类似物，其氨基酸序列如下：X_a‑Lys‑X_b‑Leu‑Lys‑Lys‑X_c‑CONH₂，其中X_a和X_c，两者至少其中之一为结构单元Ⅰ；结构单元Ⅰ为

其中，R₁为异丁基或苯甲基，R₂为烷基或苯基；或者R₂为带侧链的苯基，所述侧链包括烷基、烷基取代基，烷氧基、卤素基团或硝基。本发明的FK3多肽类似物抗菌和抗生物膜活性高、稳定性和选择性高、能够改善耐药细菌和生物膜引发的感染，制备成本低，可推广性更高；解决了FK3稳定性较差、生物利用度和药效低的问题。

Description

FK3多肽类似物及其应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体的，涉及一类FK3多肽类似物，本发明还涉及上述FK3多肽类似物的制备方法及其在耐药细菌感染和生物膜感染等相关疾病的预防和/或治疗中的用途。

背景技术

现如今，细菌耐药性已成为全球性关注的问题，耐药细菌所致感染已构成新世纪抗感染治疗的新挑战，是当今人类健康和生命的主要威胁。据WHO统计，每年至少有70万人死于细菌耐药性疾病，并且预计耐药细菌感染性疾病在2050年将超过心脏疾病，成为全球第一大死亡原因。革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌均是院内感染的重要耐药病原菌，这些耐药病原菌出现的比率逐年升高，导致常规抗生素的治疗效果下降，死亡率上升。基于此现状，仅减少抗生素的使用远远不够，急需开发新型抗菌药物和治疗策略来解决耐药菌感染的问题。

生物膜是引起细菌耐药的主要原因之一，与浮游细胞相比，生物膜中的细胞对环境压力，消毒剂，抗生素治疗和宿主免疫防御具有高度耐受力，这导致生物膜感染反复发作，病情久治不愈。美国NIH调查发现人类多达80％的细菌感染与生物膜有关，目前临床上并没有理想的药物能够有效治疗细菌生物膜引起的耐药感染。

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)，是生物体在抵抗病原微生物侵袭时，自身防御系统产生的富含抗菌活性的一类阳离子多肽。抗菌肽主要的作用机制是破坏细菌的细胞膜，细菌很难通过改变细胞膜组分对抗菌肽产生耐药性，因此抗菌肽在针对目前细菌耐药和生物膜感染这一难题中展示出良好的开发和应用前景。FK3(氨基酸序列为：FLKLLKKLL-NH₂)是Hou等2015年报道的东方铃蟾皮肤分泌的一种抗菌肽核心序列类似物，呈现典型的α-螺旋结构，对临床最常见且难以治愈的铜绿假单胞菌具有较好的抗菌活性和抗生物膜活性。但是FK3稳定性差并且具有溶血活性。现有技术对FK3进行了氨基酸关键位点的替换，得到的类似物抗菌活性提高，抗菌谱扩大，稳定性提高，能够有效治疗细菌耐药和生物膜感染，但是仍存在生物利用度低、药效有待提高的问题。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的在于提供一种FK3多肽类似物。

本发明的再一目的在于提供所述FK3多肽类似物的应用。

根据本发明具体实施方式的FK3多肽类似物，其氨基酸序列如下：

X_a-Lys-X_b-Leu-Lys-Lys-X_c-CONH₂，

其中，

X_a为结构单元Ⅰ或结构单元A；X_c为结构单元Ⅰ或结构单元C；且X_a和X_c，两者至少其中之一为结构单元Ⅰ；

X_b为Ala或Leu；

所述结构单元A为：Phe-Leu，Phe-Leu指缩合的苯丙氨酸和亮氨酸；所述结构单元C为：Leu-Leu，Leu-Leu指缩合的两个亮氨酸；X_a和X_c在本发明的FK3多肽类似物中占有两个氨基酸的位点。

所述结构单元Ⅰ为：

其中，R₁为异丁基或苯甲基；R₂为烷基或苯基；或者R₂为带侧链的苯基，所述侧链包括烷基、烷基取代基、烷氧基、卤素基团或硝基，侧链连接位置可以是苯基的邻位，间位，对位单取代，苯基的3，5位双取代或苯基的2，4，6位三取代。

