KR100370597B1

KR100370597B1 - 산형매립초로부터 분리한 신규한 나프탈렌계 화합물 및이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR100370597B1
Application number: KR10-2000-0034533A
Authority: KR
Inventors: 박정일; 황귀서; 박용수; 권성원; 박만기
Original assignee: 박정일
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2000-06-22
Publication date: 2003-02-05
Also published as: KR20020000274A

Abstract

본 발명은 산형매립초로부터 분리한 하기 화학식 1의 나프탈렌계 화합물 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 하기 화학식 1의 나프탈렌계 화합물은 산형매립초의 유기용매 추출물로부터 크로마토그래피를 수행하여 분리한 것으로서, 조골세포에서 분화와 단백질합성을 촉진시키는 효능이 있어 골다공증 예방제 및 치료제, 성장촉진제, 골절치료제 또는 관절염치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

상기 R은 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이다.

Description

산형매립초로부터 분리한 신규한 나프탈렌계 화합물 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물{Novel compound from Chimaphila umbellata and pharmaceutical compositions thereof}

본 발명은 산형매립초로부터 분리한 하기 화학식 1의 나프탈렌계 화합물 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 하기 화학식 1의 나프탈렌계 화합물은 산형매립초의 유기용매 추출물로부터 크로마토그래피를 수행하여 분리한 것으로서, 조골세포에서 분화와 단백질합성을 촉진시키는 효능이있다.

일반적으로 뼈에서는 골흡수와 골침착 과정이 균형을 이룬 골대사가 끊임없이 일어나고 있다. 골대사는 조골세포(osteoblast)에 의한 골형성과 파골세포(osteoclast)에 의한 골흡수 과정을 포함하며, 이러한 과정에는 전신성 호르몬인 파라티로이드 호르몬(parathyroid hormone, 이하 'PTH'로 약칭함), 칼시토닌(calcitonin), 인슐린(insulin), 성장 호르몬(growth hormone) 등의 폴리펩타이드 계열의 호르몬과 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 에스트로겐(estrogen), 에스트라디올(estradiol), 프로게스테론(progesterone), 1,25-디하이드록시비타민 D3 (1,25-dihydroxyvitamine D3) 등의 스테로이드 계열의 호르몬이 관여하는 것으로 보고되고 있다.

또한 노화가 진행됨에 따라 체내의 호르몬 분비 기능이 변화된다는 것은 이미 밝혀져 있으며, 이에 따라 골형성과 골흡수의 불균형이 일어나면 골량이 감소되고 골조직의 미세구조에 이상이 나타나는 골다공증이 야기될 수 있다.

골다공증은 여성호르몬의 부족, 갑상선기능항진증 등의 내분비질환, 부신피질호르몬 등의 약물의 장기복용, 영양장애 및 골수질환과 같은 다양한 원인에 의해 발생하며, 현재 한국에서 골다공증 환자는 200만명 이상으로 추정되고 있다. 특히 난소기능이 정지되어 에스트로겐이 부족한 폐경기 여성에게서 골다공증이 빈발하는데 이 경우에는 매년 2-3%의 골밀도 감소가 일어나면서 골절율은 2배정도 급격히 증가한다.

골다공증은 심한 충격 없이도 각종 골절을 쉽게 초래하고 이로인한 장기간의활동제한에 따르는 경제적 손실로 인하여 사회적, 의학적으로 큰 문제를 야기하고 있다. 더욱이, 골다공증은 노인층 사망 원인의 약15%를 차지하는 골절의 원인이 되기도 한다.

현재, 세계적으로 골다공증이 고령화 사회의 중요한 의료문제로 대두됨에 따라 골다공증의 치료제 개발에 많은 연구가 진행되어왔다. 임상에서 현재 사용되는 약물로는 골형성을 촉진시키는 약제와 골흡수를 차단시키는 작용이 있는 약제로 나눌 수 있는데, 주로 많이 쓰이고 있는 에스트로겐, 칼시토닌, 아이프리플라본(ipriflavone) 등은 골의 흡수를 억제하는 약물들로 보고되어 있다. 반면에 아나볼릭 스테로이드(anabolic steroid), 불소화합물(fluoro compound), 비타민 D 및 파라티로이드 호르몬 등은 골형성을 촉진시키는 약물로 밝혀져 있다.

