JPH07223945A - 骨疾患治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 本発明は、一般式（Ｉ） 【化１】 （式中Ｒ¹ 及びＲ² は水素又はアルキル基を表す。）で
表されるリベロマイシン類またはその塩を有効成分とし
て含有することを特徴とする骨疾患治療剤。 【効果】 骨芽細胞に対し顕著な分化及び石灰化促進活
性を有しており、また破骨細胞に対し、顕著な分化・成
熟抑制活性を有している。骨粗鬆症、高カルシウム血症
等の治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は優れた骨形成促進及び骨
吸収抑制作用を有する骨疾患治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】骨多孔症や骨粗鬆症等は、骨の石灰質と
骨基質とがともに減少することを特徴としている。これ
らの疾患は骨の疼痛を発生し、骨の脆弱化による骨折の
原因となることが知られており、現在、これらの疾患は
高齢人口の増加に伴い社会問題化している。人の骨は絶
えず吸収と再形成を繰り返しており、これらの疾患は骨
組織において、骨芽細胞による骨形成を破骨細胞による
骨吸収が上回ることにより骨組織が脆くなり発生する疾
患であると言われている。又、物理的骨折や疲労骨折等
は骨折部位の修正を行い、修正後は患者自身の治癒力に
任せるといった治療がされているのが現状である。

【０００３】現在これらの骨に関わる疾患の治療剤及び
治療期間の短縮を図るものとして臨床では活性型ビタミ
ンＤ₃ 、カルシトニン及びその誘導体やエストラジオー
ル等のホルモン製剤、イプリフラボン、カルシウム製剤
等が投与されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらを用い
た治療法には経口投与を行うことができない、或いは効
果の不確実性等の改善されるべき問題があり、これらに
代わる新しい治療剤の開発が望まれていた。本発明は新
規な骨疾患治療剤を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な状況に鑑み鋭意研究の結果、抗腫瘍剤及び抗菌剤とし
て開発されたリベロマイシン類（特開平４−４９２９６
号及び特開平５−１９４５２５号）のうち、特定の化合
物に骨形成促進及び骨吸収抑制作用があることを見出し
た。本発明は、特定のリベロマイシン類に、（１）骨芽
細胞の分化促進及び分化促進による骨の石灰化促進作
用、及び（２）破骨細胞の分化抑制作用があることを見
出し、この化合物を骨疾患治療剤として使用することを
可能とした。

【０００６】本発明の骨疾患治療剤は骨芽細胞分化促
進、骨芽細胞分化促進による石灰化の促進、及び破骨細
胞分化抑制作用を有し、ヒト及び動物に対する骨疾患治
療剤として使用される。本発明製剤は骨量減少等の内因
性骨疾患及び物理的骨折等の外因性骨疾患の治療及び治
療期間の短縮を適用とし、具体的には骨粗鬆症、高カル
シウム血症、骨ページェット病、外傷性骨折、疲労骨
折、骨多孔症、骨軟化症、栄養障害、悪性腫瘍、その他
疾病が原因による骨組織の脆弱化及び骨折等の治療及び
治療期間の短縮に用いられる。

【０００７】本発明で使用されるリベロマイシン類は下
記一般式（Ｉ）

【０００８】

【化２】 （式中、Ｒ¹ 及びＲ² は水素又はアルキル基を表す。）
で表される化合物及びその生理学的に許され得る塩より
なる。生理学的に許容される塩として、ナトリウム及び
カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム及びカルシ
ウム等のアルカリ土類金属塩、アルミニウムその他の金
属、及びアルキルアミン塩、ピリジン塩等の有機アミン
塩等が挙げられる。