本发明中烷基取代基是指烷基包括其他取代的基团，例如烷基上氢被卤素取代的情况；本发明中卤素基团是指氟基、氯基、溴基、碘基等。

优选的，所述结构单元Ⅰ中，R₂为带侧链的苯基，所述侧链包括烷基、烷基取代基、烷氧基、卤素基团或硝基；所述侧链设置在苯基的对位。

优选的，所述结构单元Ⅰ中，R₂为对甲基苯基、对三氟甲基苯基、对碘苯基或对硝基苯基。

优选的，所述X_a为以下结构中的任一种：

优选的，所述X_c为：

优选的，X_b为Ala。

优选的，所述FK3多肽类似物为如下化合物中的任一种：

化合物K101，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

SEQ ID NO.1：

化合物K120，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2：

化合物K121，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：

SEQ ID NO.3：

化合物K122，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

SEQ ID NO.4：

化合物K124，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：

SEQ ID NO.5：

化合物K134，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：

SEQ ID NO.6：

化合物K135，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：

SEQ ID NO.7：

优选的，所述的FK3多肽类似物，所述结构单元Ⅰ的合成路线为：

其中，R₁为异丁基或苯甲基；R₂为烷基或苯基；或者R₂为带侧链的苯基，所述侧链包括烷基、烷基取代基、烷氧基、卤素基团或硝基。

本发明的再一目的在于提供一种组合物，其含有上述FK3多肽类似物，还包括药学上可接受的载体或辅料。载体可以是能够减少药物降解及损失、降低副作用的载体，例如胶束、微乳液、凝胶等；辅料可以是使药物制成适宜的剂型而加入的物料，例如液体配方、冻干用赋形剂等，液体配方一般是缓冲液、等渗溶液和水溶液。具体的，以FK3多肽类似物为活性成分添加药学上可接受的载体和/或辅料支撑药物组合物。

本发明的药物组合适用于各种给药方式，例如口服给药、经皮给药、静脉给药、肌肉给药、局部给药、经鼻给药等。根据所采用的给药方式，可将本发明的多肽类似物药物组合支撑各种合适的剂型，其中包含至少一种有效量的本发明的多肽类似物和至少一种药学上可接受的药用载体。

适当剂型的实例为片剂、胶囊、糖衣片剂、粒剂、口服溶液和糖浆、用于皮肤表面的油膏和药贴、气雾剂、鼻喷剂以及可以用于注射的无菌溶液。含有本发明多肽类似物的药物组合物可以制成溶液或者冻干粉以用于胃肠外给药，在使用前可加入适当溶剂或其他可要用的载体将粉末重新配制，液体配方一般是PBS缓冲液、生理盐水等渗溶液和水溶液。

本发明多肽类似物在药物组合物中的用量可以在较大范围内变动，本领域技术人员可以根据一些客观的因素如疾病的种类、病情严重程度、患者体重、剂型、给药途径等因素很容易地加以确定。

本发明提供上述FK3多肽类似物的应用，具体包括：

在制备预防或治疗耐药细菌感染的药物中的应用，或者在制备预防或治疗细菌生物膜感染的药物中的应用。

本发明的FK3多肽类似物对耐药细菌感染疾病具有治疗和改善作用，可用于直接或间接治疗以耐药细菌感染为特征的病症；其中，耐药细菌感染，主要由于抗生素不合理的使用导致细菌产生耐药性引起的细菌感染疾病。

本发明的FK3多肽类似物对细菌生物膜感染疾病具有治疗和改善作用，可用于直接或间接治疗以细菌生物膜感染为特征的病症。其中，细菌生物膜感染疾病，包括细菌定植在医疗器械表面引起的慢性生物膜感染和生物膜内细菌逃避抗生素或者机体免疫系统，引起的持续性或免疫性疾病。

本发明的有益效果：

本发明合成了一系列FK3多肽类似物，并对这一系列FK3多肽类似物的药效作用展开研究，包括FK3多肽类似物对耐药细菌的体外抗菌活性、抗生物膜活性、对体内耐药细菌感染和生物膜感染的改善治疗作用等活性指标进行评价，还包括FK3多肽类似物的盐稳定性、血清稳定性和小鼠的体内毒性进行研究。结果显示，与母肽FK3相比，筛选得到的FK3多肽类似物K101、K120、K121、K122、K124、K134和K135，各方面的活性指标均优于母肽，稳定性和安全性也优于母肽。由此证明，本发明的FK3多肽类似物可以用于制备预防或治疗耐药细菌感染和生物膜感染疾病的药物。

本发明的结构单元Ⅰ可以模拟天然多肽的二级结构，在与细菌膜相互作用时形成类α-螺旋或β-折叠等结构，能够调节类似物的二级结构和两亲性。由于蛋白酶在体内识别的氨基酸是天然L-氨基酸，引入结构单元Ⅰ可以改变蛋白酶识别位点的肽键结构，提高多肽酶解稳定性。本发明中合成的结构单元Ⅰ的R₁侧链为异丁基或苯甲基，R₂为烷基、苯基或带侧链的苯基，增加了化学结构的多样性，能够调节类似物的疏水性，进而对类似物的活性和选择性进行细微调整。因此FK3的关键性疏水氨基酸位点1、2位点和8、9位点引入结构单元Ⅰ后，抗菌活性、稳定性和选择性均有所提高。

本发明经化学改造筛选出的FK3多肽类似物K101、K120、K121、K122、K124、K134及K135具有更好的抗耐药细菌感染和生物膜感染生物学活性；与母肽FK3相比，活性提高，稳定性提高，生物利用度提高；与对照抗生素相比，抗菌谱扩大，对耐药细菌和生物膜感染治疗效果显著；与大分子蛋白相比，制备成本更经济，可推广性更高。

其中，化合物K134和化合物K135，在FK3的1、2位点引入R₁为苯甲基、R₂为对碘苯基或对三氟甲基苯基的结构单元Ⅰ后，类似物的疏水性过高导致细胞毒性增加。用同样是疏水性氨基酸的丙氨酸替换母肽FK3中第4位氨基酸亮氨酸，能够调节疏水性，降低毒性。因此在1，2位点引入上述结构单元Ⅰ，在第4位氨基酸位点引入丙氨酸，类似物的抗菌活性增强，毒性降低安全增加。