그러나 일반적으로 골흡수 억제제는 골의 재형성이 항진되어 있고 현재 진행중인 제1형 골다공증의 예방과 치료에는 효과가 있으나, 대부분 문제가 되고 있는 진행된 골다공증에는 효과적이지 못한 한계가 있다. 반면, 골형성 촉진제는 골 재형성이 감소된 제2형 골다공증 또는 이미 진행된 골다공증 환자들에게 유용하게 쓰일 수 있다고 알려져 있어서 골형성 촉진 약물의 개발 필요성이 절실히 요구되고 있지만, 실질적으로 임상에서 사용될만한 골형성 촉진 약물은 아직 개발되어 있지 못한 실정이다.

백두산 천연 약용식물인 산형매립초(Chimaphila umbellataBarton, 傘形梅笠草)는 주로 중국 동북지구, 일본, 유럽, 러시아 등지에 야생하고 있다. 아직까지 많은 연구는 되어 있지 않지만, 주로 러시아와 유럽에서 산형매립초에 관한 성분및 그 생리활성에 관한 연구를 진행하였다.

베이치 등이 산형매립초의 아세톤 층으로부터 β-아미린(β-amyrin)을 분리한데 이어(Veitch et al.,J. Am. Chem. Soc.,1951, 73, 3530), 다미코는 산형매립초의 분획이 항생작용을 갖고 있다고 보고하였다(Maria Luisa D'Amico,Fitoterapia,1959, 21, 77-79). 또한 트루바체브는 1967년에 산형매립초로부터 알부틴(arbutin), 우르소르산(ursolic acid), 퀴에르세틴(quercetin), 갈레이트(gallate) 등 여러 가지 화합물을 분리하였고(Trubachev,Tr. Leningrad. Khim.-Farm. Inst.1967, 21, 176-182), 1968년에 하이퍼로사이드(hyperoside: quercetin-3-β-D-glactopyranoside), 아비큘라린(avicularin: quercetin-3-α-L-arabinoside), 캠페롤(kaempferol) 등의 플라보노이드계 화합물을 분리하였다(Trubachev et al.,Khim. Prir. Soedin. 1968, 4(5), 320-321). 와레스카 등은 이소호모알부틴(isohomoarbutin), 레니폴린(renifolin), 호모알부틴(homoarbutin) 등을 분리 보고하였다(Walewska and Ewa,Pharmazie.1969, 24(7), 423-425;Herba Pol.1971, 17(3), 242-247).

본 발명자들은 한약재를 이용하여 부작용이 적고 안전한 골형성 촉진 약물을 개발하기 위하여, 다양한 생약을 스크리닝 하던 중 산형매립초로부터 분리한 신규한 화합물이 골형성에 관련있는 조골세포의 분화를 촉진하는 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 생약재로부터 분리하여 안정하고 골형성 촉진 효과가 있는신규 화합물 및 그를 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 산형매립초로부터 분리하는 방법을 도시한 개략도이고,

도 2는 화학식 1의 화합물의 조골세포 증식 활성을 도시한 그래프이고,

도 3은 화학식 1의 화합물에 의한 조골세포에서의 알카라인 포스파타제 생성 활성을 도시한 그래프이고,

도 4는 화학식 1의 화합물에 의한 조골세포에서의 프로테인 카이네이즈 C 활성화 작용을 도시한 그래프이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 제공한다.

[화학식 1]

상기 R은 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이다.

구체적으로, 상기 화합물중 R이 수소인 3,6-디메틸-1-하이드록시나프탈렌-4-글루코피라노사이드(3,6-dimethyl-1-hydroxynaphthalene-4-glucopyranoside)를 제공한다.

이때, 상기 화학식 1의 화합물은 산형매립초로부터 분리가능하다. 나아가, 상기 화학식 1의 화합물은 산형매립초를 저급알콜, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 유기용매로 추출하고 크로마토그래피를 실시하여 분리하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 함유하는 산형매립초 추출물을 제공한다. 이때 상기 산형매립초 추출물은 저급알콜, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 유기용매로 추출한다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이를 포함하는 산형매립초 추출물을 유효성분으로 포함하는 골형성 촉진제용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 골다공증 및 관절염의 치료 및 예방제 또는 성장촉진제로 특히 유용하다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염을 제공한다.

상기 화합물은 조골세포의 증식을 촉진시키는 생리활성이 있는 물질로서 골다공증 예방과 치료, 어린이 성장촉진, 뼈 골절의 치료효과가 있다.

