CN113024634B - 类肽化合物及其在制备抗生素中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种类肽化合物及其在制备抗生素中的应用。该化合物的化学式如式(Ⅰ)。式(Ⅰ)中，R1为H，供电子取代基，或通过连接基团L1与母核连接的供电子取代基、芳环取代基或芳杂环取代基；R2为供电子取代基，或通过连接基团L2与母核连接的供电子取代基、芳环取代基或芳杂环取代基。本发明首次发现了一种新颖的四肽母核结构，进一步基于该四肽母核结构的化学改造获得了一系列广谱抗菌、强效、安全且不易诱导耐药的类肽化合物。经测试，这些类肽化合物表现出广谱抗菌效果，而且具有较低的细胞毒性，为抗生素的开发提供新的选择。

Description

类肽化合物及其在制备抗生素中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种类肽化合物及其在制备抗生素中的应用。
背景技术
细菌耐药的快速演化与传播导致了全球性的抗生素危机，严重威胁了人类的生命健康及全球公共卫生。据估计，到2050年，每年将会有一千万人死于耐药菌感染。由于抗生素的滥用以及漫长的研发周期，目前临床上可以用到的抗生素均产生了相应的耐药株。
比如，泰能是一种强效的碳青霉烯类广谱抗生素，是重症监护室中的一线抗菌用药，目前主要用于治疗革兰氏阴性细菌所导致的脓毒症以及肺炎。然而耐碳青霉烯病原菌，包括耐碳青霉烯的肠科杆菌(CRE)、耐碳青霉烯的肺炎克雷伯杆菌(CR-K.pneumoniae)以及耐碳青霉烯的铜绿假单胞菌(CR-P.aeruginosa)等耐药株的出现，极大地提高了相应疾病的死亡率。
又如，多粘菌素B(PMB)是一种环多肽类的抗生素，具有强效的抗革兰氏阴性细菌的活性，但对于革兰氏阳性菌的活性十分微弱。作为临床最终一线的抗生素，PMB目前被我国用于防治COVID-19重症病人的院内获得性细菌感染，这种院内获得性的细菌感染也是导致COVID-19病人死亡的重要原因。尽管如此，耐PMB病原菌的出现和传播，以及PMB本身较强的肾毒性和神经毒性，均大大限制了PMB的应用。
因此，进一步开发高效低毒、不易诱导耐药且具有新颖母核结构的抗生素具有重要的意义和价值。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种类肽化合物及其在制备抗生素中的应用，该类肽化合物不仅具有强效广谱抗菌特性，而且不易诱导耐药。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种类肽化合物，其特征在于，结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002957230620000021
式(Ⅰ)中，R1为H，供电子取代基，或通过连接基团L1与母核连接的供电子取代基、芳环取代基或芳杂环取代基；
R2为供电子取代基，或通过连接基团L2与母核连接的供电子取代基、芳环取代基或芳杂环取代基。
本发明首次从人α防御素5全长结构中鉴定并发现了一种新颖的四肽母核结构(R1为H且R2为NH2)，进一步基于该四肽母核结构作化学改造获得了一系列广谱抗菌、强效、安全且不易诱导耐药的类肽化合物。经测试，该类肽化合物对MRSA(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus)、S.aureus、Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa和Acinetobacter baumannii均具有优异的抗菌效果，而且具有较低的细胞毒性，为抗生素的开发提供新的选择。
基于此，本发明还提供了所述的类肽化合物在制备抗生素中的应用，所述的抗生素用于抗MRSA、S.aureus、E.coli、K.pneumoniae、P.aeruginosa和A.baumannii中的至少一种。
本发明还提供了一种抗生素，该抗生素的有效成分包括上述的类肽化合物，或其药学上可接受的盐、溶剂化物或前药。
在上述的类肽化合物中，作为R1的所述的供电子取代基为
Figure BDA0002957230620000022
作为R2的所述的供电子取代基为-NH2、
Figure BDA0002957230620000023
其中，X1为卤素原子。
在上述的类肽化合物中，所述的通过连接基团L1与母核连接的供电子取代基为
Figure BDA0002957230620000024
所述的通过连接基团L2与母核连接的供电子取代基为
Figure BDA0002957230620000025
其中，n＝8-21。
在上述的类肽化合物中，所述的通过连接基团L1与母核连接的芳环取代基为：
Figure BDA0002957230620000031
所述的通过连接基团L2与母核连接的芳环取代基为：
Figure BDA0002957230620000032
Figure BDA0002957230620000033
其中，X2为任意取代基。
在上述的类肽化合物中，所述的通过连接基团L1与母核连接的芳杂环取代基为：