【０００９】一般式（Ｉ）で表されるリベロマイシン類
の、側鎖Ｒ¹ 及びＲ² は水素またはアルキル基を示す。
アルキル基としては、特に炭素数１〜４のアルキル基が
好ましく、このようなアルキル基としてはメチル基、エ
チル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル
基、イソブチル基、三級ブチル基が挙げられる。リベロ
マイシン類は、一般式（Ｉ）で表される構造中に持つ側
鎖Ｒ¹ 及びＲ² に入る水素又はアルキル基により、リベ
ロマイシンＡ、Ｃ、Ｄ、及びこれらとはスピロ環部分の
構造が異なるリベロマイシンＢとに分けられる。以下に
これらの構造を示す。

【００１０】

【化３】

【００１１】

【化４】

【００１２】

【化５】

【００１３】

【化６】

【００１４】本発明において上記一般式（Ｉ）に包含さ
れるリベロマイシン類にリベロマイシンＡ，Ｃ及びＤを
挙げることができる。

【００１５】これらのリベロマイシン類の製造法は公知
方法及びそれに準ずる方法、例えば特開平４−４９２９
６又は特開平５−１９４５２５号公報、及びジャーナル
・オブ・アンチバイオティクス（Journal of Antibioti
cs ;４５巻、９号、１４０９−１４１３頁、１９９２年
発行）に記載されているリベロマイシン類生産菌を培養
する方法により製造することができる。

【００１６】本発明で用いられる骨疾患治療剤は、ヒト
及び動物に対し、医薬として経口的及び非経口的に安全
に投与される。非経口的投与には、例えば静脈注射、筋
肉内注射、皮下注射、腹腔内注射、経皮投与、経肺投
与、経鼻投与、経腸投与、口腔内投与、経粘膜投与等が
挙げられ、これらの製剤が投与される。例えば注射剤、
坐剤、エアゾール剤、経皮吸収テープなどが挙げられ
る。又、経口投与製剤として例えば錠剤（糖衣錠、コー
ティング錠、バッカル錠を含む）、散剤、カプセル剤
（ソフトカプセルを含む）、顆粒剤（コーティングした
物も含む）、丸剤、トローチ剤、液剤、又はこれらの製
剤学的に許容され得る徐放化製剤等が挙げられる。経口
投与用液剤には懸濁剤、乳剤、シロップ剤（ドライシロ
ップを含む）、エリキシル剤などが挙げられる。これら
の製剤は公知の製剤学的製法に準じ、製剤として薬理学
的に許容され得る担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色
剤等と共に医薬組成物として投与される。これらの製剤
に用いる担体や賦形剤としては、例えば乳糖、ブドウ
糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコ
シデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸
カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ
末など、結合剤としては例えばデンプン、トラガントゴ
ム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリ
ビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプ
ロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロースなど、崩壊剤としては
例えばデンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチル
セルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカ
ルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素
ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど、滑沢剤として
は例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加
植物油、マクロゴールなど、着色剤としては医薬品に添
加することが許容されているものを、それぞれ用いるこ
とができる。錠剤、顆粒剤は必要に応じ白糖、ゼラチ
ン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼ
ラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸
セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセル
ロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリ
ル酸重合体などで被膜しても良いし、２以上の層で被膜
しても良い。さらにエチルセルロースやゼラチンのよう
な物質のカプセルでも良い。又、注射剤を調製する場合
は、主薬に必要に応じｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、
可溶化剤などを添加して、常法により各注射剤とする。

【００１７】本発明の骨疾患治療剤を患者に投与する場
合、症状の程度、患者の年齢、健康状態、体重などの条
件によって異なり特に限定はされないが、成人１日当た
り約１０ｍｇ〜１０ｇを経口或いは非経口的に１日１回
若しくはそれ以上投与すれば良い。

【００１８】本発明の薬剤の毒性は非常に低く、例えば
本薬剤１００ｍｇ／ｋｇ体重を４週齢（体重１００〜１
２０ｇ）のＷｉｓｔａｒ系雄ラットに静脈注射した場
合、９日間投与しても毒性を示さず、非常に安全な薬剤
である。

【００１９】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明する。しかしこれらは単に例示するのみであり、本
発明はこれらにより限定されるものではない。