상기 화학식 1의 화합물은 생약재인 산형매립초로부터 분리되거나 또는 분리된 물질로부터 용이하게 합성될 수 있다.

구체적으로 본 발명은 3,6-디메틸-1-하이드록시나프탈렌-4-글루코피라노사이드를 제공한다. 이는 자연계에서 처음으로 보고되는 신규한 화합물이다.

본 발명자들은 산형매립초로부터 조골세포 증식활성이 있는 물질을 분리하고자, 산형매립초 건조분말을 저급알콜, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택한 유기용매로 추출분획하고 그 결과 얻어진 추출분획을 대상으로 크로마토그래피를 수행하여 3,6-디메틸-1-하이드록시나프탈렌-4-글루코피라노사이드를 분리하였다.

상기 과정에서 유기용매 및 크로마토그래피의 선택과 실시는 당업자에게 자명한 기술이며, 따라서 본 발명에 따른 활성물질은 구체적인 경로에 비의존적으로 산형매립초로부터 분리가능하다.

구체적으로 본 발명에서는 산형매립초 건조분말을 메탄올로 가열추출한 다음 적당량의 증류수에 분산시킨 후 클로로포름, 부탄올의 순으로 추출분획을 실시하고 감압농축하여 부탄올 추출물을 얻었다.

상기 부탄올 추출물을 대상으로 클로로포름, 메탄올 및 물의 혼합용매를 이동상으로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 3,6-디메틸-1-하이드록시나프탈렌-4-글루코피라노사이드를 분리하였다.

본 발명에서는 상기 화학식 1의 화합물의 조골세포의 증식유도 활성을 확인하기 위하여, 우선 래트의 태자로부터 두개골 조골세포를 분리하여 배양하였다. 다음에 개수를 알고있는 조골세포가 포함된 배양용기에 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물을 가하고 일정 기간 배양한 후 세포의 수를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 세포분열을 촉진시켜 조골세포의 증식을 유도하였다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 조골세포의 증식을 촉진하여 뼈의 형성을 증가시킴을 확인하였다.

또한 조골세포가 활성화되면 콜라겐등의 여러가지 단백질을 합성하여 골기질을 만들어내게 된다. 본 발명에서는 조골세포의 활성화 결과 생성되는 단백질의 지표물질로 알려진 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, 이하 'ALP'로 약칭함)의 활성을 측정하여, 화학식 1의 화합물에 의한 조골세포의 단백질 생합성에 미치는 영향을 시험하였다.

구체적으로 상기와 같이 래트의 태자로부터 분리한 두개골 조골세포에 화학식 1의 화합물을 첨가한 후에 일정 기간 동안 배양하여 ALP의 합성을 유도하고, 세포를 파쇄한 다음 이에 니트로페닐 포스페이트를 함유한 반응액을 가하여 ALP의 활성도를 측정하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 화합물은 조골세포의 ALP 활성을 유의적으로 증가시켰다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물은 조골세포의 단백질 생합성 증가를 통해 골기질 물질의 생성을 증가시킴을 확인하였다.

또한 골세포의 분화에서는 PKC(protein kinase C)의 활성화가 주요한 작용통로로 작용한다. PTH 등 골대사를 조절하는 인자가 조골세포에 작용하여 PKA 및 PKC를 활성화시키는 기전은 잘 알려져 있다. PKA와 PKC는 골세포의 활성이 증가하고 분화가 진행되는데 관여하는 유전자의 발현이나 여러 단백질의 활성을 증가시키는데 기여할 것으로 예상되며, 그 정확한 기전에 대해서는 여러가지 연구가 진행중이다. 또한 PKA나 PKC의 활성은 에스트로겐 등의 골대사 조절 호르몬에 대한 조골세포의 감수성을 변화시키는데도 기여한다고 보고되어 있다(S. Migliaccio et al, 1993).

본 발명에서는 PKC의 활성이 증가되어 조골세포의 분화가 촉진되는지를 알아보기 위하여, 화학식 1의 화합물이 PKC의 활성에 미치는 영향에 대하여 시험하였다.

구체적으로 래트의 태자로부터 분리한 조골세포에 본 발명에 따른 화합물을 처리하여 일정 기간 배양함으로써 PKC의 합성 및 활성화를 유도한 다음 세포를 파쇄하고, 이에 PKC 기질 및 인산화된 아미노산을 가하여 반응시킨 다음 인산화된 기질의 양을 측정하여 본 발명에 따른 화합물이 PKC 활성에 미치는 영향을 조사하였다.