Figure BDA0002957230620000034
所述的通过连接基团L2与母核连接的芳杂环取代基为：
Figure BDA0002957230620000035
Figure BDA0002957230620000036
其中，Y1和Y2各自独立地为S、O或N，X3和X4为任意取代基。
在上述的类肽化合物中，所述的连接基团L1通过酰胺键与母核连接，所述的连接基团L2通过酰胺键与母核连接。
作为优选，在上述的类肽化合物中，所述的连接基团L1为甘氨酸、β-丙氨酸或赖氨酸残基，所述的连接基团L2为赖氨酸残基。
作为优选，在上述的类肽化合物中，所述的R1为：-H、
Figure BDA0002957230620000037
Figure BDA0002957230620000038
Figure BDA0002957230620000039
Figure BDA0002957230620000041
所述的R2为：-NH2、
Figure BDA0002957230620000042
Figure BDA0002957230620000043
其中，X1为卤素原子，n＝8-21。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明首次从人α防御素5全长结构中鉴定并发现了一种新颖的四肽母核结构(R1为H且R2为NH2)，进一步基于该四肽母核结构作化学改造获得了一系列广谱抗菌、强效、安全且不易诱导耐药的类肽化合物。经测试，该化合物A对MRSA、S.aureus、E.coli、K.pneumoniae、P.aeruginosa和A.baumannii均具有优异的抗菌效果，而且具有较低的细胞毒性，为抗生素的开发提供新的选择。
附图说明
图1为本发明类肽化合物1的质谱分析结果；
图2为本发明类肽化合物1的液相色谱分析结果；
图中，Time(min)表示出峰时间(分钟)，Intensity(mv)表示电信号强度(毫伏)，下同；
图3为本发明类肽化合物2的质谱分析结果；
图4为本发明类肽化合物2的液相色谱分析结果；
图5为本发明类肽化合物3的质谱分析结果；
图6为本发明类肽化合物3的液相色谱分析结果；
图7为本发明类肽化合物4的质谱分析结果；
图8为本发明类肽化合物4的液相色谱分析结果；
图9为本发明类肽化合物5的质谱分析结果；
图10为本发明类肽化合物5的液相色谱分析结果；
图11为本发明类肽化合物6的质谱分析结果；
图12为本发明类肽化合物6的液相色谱分析结果；
图13为本发明类肽化合物7的质谱分析结果；
图14为本发明类肽化合物7的液相色谱分析结果；
图15为本发明类肽化合物8的质谱分析结果；
图16为本发明类肽化合物8的液相色谱分析结果；
图17为本发明类肽化合物9的质谱分析结果；
图18为本发明类肽化合物9的液相色谱分析结果；
图19为本发明类肽化合物4和9以及市售抗生素泰能诱导大肠杆菌(E.coli)耐药性实验结果；
其中，Compound 4表示类肽化合物4，Compound 9表示类肽化合物9，Tienam表示泰能，MIC Fold Change表示最低抑菌浓度差异倍数，Time(days)表示时间(天数)，下同；
图20为本发明类肽化合物4和9以及市售抗生素万古霉素诱导金黄色葡萄球菌(S.aureus)耐药性实验结果；
其中，Vancomycin表示万古霉素；
图21为本发明类肽化合物4和9及市售抗生素多粘菌素B治疗腹膜炎脓毒症小鼠生存率结果；
其中，Vehicle表示药物溶剂，PMB表示多粘菌素B，Survival(％)表示生存率(％)，Time(h)表示时间(小时)，****表示与Vehicle组相比存在显著差异(p＜0.0001)，下同；
图22为本发明类肽化合物4和9及市售抗生素多粘菌素B治疗肺炎克雷伯杆菌(K.pneumoniae)诱导的肺炎小鼠生存率结果；
其中，*表示与Vehicle组相比存在显著差异(p＜0.05)，***表示与Vehicle组相比存在显著差异(p＜0.001)，下同；
图23为本发明类肽化合物4和9及市售抗生素多粘菌素B治疗金黄色葡萄球菌(S.aureus)诱导的肺炎小鼠生存率结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1基于分子对接的先导化合物发现及结构优化
通过多个分子对接程序(包括ZDOCK程序和DockThor程序)，模拟了人α防御素5的晶体结构(PDB编号：1ZMP)与其抗菌靶标分子外膜蛋白A和脂质Ⅱ的相互作用范式，使用HawkDock MM/GBSA程序对所得到的复合物结构进行相互作用分析。最后，通过观察人α防御素5与其分子靶标的相互作用构象和关键氨基酸的相互作用，最终鉴定出了人α防御素5全长结构中潜在的药效团结构域，将该药效团结构基序作为先导化合物的母核结构用于结构修饰与优化。通过结构修饰获得了9种类肽化合物，见表1。
表1
Figure BDA0002957230620000061
Figure BDA0002957230620000071
委托上海楚肽生物有限公司合成上述九个类肽化合物。