本发明中所用缩写具体含义如下：

Phe(简写F)为苯丙氨酸，Leu(简写L)为亮氨酸，Lys(简写K)为赖氨酸，Ala(简写A)为丙氨酸，EDC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，HOBT为1-羟基苯并三唑，HBTU为O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，DIEA为N,N-二异丙基乙胺，DCM为二氯甲烷，LiAlH₄为氢化铝锂，THF为四氢呋喃，MeOH为无水甲醇，TEA为三乙胺，NaCNBH₃为氰基硼氢化钠，CH₃COOH为冰醋酸，TFA为三氟乙酸，Fmoc为芴甲氧羰基，Tis为三异丙基硅烷，DMF为N,N-二甲基甲酰胺，EA为乙酸乙酯，HCl为盐酸，MRSA为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。

图1为实施例1中合成的结构单元Ⅰ的结构；

图2为实施例2中合成的FK3类似物的序列；

图3为实施例4中受试物溶血活性实验的结果图；

图4为实施例5中受试物FK3、K101、K120、K121、K122、K124、K134和K135与小鼠血清孵育0.5h，1h，2h，4h和6h后，受试物在血清中的残留率；

图5为实施例6中浓度为4-64μg/mL的受试物FK3、K101、K120、K121、K122、K124、K134和K135对细菌生物膜形成抑制率；

图5A为受试物对铜绿假单胞菌生物膜形成抑制率；

图5B为受试物对金黄色葡萄球菌生物膜形成抑制率；

图5C为受试物对MRSA生物膜形成抑制率；

图5D为受试物对表皮葡萄球菌的生物膜形成抑制率；

图6为实施例7中受试物K122对细菌生物膜持留细菌的抗菌活性；

图6A为K122对铜绿假单胞菌生物膜持留细菌的抗菌活性；

图6B为K122对金黄色葡萄球菌生物膜持留细菌的抗菌活性；

图6C为K122对MRSA生物膜持留细菌的抗菌活性；

图6D为K122对表皮葡萄球菌生物膜持留细菌的抗菌活性；

图7为实施例8中1×MIC，2×MIC，4×MIC K122和4×MIC抗生素对细菌的杀菌能力；

图7A为K122对铜绿假单胞菌的杀菌能力；

图7B为K122对金黄色葡萄球菌的杀菌能力；

图7C为K122对大肠埃希菌的杀菌能力；

图7D为K122对MRSA的杀菌能力；

图7E为抗生素亚胺培南，头孢他啶，氨曲南和多粘菌素B对铜绿假单胞菌的杀菌能力；

图7F为抗生素万古霉素，达托霉素，阿莫西林，亚胺培南，多粘菌素B对金黄色葡萄球菌的杀菌能力；

图8是实施例9中受试物K122和对照抗生素对细菌的诱导耐药能力；

图8A是K122，多粘菌素B，头孢他啶，亚胺培南和氨曲南对铜绿假单胞菌的诱导耐药能力；

图8B是K122，阿莫西林，万古霉素和多粘菌素B对金黄色葡萄球菌的诱导耐药能力；

图8C是K122，万古霉素和多粘菌素B对MRSA的诱导耐药能力；

图8D是K122，万古霉素和多粘菌素B对表皮葡萄球菌的诱导耐药能力；

图9为实施例10中治疗3天后，正常组，模型组，实验组K122(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)，实验组头孢他啶(5mg/kg)和实验组多粘菌素B(5mg/kg)中小鼠肺部细菌感染情况；

图9A为正常组、模型组和实验组小鼠体重变化；

图9B为小鼠经3天治疗后，正常组、模型组和实验组肺部组织图片和肺部组织匀浆后组织液和稀释100倍的组织液在MH固体平板上细菌生长情况；

图9C为小鼠经3天治疗后，正常组、模型组和实验组肺组织的细菌负荷；

图9D为小鼠经3天治疗后，正常组、模型组和实验组小鼠肺部组织病理切片HE染色结果；

图9E是为小鼠经3天治疗后，正常组、模型组和实验组小鼠肺部组织中炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的分泌情况。

具体实施方式

为使本发明的优点和技术方案更加清楚，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其他实施方式，都属于本发明所保护的范围。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另有说明，否则所用试剂或仪器均可以通过市场购置获得。

材料与方法：

下述实施例中所述实验条件和实验方法，如无特殊说明，均为常规条件和方法，所述试剂或仪器，均可从商业途径获得。

其中，GraphPad Prism 8.0软件用于数据统计和分析，数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，通过单因素方差分析和Tukey检验进行显著性差异分析(^***P＜0.001，^**P＜0.01，^*P＜0.05)。

实施例1、结构单元Ⅰ的合成

(1)称取1倍量苯丙氨酸/亮氨酸、1.5倍量EDC和1.5倍量HOBT于100mL的圆底烧瓶中，加入DCM溶解。将圆底烧瓶放置于冰浴中，加入1倍量DIEA，搅拌15min后，加入1.5倍量二甲羟胺盐酸盐，再加入1倍量DIEA，冰浴中反应3h，薄层色谱检测反应进度；

(2)反应完全后，将DCM旋干，加入HCl和EA转移到分液漏斗中萃取，收集有机相产物于锥形瓶中。用水萃取一次，饱和食盐水萃取一次，用无水硫酸钠干燥后，将溶剂旋干，进行柱层析；