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 유의성있게 PKC의 활성을 증가시킴을 확인하였다.

상기한 바와 같이, 화학식 1의 화합물은 조골세포의 분화 및 단백질 합성을 촉진하는 생리활성을 가짐을 확인하였으므로 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 및 이를 함유하는 산형매립초 추출물은 골형성 촉진제로 이용될 수 있다.

따라서 본 발명은 적당한 부형제 또는 보조제를 포함하고 상기 화학식 1의 화합물 및/또는 이를 함유하는 산형매립초 추출물을 유효성분으로 하는 골형성 촉진제용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명에 따른 약학적 조성물은 조골세포의 증식을 통한 골다공증 예방과 치료, 어린이 성장촉진 및 골절의 치료에 효과가 있다.

이러한 목적을 위하여, 본 발명의 조성물 그 자체로 또는 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들어 정제, 캅셀제, 액제, 현탁제 등의 경구투여용 제제, 주사용 용액 또는 현탁액 등의 다양한 제제로 제형화할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물의 인체에 대한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불화성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태에 따라 적절히 사용하여야 하나, 일반적으로 성인에게 1일 5-1000mg의 양이 투여되도록 한다.

또한 본 발명에 따른 화합물은 전통적인 생약재로 사용되어온 산형매립초로부터 분리되거나 이로부터 합성된 것으로서 독성을 거의 나타내지 않는다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉화학식 1의 화합물의 분리 및 정제

건조한 산형매립초 전초 100g을 분말로 만든 후 80℃에서 메탄올 500ml로 3시간동안 가열추출하여 여과하는 조작을 3회 실시하여 메탄올 추출물을 얻었다. 메탄올 추출물을 합하여 감압 농축한 후 남은 잔사를 물 500ml에 현탁시킨 후 클로로포름으로 추출하고 다시 수층을 부탄올로 추출하여 부탄올 분획을 6g 얻었다. 얻은 부탄올 분획을 대상으로 실리카겔 컬럼상에서 크로마토그라피를 수행하여 클로로포름:메탄올:물=15:1:0.1로부터 시작하여 10:1:0.1, 5:1:0.1로 용매강도를 증가시키면서 크로마토그래피를 실시하여 7개의 분획을 얻었다. 4번 분획을 대상으로 다시 실리카겔 컬럼상에서 클로로포름:메탄올:물=10:1:0.1을 분리용매로 크로마토그라피를 수행하여 신규 화합물 3,6-디메톡시-1-하이드록시나프탈렌-4-O-β-D-글루코피라노사이드를 분리하였다(도 1 참조).

상기 화합물을 대상으로 IR, UV, 질량분석 및 NMR 분석을 수행한 결과는 하기와 같다.

이화학적 성질

- 백색의 침상 물질

- mp : 208-209℃

- IR (KBr) ν_maxcm^-1: 3440, 2922, 2853, 1738, 1617, 1456, 1383, 1260, 1024

-UV (MeOH) λ_maxnm : 280, 262, 226, 216, 200

-질량스펙트럼 EI-MS (m/z) : 350[M⁺], 188, 145, 119, 115

-HRMS (m/z) : 350.1365 (C₁₈H₂₂O₇계산값: 350.1365)

-¹H-NMR (500MHz, CD₃OD) : 8.19(1H, s, H-5), 7.97(1H, d, J=8.5, H-8), 7.17(1H, dd, J=8.5, 1.6, H-7), 6.54(1H, s, H-2), 4.73(1H, d, J=7.8, H-1'), 3.73-3.08(5H, H-6', 5', 4', 3', 2') 2.47(3H, s, 6-CH₃), 2.42(3H, s, 3-CH₃)

-¹³C-NMR (125MHz, CD₃OD) : 150.95(C-1), 143.55(C-4), 136.69(C-6), 130.53(C-10), 129.45(C-3), 126.93(C-7), 124.12(C-9), 123.15(C-8), 122.47(C-5), 110.76(C-2), 106.41(C-1'), 78.19(C-3'), 77.83(C-5'), 75.96(C-2'), 71.88(C-4'), 62.97(C-6'), 21.99(6-CH₃), 17.80(3-CH₃)

상기 실시예 1에서 얻은 본 발명의 화합물의 생리활성을 하기 방법으로 시험하였다.