实施例2化合物1(compound 1)的合成
采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相合成法合成该化合物1，包括以下步骤：
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂投料于固相合成反应管中，加入二氯甲烷(DCM)，振荡30分钟溶胀树脂；
(2)抽去固相合成反应管中的二氯甲烷，而后加入过量的Fmoc保护的精氨酸，随后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，接着加入过量的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡1h，最后用甲醇封闭，抽去DMF；
(3)向固相合成反应管中加入20％piperidine-DMF脱保护液，充分振荡后去掉反应液，并再次加入脱保护液，充分振荡，而后抽去脱保护液，取少量树脂，采用印三酮法检测反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(4)向固相合成反应管中加入过量的Fmoc保护的酪氨酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时，而后取少量树脂用印三酮法检测缩合反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(5)重复步骤(3)和(4)，依次将过量的Fmoc保护的亮氨酸、Fmoc保护的精氨酸加入到固相合成反应管中，直至所有氨基酸脱水缩合完毕；
(6)肽链组装完毕之后，重复步骤(3)脱去多肽链N端的Fmoc保护基团；
(7)向固相合成反应管中加入含95％TFA，1％水，2％乙二硫醇和2％三异丙基硅烷的切割剂，切割1.5-2.5h后，将多肽C端的羧基酰胺化，即获得目标粗品；采用反相高效液相色谱对目标粗品进行纯化，最终获得本实施例的化合物1。
该化合物1的质谱分析结果见图1，液相色谱分析结果见图2。
实施例3化合物2(compound 2)的合成
采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相合成法合成该化合物1，包括以下步骤：
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂投料与固相合成反应管中，加入二氯甲烷(DCM)，振荡30分钟溶胀树脂；
(2)抽去固相合成反应管中的二氯甲烷后，加入过量的Fmoc保护的精氨酸，随后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，接着加入过量的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡1h，最后用甲醇封闭，抽去DMF；
(3)向固相合成反应管中加入20％piperidine-DMF脱保护液，充分振荡后去掉反应液，并再次加入脱保护液，充分振荡，而后抽去脱保护液，取少量树脂，采用印三酮法检测反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(4)向固相合成反应管中加入过量的Fmoc保护的酪氨酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时。取少量树脂用印三酮法检测缩合反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(5)重复步骤(3)和(4)，依次将过量的Fmoc保护的亮氨酸、Fmoc保护的精氨酸、Fmoc保护的甘氨酸加入到固相合成反应管中，直至所有氨基酸脱水缩合完毕；
(6)肽链组装完毕之后，重复步骤(3)脱去多肽链N端的Fmoc保护基团；
(7)重复步骤(4)，将棕榈酸的羧基与多肽链N端的氨基脱水缩合；
(8)向固相合成反应管中加入含95％TFA，1％水，2％乙二硫醇和2％三异丙基硅烷的切割剂，切割1.5-2.5h后，将多肽C端的羧基酰胺化，即获得目标粗品；采用反相高效液相色谱对目标粗品进行纯化，最终获得本实施例的化合物2。
该化合物2的质谱分析结果见图3，液相色谱分析结果见图4。
实施例4化合物3(compound 3)的合成
采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相合成法合成该化合物3，包括以下步骤：
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂投料与固相合成反应管中，加入二氯甲烷(DCM)，振荡30分钟溶胀树脂；
(2)抽去固相合成反应管中的二氯甲烷后，加入过量的Fmoc保护的精氨酸，随后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，接着加入过量的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡1h，最后用甲醇封闭，抽去DMF；