(3)将柱层析得到的产物溶解于THF中，冰盐浴中反应，缓慢加入1倍量氢化锂铝，反应30min。反应完全后，逐滴加水淬灭反应，用硅藻土过滤，加入EA和HCl转移到分液漏斗中萃取，收集有机相产物于锥形瓶中。用水萃取一次，饱和食盐水萃取一次，用无水硫酸钠干燥后，将溶剂旋干，进行柱层析；

(4)将柱层析得到的产物溶解于无水甲醇中，冰浴中反应，称量1倍量甘氨酸叔丁酯盐酸盐溶于无水甲醇中，加入1倍量三乙胺，搅拌20min，在反应液中加入4倍量冰醋酸和2倍量氰基硼氢化钠反应4h，薄层色谱监测反应进度；

(5)将甲醇旋干，加入饱和碳酸氢钠和DCM转移到分液漏斗中萃取，用DCM萃取水相2次，收集所有的有机相产物于锥形瓶中。用饱和碳酸氢钠萃取一次，饱和食盐水萃取一次。得到的有机相产物用无水硫酸钠干燥，将溶剂旋干后进行柱层析；

(6)将柱层析得到的产物溶解于DCM中，冰浴反应，加入1.2倍量DIEA，5min后加入1.2倍量带有不同侧链的苯磺酰氯，反应6h。待反应完全后，用水萃取一次，用饱和食盐水萃取一次。将溶剂旋干后，进行柱层析；

(7)将柱层析得到的产物用DCM和TFA按照1:1的比例溶解，反应2h，。反应完全后用旋转蒸发仪将溶剂旋干，反复旋蒸5次，进行柱层析，得到结构单元Ⅰ。

基于以上合成步骤，合成本发明的如图1所示结构单元Ⅰ。

实施例2、化合物的制备

步骤1：化合物的合成采用Fmoc固相合成法，由羧基端向氨基端方向合成，具体步骤如下：

(1)MBHA树脂的活化：称取树脂加入适量DCM在摇床上溶胀30min，抽干后加入DMF清洗3次，每次3min；

(2)茚检：在试管中加入茚三酮：吡啶：苯酚＝1：2：1的茚检试剂，蘸取少许树脂于其中，沸水浴3min，若茚检结果为黄色，表明树脂正常；

(3)树脂脱保护：加入含有3％重蒸哌啶的DMF溶液脱去保护基团，抽去残留试剂，加入DMF清洗，每次3min，重复4次，抽去残余试剂；

(4)茚检：在试管中加入茚三酮：吡啶：苯酚＝1：2：1的茚检试剂，取少量树脂于试管，沸水浴3min，若茚检结果为蓝紫色则证明保护基已脱去；

(5)氨基酸缩合反应：结构单元Ⅰ和后两个位点的氨基酸，在烧杯中称取2倍量结构单元Ⅰ或氨基酸、4倍量HOBT、4倍量HBTU、6倍量DIEA，少量DMF溶解，立即加入树脂中搅拌反应4h。其它位点上的氨基酸，在烧杯中称取3倍量的氨基酸、3倍量HOBT、3倍量HBTU、6倍过量的DIEA，少量DMF溶解，立即加入树脂中，搅拌1h，抽干溶剂，用DMF清洗3min，重复3次；

(6)茚检：若茚检结果为黄色，则表明缩合成功；

(7)重复步骤(3)(4)(5)(6)按照化合物中氨基酸序列的顺序依次缩合，直至待合成化合物的全部氨基酸缩合完成，得到多肽肽链：X_a-Lys-X_b-Leu-Lys-Lys-X_c-CONH₂；

步骤2：切割多肽肽链：肽链合成后脱保护，DMF洗涤树脂3min，重复2次；甲醇清洗3min；DCM洗3min；最后甲醇洗3min，重复2次。抽干树脂3h至粉末状。配制TFA：Tis：H₂O＝95：2.5：2.5(V/V/V)的切割液，加入到树脂中切割3h，收集切割液。用旋转蒸发仪旋去溶剂，加入预冷的冰乙醚沉淀类似物，加入去离子水萃取，收集水相分装至50mL的烧杯中，于-80℃冰箱过夜冻存后进行冷冻干燥处理，得到粗肽。

步骤3：化合物的制备纯化：

(1)称取约40mg的粗肽溶解于去离子水制成多肽溶液，待完全溶解之后用0.45μm规格滤器除去多肽溶液中不溶性物质，洗脱溶剂(乙腈和去离子水)中加入0.1％TFA；

(2)高效液相色谱使用C18反向制备柱100％乙腈冲洗至谱线平稳，设置流量梯度，初始浓度平衡后进样；

(3)进样后，检测220nm处的吸收峰，收集主峰对应洗脱液，标记后用保鲜膜密封，扎排气孔，于-80℃冰箱过夜冻存后进行冷冻干燥处理，得到化合物；基于以上合成步骤，合成本发明FK3类似物如图2所示。

(4)冻干后取少量化合物溶解，C18反向分析柱以5％-95％乙腈/去离子水洗脱30min，220nm色谱图峰面积积分统计化合物保留时间及纯度，并使用质谱表征鉴定分离出的产物，确认质子化分子离子峰的m/z值，并将测量m/z与理论m/z比较，确认合成纯化的产物为目标产物，表1分别给出了实施例2所合成的化合物的理论m/z、测量m/z、疏水氨基酸数、电荷数、保留时间及纯度。