〈시험예 1〉화학식 1의 화합물의 조골세포 증식 활성 시험

(1-1) 래트 조골세포의 분리 및 배양

임신 21 일 된 래트의 자궁을 절개하여 태자를 꺼낸 후, 후두부를 절개하고 두개골을 적출했다. 적출한 두개골을 콜라게나제 0.1 % (트립신 0.05 % , EDTA 0.5 mM이 함유됨) 용액에 넣어 37℃에서 10 분간 반응시켰다. 상기 반응물에서 상징액을 취하고 원심분리하여 침전된 두개골 조골세포를 얻었다.

상기 과정으로 분리된 PBS(인산 완충용액, pH 7.4)에 재현탁하여 원심분리한 후, 이를 DMEM 배지(10 % FBS, 100 IU/페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 50 ㎍/ml L-아스코르브산, 10 nM 덱사메타손(dexamethasone), 10 mM β-글리세로포스페이트, 300 ng/ml 펀자이존(Fungizone))에 넣어 재현탁하고 37℃, 5 % CO₂에서 배양하였다. 세포의 배지는 3일에 한번씩 교환하였다.

상기 조골세포 분리과정에서 상징액을 취하고 남은 두개골에는 다시 콜라게나제 효소 용액을 넣고, 상기 반응을 반복 시행하여 두개골 조골세포를 얻었다.

배양한 세포는 2주후에 트립신을 처리하여 세포를 떼어낸 후, 세포계수기를 이용하여 세포수를 측정하여 시험에 이용하였다.

(1-2) 화학식 1의 화합물에 의하여 증식한 조골세포 개수 측정

(1-1)에서 얻어진 두개골 세포를 10⁵개/ml 농도로 맞춘 다음 24 웰 배양용기에 담고, 실시예 1에서 분리한 화합물을 최종농도가 1.0 ug/ml 가 되도록 맞춘 다음, 37^oC, 5% CO₂로 각각 2일, 4일, 6일간 배양하였다.

세포수를 세기 위하여 배지를 제거하고, HBSS 완충액으로 세포를 세척하였다. 이후, 0.1 % 콜라게네이즈(0.05 % 트립신, 0.5 mM EDTA 포함) 용액을 가하여 세포를 세포배양용 용기로부터 분리하였다. 분리된 세포를 아이소톤 Ⅱ(Isoton-Ⅱ) 용액을 이용하여 20배로 희석한 후 세포계수기 (Sysmax F-820)로 세포의 수를 측정하여 화학식 1의 화합물을 처리하지 않은 대조군과 비교하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 래트의 태자로부터 분리한 두개골 조골세포를 이용하여 시험하였을 때, 본 발명에 따른 화합물을 처리한 군은 대조군보다 유의적으로 세포분열이 증가하였다.

〈시험예 2〉화학식 1의 화합물의 단백질 생합성 활성 시험

상기 시험예 1의 (1-1)에서와 같은 방법으로 분리배양한 조골세포를 배양용 용기에 옮기고 실시예 1에서 분리한 화합물을 최종농도 1.0 ㎍/ml이 되도록 첨가한 다음 4일, 8일간 각각 배양하였다. 배양용 용기를 냉각한 PBS 완충액으로 세척하고 세포를 긁어 낸 후 루펩틴(leupeptin)이 함유된 차가운 냉각한 PBS에 세포를 재현탁하였다. 이 현탁액을 4℃에서 초음파발생기(ultrasonicator)로 초음파처리한 후 3000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다.

ALP의 활성을 측정하기 위하여, 상기의 원심분리 후 상징액 50㎕를 취하여 0.56 M 2-아미노-2-메틸-프로판올, 1 mM MgCl₂, 10 mM p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenyl phosphate)를 함유한 반응액 1ml와 함께 37℃에서 10분간 반응시켰다. 0.2N NaOH 1ml를 가하여 반응을 중단시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였으며, 검량선을 통하여 효소활성도를 결정하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 조골세포의 ALP 활성을 유의적으로 증가시켰다.

〈시험예 3〉세포내의 단백질 카이네이즈 C(PKC)의 활성 측정

상기 시험예 1의 (1-1)과 같은 방법으로 배양한 세포를 PBS로 세척한 후 DMEM 배지에서 1시간 동안 안정시켰다. 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 가하고 실시예 1에서 분리한 화합물을 최종농도가 1.0 ug/ml이 되도록 처리한 다음 1시간, 2시간을 각각 더 배양한 후 PBS로 다시 세척하였다. 스크랩퍼(scrapper)를 사용하여 세포를 긁어내어 현탁용 완충액(20 mM 트리스-HCl, 2 mM EDTA, 10 mM EGTA, 250 mM 수크로스, 5 mM DTT, 0.24 mM 루펩틴, 0.1 % 트리톤 X-100)에 현탁시켰다. 초음파로 세포를 파쇄한 후 100,000×g에서 30분간 원심분리하여 상징액을 취하였다.