(3)向固相合成反应管中加入20％piperidine-DMF脱保护液，充分振荡后去掉反应液，并再次加入脱保护液，充分振荡，而后抽去脱保护液，取少量树脂，采用印三酮法检测反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(4)向固相合成反应管中加入过量的Fmoc保护的酪氨酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时。取少量树脂用印三酮法检测缩合反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(5)重复步骤(3)和(4)，依次将过量的Fmoc保护的亮氨酸、Fmoc保护的精氨酸、Fmoc保护的甘氨酸加入到固相合成反应管中，直至所有氨基酸脱水缩合完毕；
(6)肽链组装完毕之后，重复步骤(3)脱去多肽链N端的Fmoc保护基团；
(7)重复步骤d)，将月桂酸的羧基与多肽链N端的氨基脱水缩合；
(8)向固相合成反应管中加入含95％TFA，1％水，2％乙二硫醇和2％三异丙基硅烷的切割剂，切割1.5-2.5h后，将多肽C端的羧基酰胺化，即获得目标粗品；采用反相高效液相色谱对目标粗品进行纯化，最终获得本实施例的化合物3。
该化合物3的质谱分析结果见图5，液相色谱分析结果见图6。
实施例5化合物4(compound 4)的合成
采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相合成法合成该化合物4，包括以下步骤：
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂投料与固相合成反应管中，加入二氯甲烷(DCM)，振荡30分钟溶胀树脂；
(2)抽去固相合成反应管中的二氯甲烷后，加入过量的Fmoc保护的精氨酸，随后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，接着加入过量的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡1h，最后用甲醇封闭，抽去DMF；
(3)向固相合成反应管中加入20％piperidine-DMF脱保护液，充分振荡后去掉反应液，并再次加入脱保护液，充分振荡，而后抽去脱保护液，取少量树脂，采用印三酮法检测反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(4)向固相合成反应管中加入过量的Fmoc保护的酪氨酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时。取少量树脂用印三酮法检测缩合反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(5)重复步骤(3)和(4)，依次将过量的Fmoc保护的亮氨酸、Fmoc保护的精氨酸、Fmoc保护的甘氨酸加入到固相合成反应管中，直至所有氨基酸脱水缩合完毕；
(6)肽链组装完毕之后，重复步骤(3)脱去多肽链N端的Fmoc保护基团；
(7)重复步骤(4)，将肉豆蔻酸的羧基与多肽链N端的氨基脱水缩合；
(8)向固相合成反应管中加入含95％TFA，1％水，2％乙二硫醇和2％三异丙基硅烷的切割剂，切割1.5-2.5h后，将多肽C端的羧基酰胺化，即获得目标粗品；采用反相高效液相色谱对目标粗品进行纯化，最终获得本实施例的化合物4。
该化合物4的质谱分析结果见图7，液相色谱分析结果见图8。
实施例6化合物5(compound 5)的合成
采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相合成法合成该化合物4，包括以下步骤：
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂投料与固相合成反应管中，加入二氯甲烷(DCM)，振荡30分钟溶胀树脂；
(2)抽去固相合成反应管中的二氯甲烷后，加入过量的Fmoc保护的精氨酸，随后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，接着加入过量的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡1h，最后用甲醇封闭，抽去DMF；
(3)向固相合成反应管中加入20％piperidine-DMF脱保护液，充分振荡后去掉反应液，并再次加入脱保护液，充分振荡，而后抽去脱保护液，取少量树脂，采用印三酮法检测反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(4)向固相合成反应管中加入过量的Fmoc保护的酪氨酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时。取少量树脂用印三酮法检测缩合反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(5)重复步骤(3)和(4)，依次将过量的Fmoc保护的亮氨酸、Fmoc保护的精氨酸、Fmoc保护的甘氨酸加入到固相合成反应管中，直至所有氨基酸脱水缩合完毕；