【００２０】製造例１：リべロマイシン類の製造方法 ストレプトミセス属に属する放線菌ＳＮ−５９３株（微
工研菌寄第１１５０３号）をグルコース２％、可溶性デ
ンプン１％、肉エキス０．１％、乾燥酵母０．４％、大
豆粉２．５％、食塩０．２％の組成からなる培地に接種
し、前培養液とした。この前培養液１．５リットルを同
組成の培地１２０リットルを含む２００リットル容タン
クに接種し、２７℃で１１７時間にわたり通気攪拌培養
した。この全培養液の瀘液約１００リットルを１８．５
リットル容量のダイヤイオンＨＰ２０に吸着させ、約３
６リットルの３０％メタノールで不純物を溶出させた
後、３６リットルの１００％メタノールで活性成分を溶
出させた。活性成分を含むフラクションを減圧濃縮した
後、２リットルの酸性水（１Ｎ塩酸でpH３に調整）を加
え、等量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を
減圧濃縮して得られた残渣を少量のクロロホルム：メタ
ノール混合液（２：１）に溶解し、２．２リットル容量
のシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付した。４．
５リットルのクロロホルム：メタノール混合液（２：
１）で洗浄した後、４．５リットルの１００％メタノー
ルで溶出して活性画分を得た。さらに活性画分を減圧濃
縮した後、残渣を少量の２０％メタノールに溶解して１
リットル容量のセファデックスＬＨ−２０カラムに付
し、１．５リットルの２０％メタノールで展開して活性
画分を回収した。活性画分を減圧濃縮した後に凍結乾燥
し、リベロマイシンＡ、リベロマイシンＢ、リベロマイ
シンＣ、及びリベロマイシンＤを含む粗精製物約８ｇを
得た。

【００２１】この粗精製物を高速液体クロマトグラフィ
ー（カラム：CAPCELL PAK C₁₈,１００mmφ×５００mm、
検出：ＵＶ２４０ｎｍ）に付し、メタノール：水：１％
アンモニア水（１８：８１：１）の混合溶媒を用いて、
流速２２０ｍｌ／分で展開してリベロマイシンＡ、リベ
ロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベロマイシン
Ｄをそれぞれ単一の成分として含むフラクションを回収
した。各フラクションを減圧濃縮し、残った水溶液を１
Ｎ塩酸でpH３に調整した後、等量の酢酸エチルで２回抽
出した。酢酸エチル層を減圧濃縮して得られた残渣を凍
結乾燥し、約３ｇのリベロマイシンＡ、約１２ｍｇのリ
ベロマイシンＢ、約８０ｍｇのリベロマイシンＣ、及び
約１４ｍｇのリベロマイシンＤを得た。

【００２２】脱スクシニル−リベロマイシンＡの製造方
法 得られたリベロマイシンＡを０．５Ｎ水酸化カリウム溶
液中で室温にて１時間以上反応させる。この反応液を1N
塩酸でpH３に調整した後酢酸エチルで抽出し、抽出液を
濃縮乾固して目的の脱スクシニル−リベロマイシンＡが
得られた。以下に脱スクシニル−リベロマイシンＡの構
造式を示す。本化合物は以下に示す実験により、骨疾患
治療効果がないことが確認された。本発明においてはリ
ベロマイシン類の骨疾患治療効果を確認する際の対照と
して用いた。

【００２３】

【化７】

【００２４】リベロマイシンＡナトリウムの製造方法 得られたリベロマイシンＡを蒸留水に懸濁させ、これに
１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を滴下し、pH７〜７．５に調
整し、０．４５μｍ孔径のメンブレンフィルターによる
濾過を行い、凍結乾燥して目的とするリベロマイシンＡ
ナトリウムが得られた。以下にリベロマイシンＡナトリ
ウムの構造式を示す。本化合物は本発明において注射剤
としてリベロマイシン類を投与するための化合物として
用いた。