表1、实施例2所合成的化合物的理化性质：

实施例3、将实施例2得到的化合物作为受试物进行体外抗菌活性检测

选用革兰氏阴性细菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽胞杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，检测化合物对敏感细菌的最小抑菌浓度(MIC)评估化合物的体外抗菌活性。

选用革兰氏阴性铜绿假单胞菌耐药细菌和革兰氏阳性MRSA耐药细菌各10株，检测化合物K101，K120，K121，K122，K134，K135对耐药细菌的抗菌活性。

(1)无菌试管中加入3mL肉汤培养基，接入单克隆菌落，放入37℃、180rpm震荡培养箱中，培养5-7h至对数生长期。通过麦氏比浊法比对浊度，并用MH稀释得到浓度为1.0×10⁶CFU/mL的菌液。

(2)称取类似物，用超纯水配成2048μg/mL的母液。用MH培养基二倍稀释得到一系列浓度梯度为4-128μg/mL的药液。

(3)在无菌96孔板中加入不同浓度的药液和等体积菌液，每个浓度设置3个复孔，放入培养箱中，37℃培养过夜16-18h。

(4)观察细菌浊度，澄清孔中药物最小浓度为化合物的最小抑菌浓度，结果记录在表2、表3和表4中。

表2、实施例2所合成的化合物对敏感细菌的最小抑菌浓度：

表3、实施例2所合成的化合物对铜绿假单胞菌耐药细菌的最小抑菌浓度：

表4、实施例2所合成的化合物对MRSA耐药细菌的最小抑菌浓度：

通过检测受试物对细菌的最小抑菌浓度，可见受试物K101、K120、K121、K122、K124、K134和K135对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有良好的抗菌活性。尤其对于革兰氏阳性细菌，与母肽FK3相比，受试物对革兰氏阳性细菌的抗菌活性显著提高。对于铜绿假单胞菌耐药细菌和MRSA耐药细菌，受试物K122的最小抑菌浓度均为4μg/mL，抗菌活性显著。抗生素亚胺培南、头孢他啶和氨曲南对铜绿假单胞菌耐药细菌活性减弱，抗生素多粘菌素B、阿莫西林对MRSA耐药细菌活性减弱。

实施例4、将实施例2得到的化合物作为受试物进行溶血活性实验

选用昆明小鼠新鲜的血红细胞，检测化合物对血红细胞的裂解活性，作为评估化合物体外毒性的一个指标。

(1)用PBS将肝素钠配制成浓度为2mg/mL的溶液，每管200μL加入离心管中。采用眼球取血的方式取出血液装入离心管，800g离心10min。弃上清液，下层血红细胞用PBS洗涤三次，并用PBS稀释得到8％的血红细胞悬液。

(2)用PBS将化合物配制成浓度为2048μg/mL的母液，通过二倍稀释得到8-128μg/mL的药液。

(3)在96孔板中分组加样：阴性对照组加入等体积血红细胞悬液和PBS缓冲液；实验组加入等体积血红细胞悬液和不同浓度受试物溶液；阳性对照组加入等体积血红细胞悬液和1％TritonX-100。

(4)放入37℃培养箱中孵育，1h后取出离心，将上清液转移至另一干净96孔板中，检测上清液在490nm处的吸光值。

(5)按以下公式计算化合物溶血率，根据最低溶血浓度计算治疗指数。

溶血率(％)＝(OD₄₉₀实验组-OD₄₉₀阴性对照组)/(OD₄₉₀阳性对照组-OD₄₉₀阴性对照组)×100％。

治疗指数＝最低溶血浓度/最小抑菌浓度

表5、实施例2所合成的化合物的最低溶血浓度和治疗指数：

注：最低溶血浓度定义为受试物诱导20％小鼠红细胞溶血的最低浓度。当在128μg/mL未检测到20％红细胞溶血时，记录受试物的最低溶血浓度为256μg/mL。

图3为受试物对小鼠血红细胞的溶血活性结果图。结果显示，与母肽FK3相比，K124在浓度为128μg/mL时检测到的溶血率不足1％。受试物K89，K91，K119和K128溶血活性较高，其余受试物尤其K101、K120、K121、K122、K134，K135，K139和K141在最高浓度128μg/mL时，溶血率均低于20％，溶血活性很低。由表5中数据可知，受试物与FK3相比，对革兰氏阳性菌和阴性菌的抗菌活性提高，最小抑菌浓度降低，所以受试物与FK3相比，对哺乳动物细胞的安全性和选择性有所提高。

实施例5、将实施例2得到的化合物作为受试物进行盐离子和血清稳定性实验

选用150mM NaCl、4.5mM KCl、2mM CaCl₂、6μM NH₄Cl、8μM ZnCl₂、1mM MgCl₂、4μMFeCl₃检测受试物在生理环境中对铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌和MRSA的抗菌活性。