(6)肽链组装完毕之后，重复步骤(3)脱去多肽链N端的Fmoc保护基团；
(7)重复步骤(4)，将2-(4-(叔-丁基)苯基)-4-甲基嘧啶-5-羧酸的羧基与多肽链N端的氨基脱水缩合；
(8)向固相合成反应管中加入含95％TFA，1％水，2％乙二硫醇和2％三异丙基硅烷的切割剂，切割1.5-2.5h后，将多肽C端的羧基酰胺化，即获得目标粗品；采用反相高效液相色谱对目标粗品进行纯化，最终获得本实施例的化合物5。
该化合物5的质谱分析结果见图9，液相色谱分析结果见图10。
实施例7化合物6(compound 6)的合成
采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相合成法合成该化合物6，包括以下步骤：
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂投料与固相合成反应管中，加入二氯甲烷(DCM)，振荡30分钟溶胀树脂；
(2)抽去固相合成反应管中的二氯甲烷后，加入过量的Fmoc保护的精氨酸，随后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，接着加入过量的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡1h，最后用甲醇封闭，抽去DMF；
(3)向固相合成反应管中加入过量的2-(4-(叔-丁基)苯基)-4-甲基嘧啶-5-羧酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时，使其偶联到赖氨酸的ε-氨基上；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(4)向固相合成反应管中加入20％piperidine-DMF脱保护液，充分振荡后去掉反应液，并再次加入脱保护液，充分振荡，而后抽去脱保护液，取少量树脂，采用印三酮法检测反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(5)向固相合成反应管中加入过量的Fmoc保护的精氨酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时。取少量树脂用印三酮法检测缩合反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(6)重复步骤(4)和(5)，依次将过量的Fmoc保护的酪氨酸、Fmoc保护的亮氨酸、Fmoc保护的精氨酸、Fmoc保护的甘氨酸加入到固相合成反应管中，直至所有氨基酸脱水缩合完毕；
(7)肽链组装完毕之后，重复步骤(4)脱去多肽链N端的Fmoc保护基团；
(8)重复步骤(5)，将肉豆蔻酸的羧基与多肽链N端的氨基脱水缩合；
(9)向固相合成反应管中加入含95％TFA，1％水，2％乙二硫醇和2％三异丙基硅烷的切割剂，切割1.5-2.5h后，将多肽C端的羧基酰胺化，即获得目标粗品；采用反相高效液相色谱对目标粗品进行纯化，最终获得本实施例的化合物6。
该化合物6的质谱分析结果见图11，液相色谱分析结果见图12。
实施例8化合物7(compound 7)的合成
采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相合成法合成该化合物7，包括以下步骤：
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂投料与固相合成反应管中，加入二氯甲烷(DCM)，振荡30分钟溶胀树脂；
(2)抽去固相合成反应管中的二氯甲烷后，加入过量的Fmoc保护的精氨酸，随后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，接着加入过量的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡1h，最后用甲醇封闭，抽去DMF；
(3)向固相合成反应管中加入过量的(4-(氯磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁酯和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时，使其偶联到赖氨酸的ε-氨基上；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(4)向固相合成反应管中加入20％piperidine-DMF脱保护液，充分振荡后去掉反应液，并再次加入脱保护液，充分振荡，而后抽去脱保护液，取少量树脂，采用印三酮法检测反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(5)向固相合成反应管中加入过量的Fmoc保护的精氨酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时。取少量树脂用印三酮法检测缩合反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(6)重复步骤(4)和(5)，依次将过量的Fmoc保护的酪氨酸、Fmoc保护的亮氨酸、Fmoc保护的精氨酸、Fmoc保护的甘氨酸加入到固相合成反应管中，直至所有氨基酸脱水缩合完毕；