【００２５】

【化８】

【００２６】 各成分を混合し、リベロマイシン２５ｍｇを含む５００
ｍｇの錠剤４００個を製造した。

【００２７】 各成分を混合した後圧縮成形し、粉砕、整粒して２０〜
５０メッシュの５％顆粒剤を製造した。

【００２８】 製造例４：カプセル剤の製造 リベロマイシンＡ ５ｇ 乳糖 ４０ｇ 馬鈴薯澱粉 ５０ｇ ヒドロキシプロピルメチルセルロース ３．５ｇ ステアリン酸マグネシウム １．５ｇ ────────────────────────────── 合計 １００ｇ 各成分を良く混和し１号カプセルに充填し、３００個製
造した。

【００２９】 製造例５：注射剤の製造 リベロマイシンＡナトリウム ５ｇ 生理食塩水 １００ｍｌ ────────────────────────────── 合計 ５ｇ／１００ｍｌ 上記のリベロマイシンＡナトリウムを生理食塩水に溶解
し、バイアルに充填し、加熱殺菌を行って静注用注射剤
とした。

【００３０】

【発明の効果】以下に本発明の骨疾患に対する効果を示
す。

【００３１】試験例１：石灰化試験に用いる細胞の調製 in vitroにおける骨形成の試験方法として有用であるラ
ット骨髄間質細胞の石灰化試験（Cell. Tissue. Res. v
ol.254, pp 317-330, 1988： Blood vol.77, pp 1906-1
911,1991) を行うための試料調製を行った。５又は６週
齢の雌ＳＤ系ラットの大腿骨より骨髄細胞を採取し、１
５％牛胎児血清、アスコルビン酸 ５０μg/ml、β−グ
リセロリン酸 １０mM、デキサメサゾン １０^-8Ｍ、ペ
ニシリンＧナトリウム １００Ｕ／ml、硫酸ストレプト
マイシン １００μg/ml、及びアムホテリシンＢ ０．
２５μg/mlを含むＭＥＭ−アルファ培地（核酸含有）４
０mlに懸濁させ、１匹のラットか得られた細胞毎に７５
cm² Ｔ−フラスコに播種した。このＴ−フラスコに播種
した細胞を５％炭酸ガス、湿度１００％、３７℃に調整
したインキュベーター中で培養した。培養開始２日後
に、培養液を新鮮な上記培養基に交換し、更に培養を行
った。培養開始４から６日後、Ｔ−フラスコを０．０５
％のトリプシンで処理し、付着細胞、即ち骨髄間質細胞
を得た。骨髄間質細胞を、試験検体を加えた上記培養基
に懸濁させ、９６穴マイクロウェル又は２４穴マイクロ
ウェルに各々５×１０³ 個／２００μl ／９６ウェル又
は３×１０⁴ 個／１ml／２４ウェル播種した。

【００３２】カルシウム沈着試験法 前記試験例１記載の方法に従い、ラット骨髄間質細胞の
培養を行い、石灰化の指標である組織カルシウムの沈着
を試験した。前記試験例１記載の方法に従い得られた各
ウェルのラット骨髄間質細胞を、培養開始１週間後にリ
ン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、中性ホルマリンで一晩
室温で固定した。固定後、各ウェルを水洗し、ダールの
カルシウム染色（アリザリンレッドＳ染色）を行った。
各ウェルを再度水洗した後、石灰化組織に沈着した色素
を１Ｍリン酸−エタノール溶液（１：１）で可溶化し
た。尚、可溶化は９６ウェルの場合１００μl 、２４ウ
ェルの場合１ ml のリン酸−エタノール溶液を用いて実
施した。可溶化後、４０５nmの吸光度を測定し、カルシ
ウムの沈着を測定した。

【００３３】カルシウム沈着試験 Ｉ 上記の９６ウェルを用いた試験法に従い、リベロマイシ
ン類を添加した培地中で骨髄間質細胞を培養しカルシウ
ム沈着試験を行い、その結果を表１に示した。尚、カル
シウム沈着試験の結果は、４０５nmの吸光度のコントロ
ール値に対する百分率で示した。