상기 상징액에 반응 완충액(100 mM HEPES, pH 7.4, 6.5 mM CaCl₂, 5 mM DTT, 50 mM MgCl₂, 5 mM ATP) 5 ㎕, PKC 기질(PLSRTLSVAAK, 0.4 mg/ml) 5㎕ 및 포스파티딜 세린(phosphatidyl serine, 5 μM) 용액 5㎕를 가하였다. 계속하여 펩타이드 보호용액(PMSF 1 mM, E-64 5 μM, 루펩틴 50μM) 1㎕를 가한 후, 본 발명에 따른 화합물을 처리하고 30분간 30℃에서 반응시켰다.

반응을 종료하기 위하여 반응액을 95℃에서 10분간 가열하였다. 반응액의 점성을 높이기 위해 80% 글리세롤를 가하여 주고, 0.8 % 아가로스 겔(50 mM 트리스-HCl 완충용액, pH 8.0)에 로딩하여 100 V의 전압에서 전기영동하였다. 겔을 취하여 UV 광선하에서 형광을 촬영하여 형성된 띠의 양상을 관찰하였다. 인산화된 기질의양을 측정하기 위하여 띠가 나타난 겔을 일정량씩 취하여 용해시킨 후 570 nm에서 흡광을 측정하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 화합물 1 ㎕/ml을 1시간 동안 처리한 경우 대조군에 비해 유의성 있는 PKC의 활성증가가 나타났다(도 4 참조).

〈시험예 4〉독성시험

래트의 심장으로부터 헤파린을 처리한 주사기를 이용하여 혈액을 채취한 다음 생리식염수(0.85% NaCl 상의 10% 글루코스)를 넣어 5배로 희석하였다. 희석된 혈액에 본 발명에 따른 화합물을 100μg/mL, 10μg/mL, 1μg/mL이 되도록 섞은 다음, 37C에서 2시간 동안 배양하였다. 1,500 g에서 15분간 원심분리한 후, 상층을 취하여 540nm에서 흡광도를 측정하여 용혈 여부를 측정하였다.

대조군으로 화합물을 첨가하지 않은 경우를 0%로 하고, 증류수에 혈액을 현탁시킨 후 똑같은 조작을 한 것을 100% 용혈된 것으로 하였다.

그 결과 하기 표 1에 나타난 바와 같이 본 발명에 의한 화합물은 거의 독성이 없는 것으로 나타났다.

물질농도	용혈율(%)
100 ㎍/mL	1.1 ± 0.2
10 ㎍/mL	-0.5 ± 0.3
1 ㎍/mL	0.6 ± 0.2

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 산형매립초로부터 유기용매 추출 및 크로마토그래피를 실시하여 분리할 수 있으며, 이는 조골세포의 분화와 단백질 합성을 촉진하므로 골다공증, 골절, 관절염의 예방 및 치료제로 유용하게 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분으로 생약재로부터 분리하거나 이로부터 합성한 화합물을 포함하므로 안전하고 부작용이 적다.

Claims

하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 염.

[화학식 1]

상기 R은 수소 또는 C₁-C₄의 알킬기이다.
제1항에 있어서, 3,6-디메틸-1-하이드록시나프탈렌-4-글루코피라노사이드 (3,6-dimethyl-1-hydroxynaphthalene-4-glucopyranoside)인 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물 또는 이의 염.
제1항 또는 제2항에 있어서, 산형매립초로부터 분리된 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물 또는 이의 염.
제1항 또는 제2항에 있어서, 산형매립초를 저급알콜, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택한 유기용매로 추출분획하고 그 결과 얻어진 추출분획을 대상으로 크로마토그래피를 수행하여 분리되는 것을 특징으로 하는 화학식 1의 화합물 또는 이의 염.
제1항의 화합물을 포함하여 골형성 촉진 약리활성을 갖는 산형매립초 추출물.
제1항에 따른 화학식 1의 화합물 또는 제5항에 따른 산형매립초 추출물을 함유하는 골형성 촉진제용 약학적 조성물.
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