(7)肽链组装完毕之后，重复步骤(4)脱去多肽链N端的Fmoc保护基团；
(8)重复步骤(5)，将肉豆蔻酸的羧基与多肽链N端的氨基脱水缩合；
(9)向固相合成反应管中加入含95％TFA，1％水，2％乙二硫醇和2％三异丙基硅烷的切割剂，切割1.5-2.5h后，将多肽C端的羧基酰胺化，即获得目标粗品；采用反相高效液相色谱对目标粗品进行纯化，最终获得本实施例的化合物7。
该化合物7的质谱分析结果见图13，液相色谱分析结果见图14。
实施例9化合物8(compound 8)的合成
采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相合成法合成该化合物7，包括以下步骤：
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂投料与固相合成反应管中，加入二氯甲烷(DCM)，振荡30分钟溶胀树脂；
(2)抽去固相合成反应管中的二氯甲烷后，加入过量的Fmoc保护的精氨酸，随后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，接着加入过量的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡1h，最后用甲醇封闭，抽去DMF；
(3)向固相合成反应管中加入过量的肉豆蔻酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时，使其偶联到赖氨酸的ε-氨基上；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(4)向固相合成反应管中加入20％piperidine-DMF脱保护液，充分振荡后去掉反应液，并再次加入脱保护液，充分振荡，而后抽去脱保护液，取少量树脂，采用印三酮法检测反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(5)向固相合成反应管中加入过量的Fmoc保护的精氨酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时；取少量树脂用印三酮法检测缩合反应是否完成，待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(6)重复步骤(4)和(5)，依次将过量的Fmoc保护的酪氨酸、Fmoc保护的亮氨酸、Fmoc保护的精氨酸、Fmoc保护的甘氨酸加入到固相合成反应管中，直至所有氨基酸脱水缩合完毕；
(7)肽链组装完毕之后，重复步骤(4)脱去多肽链N端的Fmoc保护基团；
(8)重复步骤(5)，将(4-(氯磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的磺酰基与多肽链N端的氨基缩合；
(9)向固相合成反应管中加入含95％TFA，1％水，2％乙二硫醇和2％三异丙基硅烷的切割剂，切割1.5-2.5h后，将多肽C端的羧基酰胺化，即获得目标粗品；采用反相高效液相色谱对目标粗品进行纯化，最终获得本实施例的化合物8。
该化合物8的质谱分析结果见图15，液相色谱分析结果见图16。
实施例10化合物9(compound 9)的合成
采用9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)固相合成法合成该化合物7，包括以下步骤：
(1)将2-氯三苯甲基氯树脂投料与固相合成反应管中，加入二氯甲烷(DCM)，振荡30分钟溶胀树脂；
(2)抽去固相合成反应管中的二氯甲烷后，加入过量的Fmoc保护的精氨酸，随后加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)充分溶解，接着加入过量的二异丙基乙胺(DIEA)，振荡1h，最后用甲醇封闭，抽去DMF；
(3)向固相合成反应管中加入过量的棕榈酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时，使其偶联到赖氨酸的ε-氨基上；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(4)向固相合成反应管中加入20％piperidine-DMF脱保护液，充分振荡后去掉反应液，并再次加入脱保护液，充分振荡，而后抽去脱保护液，取少量树脂，采用印三酮法检测反应是否完成；待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(5)向固相合成反应管中加入过量的Fmoc保护的精氨酸和HBTU，同时加入少量DMF溶解，并立即加入过量的DIEA，反应0.5小时；而后取少量树脂用印三酮法检测缩合反应是否完成，待反应完成后用DMF和DCM间歇洗涤树脂；