【００３４】

【表１】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ サンプル濃度 ( M ) ───────────────────── 5.6 × 10 ^-7 1.7 × 10 ^-6 5.1 × 10 ^-6 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加(Control) 100 ± 10 リベロマイシンＡ 92 ± 0 119 ± 2 138 ± 10 リベロマイシンＢ 103 ± 22 72 ± 2 36 ± 7 リベロマイシンＣ 105 ± 11 122 ± 3 27 ± 6 脱スクシニル-リヘ゛ロマイシン Ａ 93 ± 2 86 ± 4 84 ± 3 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ （数値は平均値±標準偏差 (n=3)）

【００３５】上記表１より、１．７×１０^-6及び５．１
×１０^-6ＭのリベロマイシンＡ及び１．７×１０^-6Ｍの
リベロマイシンＣにより、石灰化組織への顕著なカルシ
ウム沈着の促進が観察された。又、リベロマイシンＢ及
び脱スクシニル−リベロマイシンＡによるカルシウム沈
着の促進は観察されなかった。以上の結果から、その部
分構造に、六−六員環スピロケタールとコハク酸部分を
有するリベロマイシン類に明確な石灰化促進活性が存在
することが明らかになった。

【００３６】試験例２：カルシウム沈着試験 II 上記の２４ウェルを用いた試験法に従い、石灰化促進活
性が観察されたリベロマイシンＡを添加した培地中で骨
髄間質細胞を５−１０日間培養しカルシウム沈着試験を
行い、その結果を図１に示した。尚、カルシウム沈着試
験の結果は４０５nmの吸光度で示した。

【００３７】図１より、１０^-6ＭのリベロマイシンＡは
デキサメサゾンによる石灰化（カルシウム沈着）速度を
増し、さらに最大カルシウム沈着量を増大させることが
明らかになった。この結果からも、特定の構造を有する
リベロマイシン類に明確な石灰化促進活性が存在するこ
とが明らかになった。

【００３８】試験例３：アルカリフォスファターゼ（Ａ
ＬＰ）活性測定 前記試験例１に従いラット骨髄間質細胞の培養を行い、
骨芽細胞の分化の指標となることが知られている組織ア
ルカリフォスファターゼ活性( 組織培養、１５巻、１５
５−１５９頁、１９８９年発行、及びBlood Vol.77, pp
1906-1911(1991)) を試験した。

【００３９】前記試験例１記載の方法に従い得た各ウェ
ルのラット骨髄間質細胞を、培養開始一定期間後にリン
酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、中性ホルマリンで一晩４
℃で固定した。固定後、各ウェルを水洗し、アゾ色素法
に従い、２分３０秒間アルカリフォスファターゼ染色を
行った。尚、アゾ染色の基質としては、ナフトールＡＳ
−ＢＩリン酸２ナトリウム塩を用い、ジアゾニウム塩と
してはファーストブルーＲＲ塩を用い試験を行った。各
ウェルを再度水洗した後、培養組織に沈着した色素をジ
メチルスルホキシド５００μl で可溶化した。可溶化
後、４７０nmの吸光度を測定し、組織アルカリフォスフ
ァターゼ活性を測定した。尚、このアルカリフォスファ
ターゼ活性試験は２４ウェルを用いて実施した。

【００４０】アルカリフォスファターゼ活性試験 Ｉ 上記の２４ウェルを用いた試験法に従い、リベロマイシ
ンＡを添加した培地中で骨髄間質細胞を１週間培養し、
組織アルカリフォスファターゼ活性を試験した。尚、こ
の試験は１０^-8Ｍのデキサメサゾン存在下及び非存在下
で実施し、その結果を表２に示した。アルカリフォスフ
ァターゼ活性試験の結果は、４７０nmの吸光度のデキメ
サゾン存在下及び非存在下でのコントロール値に対する
百分率で示した。