用营养肉汤培养基将细菌在37℃恒温摇床中培养至对数生长期，MH液体培养基将其稀释成1.5×10⁶CFU/mL的细菌悬液。用MH培养基将化合物二倍稀释至终浓度为4-128μg/mL的浓度梯度。去离子水配置终浓度为150mM NaCl、4.5mM KCl、2mM CaCl₂、6μM NH₄Cl、8μMZnCl₂、1mM MgCl₂、4μM FeCl₃盐溶液。96孔板中加入等体积菌液、盐溶液和对应浓度的受试物，37℃培养过夜，将澄清孔药物的最小浓度记录为受试物在盐离子中的最小抑菌浓度，计算受试物在7种盐离子溶液中最小抑菌浓度的平均值，结果记录在表6。

表6、实施例2所合成的化合物的盐稳定性：

注：治疗指数＝最低溶血浓度/平均最小抑菌浓度

由表6中数据可知，K101，K105，K120，K121，K122，K134，K135，K139和K141在7种盐离子中对铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌和MRSA这三种细菌的平均最小抑菌浓度均小于K3，尤其K122的平均最小抑菌浓度为4.95μg/mL，表明受试物有高度的盐耐受性，这7种盐离子的加入对化合物的抗菌活性有一定的促进作用。受试物K101，K105，K120，K121，K122，K134，K135，K139和K141在盐溶液中抗菌活性增强，治疗指数升高。

2.血清稳定性

昆明小鼠麻醉后取血，全血8000rpm/min离心30min，吸取上层血清备用。称取适量受试物，配制成浓度为10mM的母液，将受试物与小鼠血清按照1：4(V:V)混匀后37℃孵育，分别在不同时间点(0h、0.5h、1h、2h、4h、6h)取样70μL，立即加入等体积冰乙腈，涡旋震荡后冰上静置10min。样品13000g离心15min，收集上清。RP-HPLC以5％-95％乙腈/去离子水梯度洗脱30min，检测220nm处的吸收峰，记录受试物峰面积并与0h受试物峰面积进行比较，计算不同时间点受试物在血清中的残留率(图4)和半衰期(表7)。

图4是受试物与血清孵育0.5h，1h，2h，4h和6h，受试物在血清中的残留率，与母肽FK3相比，受试物与血清孵育不同时间后，在血清中的残留率均高于FK3，受试物血清稳定性提高。

表7、实施例2受试物半衰期：

表7为受试物的半衰期，结果显示，与母肽FK3相比，受试物血清稳定性均有所提高。

实施例6、将实施例2得到的FK3、K101、K120、K121、K122、K124、K134和K135作为受试物进行体外抗生物膜活性实验

选用铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和MRSA，检测受试物对细菌生物膜的抑制活性。

用营养肉汤培养基将细菌在37℃恒温摇床中培养至对数生长期，并用TSBG培养基将其稀释成1.0×10⁶CFU/mL的细菌悬液。用TSBG培养基将受试物二倍稀释为4-64μg/mL的浓度梯度，多粘菌素B作为抗生素对照。在96孔板中分组加样：实验组中加入等体积不同浓度的多肽药物和细菌悬液，阳性对照组加入等体积TSBG培养基和细菌悬液，阴性对照组加入TSBG培养基，放入37℃恒温培养箱中培养24h以形成生物膜。取出96孔板，移去表面的浮游细菌并用PBS缓冲液轻柔清洗，用无水甲醇固定15min，晾干后加入0.1％的结晶紫染液将生物膜染色15min，除去结晶紫染液，用去离子水清洗2-3遍，最后加入95％的乙醇放置15min，检测595nm处的吸光值。

生物膜形成抑制率(％)＝[1-(实验组OD₅₉₅-阴性对照组OD₅₉₅)/(阳性对照组OD₅₉₅-阴性对照组OD₅₉₅)]×100％。

图5为实施例6中浓度为4-64μg/mL的FK3、K101、K120、K121、K122、K124、K134和K135对细菌生物膜形成抑制率；

图5A为受试物对铜绿假单胞菌生物膜形成抑制率；

图5B为受试物对金黄色葡萄球菌生物膜形成抑制率；

图5C为受试物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生物膜形成抑制率；

图5D为受试物对表皮葡萄球菌的生物膜形成抑制率；

由图可知，与母肽FK3相比，K101，K120，K122对上述四种细菌的抗生物膜活性提高。多粘菌素B能够显著抑制铜绿假单胞菌的生物膜形成，但对革兰氏阳性菌的抗生物膜活性很弱，而化合物K101、K120、K121、K122、K124、K134和K135，尤其是K122均能够显著抑制铜绿假单胞菌及三种革兰氏阳性菌的生物膜形成，有很强的抗生物膜活性。

实施例7、将实施例2得到的K122作为受试物进行体外抗生物膜持留菌活性实验

选用铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和MRSA，检测K122对细菌生物膜持留细菌的抗菌活性。

将对数生长期的细菌用TSBG培养基稀释至1×10⁸CFU/mL，每孔200μL铺于96孔板中，在37℃下孵育24h形成生物膜。用PBS洗涤两次除去浮游细菌，将生物膜暴露于200μLTSBG培养基稀释的高浓度抗生素中，在37℃中培养24h。用PBS洗涤两次去除浮游细菌，超声5min将附着的细菌转移到100μL PBS中，随后将细菌暴露于2×MIC和4×MIC的K122中，PBS作为对照组。在37℃下培养0.5h、1h、2h、4h和6h后，涂布平板确定活细菌的数量。