(6)重复步骤(4)和(5)，依次将过量的Fmoc保护的酪氨酸、Fmoc保护的亮氨酸、Fmoc保护的精氨酸、Fmoc保护的甘氨酸加入到固相合成反应管中，直至所有氨基酸脱水缩合完毕；
(7)肽链组装完毕之后，重复步骤(4)脱去多肽链N端的Fmoc保护基团；
(8)重复步骤(5)，将(4-(氯磺酰基)苯基)氨基甲酸叔丁酯的磺酰基与多肽链N端的氨基缩合；
(9)向固相合成反应管中加入含95％TFA，1％水，2％乙二硫醇和2％三异丙基硅烷的切割剂，切割1.5-2.5h后，将多肽C端的羧基酰胺化，即获得目标粗品；采用反相高效液相色谱对目标粗品进行纯化，最终获得本实施例的化合物9。
该化合物9的质谱分析结果见图17，液相色谱分析结果见图18。
实施例11体外抗菌活性测定
使用虚拟克隆计数法测定实施例2-10所获得化合物的体外抗菌活性。
测试方法为：
(1)吸取5μL受试菌株(包括S.aureus ATCC25923，MRSA ATCC43300，E.coliATCC25922，K.pneumoniae ATCC13883，P.aeruginosa ATCC27853，A.baumanniiATCC17978)的冻存菌液于5mL液体LB培养基中，置于37℃恒温摇床200rpm培养至对数期，4000rpm离心洗涤，将菌液浓度调整至5×105CFU/mL；
(2)在透明96孔板内每孔加入50μL菌液，并同时加入50μL待测药物，使药物终浓度为0.195μM-100μM；
(3)置于37℃恒温培养箱内孵育2h，而后每孔加入100μL 2×LB液体培养基，充分混匀后，置于多功能酶标仪中，设置检测波长为600nm，于37℃下过夜动态监测OD值，从而得到每孔细菌的生长曲线；
(4)根据所得的细菌生长曲线，计算每孔细菌的存活率，并使用GraphPad7.0计算得到待测药物对受试菌株的EC50以及MBC。
抗菌活性的测试结果见表2和表3。
表2各化合物的抗菌活性测试结果(EC50值)
Figure BDA0002957230620000151
注：EC50表示杀灭50％病原菌所需的最低药物浓度。
由表2可见，化合物1对各测试菌株均具有良好的抗菌活性，其中以对K.pneumoniae的抗菌活性最强。在化合物1的基础上进行化学改造后，化合物2-9对各测试菌株的抗菌活性均出现显著增强，其中以化合物2/4/6/9最优。
表3各化合物的抗菌活性测试结果(MBC值)
Figure BDA0002957230620000161
注：MBC表示杀灭99.9％病原菌所需的最低药物浓度。
从表3可以看出，化合物1对各测试菌株的MBC值均相对较高(>100μM)，但经化学改造后，化合物2-9对对各测试菌株的MBC值均显著降低，其中，以化合物4/9最优。
实施例12体外细胞毒性检测
使用MTT法检测实施例2-10所获得化合物的体外细胞毒性。
测试方法为：
(1)将三种哺乳动物细胞以合适的细胞密度接种于透明96孔板中(3.5×103cell/well hepatocyte BNL CL.2,5×103cell/well fibroblast 3T3,and 5×103cell/wellperitoneal macrophages)，并置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养使之贴壁；
(2)次日，将孔板内的细胞培养基更换为新鲜的细胞培养基，并同时加入待测药物刺激，使药物终浓度为0.195μM-100μM；
(3)置于37℃恒温培养箱内孵育24h，而后向每孔加入10％体积的MTT(5mg/mL)溶液，于37℃恒温培养箱中孵育4h；
(4)弃去细胞培养基，每孔加入150μL的DMSO以溶解MTT进入活细胞后所产生的甲瓒，充分混匀后，置于多功能酶标仪中，在检测波长为490nm下检测OD值，计算每孔细胞的存活率，并使用GraphPad 7.0计算得到待测药物对受试细胞的CC50。
体外细胞毒性实验的测试结果见表4。
表4各化合物的细胞安全性测试结果(CC50值)
Figure BDA0002957230620000171
注：CC50表示允许50％细胞存活的最高药物浓度；“_”代表在本实验设置条件下测不到细胞毒性。
由表4可见，化合物1和化合物5基本无细胞毒性，化合物7/8/9的综合细胞毒性均较弱，其他各化合物虽然存在一定的细胞毒性，但CC50值均较高，且明显高于其EC50值和MBC值。
实施例13耐药实验
在上述抗菌活性和细胞安全性测试结果的基础上，本发明选择化合物4和9对其诱导大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)耐药性进行测试。
测试方法为：
(1)按照实施例11中的方法培养大肠杆菌(E.coli ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC25923)，并将菌液浓度调整至5×105CFU/mL；
(2)在透明96孔板内每孔加入50μL菌液，并同时加入50μL待测药物，使药物终浓度为0.195μM-100μM；