【００４１】

【表２】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ リベロマイシンＡ濃度 ( M ) ───────────────────── Control 10 ^-6 2 × 10 ^-6 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 10 ^-8 M デキサメサゾン 100± 1 114± 1 121± 3 *(140± 1) （−） デキサメサゾン 100± 3 121± 0 145± 7 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ （数値は平均値±標準偏差 (n=3)） （＊はデキサメサゾン非存在下でのコントロール値に対
する、１０ ^-8 Ｍデキサメサゾン存在下でのコントロー
ル値の百分率値）

【００４２】上記表２より、１０ ^-6 及び２×１０ ^-6
のリベロマイシンＡにより、デキサメサゾン存在下及び
非存在下で、組織での顕著なアルカリフォスファターゼ
活性の上昇が観察された。既に述べたように、アルカリ
フォスファターゼ活性の上昇は一般に骨芽細胞の分化の
指標と考えられている。従って、上記の結果から、特定
の構造を有するリベロマシシン類の石灰化促進活性は骨
芽細胞の分化の促進により引き起こされていることが明
らかになった。また前記試験例２に示したリベロマイシ
ンＡによる石灰化の速さを増す作用もこの結果より明ら
かである。

【００４３】試験例４：アルカリフォスファターゼ活性
試験 II 上記の２４ウェルを用いた試験法に従い、リベロマイシ
ンＡを添加した培地中で骨髄間質細胞を一定期間培養
し、組織アルカリフォスファターゼ活性を試験した。
尚、この試験は１０^-8Ｍのデキサメサゾン存在下及び非
存在下で実施し、その結果を表３に示した。アルカリフ
ォスファターゼ活性試験の結果は、４７０nmの吸光度の
デキメサゾン存在下及び非存在下でのコントロール値に
対する百分率で示した。

【００４４】

【表３】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 培養 リベロマイシンＡ濃度 (Ｍ） ──────────────────── 期間 Control 10 ^-6 2 ×10 ^-6 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ６日 100 ± 4 131 ± 7 123 ± 4 ７日 10 ^-8 M デキサメサゾン 100 ± 3 129 ± 8 155 ± 6 ８日 100 ± 4 116 ± 2 166 ± 2 ──────────────────────────────────── ６日 100 ± 4 123 ± 3 143 ± 2 ７日 （−） デキサメサゾン 100 ± 6 105 ± 9 142 ± 5 ８日 100 ± 5 103 ± 3 120 ± 6 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ （数値は平均値±標準偏差 (n=3)）

【００４５】上記表３より、各培養期間において、１０
^-6及び２×１０^-6ＭのリベロマイシンＡにより、組織で
の顕著なアルカリフォスファターゼ活性の上昇が観察さ
れた。従って、上記の結果から、特定の構造を有するリ
ベロマイシン類の石灰化促進活性は骨芽細胞の分化の促
進により引き起こされていることが明らかになった。

【００４６】試験例５：破骨細胞形成試験 骨吸収の抑制を評価するin vitro試験法として有用であ
るラット骨髄細胞からの破骨細胞形成試験法 (蛋白質
核酸 酵素 Vol.34, pp 999-1005 (1989) 及びEndocrin
ology Vol.122, pp 1373-1382(1988)) を用い、リベロ
マイシン類の活性を試験した。

【００４７】１６日齢のメスＳＤラットの大腿骨より骨
髄細胞を採取し、１０％牛胎児血清、１０^-8Ｍ 活性型
ビタミンＤ₃ ( カルシフェロール) 、１００ Ｕ／mlペ
ニシリンＧナトリウム塩、１００μg/ml 硫酸ストレプ
トマイシン、及び０．２５μg/ml アンフォテリシンＢ
（ファンギゾン）を含むＭＥＭ−アルファ培地（核酸不
含) に懸濁させ、２４穴マイクロウェルに７．５×１０
⁵ 個／０．５ml／２４ウェル播種した。培養開始３日後
及び５日後に、各ウェルの培養液を試験検体を含む新鮮
な培養液に交換した。培養開始１週間後、各ウェルをリ
ン酸塩緩衝生理食塩水で洗浄し、エタノール−アセトン
溶液（１：１）を用い、室温で１分間固定した。固定終
了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、白血
球酸性フォスファターゼキット（シグマ社製）を用い各
ウェルの細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ染色を
行った。染色後、倒立顕微鏡を用い、赤橙色に染色され
た細胞を破骨細胞として計数した。