铜绿假单胞菌用100×MIC即50μg/mL的头孢他啶处理；金黄色葡萄球菌用100×MIC即12.5μg/mL的阿莫西林处理；MRSA用100×MIC即50μg/mL的万古霉素处理；表皮葡萄球菌用100×MIC即50μg/mL的万古霉素处理。

图6为实施例7中受试物K122细菌生物膜持留细菌的抗菌活性；

图6A为K122对铜绿假单胞菌生物膜持留细菌的抗菌活性；

图6B为K122对金黄色葡萄球菌生物膜持留细菌的抗菌活性；

图6C为K122对MRSA生物膜持留细菌的抗菌活性；

图6D为K122对表皮葡萄球菌生物膜持留细菌的抗菌活性。

由图可知，细菌生物膜经过高浓度的抗生素处理后，有大量生物膜细菌存活，高浓度的抗生素无法杀死生物膜持留细菌。K122对持留细菌具有显著的杀菌能力。2×MIC和4×MIC的K122分别在1h和0.5h内杀死表皮葡萄球菌持留细菌，能够在2h和1h内杀死铜绿假单胞菌持留细菌，对金黄色葡萄球菌和MRSA生物膜持留细菌的杀菌速度较慢，但是杀菌效果仍然显著。

实施例8、将实施例2得到的K122作为受试物进行杀菌动力学实验

选用铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和MRSA，检测K122对细菌的快速杀菌能力。检测4×MIC抗生素亚胺培南，头孢他啶，氨曲南和多粘菌素B对铜绿假单胞菌的杀菌能力；4×MIC抗生素万古霉素，达托霉素，阿莫西林，亚胺培南，多粘菌素B对金黄色葡萄球菌的杀菌能力，比较K122和抗生素在短时间内对细菌的杀菌效果。

对数生长期细菌在MH液体培养基稀释至1.0×10⁶CFU/mL。用MH培养基将受试物K122稀释为终浓度为1×MIC，2×MIC，4×MIC。将抗生素稀释至终浓度为4×MIC。将K122/抗生素与菌液等体积混匀，在37℃恒温培养箱中培养，分别在不同的时间间隔(0h，0.5h，1h，2h，3h，6h，8h和24h)取出适量菌液，用MH培养基稀释适当倍数，均匀涂布于MH固体培养基。将MH固体平板放于37℃恒温培养箱中过夜培养，记录各琼脂平板生长的菌落数。

图7为实施例8中1×MIC，2×MIC，4×MIC K122和4×MIC抗生素对细菌的杀菌能力；

图7A为K122对铜绿假单胞菌的杀菌能力；

图7B为K122对金黄色葡萄球菌的杀菌能力；

图7C为K122对大肠埃希菌的杀菌能力；

图7D为K122对MRSA的杀菌能力；

图7E为抗生素亚胺培南，头孢他啶，氨曲南和多粘菌素B对铜绿假单胞菌的杀菌能力结果图；

图7F为抗生素万古霉素，达托霉素，阿莫西林，亚胺培南，多粘菌素B对金黄色葡萄球菌的杀菌能力。

由图可知，K122对革兰氏阴性菌的杀菌时间很快，4×MIC浓度下能够在5min内杀死铜绿假单胞菌。相比之下对革兰氏阳性菌的杀菌时间较慢，4×MIC浓度下能够在1h内杀死金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，在2.5h杀死耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。与K122相比，抗生素杀菌能力较慢，多粘菌素B能在0.5h内杀死铜绿假单胞菌，6h内杀死金黄色葡萄球菌，万古霉素、阿莫西林、亚胺培南、达托霉素、头孢他啶和氨曲南的杀菌速度也远低于K122。

实施例9、将实施例2得到的K122作为受试物进行诱导耐药实验

选取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和MRSA，检测K122和多种对照抗生素对细菌的诱导耐药能力。

对铜绿假单胞菌选用的对照抗生素为多粘菌素B，头孢他啶，亚胺培南和氨曲南；对金黄色葡萄球菌选用的对照抗生素为阿莫西林，万古霉素和多粘菌素B；对MRSA选用的对照抗生素为万古霉素和多粘菌素B，对表皮葡萄球菌选用的对照抗生素为万古霉素和多粘菌素B。

用MH液体培养基将对数期细菌稀释成1.0×10⁶CFU/mL的细菌悬液。用MH液体培养基将K122和抗生素二倍稀释为0.125-128μg/mL的药物浓度，检测K122和抗生素的最小抑菌浓度。吸取亚抑制浓度的菌液，加入3mL营养肉汤培养基中培养到细菌生长的对数生长期，用MH液体培养基稀释至1.0×10⁶CFU/mL。再次检测每组药物的最小抑菌浓度。重复此过程，连续实验20天，记录结果。