(3)置于37℃恒温培养箱内孵育2h，而后向每孔加入100μL 2×LB液体培养基，充分混匀后，置于37℃恒温培养箱中孵育18h；
(4)用多功能酶标仪检测每孔细菌的OD值，将使细菌OD值下降一半的最低药物浓度记录为最低抑菌浓度(MICs)，其允许细菌增殖的下一个浓度记录为亚最低抑菌浓度(Sub-MICs)；
(5)将Sub-MICs孔中的菌液吸取5μL于5mL液体LB培养基中，置于37℃恒温摇床培养至对数期用于下一代耐药诱导实验，该过程重复八次，记录每次每种药物的MIC值，并根据MIC值的升高倍数来表明细菌耐药性的产生。
结果见图19和图20。
如图19所示，本发明的化合物4和化合物9几乎不诱导大肠杆菌(E.coli)产生耐药性，明显优于市售抗生素泰能(Tienam)。
如图20所示，本发明的化合物4和化合物9几乎不诱导金黄色葡萄球菌(S.aureus)产生耐药性，明显优于市售抗生素万古霉素(Vancomycin)。
实施例14脓毒症治疗效果验证
按实施例11方法培养大肠杆菌(E.coli ATCC25922)，每只C57BL/6小鼠腹腔注射1×107CFU大肠杆菌以建立小鼠腹膜炎脓毒症模型，而后立即腹腔注射4mg/kg的待测药物(化合物4，化合物9或多粘菌素B)，观察并记录小鼠生存率。结果见图21。
如图21所示，采用本发明的化合物4和化合物9治疗后，腹膜炎脓毒症小鼠生存率达到100％，与市售抗生素多粘菌素B(PMB)的疗效相当。
实施例15细菌性肺炎治疗效果验证
按实施例11方法分别培养肺炎克雷伯杆菌(K.pneumoniae ATCC13883)和金黄色葡萄球菌(S.aureus ATCC25923)，分别给C57BL/6小鼠经气管内注射5×107CFU肺炎克雷伯杆菌或9×107CFU金黄色葡萄球菌以建立细菌性肺炎小鼠模型，而后立即经气管内注射2mg/kg的待测药物(化合物4，化合物9或多粘菌素B)，观察并记录小鼠生存率。结果见图21和图22。
如图21所示，肺炎克雷伯杆菌(K.pneumoniae)诱导的阴性对照组肺炎小鼠在未接受任何治疗的情况下，在48h后已全部死亡；而采用本发明的化合物4治疗120h后，小鼠存活率约为50％；采用化合物9治疗120h后，小鼠存活率约为80％；采用市售抗生素多粘菌素B(PMB)治疗120h后，小鼠存活率达100％。
如图22所示，金黄色葡萄球菌(S.aureus)诱导的阴性对照组肺炎小鼠在未接受任何治疗的情况下，在72h后存活率均为20％；而采用本发明的化合物4治疗后，小鼠存活率约为90％；采用化合物9治疗后，小鼠存活率达到100％；而采用市售抗生素多粘菌素B(PMB)治疗后，小鼠存活率仅为约30％；表明本发明的化合物4和化合物9对金黄色葡萄球菌(S.aureus)诱导的肺炎的治疗效果均优于多粘菌素B，且化合物9的治疗效果更优。

Claims (5)

1.一种类肽化合物，其特征在于，结构式如式（Ⅰ）所示：
Figure 74627DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）；
式（Ⅰ）中，R1为H、
Figure 436469DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure 852407DEST_PATH_IMAGE003
、
Figure DEST_PATH_IMAGE004
或
Figure 699534DEST_PATH_IMAGE005
，R2为-NH2。
2.一种类肽化合物，其特征在于，结构式如式（Ⅰ）所示：
Figure 695172DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）；
式（Ⅰ）中，R1为
Figure DEST_PATH_IMAGE006
，R2为
Figure 442679DEST_PATH_IMAGE007
或
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
3.一种类肽化合物，其特征在于，结构式如式（Ⅰ）所示：
Figure 544365DEST_PATH_IMAGE001
（Ⅰ）；
式（Ⅰ）中，R1为
Figure 767536DEST_PATH_IMAGE009
，R2为
Figure DEST_PATH_IMAGE010
或
Figure 832444DEST_PATH_IMAGE011
。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的类肽化合物在制备抗生素中的应用，其特征在于，所述的抗生素用于抗MRSA、S. aureus、E. coli、K. pneumoniae、P. aeruginosa和A. baumannii中的至少一种。
5.一种抗生素，其特征在于，有效成分包括如权利要求1-3中任意一项所述的类肽化合物，或其药学上可接受的盐。
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