【００４８】破骨細胞形成試験 Ｉ 上記試験法に従い、リベロマイシン類を添加した培地中
で骨髄細胞を培養し破骨細胞形成試験を行い、結果を表
４に示した。尚、破骨細胞形成試験の結果は、形成され
た破骨細胞数のコントロール値に対する百分率で示し
た。

【００４９】

【表４】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ サンプル濃度 ( M ) ───────────────── 10 ^-8 10 ^-7 10 ^-6 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加(Control) 100 ± 21 リベロマイシンＡ 26 ± 5 16 ± 5 8 ± 3 リベロマイシンＣ 84 ± 26 39 ± 13 13 ± 3 脱スクシニル-リヘ゛ロマイシン Ａ 105 ± 26 105 ± 23 100 ± 18 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ （数値は平均値±標準偏差 (n=3)）

【００５０】上記表４より１０^-8、１０^-7及び１０^-6Ｍ
リベロマイシンＡと１０^-7及び１０^-6Ｍリベロマイシン
Ｃにより、濃度に依存して顕著な破骨細胞形成の抑制が
観察された。脱スクシニル−リベロマイシンＡによる破
骨細胞形成の抑制は観察されなかった。以上の結果か
ら、その部分構造にコハク酸部分を有する特定のリベロ
マイシン類に明確な破骨細胞形成抑制活性が存在するこ
とが明らかになった。

【００５１】試験例６：破骨細胞形成試験 II 上記試験法に従い、リベロマイシンＡを添加した培地中
で骨髄細胞を培養し、又破骨細胞形成を抑制することが
知られているビタミンＫ₂ を対照品として供し、破骨細
胞形成試験を行い、結果を表５に示した。尚、破骨細胞
形成試験の結果は、形成された破骨細胞数のコントロー
ル値に対する百分率で示した。

【００５２】

【表５】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ サンプル濃度 (Ｍ） ──────────────── 6.3×10 ^-7 10 ^-5 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加(Control) 100 ± 30 リベロマイシンＡ 9 ± 2 4 ± 2 ビタミンＫ₂ 98 ± 47 11 ± 2 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ （数値は平均値±標準偏差 (n=3)）

【００５３】上記表５より、６．３×１０^-7及び１０
^-5 ＭのリベロマイシンＡにより、リベロマイシン濃度
に依存した顕著な破骨細胞形成の抑制が再現された。ま
た、その抑制活性はビタミンＫ₂ と比較して、より低濃
度で強い活性が観察された。以上の結果から、特定の構
造を有するリベロマイシン類に強い破骨細胞形成抑制活
性が存在することが明らかになった。

【００５４】以上の結果より、本発明のリベロマイシン
類は骨疾患治療剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】試験例２のリベロマイシンＡによる骨髄間質細
胞の石灰化促進活性の経時変化を表す。

【符号の説明】

○；１０^-8Ｍ デキサメザゾン △；１０^-8Ｍ デキサメザゾン＋１０^-6Ｍ リベロマイ
シンＡ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 東尾 侃二 埼玉県川越市山田1769−10 (72)発明者 井瀬 正司 栃木県下都賀郡石橋町石橋809−３ (72)発明者 吉浜 誠 栃木県宇都宮市江曽島町1400−８

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（Ｉ）で表されるリベロマイシン
   類またはその生理的に許され得る塩を有効成分とするこ
   とを特徴とする骨疾患治療剤。 【化１】 （式中、Ｒ¹ 及びＲ² は水素又はアルキル基を表す。）