图8是实施例9中受试物K122和对照抗生素对细菌的诱导耐药能力；

图8A是K122，多粘菌素B，头孢他啶，亚胺培南和氨曲南对铜绿假单胞菌的诱导耐药能力；

图8B是K122，阿莫西林，万古霉素和多粘菌素B对金黄色葡萄球菌的诱导耐药能力；

图8C是K122，万古霉素和多粘菌素B对MRSA的诱导耐药能力；

图8D是K122，万古霉素和多粘菌素B对表皮葡萄球菌的诱导耐药能力；

由图可知，连续20天诱导后，K122对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度降低为之前的0.5倍，对金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的最小抑菌浓度增长为之前的2倍，K122不易诱导细菌产生耐药性。抗生素容易诱导细菌产生耐药性，头孢他啶对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度增长了256倍；阿莫西林对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度增长了4096倍；针对MRSA有良好抗菌活性的万古霉素的最小抑菌浓度也增长了4倍。

实施例10、将实施例2得到的K122作为受试物进行小鼠肺部感染实验

将56只雌性C57BL/6J小鼠(8周龄，体重约18g，购自兰州大学动物实验中心)，随机分为7组，每组8只，分别是正常组、模型组、K122实验组(2.5mg/kg)、K122实验组(5mg/kg)、K122实验组(10mg/kg)、多粘菌素B实验组(5mg/kg)、头孢他啶实验组(5mg/kg)。

肺部感染模型建立：C57BL/6J小鼠经腹腔注射1％戊巴比妥钠溶液(50mg/kg)麻醉后，75％酒精对小鼠颈部皮肤消毒，无菌手术器械切开皮肤约1cm，钝性分离肌肉使气管暴露，气管内注射40μL铜绿假单胞菌(5×10⁶CFU/mL)诱导肺部细菌感染，正常组小鼠气管滴注40μL无菌生理盐水。细菌感染1h后，模型组小鼠腹腔注射生理盐水，实验组小鼠腹腔注射相应化合物，细菌感染24h和48h后分别给药1次。72h后，小鼠安乐死，取出全部肺部组织。部分肺部组织称量后用PBS匀浆，计算肺部组织中细菌负荷。部分肺部组织H&E染色后进行病理观察。

图9为实施例10中治疗3天后，正常组，模型组，实验组K122(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)，实验组头孢他啶(5mg/kg)和实验组多粘菌素B(5mg/kg)中小鼠肺部细菌感染情况；

图9A为正常组、模型组和实验组小鼠体重变化。小鼠在手术后24小时内体重下降，72小时内体重上升。模型组小鼠体重急剧下降，正常组和实验组小鼠体重下降程度减弱。

图9B为小鼠经3天治疗后，正常组、模型组和实验组肺部组织图片和肺部组织匀浆后组织液和稀释100倍的组织液在MH固体平板上细菌生长图片。正常组中没有细菌生长，实验组K122(2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg)，实验组头孢他啶(5mg/kg)和实验组多粘菌素B(5mg/kg)与模型组相比，平板中细菌数目显著减少。

图9C为小鼠经3天治疗后，正常组、模型组和实验组肺部组织的细菌负荷。模型组小鼠肺部组织的细菌量为6.4×10³CFU/mg，K122组2.5mg/kg，5mg/kg和10mg/kg剂量组治疗后，肺部组织的细菌量分别减少为3.0×10³CFU/mg，2.8×10³CFU/mg和1.4×10³CFU/mg，与对照组相比显著减少小鼠肺部组织中的细菌负荷(***P<0.001)。10mg/kg的K122治疗效果最为显著。5mg/kg头孢他啶的治疗效果与2.5mg/kg K122组的治疗效果相当。5mg/kg的多粘菌素B对小鼠肺部感染治疗效果显著(***P<0.001)，与10mg/kg K122的作用相当。

图9D为小鼠经3天治疗后，正常组、模型组和实验组小鼠肺部组织病理切片HE染色结果。模型组小鼠肺部组织呈现弥漫性炎性细胞浸润，肺泡严重塌陷，肺泡囊收缩，肺泡隔膜增厚。经K122、头孢他啶和多粘菌素B治疗后，肺泡有效扩张，炎性细胞减少，炎症反应明显减轻。与头孢他啶和多粘菌素B相比，10mg/kg K122对小鼠肺组织损伤的改善作用更加明显。

图9E是为小鼠经3天治疗后，正常组、模型组和实验组小鼠肺部组织中炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的分泌情况。模型组小鼠肺部组织中IL-1β，IL-6和TNF-α的含量与正常组相比显著升高。K122，头孢他啶和多粘菌素B治疗后，肺部组织中这三种炎症因子的含量与模型组相比显著降低(***P＜0.001，**P＜0.01)，与正常组中炎症因子的含量没有显著性差异。

由以上结果可知，本申请的化合物K101，K120，K121，K122，K124，K134和K135有良好的抗菌和抗生物膜活性，稳定性和生物利用度高，另外，10mg/kg K122对小鼠肺部感染的治疗效果明显高于头孢他啶(*P＜0.05)，且对肺组织损伤的改善效果较头孢他啶和多粘菌素B更加明显。

以上，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (4)

1.FK3多肽类似物，其特征在于，所述FK3多肽类似物为如下化合物中的任一种：化合物K101：

化合物K120：

化合物K121：

化合物K122：

化合物K124：

化合物K134：

化合物K135：

2.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的FK3多肽类似物和药学上可接受的载体或辅料。

3.权利要求1所述的FK3多肽类似物在制备预防或治疗耐药细菌感染的药物中的应用。

4.权利要求1所述的FK3多肽类似物在制备预防或治疗生物膜感染的药物中的应用。

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